JP5282040B2 - Fc受容体遺伝子導入NK細胞を用いた抗体依存性細胞傷害のアッセイ方法 - Google Patents
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Description
即ち、本発明の抗体依存性細胞傷害のアッセイ方法は、
(a)標的細胞に、これを認識するヒト抗体、ヒト化抗体、及びヒトキメラ抗体からなる群より選択される抗体を接触する工程;
(b)細胞表面にヒトFc受容体を発現したNK細胞由来細胞株を、前記抗体に接触する工程;
(c)前記標的細胞に細胞傷害が生じているか否かを検出する工程;
を含み、
前記抗体が蛍光標識されており、
前記工程(c)を、標的細胞またはエフェクタ細胞の少なくとも一方を蛍光標識して、蛍光顕微鏡を用いた観察において両細胞を識別して観察・カウントすることにより行う。
また、前記アッセイ方法においては、前記NK細胞由来細胞株が、KHYG−1であることが好ましい。
・健常人ボランティアや被験者からの末梢血の採血に依存することなく、アッセイに用いることが可能なエフェクタ細胞を大量に調製することが可能である;
・細胞株の培養物を用いてアッセイを行うことができるため、煩雑で時間のかかるエフェクタ細胞精製工程を経る必要がない;
・株化した細胞を大量に調製することができるため、エフェクタ細胞の活性を均一とすることができ、アッセイを安定して行うことが可能である。
以下、本発明の、Fc受容体発現-NK細胞由来細胞株の作製方法について説明する。
(i)ヒトFc受容体をコードする遺伝子を組み込んだ組換えベクタを調製する工程;
(ii)上記工程(i)により調製した組換えベクタでNK細胞由来細胞株を形質転換する工程;及び
(iii)形質転換済細胞株を培養し、細胞表面におけるFc受容体の発現の有無に基づき、Fc受容体を発現した細胞株を選択・分離する工程;
を含む方法により作製することができる。
例えばヒト末梢血から分離した単球フラクションより抽出したmRNAをもとに、市販の逆転写酵素を利用してcDNAを調製しておき、Fc受容体についての既知のcDNA配列情報に基づきプライマを設計し、これらをPCRにかけて全長ヒトFc受容体遺伝子をコードするDNAの調製を行う。工程(i)のこの部分については、市販のRT-PCRキット等を使って行うことができる。尚、ヒトFc-γ受容体の多型のそれぞれについてのDNAを調製する方法については、下記の調製例に記載する。
本発明においては、このような細胞株以外にも、ADCC能とFc受容体とを持つ、ヒト由来のNK細胞、単核球、マクロファージを人工的に不死化し、これを株化したものも用いることができる。また、これらの細胞について細胞腫が入手できる場合には、それを利用することも可能である。
また、例えば、限界希釈法やメチルセルロースによる検鏡下で細胞株のクローニングを行なったものを更に培養して、これをエフェクタ細胞として用いることも可能である。
(a)標的細胞に、これを認識するヒト抗体、ヒト化抗体、及びヒトキメラ抗体からなる群より選択される抗体を接触する工程;
(b)上記(1)乃至(3)の何れか一つに記載の細胞株を、前記抗体に接触する工程;
(c)前記標的細胞に細胞傷害が生じているか否かを検出する工程;
を含むものである。
他には、PKH(シグマ社製)、DiO C6(インビトロジェン社製)、Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl ester(CFDA)(インビトロジェン社製)など、細胞膜染色蛍光試薬によって標的細胞若しくはエフェクタ細胞、又はその両方を接触させる前に染色しておく方法も可能である。更には標的細胞に特有の表面抗原を染色するか、又は標的細胞に接触させる抗体そのものを蛍光標識しておいて使用する方法も可能である。
このように標識(染色)を行うことで、観察・カウントされる生細胞、死細胞の数から、エフェクタ細胞の数を差し引くことが容易になり、アッセイ結果の正確性を向上させることが可能である。
組合せの具体例としては、B細胞性リンパ腫に対するリツキシマブや、イブリツモマブ、乳がんに対するトラスツマブ(抗Her2抗体医薬)、EGFR陽性細胞(適応は大腸がん)に対するセツキシマブ等が挙げられる。
健常人ボランティアから末梢血を採血し、ヒストパックを用いて末梢血から単球を分離した。市販のRNA抽出キット(キアゲン社製RNAeasy micro等)を使用して単球からRNAを抽出した。市販の逆転写酵素(Takara社製M-MLV RTase)を使用して、前記抽出済みのRNAからcDNAを合成した。逆転写反応の際のプライマとしては、ランダム6merを利用した。
方法:
標的細胞にはバーキットリンパ腫(CD20陽性リンパ腫)細胞株であるRaji細胞を、抗体にはリツキシマブ(抗CD20マウス-ヒトキメラ抗体)を、エフェクタ細胞としてはFc-γ受容体IIIa遺伝子(158V及び158F)を導入したKHYG-1細胞株を利用して実験を行った。
Raji細胞は、10%FCS及び20ng/mlのIL-2を含有するRPMI培地で培養し、1.25×106細胞/mlの濃度で96穴プレートの1ウェル当たり40μlで使用した。エフェクタ細胞も同様の条件で培養及び使用を行った。リツキシマブ(中外製薬社製リツキサン、10mg/ml)は、10%FCS及び20ng/mlのIL-2を含有するRPMI培地で5×濃度で調製し(最終濃度は、0ng/ml又は1μg/ml)、96穴プレートの1ウェル当たり20μlで使用した。エフェクタ細胞:標的細胞の比率を0:1〜1:1の間で4段階とし、エフェクタ細胞の作用時間を4時間とし、37℃、5%CO2インキュベータ内で静置した。測定は、Promega社製キット、CytoTox-ONE(登録商標)を使い、キットに付属の説明書に添って行った。測定結果を図1に示す。図1中Mockは、Fc-γ受容体を導入していないNK細胞腫由来細胞株KHYG-1を利用したときの結果を表す。FcγRIIIa(158V)及びFcγRIIIa(158F)は、それぞれFc−γ受容体の多型(158V及び158F)をそれぞれ発現させたKHYG-1細胞株を利用したときの結果を表す。
