JP2019521695A - 複製可能ウイルスの存在または非存在を評価するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、「Methods for Assessing the Presence or Absence of Replication Competent Virus」という名称の2016年7月29日に出願された米国仮出願第62/369,024号、および「Methods for Assessing the Presence or Absence of Replication Competent Virus」という名称の2017年1月20日に出願された米国仮出願第62/448,954号からの優先権を主張し、これらの内容は参照によりそれらの全体が組み入れられる。
本出願は、電子的フォーマットの配列表と共に出願される。配列表は、サイズが40,464バイトである、2017年7月28日に作成された、735042005640SeqList.TXTという名称のファイルとして提供される。配列表の電子的フォーマットの情報は、参照によりその全体が組み入れられる。
本開示は、複製可能レトロウイルスの非存在を検出または確認する方法に関する。本方法は、ウイルス遺伝子、例えば、構造またはパッケージング遺伝子のような、1つまたは複数の標的遺伝子のRNAレベルを評価する工程を含み、ウイルス遺伝子由来の遺伝子産物は、複製可能レトロウイルス(例えば、ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルス)に感染したある細胞中では発現されるが、異種核酸で細胞に形質導入を行うために使用されたウイルスベクター中には存在せず、複製可能レトロウイルスを含有しない細胞中には存在しないかつ/もしくは発現されない、または存在しないかつ/もしくは発現されないと予想される。1つまたは複数の標的遺伝子のRNAレベルが参照値よりも高い場合に、複製可能レトロウイルスは存在すると決定され得、該参照値は、例えば標的遺伝子を含有する陽性対照サンプルから、直接または間接的に測定され得る。
レトロウイルスベクター粒子、例えば、ガンマレトロウイルスおよびレンチウイルスベクター粒子は、細胞および/または対象中への治療用遺伝子の導入のためのものを含む、様々な臨床適用において使用される。そのようなウイルスベクター粒子は複製欠損であるように操作されるが、多くの場合、投与用に製剤化された治療用または薬学的組成物のような、サンプルまたは組成物における複製可能ウイルス(例えば、複製可能レトロウイルス(RCR)または複製可能レンチウイルス(RCL))の非存在を立証することが、望ましいかまたはさらには必要である場合がある。例えば、ある適用において、移入ベクター、パッケージングコンポーネント、および/またはウイルスベクター粒子の産生のために使用した細胞中の内因性ウイルスエレメント間の相同または非相同組換えを通してなど、作製またはプロセシング工程中にRCRが生じなかったことを立証または確認するための方法が使用される。例えば、作製およびプロセシング中または後の、投与用の製剤化治療用組成物および/もしくは薬物製品(例えば操作細胞)における、ならびに/または、対象(例えば、ウイルスベクター粒子で形質導入が行われた細胞を含有する療法を受けた対象)由来のサンプルにおける、複製可能ウイルスの非存在を立証するためなど、様々な方法が、そのような確認および立証のために利用可能である。しかし、既存の方法は、過度に時間を消費しかつ/または偽陽性結果のリスクを伴い得る。RCRを検出するために必要である改善された方法の必要性がある。
以下を含む方法を本明細書に提供する:
(a)試験サンプル中のパラメータのレベルを決定する工程であって、パラメータまたはレベルは、生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在、非存在、または量もしくは濃度を示すかまたはこれらと(任意で正にもしくは逆に)相関し、生物学的サンプルは、異種核酸および/または異種タンパク質をコードする核酸を含有する少なくとも1つの細胞を含み、生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在、非存在、または量もしくは濃度が、生物学的サンプル中のまたは生物学的サンプルが起因するサンプル中の複製可能ウイルスの、存在もしくは非存在、またはリスクを示し;かつ/または、ウイルスRNAが、複製可能ウイルスの複製能力に必要であるか、またはこれに必要である遺伝子産物もしくはその特異的に識別可能な部分をコードする、工程。
形質導入細胞を含有する治療用細胞組成物のような、サンプルまたは組成物中で、複製可能レトロウイルス由来のウイルスRNAの存在、非存在、量、および/または濃度を検出するための方法および組成物を本明細書に提供する。特定の態様において、本方法は、ウイルスRNAの存在、非存在、量および/または濃度を示すかまたはこれらと相関するパラメータのレベルまたは量を測定または決定する1つまたは複数の工程を含む。いくつかの態様において、生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在、非存在、量、および/または濃度は、複製可能レトロウイルスの存在もしくは非存在、または複製可能レトロウイルスの存在もしくは非存在と関連するリスクを示す。いくつかの態様において、ウイルスRNAは、複製可能ウイルスの複製能力に必要であるか、または複製可能ウイルスの複製能力に必要である遺伝子産物もしくはその特異的に識別可能な部分をコードする。
サンプル中の複製可能ウイルスの存在、非存在、またはレベルを検出する方法を本明細書に提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される方法は、パラメータの値、量、またはレベルを測定、決定、評価、および/または定量化する工程を含む。いくつかの態様において、パラメータの量、値、および/またはレベルは、ウイルスRNAの存在、非存在、および/または量もしくは濃度を示すかまたはこれらと相関する。特定の態様において、生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在、非存在、または量もしくは濃度は、複製可能ウイルスの、存在もしくは非存在、またはリスクを示す。ある態様において、ウイルスRNAは、複製可能ウイルスの複製能力に必要であるか、または複製可能ウイルスの複製能力に必要である遺伝子産物もしくはその特異的に識別可能な部分をコードする。
複製可能ウイルスを潜在的に含有し得るか、または、複製可能ウイルスの非存在を決定的に確認することが望ましいかつ/もしくは必要であるサンプル(例えば生物学的サンプル)由来のRNAを含有するサンプル(例えば試験サンプル)中の、複製可能ウイルスの存在、非存在、もしくはレベルを検出する、例えば、複製可能ウイルスの非存在を確認する方法を本明細書に提供する。いくつかの態様において、試験サンプルは、組換えおよび/または異種分子をコードする複製欠損ウイルスベクター粒子を使用して核酸が形質導入された細胞を含むサンプル、例えば、生物学的サンプルおよび/または生物学的サンプルの供給源から取得される。いくつかの局面において、立証またはアッセイの前に、複製可能ウイルスが、例えば組換えによって、生じた可能性があることが、理論的に可能であり、そのようなサンプルは、例えば提供される方法によって、複製可能ウイルス、例えばRCRを含有しないと立証される。
いくつかの局面において、複製可能ウイルスの非存在を検出または立証または確認するための方法を提供する。そのような方法は、1つもしくは複数のウイルス配列または1つもしくは複数のウイルス標的遺伝子(例えばウイルス遺伝子)のまたはこれらによってコードされる、ウイルスRNAレベルを評価する工程を含み得る。いくつかの態様において、1つまたは複数の標的遺伝子は第1ウイルス遺伝子を含む。いくつかの場合において、1つまたは複数の標的遺伝子は、第1および第2ウイルス遺伝子を含む。いくつかの態様において、第1および第2ウイルス遺伝子は同じではない。いくつかの態様において、1つまたは複数の標的遺伝子は、3つ以上のウイルス遺伝子を含む。いくつかの局面において、1つまたは複数の標的遺伝子は、レトロウイルス、例えば、ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルス由来である。いくつかの態様において、標的遺伝子の評価に加えて、対照遺伝子のRNAレベルが、例えば、アッセイの妥当性または感度および/もしくは特異性を確認するために、評価される。
いくつかの態様において、本方法は、標的遺伝子または標的遺伝子の遺伝子発現産物の量、レベル、および/または濃度と、負または正のいずれかに、関連しかつ/または相関するパラメータを測定、検出、評価、および/または定量化するための工程を提供する。いくつかの態様において、パラメータは、標的遺伝子によってコードされるタンパク質であり、タンパク質のレベル、量、または濃度は、標的遺伝子の存在もしくは非存在、および/または量、レベル、もしくは濃度と正に相関する。ある態様において、パラメータは、標的遺伝子をコードするウイルスRNAであり、ウイルスRNAのレベル、量、または濃度は、標的遺伝子の存在もしくは非存在、および/または量、レベル、もしくは濃度と正に相関する。
いくつかの態様において、パラメータを測定、検出、評価、および/または定量化することに加えて、対照パラメータの量、レベル、および/または濃度も測定、検出、評価、および/または定量化する。特定の態様において、対照パラメータの値または測定は、対照遺伝子または遺伝子発現産物の量、レベル、および/または濃度と相関しかつ/または関連する。いくつかの態様において、パラメータおよび対照パラメータは両方とも、遺伝子または遺伝子発現産物、例えば、タンパク質である。ある態様において、パラメータおよび対照パラメータは両方とも、遺伝子、RNAポリヌクレオチド、および/またはRNAポリヌクレオチドに起因するDNAポリヌクレオチドである。ある態様において、対照パラメータの値または測定は、対照遺伝子または遺伝子発現産物のレベル、濃度、および/または量と、例えば負にまたは正に、相関する。いくつかの態様において、遺伝子発現産物はmRNAである。特定の態様において、対照遺伝子発現産物は、非ウイルスRNA、例えばヒトmRNAである。
ある態様において、1つまたは複数のアッセイは、パラメータを検出、測定、評価、および/または定量化するために行われる。いくつかの態様において、パラメータを検出、測定、評価、および/または定量化する工程は、ポリヌクレオチド、例えば、ウイルスRNAポリヌクレオチドおよび/またはRNAポリヌクレオチドに起因するDNAポリヌクレオチドのレベルを検出、測定、評価、および/または定量化する工程であるかまたはこれらを含む。ある態様において、パラメータを検出、測定、評価、および/または定量化する工程は、タンパク質、例えばウイルスタンパク質のレベルを検出、測定、評価、および/または定量化する工程であるかまたはこれらを含む。
a.試験サンプル
いくつかの態様において、試験サンプルは、ウイルスRNAのレベルと関連する、これと相関するかつ/またはこれを予測する1つまたは複数のパラメータを含有する。特定の態様において、生物学的サンプル中のウイルスRNAのレベルと関連する、これと相関するかつ/またはこれを予測する1つまたは複数のパラメータ。
いくつかの局面において、提供される方法は、1つまたは複数の対照サンプルに対してさらに行われる。いくつかの態様において、プラスミド標準対照が、アッセイのPCR増幅部分についての対照として使用される。いくつかの局面において、プラスミド標準対照は、対照遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子を含有する。いくつかの態様において、対照遺伝子はb-アクチンである。
いくつかの態様において、標的遺伝子、例えば、第1ウイルス遺伝子および/または第2ウイルス遺伝子は、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して試験サンプルおよび/または対照サンプルにおいて評価される。いくつかの場合では、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的遺伝子の配列に特異的である。いくつかの場合では、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、対照遺伝子の配列に特異的である。いくつかの局面において、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。従って、いくつかの場合において、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーは、一対のプライマーを含む。いくつかの場合において、一対のプライマーは、標的遺伝子または対照遺伝子の配列に各々特異的な、順方向および逆方向プライマーを含有する。いくつかの局面において、順方向および逆方向プライマーは、同じ標的遺伝子または対照遺伝子の異なる配列に特異的である。
いくつかの態様において、1つまたは複数のパラメータの量、レベル、または濃度が参照値よりも高いまたは低い場合、複製可能レトロウイルスは存在すると決定され得、参照値は、例えば標的遺伝子を含有する陽性対照サンプルから、直接または間接的に測定され得る。いくつかの態様において、1つまたは複数の標的遺伝子の量、レベル、または濃度と正に相関する1つまたは複数のパラメータの量、レベル、または濃度が参照値よりも高い場合、複製可能レトロウイルスは存在すると決定され得る。特定の態様において、1つまたは複数の標的遺伝子の量、レベル、または濃度と負に相関する1つまたは複数のパラメータの量、レベル、または濃度が参照値よりも低い場合、複製可能レトロウイルスは存在すると決定され得る。いくつかの態様において、パラメータおよび/または参照レベルもしくは値は、標的遺伝子のレベルまたは量でありかつ/またはこれらを示す。いくつかの態様において、パラメータおよび/または参照レベルもしくは値は、ウイルスRNA遺伝子である標的遺伝子のレベルまたは量でありかつ/またはこれらを示す。
