JP2000342274A - Ｈｉｖ−１およびｈｉｖ−２の効率的検出のためのオリゴヌクレオチド逆転写プライマー並びにそれの使用方法 - Google Patents
Ｈｉｖ−１およびｈｉｖ−２の効率的検出のためのオリゴヌクレオチド逆転写プライマー並びにそれの使用方法Info
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- JP2000342274A JP2000342274A JP2000025419A JP2000025419A JP2000342274A JP 2000342274 A JP2000342274 A JP 2000342274A JP 2000025419 A JP2000025419 A JP 2000025419A JP 2000025419 A JP2000025419 A JP 2000025419A JP 2000342274 A JP2000342274 A JP 2000342274A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】生物学的試料中の核酸配列、特に感染性微生物
に由来する配列の改良検出方法の提供。 【解決手段】ヒト被検者からの生物学的試料中のヒト免
疫不全ウイルスの検出方法及びそのためのキット。さら
にそのようなヒト免疫不全ウイルスの検出方法及びその
ためのキットに使われるオリゴヌクレオチド逆転写プラ
イマー。
に由来する配列の改良検出方法の提供。 【解決手段】ヒト被検者からの生物学的試料中のヒト免
疫不全ウイルスの検出方法及びそのためのキット。さら
にそのようなヒト免疫不全ウイルスの検出方法及びその
ためのキットに使われるオリゴヌクレオチド逆転写プラ
イマー。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、生物学的試料中の
核酸配列、特に感染性微生物に由来する配列の改良検出
方法に関する。
核酸配列、特に感染性微生物に由来する配列の改良検出
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は世界
中の何百万という人々に感染しており、従って深刻な社
会的健康問題の代表である。汚染された血液製剤を介し
たＨＩＶ感染の伝播は、患者試料中の少量のＨＩＶ Ｒ
ＮＡを検出することができるスクリーニング法が必要で
あることを意味する。更に、ＨＩＶ感染の改善療法の入
手可能性が増大してきていることは、適当な療法介入を
開始するために患者において感染の早期検出がきわめて
重大であることを意味する。
中の何百万という人々に感染しており、従って深刻な社
会的健康問題の代表である。汚染された血液製剤を介し
たＨＩＶ感染の伝播は、患者試料中の少量のＨＩＶ Ｒ
ＮＡを検出することができるスクリーニング法が必要で
あることを意味する。更に、ＨＩＶ感染の改善療法の入
手可能性が増大してきていることは、適当な療法介入を
開始するために患者において感染の早期検出がきわめて
重大であることを意味する。
【０００３】従って、診断とスクリーニングに利用する
ことができる、ＨＩＶについての高感度の検出方法が当
該技術分野で必要とされている。
ことができる、ＨＩＶについての高感度の検出方法が当
該技術分野で必要とされている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、生物学的試料
中のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＮＡを逆転写す
る方法であって、(a) オリゴヌクレオチドプライマーが
前記ＲＮＡの少なくとも一部分に相補的なＤＮＡの合成
を開始させるような条件下で、前記オリゴヌクレオチド
を前記試料から誘導したＲＮＡと接触させることを含ん
で成り、ここで前記オリゴヌクレオチドが (i) 5'-CTTGTATTACTACTG-3' 〔配列番号１〕、(ii)
5'-CCCTGTGGCGCC-3'〔配列番号２〕、(iii) 5'-GCGACTA
GGAGAGA-3'〔配列番号３〕、(iv) 5'-CCCAGACGGTCAGT-
3'〔配列番号４〕および(v) 前記のものの任意の組合
せから成る群より選ばれることを特徴とする方法を提供
する。
中のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＮＡを逆転写す
る方法であって、(a) オリゴヌクレオチドプライマーが
前記ＲＮＡの少なくとも一部分に相補的なＤＮＡの合成
を開始させるような条件下で、前記オリゴヌクレオチド