乳酸脱水素酵素法は細胞の生死に由来する物質の細胞膜透過性を利用した方法であるが、同様の方法としてヨウ化プロピディウム等核酸染色色素による蛍光測定、トリパンブルー等による比色方法などがある。両者とも生細胞の細胞膜は透過できないため染色されないが、細胞死が誘導された後には細胞膜の透過性が高くなり、色素が容易に細胞内に浸透する。前者では、核酸が赤く蛍光を発し、後者では細胞質が青色に染色されることによって定量的に死細胞を計測することができる。
図1より明らかなとおり、158Vの方が、158FよりもADCC活性が高く、158Vを用いた場合のエフェクタ細胞:標的細胞 の比率は、0.1:1以上の場合にADCCによる効果において有意な差異が生じた。
標的細胞を1×105細胞/mlの濃度で12穴プレートを用いて培養し、ADCCの測定方法をフローサイトメトリーにより行うこと以外は実施例1と同様にして実験を行った。フローサイトメトリーを使用する場合、標的細胞をカウントしているのか、エフェクタ細胞をカウントしているのかがそのままでは不明である。このため、標的細胞とエフェクタ細胞を分けてカウントできるように、エフェクタ細胞に対して、NK細胞表面に発現しているCD56を抗CD56抗体で染色した。染色は、標的細胞とエフェクタ細胞との混合培養後に細胞を遠心分離により回収し、PBSにより適宜洗浄し、氷上でFITC標識抗CD56抗体(BD Bioscience社製 カタログ#340410)に接触させ、5μg/mlのヨウ化プロピディウムを加えて15分間、インキュベートして行った。その後フローサイトメトリーで、生きている標的細胞と、死んでいる標的細胞と、エフェクタ細胞をカウントし、死んでいる標的細胞の数を標的細胞の全カウント数(生細胞+死細胞)で割って、ADCC活性を示す数値を算出した。結果は、実施例1と同様の傾向を示すものであった(図示せず)。
ADCCの測定方法を顕微鏡観察法により行い、NK細胞の染色の代わりにリツキシマブをAlexa Fluor488で標識すること以外は実施例1及び2と同様にして実験を行った。
市販のリツキシマブは、濃度が薄く、また界面活性剤を含んでいるため、標識化前に、透析又は限外ろ過による濃縮精製を行った。透析には、Pierce社製製品番号66810のSlide-A-Lyzer Dialysis Cassette (Extra Strength) 10,000 MWCO 3-12ml Capacityを使用した。限外ろ過を行う場合には、リツキシマブをMicrocon YM-30(Millipore社製 #42409)に分注し、キットに添付されているプロトコールに従い25℃の条件下14,000gで12分間遠心し、リツキシマブを濃縮・精製して2mg/ml以上の濃度とした。
上記のように濃縮精製を行ったリツキシマブ1mgを、Molecular Probes Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit (Invitrogen社製 #A10237)の添付プロトコールに従い、Alexa Fluor 488(A488)で標識した。
ADCCの測定は、レーザー共焦点顕微鏡FV1000(オリンパス社製)にステージインキュベータ(オリンパス社製 MI-IBC)を設置し、当該ステージ上で37℃、5%CO2で培養できる環境を作成して行った。ステージインキュベータ上にグラスボトムディッシュ(松浪硝子工業社製 D110300)など)設置し、必要に応じてシリコン製のマイクロウェルを設置して培養を行った。
結果は、実施例1及び2と同様の傾向を示すものであった(図示せず)。
Claims (5)
- (a)標的細胞に、これを認識するヒト抗体、ヒト化抗体、及びヒトキメラ抗体からなる群より選択される抗体を接触する工程;
(b)細胞表面にヒトFc受容体を発現したNK細胞由来細胞株を、前記抗体に接触する工程;
(c)前記標的細胞に細胞傷害が生じているか否かを検出する工程;
を含み、
前記抗体が蛍光標識されており、
前記工程(c)を、標的細胞またはエフェクタ細胞の少なくとも一方を蛍光標識して、蛍光顕微鏡を用いた観察において両細胞を識別して観察・カウントすることにより行う、抗体依存性細胞傷害のアッセイ方法。 - 前記Fc受容体が、Fc−γ受容体である、請求項1に記載のアッセイ方法。
- 前記Fc−γ受容体が、Fc−γIIIa(CD16)によりコードされるものであり、その158番目のアミノ酸残基がバリンであるか(158V)、又はフェニルアラニンである(158F)、請求項2に記載のアッセイ方法。
- 前記NK細胞由来細胞株が、KHYG−1である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
- 前記工程(a)における前記標的細胞、及び前記抗体が、Bリンパ腫患者のリンパ腫組織由来の細胞及びリツキシマブ(CD20キメラモノクローナル抗体);乳がん患者のHer2陽性細胞及びトラスツマブ;又はEGFR陽性細胞及びセツキシマブである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のアッセイ方法。
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