いくつかの態様において、アッセイは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、例えば、逆転写酵素(rt)PCR、ドロップレットデジタルPCR、リアルタイムおよび定量的PCR法、ノーザンブロットアッセイ;サザンブロットアッセイ;アレイベースのアッセイ、例えば、ブロッテッドアレイ、マイクロアレイ、もしくはインサイチュ合成アレイ;またはシーケンシングベースのアッセイである。いくつかの態様において、アッセイは、次世代シーケンシング(NGS)アッセイ、例えば、RNA-seqである。いくつかの態様において、アッセイは、免疫細胞化学または免疫組織化学、ELISA、ウェスタンブロット法、ペプチドシーケンシング、任意でHPLCを伴う質量分析(例えばMS/MS)であるかまたはこれらを含む。
いくつかの局面において、形質導入細胞を含む、サンプル、例えば生物学的サンプル中の複製可能ウイルスを検出するための組成物、組み合わせ、および/またはキットを提供する。いくつかの態様において、組成物、組み合わせ、および/またはキットは、細胞、例えば形質導入細胞中の、パラメータ、例えば遺伝子RNAレベルを評価するための試薬を含む。いくつかの態様において、試薬は、RNA単離、RT-PCR、qPCR、および/またはRT-qPCRのための試薬を含む。いくつかの局面において、組成物、組み合わせ、および/またはキットは、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマー、1つまたは複数の対のオリゴヌクレオチドプライマー、および/または1つまたは複数の加水分解プローブを含む。
いくつかの局面において、提供される方法は、複製可能レトロウイルス由来のRNAと関連するかつ/または相関するパラメータを検出する工程を伴う。いくつかの態様において、パラメータは、組換えおよび/または異種分子をコードするウイルスベクター粒子で形質導入が行われた細胞由来のRNAまたはcDNAを含有する試験サンプルにおいて測定される。従って、いくつかの場合において、ウイルスベクター粒子は、細胞に形質導入を行うために使用されたかまたは使用されてよく、該細胞は、提供される方法によってその後評価される。
いくつかの態様において、組換えおよび/または異種分子は、キメラ抗原受容体(CAR)であるかまたはこれを含む。CARは通常、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分に連結されている細胞外リガンド結合ドメインを有する、遺伝子改変された受容体である。このような分子は、典型的には、天然の抗原受容体を通じたシグナル、および/または共刺激受容体と組み合わせたこのような受容体を通じたシグナルを模倣または近似する。
いくつかの態様において、ウイルスベクター粒子によってコードされる組換えおよび/または異種分子は、組換えT細胞受容体(TCR)であるかまたは組換えTCRを含む。いくつかの態様において、組換えTCRは、抗原、通常は標的細胞上に存在する抗原、例えば腫瘍特異抗原、自己免疫もしくは炎症性疾患に関連する特定の細胞タイプ上に発現される抗原、またはウイルス病原体もしくは細菌病原体に由来する抗原に特異的である。
いくつかの態様において、複製可能ウイルスについて試験される細胞は、組換えおよび/または異種分子、例えば遺伝子産物をコードする核酸を含むウイルスベクター粒子で形質導入が行われた。いくつかの態様において、核酸、即ち、ポリヌクレオチドは、発現カセット内に含有される。核酸または発現カセットは、ウイルスベクター粒子中の核酸によってコードされる組換えおよび/または異種分子の発現のために、発現ベクター中、例えばウイルスベクター中に含有され得る。
いくつかの態様において、発現カセットは、プロモーターの制御下にある異種および/組換え分子をコードする核酸を含有し得る。発現カセットはまた、1つまたは複数の他の調節エレメントを含有し得る。いくつかの場合において、核酸は、プロモーター、エンハンサー、他の転写後調節エレメント、ポリアデニル化シグナル、制限酵素部位、多重クローニング部位、またはコーディングセグメントを含むがこれらに限定されない、他の核酸配列に機能的に連結され得る。
いくつかの態様において、発現カセットは、組換えタンパク質または異種タンパク質をコードする核酸分子に機能的に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、発現状況について適切である場合、使用者によって望まれる任意のプロモーターを含み得る。いくつかの態様において、プロモーターは、様々な細胞タイプにわたって高レベルの構成的発現を提供し得る真核生物起源または原核生物起源のプロモーターを含んでよく、細胞において組換えタンパク質または異種タンパク質をコードする核酸の転写を指示するのに十分である。いくつかの態様において、組換えタンパク質または異種タンパク質をコードする核酸は、遠位に位置する配列であり、これは、プロモーター配列の5’末端に機能的に連結された配列である。プロモーター領域はまた、転写の増強または抑制のための制御エレメントを含み得、使用者によって望まれるようにかつ状況に依存して、修飾され得る。
いくつかの態様において、発現カセットは、組換えタンパク質または異種遺伝子産物をコードする核酸に機能的に連結されているエンハンサーをさらに含むことができる。
いくつかの態様において、試験される細胞に形質導入を行うために使用されるウイルスベクター粒子は、レトロウイルスゲノムに基づくベクターに由来する、例えばガンマレトロウイルスまたはレンチウイルスゲノムに基づくベクターに由来するゲノムを含む。多数のこのような好適なベクターゲノムのいずれかは公知である(例えば、Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557; Pfeifer and Verma (2001) Annu. Rev. Genomics Hum. Genet., 2:177-211を参照のこと)。提供されるウイルスベクターのいくつかの局面において、組換え受容体、例えば抗原受容体、例えばCARをコードする異種核酸が、ベクターゲノムの5’LTR配列と3’LTR配列との間に含まれ、かつ/または位置する。いくつかの態様において、ベクターゲノムは、移入ベクターおよび/または移入プラスミドと呼ばれる。
提供される方法のいくつかの態様において、組換えおよび/または異種分子をコードする核酸を、あるウイルス配列の代わりにウイルスゲノム中に挿入して、複製能力がないウイルスを生成する。ビリオンを産生するためには、gag、pol、およびenv遺伝子を含有するがLTRおよびパッケージングコンポーネントを含まないパッケージング細胞株を構築し得る。組換えプラスミドをレトロウイルスLTRおよびパッケージング配列と一緒に(例えば、リン酸カルシウム沈殿により)特殊な細胞株中へ導入すると、パッケージング配列は、組換えプラスミドのRNA転写産物がウイルス粒子中にパッケージングされるのを可能にし得、次いで、これは培養培地中に分泌され得る。いくつかの態様において、組換えレトロウイルスを含有する培地を、次いで収集し、任意で濃縮し、そして遺伝子移入のために使用する。
いくつかの態様において、試験サンプルは、細胞(例えば、免疫細胞、例えばT細胞)ならびに/またはそのような細胞のRNAもしくはそのような細胞由来のRNAを含み、該細胞は、ウイルスベクターのゲノム中に組換えおよび/または異種分子(例えば、CARもしくは他の抗原受容体)をコードする核酸を含有するウイルスベクター粒子(例えば、レンチウイルスまたはガンマレトロウイルスベクター粒子)と、そのような細胞を含有する細胞の集団をインキュベートするおよび/または接触させることによって、形質導入が行われるかまたは形質導入が行われている。ウイルスベクター粒子、例えば、レンチウイルスまたはガンマレトロウイルスベクター粒子は、記載されるようないずれであってもよい。いくつかのそのような態様において、結果として生じた形質導入細胞、例えば、形質導入T細胞は、組換えおよび/または異種分子、例えばCARを発現し、養子免疫療法において使用することができる。複製可能ウイルスの存在または非存在は、いくつかの態様において、養子細胞療法における使用のための細胞を含む、形質導入が行われるかまたは形質導入が行われるであろう細胞を含む、細胞のプロセシングにおける任意の時点で評価することができる。細胞の単離、分離、選択、培養(例えば、細胞の刺激、例えば、それらの増殖および/または活性化を誘導するため)、形質導入、洗浄、懸濁、希釈、濃縮、および/または製剤化に関与する工程を含む、細胞をプロセシングするための工程を、以下に詳細に説明する。
各々のプロセシング工程の全部または一部は、閉鎖系において行われ得る。本方法の複数の局面において、プロセスは、同じ閉鎖系において行う必要はなく、しかし、異なる閉鎖系下で行うことができる。
提供される方法の複数の局面において、細胞の集団は、対象から取得される、初代細胞、例えば、T細胞を含有する初代細胞の集団を含む。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物対象、例えば霊長動物、例えばヒトである。
処理工程は、密度ベースのまたは他の物性ベースの分離法および親和性ベースの選択を含む様々な選択工程のうちの1つを使用することのような、混合集団および/または組成物からの細胞の単離を含み得る。いくつかの態様において、単離方法は、表面マーカー、例えば表面タンパク質、細胞内マーカー、または核酸のような、1種または複数種の特異的分子の細胞における発現または存在に基づく異なる細胞タイプの分離を含む。いくつかの態様において、そのようなマーカーに基づく分離のための任意の公知の方法が使用され得る。いくつかの態様において、分離は、親和性または免疫親和性に基づく分離である。例えば、いくつかの局面における単離は、細胞の1種または複数種のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの発現または発現レベルに基づく細胞および細胞集団を、例えばそのようなマーカーと特異的に結合する抗体または結合パートナーと一緒にインキュベートすることによる分離に続いて、通常、洗浄工程、ならびに抗体または結合パートナーと結合しなかった細胞からの抗体または結合パートナーと結合した細胞の分離を含む。
いくつかの態様において、提供される方法は、調製、培養、および/または操作の前または後のいずれかで、細胞を凍結、例えば凍結保存するための工程を含む。いくつかの態様において、細胞は、そのような細胞のサンプルが複製可能ウイルスについて試験される間、凍結される。いくつかの態様において、凍結およびその後の解凍工程は、細胞集団中の顆粒球およびある程度まで単球を除去する。いくつかの態様において、細胞は、例えば血漿および血小板を除去するための洗浄工程の後に、凍結溶液中に懸濁される。いくつかの局面において任意の多様な公知の凍結溶液およびパラメータが、使用され得る。一例は、20%DMSOおよび8%ヒト血清アルブミン(HSA)を含有するPBS、または他の適切な細胞凍結媒体を使用することを伴う。次に、これは、DMSOおよびHSAの最終濃度がそれぞれ10%および4%となるように媒体で1:1に希釈される。次に、細胞は、1分間あたり1°のペースで-80℃まで凍結され、液体窒素貯蔵タンクの気相中で貯蔵される。いくつかの態様において、細胞は、複製可能ウイルスについて細胞を評価する前記方法の前、間、または後のいずれかに、凍結、例えば凍結保存される。いくつかの態様において、細胞は、プロセシングするための前記方法の前、間、または後のいずれかに、凍結、例えば凍結保存される。
いくつかの局面において、細胞、例えば細胞の集団、例えば、記載されるように取得されたかつ/または単離された細胞の集団は、遺伝子移入を可能にする条件下で、ウイルスベクター粒子と、インキュベートおよび/もしくは接触され得るか、またはインキュベートおよび/もしくは接触されたことがある。そのようないくつかの態様のいずれかにおいて、ウイルスベクター粒子は、細胞中へのウイルス粒子の移入、ならびに/または、細胞における、組換えおよび/または異種分子(例えば組換え受容体、例えばCAR)をコードする核酸の発現を可能にする条件(例えばウイルスインプット)下で、細胞の集団とインキュベートおよび/または接触される。
いくつかの態様において、細胞は、遺伝子操作と関連してまたは遺伝子操作後に、刺激および/または増殖および/または増大される。いくつかの態様において、プロセシング工程は、細胞、例えば、選択細胞および/または形質導入細胞のインキュベーションを含み、ここで、インキュベーション工程は、細胞の培養、栽培、刺激、活性化、および/または繁殖を含み得る。いくつかの態様において、組成物または細胞は、刺激条件または刺激剤の存在下でインキュベートされる。そのような条件は、集団中の細胞の増殖、増大、活性化、および/または生存を誘導するように、抗原曝露を模倣するように、かつ/または組換え抗原受容体の導入用のような遺伝子操作用に細胞を予備刺激するように設計された条件を含む。
いくつかの態様において、プロセス工程は、細胞の製剤化、例えば、提供される形質導入プロセシング工程および/または記載される1つもしくは複数の他のプロセシング工程から生じる遺伝子操作細胞の製剤化を含み得る。いくつかの態様において、細胞は製剤化薬物製品(FDP)として製剤化される。いくつかの態様において、細胞の製剤化と関連する提供される方法は、閉鎖系において、上述のプロセシング工程を使用して形質導入および/または増大された細胞のような、形質導入細胞をプロセシングする工程を含む。
用語「ベクター」は、本明細書において使用される場合、それが連結されている別の核酸を伝えることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造体としてのベクター、ならびにそれが導入された宿主細胞のゲノム中へ組み込まれたベクターを含む。あるベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。ベクターの中には、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、ガンマレトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターがある。
本明細書における態様の中には以下がある:
1.