を前記試料から誘導したＲＮＡと接触させることを含ん
で成り、ここで前記オリゴヌクレオチドが (i) 5'-CTTGTATTACTACTG-3' 〔配列番号１〕、(ii)
5'-CCCTGTGGCGCC-3'〔配列番号２〕、(iii) 5'-GCGACTA
GGAGAGA-3'〔配列番号３〕、(iv) 5'-CCCAGACGGTCAGT-
3'〔配列番号４〕および(v) 前記のものの任意の組合
せから成る群より選ばれることを特徴とする方法を提供
する。
【０００５】別の面によれば、本発明は、生物学的試料
中のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＮＡの存在の検
出方法であって、 (a) 前記試料から誘導したＲＮＡを鋳型として使用しそ
して前記ＲＮＡ中に含まれるヌクレオチド配列に相補的
なオリゴヌクレオチドを逆転写プライマーとして使用し
て逆転写反応を行うことにより、ＨＩＶ特異的逆転写生
成物を生成させ、ここで前記逆転写プライマーは (i) 5'-CTTGTATTACTACTG-3' 〔配列番号１〕 (ii) 5'-CCCTGTGGCGCC-3'〔配列番号２〕、(iii) 5'-G
CGACTAGGAGAGA-3'〔配列番号３〕、(iv) 5'-CCCAGACGG
TCAGT-3'〔配列番号４〕および(v) 前記のものの任意
の組合せから成る群より選ばれ； (b) 前記逆転写生成物を増幅させることにより増幅生成
物を生成させ；そして (c) 前記増幅生成物を検出することを含んで成り、前記
増幅生成物の検出が前記試料中のＨＩＶ ＲＮＡの存在
を示す方法を提供する。
中のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＮＡの存在の検
出方法であって、 (a) 前記試料から誘導したＲＮＡを鋳型として使用しそ
して前記ＲＮＡ中に含まれるヌクレオチド配列に相補的
なオリゴヌクレオチドを逆転写プライマーとして使用し
て逆転写反応を行うことにより、ＨＩＶ特異的逆転写生
成物を生成させ、ここで前記逆転写プライマーは (i) 5'-CTTGTATTACTACTG-3' 〔配列番号１〕 (ii) 5'-CCCTGTGGCGCC-3'〔配列番号２〕、(iii) 5'-G
CGACTAGGAGAGA-3'〔配列番号３〕、(iv) 5'-CCCAGACGG
TCAGT-3'〔配列番号４〕および(v) 前記のものの任意
の組合せから成る群より選ばれ； (b) 前記逆転写生成物を増幅させることにより増幅生成
物を生成させ；そして (c) 前記増幅生成物を検出することを含んで成り、前記
増幅生成物の検出が前記試料中のＨＩＶ ＲＮＡの存在
を示す方法を提供する。
【０００６】増幅は、どんな方法で行ってもよく、好ま
しくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うこと
ができる。本発明に従ったＨＩＶ特異的逆転写プライマ
ーの使用は、試料中の、好ましくは血漿中のＨＩＶ−１
および／またはＨＩＶ−２の高感度検出方法を提供す
る。
しくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行うこと
ができる。本発明に従ったＨＩＶ特異的逆転写プライマ
ーの使用は、試料中の、好ましくは血漿中のＨＩＶ−１
および／またはＨＩＶ−２の高感度検出方法を提供す
る。
【０００７】更に別の面によれば、本発明は、生物学的
試料中のＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２またはそれらの組合せ
の検出のためのキットであって、(a) 5'-CTTGTATTACTAC
TG-3' 〔配列番号１〕 (b) 5'-CCCTGTGGCGCC-3'〔配列番号２〕、(c) 5'-GCGAC
TAGGAGAGA-3'〔配列番号３〕、(d) 5'-CCCAGACGGTCAGT-
3'〔配列番号４〕および(e) 前記のものの任意の組合せ
から成る群より選ばれた逆転写プライマーを含んで成る
キットを提供する。このキットは、逆転写、増幅および
生成物検出のための試薬や使用説明書を更に含んでもよ
い。
試料中のＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２またはそれらの組合せ
の検出のためのキットであって、(a) 5'-CTTGTATTACTAC
TG-3' 〔配列番号１〕 (b) 5'-CCCTGTGGCGCC-3'〔配列番号２〕、(c) 5'-GCGAC
TAGGAGAGA-3'〔配列番号３〕、(d) 5'-CCCAGACGGTCAGT-
3'〔配列番号４〕および(e) 前記のものの任意の組合せ
から成る群より選ばれた逆転写プライマーを含んで成る
キットを提供する。このキットは、逆転写、増幅および
生成物検出のための試薬や使用説明書を更に含んでもよ
い。
【０００８】
【発明の実施態様】本発明者らは、ヒト免疫不全ウイル
ス（ＨＩＶ）ＲＮＡ中に存在する特定の配列に相補的な
配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして逆
転写反応に用いると、生物学的試料中のＨＩＶ ＲＮＡ
の検出がより一層効率的であることを発見した。好まし
くは、それらのプライマーの配列はＨＩＶ ＲＮＡの
３′末端付近の配列に相当する。
ス（ＨＩＶ）ＲＮＡ中に存在する特定の配列に相補的な
配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして逆
転写反応に用いると、生物学的試料中のＨＩＶ ＲＮＡ
の検出がより一層効率的であることを発見した。好まし
くは、それらのプライマーの配列はＨＩＶ ＲＮＡの
３′末端付近の配列に相当する。
【０００９】分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡおよ
びタンパク質生化学の多数の技術、例えばCurrent Prot
ocols in Molecular Biology, 第Ｉ，IIおよびIII 巻,
1997（F.M. Ausubel編）；Sambrook他, 1989, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual, 第２版，Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York ; DNA Cloning: A Practical Approach,第Ｉおよ
びII巻, 1985 (D.N. Glover 編) ; Oligonucleotide Sy
nthesis, 1984 (M.L. Gait編) ; Transcription and Tr
anslation, 1984 (Hames & Higgins編) ; A Practical
Guide to Molecular Cloning; 双書, Methods in Enzym
ology (Academic Press, Inc.) ; Protein Purificatio
n: Principles and Practice, 第２版（Springer-Verla
g, N.Y.）中に説明された技術を、本発明を実施する際
に使用する。
びタンパク質生化学の多数の技術、例えばCurrent Prot
ocols in Molecular Biology, 第Ｉ，IIおよびIII 巻,
1997（F.M. Ausubel編）；Sambrook他, 1989, Molecula
r Cloning: A Laboratory Manual, 第２版，Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New
York ; DNA Cloning: A Practical Approach,第Ｉおよ
びII巻, 1985 (D.N. Glover 編) ; Oligonucleotide Sy
nthesis, 1984 (M.L. Gait編) ; Transcription and Tr
anslation, 1984 (Hames & Higgins編) ; A Practical
Guide to Molecular Cloning; 双書, Methods in Enzym
ology (Academic Press, Inc.) ; Protein Purificatio
n: Principles and Practice, 第２版（Springer-Verla
g, N.Y.）中に説明された技術を、本発明を実施する際
に使用する。
【００１０】本明細書中で用いる「核酸」または「ポリ
ヌクレオチド」とは、ポリリボヌクレオチドかポリデオ
キシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのプリ
ンおよびピリミジン含有ポリマーを言う。これには一本
鎖および二本鎖分子、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮＡ−
ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、並びにアミ