(a)試験サンプル中のパラメータのレベルを決定する工程であって、パラメータまたはレベルが、生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在、非存在、または量もしくは濃度を示すかまたはこれらと(任意で正にもしくは逆に)相関し、生物学的サンプルが、異種核酸および/または異種タンパク質をコードする核酸を含有する少なくとも1つの細胞を含む、工程
を含む方法であって、
生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在、非存在、または量もしくは濃度が、生物学的サンプル中のまたは生物学的サンプルが起因するサンプル中の複製可能ウイルスの、存在もしくは非存在、またはリスクを示し;かつ/あるいは
ウイルスRNAが、複製可能ウイルスの複製能力に必要であるか、またはこれに必要である遺伝子産物もしくはその特異的に識別可能な部分をコードする、
方法。
2.
そのように決定された前記レベルに基づいて、生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在、非存在、濃度もしくは量、またはそのリスクを決定する工程をさらに含む、態様1の方法。
3.
(b)(a)で決定されたパラメータのレベルを、パラメータについての第1参照値と比較する工程
をさらに含む、態様1または態様2の方法。
4.
前記比較が、生物学的サンプルまたはそれに起因するサンプル中のウイルスRNAの存在、非存在、濃度もしくは量、または前述のうちのいずれかのリスクを示す、態様3の方法。
5.
生物学的サンプルまたはその部分中の、ウイルスRNAの存在、非存在、または量もしくは濃度、または前述のうちのいずれかのリスクを決定する工程;ならびに/あるいは
複製可能ウイルスが、生物学的サンプルもしくはその部分中に存在する(または潜在的に存在するかもしくは存在する可能性が高い)または存在するリスクがあるかどうかを決定する工程
をさらに含む、態様1〜4のいずれか一つの方法。
6.
(a)で決定されたパラメータのレベルが第1参照値であるかまたはこれを上回る場合、任意でその場合に限り、生物学的サンプルは、複製可能ウイルスの存在を有する、存在を潜在的に有する、または存在についてのリスクがある、かつ/または、ウイルスRNAの存在または少なくとも閾値量を有すると見なされ、任意で、パラメータのレベルは、生物学的サンプル中のRNAの量と正に相関し;かつ/あるいは
(a)で決定されたパラメータのレベルが第1参照値であるかまたはこれを下回る場合、任意でその場合に限り、生物学的サンプルは、複製可能ウイルスの存在を有する、または存在についてのリスクがある、かつ/または、ウイルスRNAの存在または少なくとも閾値量を有すると見なされ、任意でパラメータのレベルは、生物学的サンプル中のウイルスRNAの量と逆に相関し;(a)で決定されたパラメータのレベルが第1参照値を下回る場合、任意でその場合に限り、生物学的サンプルおよび/または少なくとも1つの細胞のうちの1つもしくは複数は、RCR陰性と見なされ、または複製可能ウイルスの存在を有さない、または存在についてのリスクがない、または存在を潜在的に含有しないと見なされ、任意でパラメータのレベルは、生物学的サンプル中のRNAの量と正に相関し;かつ/あるいは
(a)で決定されたパラメータのレベルが第1参照値を上回る場合、任意でその場合に限り、生物学的サンプルおよび/または少なくとも1つの細胞のうちの1つもしくは複数は、複製可能ウイルスの存在を有さないまたは存在についてのリスクがない、かつ/または、ウイルスRNAの存在または少なくとも閾値量を有さないと見なされ、任意でパラメータのレベルは、生物学的サンプル中のウイルスRNAの量と逆に相関する、
態様1〜5のいずれか一つの方法。
7.
複製能に必要な別のウイルスRNAが生物学的サンプル中に存在するとたとえ決定されるとしても、生物学的サンプルが、陰性である、有さない、またはリスクがないとそのように見なされ;
生物学的サンプル中の複製能に必要な別のウイルスRNAの量と正に相関する第2パラメータの、第2参照値であるかまたはこれを上回るレベルが、試験サンプルまたは生物学的サンプルに起因するかもしくは生物学的サンプル由来の核酸を含有する第2の試験サンプル中で、たとえ検出されるかまたは検出されたことがあるとしても、生物学的サンプルが、陰性である、有さない、またはリスクがないとそのように見なされ;かつ/あるいは
複製能に必要な別のウイルスRNAの量と負に相関する第2パラメータの、第2参照値であるかまたはこれを下回るレベルが、試験サンプルまたは生物学的サンプルに起因するかもしくは生物学的サンプル由来の核酸を含有する別の試験サンプル中で、たとえ検出されるかまたは検出されたことがあるとしても、生物学的サンプルが、陰性である、有さない、またはリスクがないとそのように見なされる、
態様4の方法。
8.
生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在が決定される場合(任意でその場合に限り)、および/または、任意で閾値量であるかもしくはこれを上回るウイルスRNAの量が、生物学的サンプル中にあると決定される場合(任意でその場合に限り)、生物学的サンプルは、複製可能ウイルスの存在を有する、存在を潜在的に有する、または存在についてのリスクがあると見なされ;
生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在が決定される場合(任意でその場合に限り)、および/または、任意で閾値量であるかもしくはこれを上回るウイルスRNAの量が、生物学的サンプル中にあると決定される場合(任意でその場合に限り)、生物学的サンプルは、複製可能ウイルスの存在を潜在的に有するまたは存在についてのリスクがあると見なされるが、リスクのさらなる表示なしでは、かつ/または、別のウイルスRNAを示す別のパラメータの評価なしでは、複製可能ウイルスの存在を含有するとは見なされず;かつ/あるいは
生物学的サンプル中のウイルスRNAの非存在が決定される場合、および/または、任意で閾値量であるかもしくはこれを下回るウイルスRNAの量(または僅かその量)が、生物学的サンプル中にあると決定される場合、任意で、ウイルスの複製能力に必要な別のRNAの存在が生物学的サンプル中に存在するとたとえ決定されるとしても、生物学的サンプルは、複製可能ウイルスの存在を有さない、存在を潜在的に有さない、かつ/または存在についてのリスクがないと見なされ;かつ/あるいは
パラメータおよび/またはウイルスRNAが、試験サンプル中で検出不可能であるかもしくは検出されない、かつ/または、生物学的サンプル中に存在すると決定されない場合、生物学的サンプルは複製可能ウイルス陰性と見なされる、
態様1〜7のいずれか一つの方法。
9.
第1参照値が、閾値レベルまたはそれに対応する最小検出可能レベルもしくは読み出しである値、またはほぼこれらである値、またはこれらを僅かに上回る値であり;
第1参照値が、陽性対照サンプル中の、検出されたパラメータの値、および/または、RNAの量を示すパラメータの値であり;かつ/あるいは
パラメータのレベルが、生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在または非存在を示し;かつ/あるいは
ウイルスRNAが、第1ウイルス遺伝子をコードする核酸を含み;かつ/あるいは
異種核酸が、異種遺伝子産物をコードする、
態様1〜8のいずれか一つの方法。
10.
試験サンプルにおいて評価されるパラメータが、
ウイルスRNAの、またはそれから発現される産物の、またはRNAに対応するウイルス遺伝子から発現される産物の、任意で相対コピー数または相対重量である量または相対量であるかまたはこれらを含み、あるいは、
ウイルスRNAの、またはそれから発現される産物の、またはRNAに対応するウイルス遺伝子から発現される産物の、濃度または相対濃度であるかまたはこれらを含む、
態様1〜9のいずれか一つの方法。
11.
量が絶対量または相対量である、態様10の方法。
12.
パラメータおよび/またはレベルが、
任意でサイクル閾値(Ct)値であるサロゲートまたは相対値
であるかまたはこれらを含む、態様1〜11のいずれか一つの方法。
13.
試験サンプルについてのCT値が、参照Ctスコアである第1参照値を下回る場合、ウイルスRNAまたはその発現が、生物学的サンプル中または試験サンプル中に存在するかまたは存在するリスクがあると決定される、態様12の方法。
14.
試験サンプルが、生物学的サンプルもしくはその部分であるか、またはこれらに起因する、態様1〜13のいずれか一つの方法。
15.
(a)試験サンプル中の第1パラメータの第1レベルを決定または評価する工程であって、該第1レベルまたは第1パラメータが、第1ウイルスRNAの、および/または第1ウイルスRNAをコードする第1ウイルス遺伝子をコードする第1核酸の、生物学的サンプルにおける存在、非存在、量または濃度と(任意で正にもしくは逆に)相関する、工程;
(b)任意で同じまたは異なる試験サンプルである試験サンプル中の第2パラメータの第2レベルを決定または評価する工程であって、該第2レベルまたは第2パラメータが、第1ウイルスRNAとは異なる第2ウイルスRNAの、および/または該第2ウイルスRNAをコードする第2かつ異なるウイルス遺伝子をコードする第2核酸の、生物学的サンプルにおける存在、非存在、量または濃度と(任意で正にもしくは逆に)相関する、工程
を含む方法であって、
少なくとも1つの細胞が、異種核酸、異種遺伝子産物、および/もしくは異種タンパク質をコードする核酸を含有し、かつ/または、ウイルスベクターで形質導入されており;
生物学的サンプル中の、第1ウイルスRNAもしくは遺伝子または第2ウイルスRNAもしくは遺伝子の、存在、非存在、または量もしくは濃度、ならびに/または、第1および第2ウイルスRNAもしくは遺伝子の両方の存在、非存在、または量もしくは濃度は、生物学的サンプル中のまたは生物学的サンプルが起因するサンプル中の複製可能ウイルスの、存在もしくは非存在、またはリスクを示し;かつ/あるいは
第1ウイルスRNA、第2ウイルスRNA、ならびに/または第1および第2ウイルスRNAの両方が、複製可能ウイルスの複製能力に必要であるか、またはこれに必要である遺伝子産物もしくはその特異的に識別可能な部分をコードする、方法。
16.
そのように決定された前記レベルに基づいて、生物学的サンプル中の第1および/または第2ウイルスRNAまたは遺伝子産物の存在、非存在、濃度もしくは量、またはそれらのリスクを決定する工程
をさらに含む、態様15または20の方法。
17.
(c)(a)および/または(b)で決定された第1および/または第2パラメータのレベルを第1および/または第2参照値と比較する工程であって、比較が、生物学的サンプルまたはそれに起因するサンプル中のウイルスRNAの存在、非存在、濃度もしくは量、または前述のうちのいずれかのリスクを任意で示す、工程
をさらに含む、態様16の方法。
18.
(c)生物学的サンプルまたはその部分中の、第1ウイルスRNAまたは発現の存在、非存在、または量もしくは濃度、または前述のうちのいずれかのリスクを決定し、かつ/または、生物学的サンプルまたはその部分中の、第2ウイルスRNAまたは発現の存在、非存在、または量もしくは濃度、または前述のうちのいずれかのリスクを決定する工程;ならびに/あるいは
(d)任意で(c)での決定に基づいて、複製可能ウイルスが、生物学的サンプルもしくはその部分中に存在する(または潜在的に存在するかもしくは存在する可能性が高い)または存在するリスクがあるかどうかを決定する工程
をさらに含む、態様15〜17および20のいずれか一つの方法。
19.
ウイルスRNAがenv、gag、pol、もしくはrev由来であり、かつ/または、第1ウイルスRNAがenv、gag、pol、もしくはrev由来であり、かつ/または、第1ウイルス遺伝子がenv、gag、pol、もしくはrevであり;かつ/あるいは
ウイルスRNAがenv、gag、pol、もしくはrev由来であり、かつ/または、第2ウイルスRNAがenv、gag、pol、もしくはrev由来であり、かつ/または、第2ウイルス遺伝子がenv、gag、pol、もしくはrevである、
態様1〜19のいずれか一つの方法。
20.
(a)生物学的サンプル中の第1ウイルスRNAの量または存在もしくは非存在を示すかまたはこれらと(任意で正にもしくは逆に)相関する、試験サンプル中の第1パラメータのレベルを評価し、かつ任意で同じまたは異なる試験サンプルである試験サンプル中の第2パラメータのレベルを評価する工程であって、第1ウイルスRNAが、env遺伝子である第1ウイルス遺伝子由来であり、第2ウイルスパラメータが、生物学的サンプル中の第2ウイルスRNAの存在、非存在、または量を示すかまたはこれらと(任意で正にもしくは逆に)相関し、第2ウイルスRNAが、gag、pol、およびrev遺伝子より選択される遺伝子由来であり、生物学的サンプルが、任意で異種遺伝子産物を含むウイルスベクター粒子で形質導入が行われた細胞を含み、かつ/または、異種遺伝子産物を有する細胞を含む、工程
を含む方法であって、
少なくとも1つの細胞が、異種核酸、異種遺伝子産物、および/もしくは異種タンパク質をコードする核酸を含有し、かつ/または、ウイルスベクターで形質導入されており;
生物学的サンプル中の、第1ウイルスRNAもしくは遺伝子または第2ウイルスRNAもしくは遺伝子の存在、非存在、または量もしくは濃度、ならびに/または、第1および第2ウイルスRNAもしくは遺伝子の両方の存在、非存在、または量もしくは濃度は、生物学的サンプル中のまたは生物学的サンプルが起因するサンプル中の複製可能ウイルスの、存在もしくは非存在、またはリスクを示し;かつ/または、
第1ウイルスRNA、第2ウイルスRNA、ならびに/または第1および第2ウイルスRNAの両方が、複製可能ウイルスの複製能力に必要であるか、またはこれに必要である遺伝子産物もしくはその特異的に識別可能な部分をコードする、方法。
21.
パラメータがウイルスRNAの存在または非存在である、態様1〜20のいずれか一つの方法。
22.
参照値、第1参照値、および/または第2参照値が、閾値レベルまたは最小検出可能レベルであるかまたはこれらに対応する、態様1〜21のいずれか一つの方法。
23.
参照値、第1参照値、および/または第2参照値が、陽性対照試験サンプル中のパラメータに対応するかまたはこれに関する値であり、該陽性対照試験サンプルが、既知量または既知濃度のウイルスRNA、第2ウイルスRNA、および/または第1ウイルスRNAを任意で含有する、態様1〜22のいずれか一つの方法。
24.
前記方法が、生物学的サンプル中の第1および第2ウイルスRNAの存在または閾値量を上回る量を決定する場合、ならびに任意で、前記方法が、第1および第2 RNAの両方ではなく一方について存在または閾値量を上回る量を決定することはない場合、生物学的サンプルは、複製可能ウイルスを含有するかまたは含有するリスクがあるかまたは潜在的に含有すると見なされ;かつ/あるいは
前記方法が、生物学的サンプル中の第1ウイルスRNA、または第2ウイルスRNA、ならびに/または第1および第2ウイルスRNAの両方の、非存在、検出可能な量の非存在、または閾値量を下回る量を決定する場合、生物学的サンプルは、複製可能ウイルスについて陰性である、またはこれを含有しない、またはこれを含有するもしくは潜在的に含有するリスクがないと見なされる、
態様15〜23のいずれか一つの方法。
25.
第1および第2ウイルス遺伝子をコードするウイルスRNAのレベルが、試験サンプル中で検出不可能である、かつ/または、生物学的サンプル中に存在するともしくは閾値レベルを超えて存在すると決定されない場合、生物学的サンプルが複製可能ウイルス陰性と見なされる、態様15〜24のいずれか一つの方法。
26.
工程(a)の前に、生物学的サンプルもしくはそれ由来の部分または生物学的サンプルに起因するサンプルもしくはその部分から、RNAを単離する工程をさらに含み、
RNAが少なくとも1つの細胞のうちの1つまたは複数由来のRNAを含有する、
態様1〜25のいずれか一つの方法。
27.
複製可能ウイルスがレトロウイルスであるかまたはこれを含み、かつ/または、ウイルスRNAまたは第1および/もしくは第2ウイルスRNAがレトロウイルスによって発現される、態様1〜26のいずれか一つの方法。
28.
レトロウイルスがガンマレトロウイルスである、態様27の方法。
29.
レトロウイルスがレンチウイルスである、態様28の方法。
30.
生物学的サンプルがヒトまたは哺乳動物由来であり、かつ/または、1つまたは複数の細胞が、任意でヒトまたは哺乳動物細胞である初代細胞である、態様1〜29のいずれか一つの方法。
31.
1つもしくは複数の細胞および/または生物学的サンプルが、マスター・セル・バンク(MCB)、ワーキング・セル・バンク(WCB)、もしくは細胞株、またはそのサンプルに由来する、態様1〜30のいずれか一つの方法。
32.
少なくとも1つの細胞または生物学的サンプルが、凍結保存材料(CMAT)、凍結保存薬物製品(CDP)、もしくは自己細胞療法用の製剤化薬物製品(FDP)、またはそのサンプルであるかまたはこれらに由来する、態様1〜24のいずれか一つの方法。
33.
異種核酸または異種遺伝子産物が、組換え受容体、キメラ受容体、任意でキメラ抗原受容体、またはトランスジェニックT細胞受容体であるかまたはこれらをコードする、態様1〜32のいずれか一つの方法。
34.
決定または評価する工程が、ウイルスRNA、第1ウイルスRNAおよび/または第2ウイルスRNAの配列に特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行われる、態様1〜33のいずれか一つの方法。
35.
第2ウイルス遺伝子をコードするウイルスRNAのレベルが、第2ウイルス遺伝子の配列に特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して評価される、態様15〜34のいずれか一つの方法。
36.
ウイルスRNAのレベルが、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって評価される、態様1〜35のいずれか一つの方法。
37.
決定または評価する工程が、逆転写酵素定量的PCR(RT-qPCR)を行うことを含む、態様1〜36のいずれか一つの方法。
38.
ウイルスRNAならびに/または第1および/もしくは第2ウイルスRNAならびに/またはウイルスRNAおよび/もしくは遺伝子が、レトロウイルスに由来する、態様1〜37のいずれか一つの方法。
39.
ウイルスRNA、第1ウイルスRNA、および/もしくは第2ウイルスRNA(または前述のうちのいずれかをコードする遺伝子)が、ビリオン複製および/またはパッケージングに関与する遺伝子であるかまたはこれによってコードされる、態様1〜38のいずれか一つの方法。
40.
ウイルスRNAならびに/または第1ウイルスRNAおよび/もしくは第2ウイルスRNA(または前述のうちの1つもしくは複数をコードする遺伝子)が、形質導入細胞に形質導入を行うために使用された移入ベクターによってコードされる遺伝子ではない、態様1〜39のいずれか一つの方法。
41.
ウイルスRNA、第1ウイルスRNA、および/または第2ウイルスRNAが、ウイルス表面タンパク質、エンベロープタンパク質、群特異抗原、ウイルス由来ポリメラーゼ、ウイルス由来逆転写酵素、ウイルス由来調節エレメント、転写のトランスアクチベーター、または応答エレメントをコードする、態様1〜40のいずれか一つの方法。
42.
gag遺伝子が、マウス白血病ウイルス(MMLV) gagおよびヒト免疫不全ウイルス(HIV) gagからなる群より選択される、態様1〜41のいずれか一つの方法。
43.
env遺伝子が、GaLV envおよびVSVGより選択される、態様1〜42のいずれか一つの方法。
44.
第1ウイルス遺伝子の配列に特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO: 4〜5に記載の1つまたは複数の配列を含む、態様34〜43のいずれか一つの方法。
45.
第1ウイルス遺伝子の配列に特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO: 16〜24に記載の1つまたは複数の配列を含む、態様34〜44のいずれか一つの方法。
46.
第2ウイルス遺伝子の配列に特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO: 4〜5に記載の1つまたは複数の配列を含む、態様34〜45のいずれか一つの方法。
47.
第2ウイルス遺伝子の配列に特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO: 16〜24に記載の1つまたは複数の配列を含む、態様34〜45のいずれか一つの方法。
48.