ノ酸主鎖に塩基を結合することにより形成された「タン
パク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これには修飾塩基
を含有する核酸も含まれる。
ヌクレオチド」とは、ポリリボヌクレオチドかポリデオ
キシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのプリ
ンおよびピリミジン含有ポリマーを言う。これには一本
鎖および二本鎖分子、例えばＤＮＡ−ＤＮＡ，ＤＮＡ−
ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、並びにアミ
ノ酸主鎖に塩基を結合することにより形成された「タン
パク質核酸」（ＰＮＡ）が含まれる。これには修飾塩基
を含有する核酸も含まれる。
【００１１】本明細書中で用いる核酸配列の「相補体」
とは、元の配列と共にワトソン−クリック塩基対合に参
加するアンチセンス配列を言う。
とは、元の配列と共にワトソン−クリック塩基対合に参
加するアンチセンス配列を言う。
【００１２】本明細書中で用いる「プライマー」は、着
目の一本鎖核酸配列と共に二本鎖を形成しそして例えば
逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼを使って相補鎖の
重合を可能にする、長さ約５〜約50ヌクレオチド、好ま
しくは長さ約６〜約25ヌクレオチド、最も好ましくは約
６〜約18ヌクレオチドの単離されたオリゴヌクレオチド
である。
目の一本鎖核酸配列と共に二本鎖を形成しそして例えば
逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼを使って相補鎖の
重合を可能にする、長さ約５〜約50ヌクレオチド、好ま
しくは長さ約６〜約25ヌクレオチド、最も好ましくは約
６〜約18ヌクレオチドの単離されたオリゴヌクレオチド
である。
【００１３】本明細書中で用いる「単離された」核酸と
は、それの元の環境（例えば、それが天然に存在する混
合物であるならそれの天然の環境、それが合成物である
なら反応混合物）から分離されている成分を言う。単離
された核酸は、典型的には、最初にそれと関連していた
成分の約50％未満、好ましくは約75％未満、そして最も
好ましくは約90％未満を含有する。
は、それの元の環境（例えば、それが天然に存在する混
合物であるならそれの天然の環境、それが合成物である
なら反応混合物）から分離されている成分を言う。単離
された核酸は、典型的には、最初にそれと関連していた
成分の約50％未満、好ましくは約75％未満、そして最も
好ましくは約90％未満を含有する。
【００１４】指摘した配列「から誘導された」核酸配列
とは、その指摘した配列の一領域に相当する配列を言
う。これには、その配列に相同であるかまたは相補的で
ある配列も含まれる。
とは、その指摘した配列の一領域に相当する配列を言
う。これには、その配列に相同であるかまたは相補的で
ある配列も含まれる。
【００１５】内部陽性対照（＝ＩＰＣ）標的核酸とは、
典型的には制限エンドヌクレアーゼの作用により後で直
鎖状にされるプラスミドベクター中にクローニングされ
た合成核酸配列を指して言う。ＩＰＣは、典型的には一
般的なプローブ結合領域を取り囲む複数のプライマー結
合配列を有し、そして核酸増幅反応において偽陽性結果
に対する包括的な対照として働く。
典型的には制限エンドヌクレアーゼの作用により後で直
鎖状にされるプラスミドベクター中にクローニングされ
た合成核酸配列を指して言う。ＩＰＣは、典型的には一
般的なプローブ結合領域を取り囲む複数のプライマー結
合配列を有し、そして核酸増幅反応において偽陽性結果
に対する包括的な対照として働く。
【００１６】好ましいＩＰＣ標的ＤＮＡの配列は下記の
ものである： 5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACAT
CATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAG
TGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATC
GTG-3'〔配列番号５〕。
ものである： 5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACAT
CATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAG
TGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATC
GTG-3'〔配列番号５〕。
【００１７】本明細書中で用いる、逆転写に適した条
件、即ち、オリゴヌクレオチドがｃＤＮＡ合成を開始さ
せるような条件は、ｃＤＮＡの合成をもたらす温度と時
間でのＲＮＡおよびプライマーオリゴヌクレオチドと逆
転写酵素およびヌクレオチドとのインキュベーションを
包含する。
件、即ち、オリゴヌクレオチドがｃＤＮＡ合成を開始さ
せるような条件は、ｃＤＮＡの合成をもたらす温度と時
間でのＲＮＡおよびプライマーオリゴヌクレオチドと逆
転写酵素およびヌクレオチドとのインキュベーションを
包含する。
【００１８】本明細書中に開示するいずれかの配列また
はそれの部分配列を含んで成る核酸は、常法により調製
することができる。例えば、Matteucci 他, 1981, J. A
m. Chem. Soc. 103:3185のホスホロアミダイト固体支持
体法、Yoo 他, 1989, J. Biol. Chem. 764:17078の方
法、または他の周知の方法を使って、ＤＮＡを化学合成
することができる。当該技術分野で既知である多数の手
段により核酸を修飾することもできる。そのような修飾
の非限定例としては、メチル化、「キャップ付加」、類
似体による１もしくは複数の天然ヌクレオチドの置換、
ヌクレオチド間修飾、例えば無電荷結合（例えばメチル
ホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデー
ト、カルバメートなど）もしくは荷電結合（例えばホス
ホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）が挙げら
れる。核酸は１または複数の追加の共有結合した成分、
例えば、タンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗
体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、挿入
剤（例えばアクリジン、プソラレンなど）、キレート化
剤（例えば金属、放射性金属、鉄、被酸化性金属など）
およびアルキル化剤を含んでもよい。「核酸」なる用語
にはＰＮＡも含まれる。核酸は、メチルもしくはエチル
ホスホトリエステルまたはアルキルホスホロアミデート
結合の形成により誘導体にすることができる。更に、本
発明の核酸配列は、直接または間接的に検出可能なシグ
ナルを提供することができる標識により修飾されてもよ
い。典型的な標識としては、放射性同位体、蛍光分子、
ビオチンなどが挙げられる。
はそれの部分配列を含んで成る核酸は、常法により調製
することができる。例えば、Matteucci 他, 1981, J. A
m. Chem. Soc. 103:3185のホスホロアミダイト固体支持
体法、Yoo 他, 1989, J. Biol. Chem. 764:17078の方
法、または他の周知の方法を使って、ＤＮＡを化学合成
することができる。当該技術分野で既知である多数の手
段により核酸を修飾することもできる。そのような修飾
の非限定例としては、メチル化、「キャップ付加」、類
似体による１もしくは複数の天然ヌクレオチドの置換、
ヌクレオチド間修飾、例えば無電荷結合（例えばメチル
ホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデー
ト、カルバメートなど）もしくは荷電結合（例えばホス
ホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）が挙げら
れる。核酸は１または複数の追加の共有結合した成分、
例えば、タンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗
体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）、挿入
剤（例えばアクリジン、プソラレンなど）、キレート化
剤（例えば金属、放射性金属、鉄、被酸化性金属など）
およびアルキル化剤を含んでもよい。「核酸」なる用語
にはＰＮＡも含まれる。核酸は、メチルもしくはエチル
ホスホトリエステルまたはアルキルホスホロアミデート
結合の形成により誘導体にすることができる。更に、本
発明の核酸配列は、直接または間接的に検出可能なシグ
ナルを提供することができる標識により修飾されてもよ
い。典型的な標識としては、放射性同位体、蛍光分子、
ビオチンなどが挙げられる。