評価または決定する工程が、ウイルスRNA、ウイルス遺伝子、第1ウイルスRNAもしくは第1ウイルス遺伝子、または第2ウイルスRNAもしくは第2ウイルス遺伝子の配列に特異的な加水分解プローブの使用を含む、態様1〜47のいずれか一つの方法。
49.
第1ウイルス遺伝子の配列に特異的な加水分解プローブが、SEQ ID NO: 6に記載の配列を含む、態様48の方法。
50.
第1ウイルス遺伝子の配列に特異的な加水分解プローブが、SEQ ID NO: 18、21、または24に記載の配列を含む、態様49の方法。
51.
評価、決定、または検出する工程が、ウイルスRNA、第2ウイルスRNA、第1ウイルスRNA、および/または第2ウイルス遺伝子のうちの1つまたは複数の配列に特異的な加水分解プローブを使用することを含む、態様1〜50のいずれか一つの方法。
52.
加水分解プローブが、SEQ ID NO: 6に記載の配列を含む、態様51の方法。
53.
第1ウイルス遺伝子の配列に特異的な加水分解プローブが、SEQ ID NO: 18、21、または24に記載の配列を含む、態様51の方法。
54.
試験サンプルまたは生物学的サンプル中の、対照遺伝子をコードするRNAのレベル、またはこれを示すかもしくはこれと相関するパラメータのレベルを、試験サンプル中で評価する工程をさらに含み、
任意で、対照遺伝子がβ-アクチンであるかまたはこれを含み、かつ/あるいは
任意で、パラメータまたは対照遺伝子のレベルが、対照遺伝子の配列に対して特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して評価され、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーは個々に、SEQ ID NO: 1または2または8〜15のうちの1つに記載の1つまたは複数の配列を任意で含み、
任意で、該レベルが、対照遺伝子の配列に特異的な加水分解プローブを使用して評価され、該加水分解プローブは、SEQ ID NO: 3、9、12、または15に記載の配列を任意で含む、
態様1〜53のいずれか一つの方法。
55.
評価または決定する工程が、多重反応を行うことを含み、任意で、レベル、第1レベル、および/または第2レベル、ならびに、任意で、対照遺伝子を示すかまたはこれと相関するレベルまたはパラメータが、多重反応において評価される、態様1〜54のいずれか一つの方法。
56.
パラメータ、第1パラメータ、および/または第2パラメータが、個々に、
ウイルスRNA(または第1もしくは第2ウイルスRNA)の、またはそれから発現される産物の、またはRNAに対応するウイルス遺伝子から発現される産物の、任意で相対コピー数または相対重量である量または相対量であるかまたはこれらを含み、あるいは、
ウイルスRNA(または第1もしくは第2ウイルスRNA)の、またはそれから発現される産物の、またはRNA(または第1もしくはウイルスRNA)に対応するウイルス遺伝子から発現される産物の、濃度または相対濃度であるかまたはこれらを含む、
態様1〜55のいずれか一つの方法。
57.
量が絶対量または相対量である、態様56の方法。
58.
パラメータおよび/またはレベルが、サイクル閾値(Ct)値であるかまたはこれを含む、態様1〜57のいずれか一つの方法。
59.
試験サンプルについてのCT値が、参照Ctスコアである第1参照値を下回る場合、ウイルスRNAまたはその発現が、生物学的サンプル中または試験サンプル中に存在するかまたは存在するリスクがあると決定される、態様58の方法。
60.
生物学的サンプルおよび/または1つもしくは複数の細胞が、対象に由来する、態様1〜59のいずれか一つの方法。
61.
前記少なくとも1つの細胞が複数の細胞を含み、
該複数の細胞および/または前記生物学的サンプルが浮遊細胞を含み、
該複数の細胞および/または前記生物学的サンプルが白血球を含み、かつ/あるいは
該複数の細胞および/または前記生物学的サンプルがT細胞またはNK細胞を含む、
態様1〜60のいずれか一つの方法。
62.
第1試験サンプルおよび第2試験サンプルの一方または両方が個々に、生物学的サンプルもしくはその部分に起因するか、または、生物学的サンプルもしくはその部分に起因するRNAを含有する、態様15〜61のいずれか一つの方法。
63.
第1ウイルスRNAについて評価される試験サンプルおよび第2 RNAについて評価される試験サンプルが、同じであるか、または同じサンプルもしくは組成物の部分である、態様15〜61のいずれか一つの方法。
64.
前記複数の細胞が、未分画T細胞、単離CD8+ T細胞、または単離CD4+ T細胞を含む、態様61の方法。
65.
前記少なくとも1つの細胞がヒト細胞である、態様1〜64のいずれか一つの方法。
66.
受け入れ基準が、リアルタイムPCRの妥当性を評価するように設定される、態様29〜65のいずれか一つの方法。
67.
受け入れ基準が、90%〜110%または約90%〜約110%のパーセント効率を含む、態様66の方法。
68.
受け入れ基準が、約0.95、約0.96、約0.97、約0.99、もしくは約0.99であるR2値、または0.95、0.96、0.97、0.99、もしくは0.99より大きいR2値、または約0.95、約0.96、約0.97、約0.99、もしくは約0.99より大きいR2値を含む、態様66〜67のいずれか一つの方法。
69.
RNAの純度、完全性、および/または濃度を評価する工程をさらに含む、態様1〜68のいずれか一つの方法。
70.
SEQ ID NO: 1〜24または35〜41のいずれかに記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、プライマー。
71.
蛍光部分または標識をさらに含む、態様70のプライマー。
72.
態様70および/または態様71の1つまたは複数のプライマーを含む、キット。
73.
ヌクレアーゼフリー水、逆転写酵素、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、およびDNアーゼのうちの1つまたは複数をさらに含む、態様71のキット。
74.
試験サンプルが、生物学的サンプルであるかまたは生物学的サンプルの部分である、態様1〜73のいずれか一つの方法。
75.
前記方法が、試験サンプル中のウイルスRNAまたは第1および/もしくは第2ウイルスRNAを検出することができ、該サンプル中で、または試験サンプルもしくは生物学的サンプル中の1000万個の細胞当たり、少なくとも5個もしくは少なくとも10個もしくは少なくとも20個もしくは少なくとも50個もしくは少なくとも100個の細胞;かつ/または
前記方法が、試験サンプルおよび/または生物学的サンプル中の、僅か1.5 pg、1 pg、もしくは0.75 pg、もしくはそれ未満、または僅か約1.5 pg、約1 pg、もしくは約0.75 pg、もしくはそれ未満のウイルス標的である量の標的RNAを検出することができる、
態様1〜69および74のいずれか一つの方法。
76.
1つもしくは複数の細胞および/または生物学的サンプルがプロセスから収集され、
該プロセスにおいて、形質導入細胞が、細胞を増大させる条件下で、任意で、37℃または約37℃でかつ/または1つまたは複数の刺激剤の存在下で、培養されている、
態様1〜69、74、および75のいずれか一つの方法。
77.
形質導入細胞が、少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、もしくは14日間、または、2〜14日間、2〜10日間、4〜14日間、4〜10日間、もしくは7〜10日間、または約2〜14日間、約2〜10日間、約4〜14日間、約4〜10日間、もしくは約7〜10日間、培養されている、態様76の方法。
78.
(a)試験サンプル中のウイルスRNAのレベルを評価する工程
を含み、
試験サンプルが、異種核酸を含む少なくとも1つの細胞を含むサンプル由来のRNAを含み;かつ
ウイルスRNAのレベルが、試験サンプル中の複製可能ウイルスの存在、非存在、または量を示す、方法。
79.
(b)試験サンプル中のウイルスRNAのレベルを第1参照値と比較する工程;および
(c)複製可能ウイルスが試験サンプル中に存在するかどうかを決定する工程
をさらに含み、
ウイルスRNAの量が第1参照値を上回る場合、サンプルは複製可能ウイルス陽性と見なされる、態様78の方法。
80.
ウイルスRNAのレベルが第1参照値を下回る場合、試験サンプル細胞はRCR陰性と見なされる、態様79の方法。
81.
ウイルスRNAのレベルが検出不可能である場合、試験サンプルは複製可能ウイルス陰性と見なされる、態様78〜80のいずれか一つの方法。
82.
第1参照値が閾値レベルまたは最小検出可能レベルである、態様78〜81のいずれか一つの方法。
83.
第1参照値が陽性対照である、態様78〜82のいずれか一つの方法。
84.
ウイルスRNAのレベルが、ウイルスRNAの存在または非存在である、態様78〜83のいずれか一つの方法。
85.
ウイルスRNAが、第1ウイルス遺伝子をコードする核酸を含む、態様78〜84のいずれか一つの方法。
86.
異種核酸が異種遺伝子産物をコードする、態様78〜85のいずれか一つの方法。
87.
(a)試験サンプル中の第1ウイルス遺伝子をコードするウイルスRNAのレベルおよび第2ウイルス遺伝子をコードするウイルスRNAのレベルを評価する工程であって、ここで、試験サンプルが、異種遺伝子産物を含むウイルスベクター粒子で形質導入された少なくとも1つの細胞を含むサンプル由来のRNAを含み、ここで、第1および第2ウイルス遺伝子が同じではない、工程;
(b)試験サンプル中の第1および第2ウイルス遺伝子のレベルを、それぞれ、第1および第2参照値と比較する工程;ならびに
(c)複製可能ウイルスが試験サンプル中に存在するかどうかを決定する工程であって、ここで、第1および/または第2ウイルス遺伝子のレベルが、それぞれ、第1および/または第2参照値を上回る場合、試験サンプル細胞は複製可能ウイルス陽性と見なされる、工程
を含む、方法。
88.
第1ウイルス遺伝子がenv、gag、pol、またはrevである、態様85〜87のいずれか一つの方法。
89.
第2ウイルス遺伝子がenv、gag、pol、またはrevである、態様86または態様88の方法。
90.
(a)試験サンプルにおいて、第1ウイルス遺伝子をコードするウイルスRNAのレベルを評価し、ここで第1ウイルス遺伝子はenv遺伝子であり、そして、第2ウイルス遺伝子をコードするウイルスRNAのレベルを評価し、ここで第2ウイルス遺伝子はgag、pol、またはrev遺伝子より選択され、ここで、試験サンプルが、異種遺伝子産物を含むウイルスベクター粒子で形質導入された細胞を含むサンプル由来のRNAを含む、工程;
(b)試験サンプル中の第1および第2ウイルス遺伝子をコードするウイルスRNAのレベルを、それぞれ、第1および第2参照値と比較する工程;ならびに
(c)複製可能ウイルスが試験サンプル中に存在するかどうかを決定する工程であって、ここで、第1および/または第2ウイルス遺伝子のウイルスRNAのレベルが、それぞれ、第1および第2参照値を上回る場合、複製可能ウイルスは存在する、工程
を含む、方法。
91.
ウイルスRNAのレベルまたはウイルス遺伝子の発現を評価することが、サイクル閾値(Ct)値を計算することを含む、態様78〜90のいずれか一つの方法。
92.
Ctスコアが最大Ct値を上回る場合、ウイルスRNAのレベルまたはウイルス遺伝子の発現は第1参照値を下回る、態様91の方法。
以下の実施例は、説明の目的のためにのみ含まれ、本発明の範囲を限定するようには意図されない。
この実施例は、生物学的サンプル中の複製可能レトロウイルス(RCR)の現にあるもしくは潜在的な存在もしくはリスクおよび/またはウイルスRNAの存在、非存在、レベル、もしくは他の読み出しを示す、試験サンプル中の1つまたは複数のパラメータのレベルを評価するための例示的な方法を記載する。生物学的サンプルは、異種、外因性、および/または組換え核酸および/またはタンパク質のような、異種遺伝子産物の全部または一部をコードする異種核酸または核酸を含む細胞のような、少なくとも1つの細胞を通常含む。そのような細胞は、いくつかの局面において、形質導入によるような、通常、レトロウイルスベクター、レトロウイルスベクター粒子、またはレトロウイルスによってコードされるかつ/またはこれらの中に含有される、核酸または他の生体分子の導入へ供されたことがある。試験サンプルは通常、RNA、またはそれから生成される産物、例えばcDNAを含み、該RNAは、異種遺伝子産物を含むウイルスベクター粒子で形質導入が行われた細胞のような、生物学的サンプル中の細胞から単離されたかまたは細胞中に存在した。生物学的サンプル中の細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞であり得る。
実施例1に記載されるようなアッセイを行うために、アッセイを設計し、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)エンベロープ(env)をコードする遺伝子を検出した。GaLV envを標的として選択し、部分的に何故ならば、形質導入されたヒト細胞組成物中のその存在は、内因性のウイルス配列の存在ではなく、形質導入に基づく組換え事象を示すことができるためであった。
GaLV env配列およびヒトベータアクチン配列の断片を含有するように、陽性増殖対照プラスミドを作製し、RT-PCRにおける使用のための両方のプライマーおよびプローブセットについての鋳型を提供した。pActin-GaLVプラスミドの配列をSEQ ID NO:34に記載する。GaLV env配列の異なる領域にわたって増幅するように4つの候補プライマーおよびプローブセットを設計し、2つの候補プライマーおよびプローブセットもアクチン断片標的の周りに設計した。定量的逆転写酵素-PCR(RT-PCR)を、RTおよびTAQポリメラーゼの存在下で行った。RT-PCRに使用した増幅条件を表3に記載する。
最小限のDNA汚染を伴う高品質RNA鋳型の単離を得るために、異なる方法論を比較した。上述の通りに作製されたCMATサンプルから、RNAを単離した。RNA鋳型に由来するシグナルと汚染DNA鋳型に由来するシグナルとを区別するために、RT-PCRを逆転写酵素有り(+RT)および逆転写酵素無し(-RT)で(各場合においてTaqポリメラーゼの存在下で)行った。
GaLV env RT-PCRアッセイを、293Vec-GaLV細胞株またはpActin-GaLVプラスミド陽性対照から単離されたRNAに対して行った。GaLV envパッケージングエレメントをコードするプラスミドを使用して産生されたガンマレトロウイルスベクターで形質導入された、凍結保存された細胞組成物(CCC)から、RNAをまた得た。例示的な特異性、線形性、レンジマトリックス干渉(range matrix interference)、精度、ならびにサンプルおよびプラスミド対照安定性を含む、様々なパラメータをこの研究においてアッセイについて評価した。
例示的なデュアル標的法が、いくつかの態様において、形質導入細胞または他の細胞中の複製可能レトロウイルス(RCR)の非存在または存在を評価するために使用される。アッセイは、実質的に実施例1に記載される通りに行われ、ここで、評価される標的RNAは、GaLV env RNAおよびMMLV gag RNAを含み、各々は、それぞれのウイルスRNA-アクチンプラスミド標準の各々の使用と共に、試験サンプルにおいて評価され、その結果、同じ対照RNAが各アッセイにおいて使用され、これは、改善された対照を提供し得る。RCRのリスクは、いくつかの局面において、GaLV envおよびMMLV gag RNAの両方がサンプル中に存在するかまたは参照量を上回ると方法によって決定される場合にのみ、生物学的サンプルにおいて判定される。いくつかの局面において、RNAのうちの一方が存在するかまたは参照を上回るという決定には、サンプルを陰性と確認する前にさらなるアッセイが続く。
レトロウイルスベクターで形質導入されそしてプロセシングされたT細胞を、RCR関連RNAの非存在を確認する方法によって評価した。サンプルを調製し、RT-PCRベースのRCR検出方法を、実質的に実施例1に記載される通りに行った。簡潔には、形質導入細胞を含む生物学的サンプルから、三つ組でRNAを単離した。結果として生じたRNA含有試験サンプルを、A260/280測定を使用してRNA品質について分析し、分光光度計ならびに「逆転写酵素を含まない」対照PCRを使用して汚染DNAについて試験した。全てのサンプルが、機能的に99.999%純粋なRNAを有すると決定された。アッセイに使用されたRNA鋳型の線形性を、-GaLV細胞株由来の陽性対照RNA(GaLV envについて)および形質導入細胞のサンプル(アクチンについて)を使用して有効にした。
例示的なプロセスにおいて、異種遺伝子産物をコードするウイルスベクター粒子で形質導入することによって細胞を操作するためのプロダクト製造プロセスの全体にわたる複数の段階で、RCRについての試験を行う。細胞を操作するための例示的な方法において、白血球アフェレーシスを行い、末梢血単核細胞(PBMC)を採取し、細胞を洗浄し、そしてT細胞を免疫親和性ベースの富化によってさらに富化する。任意で、単離された細胞を、凍結保存し、その後、解凍する。細胞、例えば、解凍された細胞を、抗-CD3/-CD28ビーズの存在下で培養し、続いて、異種遺伝子産物(例えばキメラ抗原受容体(CAR))をコードするGaLV-シュードタイプ化レトロウイルスベクターで形質導入する。形質導入後、細胞を、最大10日間のような、ある期間の間の培養において増大させる。任意で、形質導入細胞を凍結保存によって凍結させる。増大および形質導入された細胞(これは任意で解凍される)を、対象への投与のためにさらに製剤化する。
実施例1、2および4に記載されるRT-PCRベースの方法を使用し、様々な数の感染単位で複製性野生型GaLVがスパイクされそしてインビトロプロセスへ供されたT細胞サンプルから取得された試験サンプル中のGaLVウイルスRNAの存在または非存在を検出した。3人の異なるヒト対象からのヒト末梢血単核細胞(PBMC)の白血球アフェレーシスからの免疫親和性ベースの富化によって、CD3+ T細胞を単離した。各対象由来の単離されたT細胞を、次いで凍結保存した。
VSV-Gシュードタイプ化複製可能レンチウイルス(RCL)中に存在するVSV-Gおよびrevへ、ならびにベータ-アクチン(ACTB)対照へ向けられた、プライマーおよび標識プローブを、表7に示されるように設計した。プローブをFAMまたはHEX-色素標識のいずれかで標識し、Iowaブラック非蛍光性クエンチャーでクエンチした。
Claims (77)
- (a)試験サンプル中のパラメータのレベルを決定する工程であって、パラメータまたはレベルが、生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在、非存在、または量もしくは濃度を示すかまたはこれらと(任意で正にもしくは逆に)相関し、生物学的サンプルが、異種核酸および/または異種タンパク質をコードする核酸を含有する少なくとも1つの細胞を含む、工程
を含む方法であって、
生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在、非存在、または量もしくは濃度が、生物学的サンプル中のまたは生物学的サンプルが起因するサンプル中の複製可能ウイルスの、存在もしくは非存在、またはリスクを示し;かつ/あるいは
ウイルスRNAが、複製可能ウイルスの複製能力に必要であるか、またはこれに必要である遺伝子産物もしくはその特異的に識別可能な部分をコードする、
方法。 - そのように決定された前記レベルに基づいて、生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在、非存在、濃度もしくは量、またはそのリスクを決定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
- (b)(a)で決定されたパラメータのレベルを、パラメータについての第1参照値と比較する工程
をさらに含む、請求項1または請求項2記載の方法。 - 前記比較が、生物学的サンプルまたはそれに起因するサンプル中のウイルスRNAの存在、非存在、濃度もしくは量、または前述のうちのいずれかのリスクを示す、請求項3記載の方法。
- 生物学的サンプルまたはその部分中の、ウイルスRNAの存在、非存在、または量もしくは濃度、または前述のうちのいずれかのリスクを決定する工程;ならびに/あるいは
複製可能ウイルスが、生物学的サンプルもしくはその部分中に存在する(または潜在的に存在するかもしくは存在する可能性が高い)または存在するリスクがあるかどうかを決定する工程
をさらに含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。 - (a)で決定されたパラメータのレベルが第1参照値であるかまたはこれを上回る場合、任意でその場合に限り、生物学的サンプルは、複製可能ウイルスの存在を有する、存在を潜在的に有する、または存在についてのリスクがある、かつ/または、ウイルスRNAの存在または少なくとも閾値量を有すると見なされ、任意で、パラメータのレベルは、生物学的サンプル中のRNAの量と正に相関し;かつ/あるいは
(a)で決定されたパラメータのレベルが第1参照値であるかまたはこれを下回る場合、任意でその場合に限り、生物学的サンプルは、複製可能ウイルスの存在を有する、または存在についてのリスクがある、かつ/または、ウイルスRNAの存在または少なくとも閾値量を有すると見なされ、任意でパラメータのレベルは、生物学的サンプル中のウイルスRNAの量と逆に相関し;(a)で決定されたパラメータのレベルが第1参照値を下回る場合、任意でその場合に限り、生物学的サンプルおよび/または少なくとも1つの細胞のうちの1つもしくは複数は、RCR陰性と見なされ、または複製可能ウイルスの存在を有さない、または存在についてのリスクがない、または存在を潜在的に含有しないと見なされ、任意でパラメータのレベルは、生物学的サンプル中のRNAの量と正に相関し;かつ/あるいは
(a)で決定されたパラメータのレベルが第1参照値を上回る場合、任意でその場合に限り、生物学的サンプルおよび/または少なくとも1つの細胞のうちの1つもしくは複数は、複製可能ウイルスの存在を有さないまたは存在についてのリスクがない、かつ/または、ウイルスRNAの存在または少なくとも閾値量を有さないと見なされ、任意でパラメータのレベルは、生物学的サンプル中のウイルスRNAの量と逆に相関する、
請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。 - 複製能に必要な別のウイルスRNAが生物学的サンプル中に存在するとたとえ決定されるとしても、生物学的サンプルが、陰性である、有さない、またはリスクがないとそのように見なされ;
生物学的サンプル中の複製能に必要な別のウイルスRNAの量と正に相関する第2パラメータの、第2参照値であるかまたはこれを上回るレベルが、試験サンプルまたは生物学的サンプルに起因するかもしくは生物学的サンプル由来の核酸を含有する第2の試験サンプル中で、たとえ検出されるかまたは検出されたことがあるとしても、生物学的サンプルが、陰性である、有さない、またはリスクがないとそのように見なされ;かつ/あるいは
複製能に必要な別のウイルスRNAの量と負に相関する第2パラメータの、第2参照値であるかまたはこれを下回るレベルが、試験サンプルまたは生物学的サンプルに起因するかもしくは生物学的サンプル由来の核酸を含有する別の試験サンプル中で、たとえ検出されるかまたは検出されたことがあるとしても、生物学的サンプルが、陰性である、有さない、またはリスクがないとそのように見なされる、
請求項4記載の方法。 - 生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在が決定される場合(任意でその場合に限り)、および/または、任意で閾値量であるかもしくはこれを上回るウイルスRNAの量が、生物学的サンプル中にあると決定される場合(任意でその場合に限り)、生物学的サンプルは、複製可能ウイルスの存在を有する、これを潜在的に有する、または存在についてのリスクがあると見なされ;
生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在が決定される場合(任意でその場合に限り)、および/または、任意で閾値量であるかもしくはこれを上回るウイルスRNAの量が、生物学的サンプル中にあると決定される場合(任意でその場合に限り)、生物学的サンプルは、複製可能ウイルスの存在を潜在的に有するまたは存在についてのリスクがあると見なされるが、リスクのさらなる表示なしでは、かつ/または、別のウイルスRNAを示す別のパラメータの評価なしでは、複製可能ウイルスの存在を含有するとは見なされず;かつ/あるいは
生物学的サンプル中のウイルスRNAの非存在が決定される場合、および/または、任意で閾値量であるかもしくはこれを下回るウイルスRNAの量(または僅かその量)が、生物学的サンプル中にあると決定される場合、任意で、ウイルスの複製能力に必要な別のRNAの存在が生物学的サンプル中に存在するとたとえ決定されるとしても、生物学的サンプルは、複製可能ウイルスの存在を有さない、存在を潜在的に有さない、かつ/または存在についてのリスクがないと見なされ;かつ/あるいは
パラメータおよび/またはウイルスRNAが、試験サンプル中で検出不可能であるかもしくは検出されない、かつ/または、生物学的サンプル中に存在すると決定されない場合、生物学的サンプルは複製可能ウイルス陰性と見なされる、
請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。 - 第1参照値が、閾値レベルまたはそれに対応する最小検出可能レベルもしくは読み出しである値、またはほぼこれらである値、またはこれらを僅かに上回る値であり;
第1参照値が、陽性対照サンプル中の、検出されたパラメータの値、および/または、RNAの量を示すパラメータの値であり;かつ/あるいは
パラメータのレベルが、生物学的サンプル中のウイルスRNAの存在または非存在を示し;かつ/あるいは
ウイルスRNAが、第1ウイルス遺伝子をコードする核酸を含み;かつ/あるいは
異種核酸が、異種遺伝子産物をコードする、
請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。 - 試験サンプルにおいて評価されるパラメータが、
ウイルスRNAの、またはそれから発現される産物の、またはRNAに対応するウイルス遺伝子から発現される産物の、任意で相対コピー数または相対重量である量または相対量であるかまたはこれらを含み、あるいは、
ウイルスRNAの、またはそれから発現される産物の、またはRNAに対応するウイルス遺伝子から発現される産物の、濃度または相対濃度であるかまたはこれらを含む、
請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。 - 量が絶対量または相対量である、請求項10記載の方法。
- パラメータおよび/またはレベルが、
任意でサイクル閾値(Ct)値であるサロゲートまたは相対値
であるかまたはこれらを含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。 - 試験サンプルについてのCT値が、参照Ctスコアである第1参照値を下回る場合、ウイルスRNAまたはその発現が、生物学的サンプル中または試験サンプル中に存在するかまたは存在するリスクがあると決定される、請求項12記載の方法。
- 試験サンプルが、生物学的サンプルもしくはその部分であるか、またはこれらに起因する、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
- (a)試験サンプル中の第1パラメータの第1レベルを決定または評価する工程であって、該第1レベルまたは第1パラメータが、第1ウイルスRNAの、および/または第1ウイルスRNAをコードする第1ウイルス遺伝子をコードする第1核酸の、生物学的サンプルにおける存在、非存在、量または濃度と(任意で正にもしくは逆に)相関する、工程;
(b)任意で同じまたは異なる試験サンプルである試験サンプル中の第2パラメータの第2レベルを決定または評価する工程であって、該第2レベルまたは第2パラメータが、第1ウイルスRNAとは異なる第2ウイルスRNAの、および/または該第2ウイルスRNAをコードする第2かつ異なるウイルス遺伝子をコードする第2核酸の、生物学的サンプルにおける存在、非存在、量または濃度と(任意で正にもしくは逆に)相関する、工程
を含む方法であって、
少なくとも1つの細胞が、異種核酸、異種遺伝子産物、および/もしくは異種タンパク質をコードする核酸を含有し、かつ/または、ウイルスベクターで形質導入されており;
生物学的サンプル中の、第1ウイルスRNAもしくは遺伝子または第2ウイルスRNAもしくは遺伝子の、存在、非存在、または量もしくは濃度、ならびに/または、第1および第2ウイルスRNAもしくは遺伝子の両方の存在、非存在、または量もしくは濃度は、生物学的サンプル中のまたは生物学的サンプルが起因するサンプル中の複製可能ウイルスの、存在もしくは非存在、またはリスクを示し;かつ/あるいは
第1ウイルスRNA、第2ウイルスRNA、ならびに/または第1および第2ウイルスRNAの両方が、複製可能ウイルスの複製能力に必要であるか、またはこれに必要である遺伝子産物もしくはその特異的に識別可能な部分をコードする、方法。 - そのように決定された前記レベルに基づいて、生物学的サンプル中の第1および/または第2ウイルスRNAまたは遺伝子産物の存在、非存在、濃度もしくは量、またはそれらのリスクを決定する工程
をさらに含む、請求項15または20記載の方法。 - (c)(a)および/または(b)で決定された第1および/または第2パラメータのレベルを第1および/または第2参照値と比較する工程であって、比較が、生物学的サンプルまたはそれに起因するサンプル中のウイルスRNAの存在、非存在、濃度もしくは量、または前述のうちのいずれかのリスクを任意で示す、工程
をさらに含む、請求項16記載の方法。 - (c)生物学的サンプルまたはその部分中の、第1ウイルスRNAまたは発現の存在、非存在、または量もしくは濃度、または前述のうちのいずれかのリスクを決定し、かつ/または、生物学的サンプルまたはその部分中の、第2ウイルスRNAまたは発現の存在、非存在、または量もしくは濃度、または前述のうちのいずれかのリスクを決定する工程;ならびに/あるいは
(d)任意で(c)での決定に基づいて、複製可能ウイルスが、生物学的サンプルもしくはその部分中に存在する(または潜在的に存在するかもしくは存在する可能性が高い)または存在するリスクがあるかどうかを決定する工程
をさらに含む、請求項15〜17および20のいずれか一項記載の方法。 - ウイルスRNAがenv、gag、pol、もしくはrev由来であり、かつ/または、第1ウイルスRNAがenv、gag、pol、もしくはrev由来であり、かつ/または、第1ウイルス遺伝子がenv、gag、pol、もしくはrevであり;かつ/あるいは
ウイルスRNAがenv、gag、pol、もしくはrev由来であり、かつ/または、第2ウイルスRNAがenv、gag、pol、もしくはrev由来であり、かつ/または、第2ウイルス遺伝子がenv、gag、pol、もしくはrevである、
請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。 - (a)生物学的サンプル中の第1ウイルスRNAの量または存在もしくは非存在を示すかまたはこれらと(任意で正にもしくは逆に)相関する、試験サンプル中の第1パラメータのレベルを評価し、かつ任意で同じまたは異なる試験サンプルである試験サンプル中の第2パラメータのレベルを評価する工程であって、第1ウイルスRNAが、env遺伝子である第1ウイルス遺伝子由来であり、第2ウイルスパラメータが、生物学的サンプル中の第2ウイルスRNAの存在、非存在、または量を示すかまたはこれらと(任意で正にもしくは逆に)相関し、第2ウイルスRNAが、gag、pol、およびrev遺伝子より選択される遺伝子由来であり、生物学的サンプルが、任意で異種遺伝子産物を含むウイルスベクター粒子で形質導入が行われた細胞を含み、かつ/または、異種遺伝子産物を有する細胞を含む、工程
を含む方法であって、
少なくとも1つの細胞が、異種核酸、異種遺伝子産物、および/もしくは異種タンパク質をコードする核酸を含有し、かつ/または、ウイルスベクターで形質導入されており;
生物学的サンプル中の、第1ウイルスRNAもしくは遺伝子または第2ウイルスRNAもしくは遺伝子の存在、非存在、または量もしくは濃度、ならびに/または、第1および第2ウイルスRNAもしくは遺伝子の両方の存在、非存在、または量もしくは濃度は、生物学的サンプル中のまたは生物学的サンプルが起因するサンプル中の複製可能ウイルスの、存在もしくは非存在、またはリスクを示し;かつ/または、
第1ウイルスRNA、第2ウイルスRNA、ならびに/または第1および第2ウイルスRNAの両方が、複製可能ウイルスの複製能力に必要であるか、またはこれに必要である遺伝子産物もしくはその特異的に識別可能な部分をコードする、方法。 - パラメータがウイルスRNAの存在または非存在である、請求項1〜20のいずれか一項記載の方法。
- 参照値、第1参照値、および/または第2参照値が、閾値レベルまたは最小検出可能レベルであるかまたはこれらに対応する、請求項1〜21のいずれか一項記載の方法。
- 参照値、第1参照値、および/または第2参照値が、陽性対照試験サンプル中のパラメータに対応するかまたはこれに関する値であり、該陽性対照試験サンプルが、既知量または既知濃度のウイルスRNA、第2ウイルスRNA、および/または第1ウイルスRNAを任意で含有する、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
- 前記方法が、生物学的サンプル中の第1および第2ウイルスRNAの存在または閾値量を上回る量を決定する場合、ならびに任意で、前記方法が、第1および第2 RNAの両方ではなく一方について存在または閾値量を上回る量を決定することはない場合、生物学的サンプルは、複製可能ウイルスを含有するかまたは含有するリスクがあるかまたは潜在的に含有すると見なされ;かつ/あるいは
前記方法が、生物学的サンプル中の第1ウイルスRNA、または第2ウイルスRNA、ならびに/または第1および第2ウイルスRNAの両方の、非存在、検出可能な量の非存在、または閾値量を下回る量を決定する場合、生物学的サンプルは、複製可能ウイルスについて陰性である、またはこれを含有しない、またはこれを含有するもしくは潜在的に含有するリスクがないと見なされる、
請求項15〜23のいずれか一項記載の方法。 - 第1および第2ウイルス遺伝子をコードするウイルスRNAのレベルが、試験サンプル中で検出不可能である、かつ/または、生物学的サンプル中に存在するともしくは閾値レベルを超えて存在すると決定されない場合、生物学的サンプルが複製可能ウイルス陰性と見なされる、請求項15〜24のいずれか一項記載の方法。
- 工程(a)の前に、生物学的サンプルもしくはそれ由来の部分または生物学的サンプルに起因するサンプルもしくはその部分から、RNAを単離する工程をさらに含み、
RNAが少なくとも1つの細胞のうちの1つまたは複数由来のRNAを含有する、
請求項1〜25のいずれか一項記載の方法。 - 複製可能ウイルスがレトロウイルスであるかまたはこれを含み、かつ/または、ウイルスRNAまたは第1および/もしくは第2ウイルスRNAがレトロウイルスによって発現される、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法。
- レトロウイルスがガンマレトロウイルスである、請求項27記載の方法。
- レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項27記載の方法。
- 生物学的サンプルがヒトまたは哺乳動物由来であり、かつ/または、1つまたは複数の細胞が、任意でヒトまたは哺乳動物細胞である初代細胞である、請求項1〜29のいずれか一項記載の方法。
- 1つもしくは複数の細胞および/または生物学的サンプルが、マスター・セル・バンク(MCB)、ワーキング・セル・バンク(WCB)、もしくは細胞株、またはそのサンプルに由来する、請求項1〜30のいずれか一項記載の方法。
- 少なくとも1つの細胞または生物学的サンプルが、凍結保存材料(CMAT)、凍結保存薬物製品(CDP)、もしくは自己細胞療法用の製剤化薬物製品(FDP)、またはそのサンプルであるかまたはこれらに由来する、請求項1〜30のいずれか一項記載の方法。
- 異種核酸または異種遺伝子産物が、組換え受容体、キメラ受容体、任意でキメラ抗原受容体、またはトランスジェニックT細胞受容体であるかまたはこれらをコードする、請求項1〜32のいずれか一項記載の方法。
- 決定または評価する工程が、ウイルスRNA、第1ウイルスRNAおよび/または第2ウイルスRNAの配列に特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して行われる、請求項1〜33のいずれか一項記載の方法。
- 第2ウイルス遺伝子をコードするウイルスRNAのレベルが、第2ウイルス遺伝子の配列に特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して評価される、請求項15〜34のいずれか一項記載の方法。
- ウイルスRNAのレベルが、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって評価される、請求項1〜35のいずれか一項記載の方法。
- 決定または評価する工程が、逆転写酵素定量的PCR(RT-qPCR)を行うことを含む、請求項1〜36のいずれか一項記載の方法。
- ウイルスRNAならびに/または第1および/もしくは第2ウイルスRNAならびに/またはウイルスRNAおよび/もしくは遺伝子が、レトロウイルスに由来する、請求項1〜37のいずれか一項記載の方法。
- ウイルスRNA、第1ウイルスRNA、および/もしくは第2ウイルスRNA(または前述のうちのいずれかをコードする遺伝子)が、ビリオン複製および/またはパッケージングに関与する遺伝子であるかまたはこれによってコードされる、請求項1〜38のいずれか一項記載の方法。
- ウイルスRNAならびに/または第1ウイルスRNAおよび/もしくは第2ウイルスRNA(または前述のうちの1つもしくは複数をコードする遺伝子)が、形質導入細胞に形質導入を行うために使用された移入ベクターによってコードされる遺伝子ではない、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。
- ウイルスRNA、第1ウイルスRNA、および/または第2ウイルスRNAが、ウイルス表面タンパク質、エンベロープタンパク質、群特異抗原、ウイルス由来ポリメラーゼ、ウイルス由来逆転写酵素、ウイルス由来調節エレメント、転写のトランスアクチベーター、または応答エレメントをコードする、請求項1〜40のいずれか一項記載の方法。
- gag遺伝子が、マウス白血病ウイルス(MMLV) gagおよびヒト免疫不全ウイルス(HIV) gagからなる群より選択される、請求項1〜41のいずれか一項記載の方法。
- env遺伝子が、GaLV envおよびVSVGより選択される、請求項1〜42のいずれか一項記載の方法。
- 第1ウイルス遺伝子の配列に特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO: 4〜5に記載の1つまたは複数の配列を含む、請求項34〜43のいずれか一項記載の方法。
- 第1ウイルス遺伝子の配列に特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO: 16〜24に記載の1つまたは複数の配列を含む、請求項34〜44のいずれか一項記載の方法。
- 第2ウイルス遺伝子の配列に特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO: 4〜5に記載の1つまたは複数の配列を含む、請求項34〜45のいずれか一項記載の方法。
- 第2ウイルス遺伝子の配列に特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーが、SEQ ID NO: 16〜24に記載の1つまたは複数の配列を含む、請求項34〜45のいずれか一項記載の方法。
- 評価または決定する工程が、ウイルスRNA、ウイルス遺伝子、第1ウイルスRNAもしくは第1ウイルス遺伝子、または第2ウイルスRNAもしくは第2ウイルス遺伝子の配列に特異的な加水分解プローブの使用を含む、請求項1〜47のいずれか一項記載の方法。
- 第1ウイルス遺伝子の配列に特異的な加水分解プローブが、SEQ ID NO: 6に記載の配列を含む、請求項48記載の方法。
- 第1ウイルス遺伝子の配列に特異的な加水分解プローブが、SEQ ID NO: 18、21、または24に記載の配列を含む、請求項49記載の方法。
- 評価、決定、または検出する工程が、ウイルスRNA、第2ウイルスRNA、第1ウイルスRNA、および/または第2ウイルス遺伝子のうちの1つまたは複数の配列に特異的な加水分解プローブを使用することを含む、請求項1〜50のいずれか一項記載の方法。
- 加水分解プローブが、SEQ ID NO: 6に記載の配列を含む、請求項51記載の方法。
- 第1ウイルス遺伝子の配列に特異的な加水分解プローブが、SEQ ID NO: 18、21、または24に記載の配列を含む、請求項51記載の方法。
- 試験サンプルまたは生物学的サンプル中の、対照遺伝子をコードするRNAのレベル、またはこれを示すかもしくはこれと相関するパラメータのレベルを、試験サンプル中で評価する工程をさらに含み、
任意で、対照遺伝子がβ-アクチンであるかまたはこれを含み、かつ/あるいは
任意で、パラメータまたは対照遺伝子のレベルが、対照遺伝子の配列に対して特異的な1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して評価され、該1つまたは複数のオリゴヌクレオチドプライマーは個々に、SEQ ID NO: 1または2または8〜15のうちの1つに記載の1つまたは複数の配列を任意で含み、
任意で、該レベルが、対照遺伝子の配列に特異的な加水分解プローブを使用して評価され、該加水分解プローブは、SEQ ID NO: 3、9、12、または15に記載の配列を任意で含む、
請求項1〜53のいずれか一項記載の方法。 - 評価または決定する工程が、多重反応を行うことを含み、任意で、レベル、第1レベル、および/または第2レベル、ならびに、任意で、対照遺伝子を示すかまたはこれと相関するレベルまたはパラメータが、多重反応において評価される、請求項1〜54のいずれか一項記載の方法。
- パラメータ、第1パラメータ、および/または第2パラメータが、個々に、
ウイルスRNA(または第1もしくは第2ウイルスRNA)の、またはそれから発現される産物の、またはRNAに対応するウイルス遺伝子から発現される産物の、任意で相対コピー数または相対重量である量または相対量であるかまたはこれらを含み、あるいは、
ウイルスRNA(または第1もしくは第2ウイルスRNA)の、またはそれから発現される産物の、またはRNA(または第1もしくはウイルスRNA)に対応するウイルス遺伝子から発現される産物の、濃度または相対濃度であるかまたはこれらを含む、
請求項1〜55のいずれか一項記載の方法。 - 量が絶対量または相対量である、請求項56記載の方法。
- パラメータおよび/またはレベルが、サイクル閾値(Ct)値であるかまたはこれを含む、請求項1〜57のいずれか一項記載の方法。
- 試験サンプルについてのCT値が、参照Ctスコアである第1参照値を下回る場合、ウイルスRNAまたはその発現が、生物学的サンプル中または試験サンプル中に存在するかまたは存在するリスクがあると決定される、請求項58記載の方法。
- 生物学的サンプルおよび/または1つもしくは複数の細胞が、対象に由来する、請求項1〜59のいずれか一項記載の方法。
- 前記少なくとも1つの細胞が複数の細胞を含み、
該複数の細胞および/または前記生物学的サンプルが浮遊細胞を含み、
該複数の細胞および/または前記生物学的サンプルが白血球を含み、かつ/あるいは
該複数の細胞および/または前記生物学的サンプルがT細胞またはNK細胞を含む、
請求項1〜60のいずれか一項記載の方法。 - 第1試験サンプルおよび第2試験サンプルの一方または両方が個々に、生物学的サンプルもしくはその部分に起因するか、または、生物学的サンプルもしくはその部分に起因するRNAを含有する、請求項15〜61のいずれか一項記載の方法。
- 第1ウイルスRNAについて評価される試験サンプルおよび第2 RNAについて評価される試験サンプルが、同じであるか、または同じサンプルもしくは組成物の部分である、請求項15〜61のいずれか一項記載の方法。
- 前記複数の細胞が、未分画T細胞、単離CD8+ T細胞、または単離CD4+ T細胞を含む、請求項61記載の方法。
- 前記少なくとも1つの細胞がヒト細胞である、請求項1〜64のいずれか一項記載の方法。
- 受け入れ基準が、リアルタイムPCRの妥当性を評価するように設定される、請求項29〜65のいずれか一項記載の方法。
- 受け入れ基準が、90%〜110%または約90%〜約110%のパーセント効率を含む、請求項66記載の方法。
- 受け入れ基準が、約0.95、約0.96、約0.97、約0.99、もしくは約0.99であるR2値、または0.95、0.96、0.97、0.99、もしくは0.99より大きいR2値、または約0.95、約0.96、約0.97、約0.99、もしくは約0.99より大きいR2値を含む、請求項66〜67のいずれか一項記載の方法。
- RNAの純度、完全性、および/または濃度を評価する工程をさらに含む、請求項1〜68のいずれか一項記載の方法。
- SEQ ID NO: 1〜24または35〜41のいずれかに記載の配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、プライマー。
- 蛍光部分または標識をさらに含む、請求項70記載のプライマー。
- 請求項70および/または請求項71に記載の1つまたは複数のプライマーを含む、キット。
- ヌクレアーゼフリー水、逆転写酵素、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、緩衝液、およびDNアーゼのうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項71記載のキット。
- 試験サンプルが、生物学的サンプルであるかまたは生物学的サンプルの部分である、請求項1〜73のいずれか一項記載の方法。
- 前記方法が、試験サンプル中のウイルスRNAまたは第1および/もしくは第2ウイルスRNAを検出することができ、該サンプル中で、または試験サンプルもしくは生物学的サンプル中の1000万個の細胞当たり、少なくとも5個もしくは少なくとも10個もしくは少なくとも20個もしくは少なくとも50個もしくは少なくとも100個の細胞;かつ/あるいは
前記方法が、試験サンプルおよび/または生物学的サンプル中の、僅か1.5 pg、1 pg、もしくは0.75 pg、もしくはそれ未満、または僅か約1.5 pg、約1 pg、もしくは約0.75 pg、もしくはそれ未満のウイルス標的である量の標的RNAを検出することができる、
請求項1〜69および74のいずれか一項記載の方法。 - 1つもしくは複数の細胞および/または生物学的サンプルがプロセスから収集され、
該プロセスにおいて、形質導入細胞が、細胞を増大させる条件下で、任意で、37℃または約37℃でかつ/または1つまたは複数の刺激剤の存在下で、培養されている、
請求項1〜69、74、および75のいずれか一項記載の方法。 - 形質導入細胞が、少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、もしくは14日間、または、2〜14日間、2〜10日間、4〜14日間、4〜10日間、もしくは7〜10日間、または約2〜14日間、約2〜10日間、約4〜14日間、約4〜10日間、もしくは約7〜10日間、培養されている、請求項76記載の方法。
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