【００１９】本明細書中で用いる「増幅」とは核酸がコ
ピーされる相互作用工程を指して言う。適当な増幅方法
としては、非限定的に、ポリメラーゼ連鎖反応、リガー
ゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸一塩基増幅、および転写
媒介増幅が挙げられる。
ピーされる相互作用工程を指して言う。適当な増幅方法
としては、非限定的に、ポリメラーゼ連鎖反応、リガー
ゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸一塩基増幅、および転写
媒介増幅が挙げられる。
【００２０】本明細書中で用いる「ヒト免疫不全ウイル
ス（ＨＩＶ）」は、レトロウイルス属の種を指し、ＨＩ
Ｖ−１，ＨＩＶ−２，ＳＩＶおよびそれらの変異株を包
含する。本発明により検出可能であるＨＩＶの分離株と
してはＨＩＶ−１とＨＩＶ−２が挙げられるが、それら
の限定されない。
ス（ＨＩＶ）」は、レトロウイルス属の種を指し、ＨＩ
Ｖ−１，ＨＩＶ−２，ＳＩＶおよびそれらの変異株を包
含する。本発明により検出可能であるＨＩＶの分離株と
してはＨＩＶ−１とＨＩＶ−２が挙げられるが、それら
の限定されない。
【００２１】本発明は生物学的試料からのＨＩＶ ＲＮ
Ａの逆転写方法を提供する。この方法は、生物学的試料
中のＨＩＶのＨＩＶの検出に有用である。ＨＩＶ特異的
増幅生成物の検出が前記試料中のＨＩＶ ＲＮＡの存在
を示す。
Ａの逆転写方法を提供する。この方法は、生物学的試料
中のＨＩＶのＨＩＶの検出に有用である。ＨＩＶ特異的
増幅生成物の検出が前記試料中のＨＩＶ ＲＮＡの存在
を示す。
【００２２】本発明によれば、任意の常法により患者か
ら生物学的試料が得られる。適当な生物学的試料として
は、非限定的に、血液、血清、血漿、尿、母乳、組織試
料および脳脊髄液が挙げられる。好ましくは、血漿がウ
イルスＲＮＡの入手源として使われる。
ら生物学的試料が得られる。適当な生物学的試料として
は、非限定的に、血液、血清、血漿、尿、母乳、組織試
料および脳脊髄液が挙げられる。好ましくは、血漿がウ
イルスＲＮＡの入手源として使われる。
【００２３】生物学的試料は、試料中に含まれるＲＮ
Ａ、特にウイルスＲＮＡに対する逆転写試薬の接近を与
えるようなやり方で処理する。生物学的試料「から誘導
された」ＲＮＡは、最初は試料中に存在していたもので
且つ試料を処理することによってそのＲＮＡへの接近が
増大された任意のＲＮＡである。好ましくは、当該技術
分野で周知の方法、例えばチオシアン酸グアニジウムを
使用する方法、またはGentra Systems, Inc. (Minneapo
lis MN) からのPureScriptTMのような市販の試薬と方法
を使う方法を用いて、試料からＲＮＡを抽出する。ＲＮ
アーゼからのＲＮＡ、別のタンパク質および／または逆
転写反応を妨害する可能性のある他の成分からの分離を
もたらすいずれの抽出方法を使ってもよい。
Ａ、特にウイルスＲＮＡに対する逆転写試薬の接近を与
えるようなやり方で処理する。生物学的試料「から誘導
された」ＲＮＡは、最初は試料中に存在していたもので
且つ試料を処理することによってそのＲＮＡへの接近が
増大された任意のＲＮＡである。好ましくは、当該技術
分野で周知の方法、例えばチオシアン酸グアニジウムを
使用する方法、またはGentra Systems, Inc. (Minneapo
lis MN) からのPureScriptTMのような市販の試薬と方法
を使う方法を用いて、試料からＲＮＡを抽出する。ＲＮ
アーゼからのＲＮＡ、別のタンパク質および／または逆
転写反応を妨害する可能性のある他の成分からの分離を
もたらすいずれの抽出方法を使ってもよい。
【００２４】次いで、試料から抽出されたＲＮＡを、オ
リゴヌクレオチドプライマーが前記抽出されたＲＮＡの
少なくとも一部分に相補的なＤＮＡの合成を開始させる
ような条件下で、前記オリゴヌクレオチドプライマーと
接触させる。オリゴヌクレオチドプライマーの配列はＨ
ＩＶの配列に由来する。それらのプライマーはＨＩＶＲ
ＮＡの一領域に相当するが、その領域は検出が所望され
る領域より下流、即ち３′側であってもよい。それらの
領域としては、例えば、ＬＴＲ領域（long terminal re
gion）、ウイルス逆転写酵素(Pol) をコードする領域、
Gag タンパク質、Tat タンパク質、エンベロープ糖タン
パク質、Vif タンパク質、Vpr タンパク質およびVpu タ
ンパク質、並びに転写因子応答要素をコードするRev 領
域が挙げられる。好ましくは、プライマーはＨＩＶゲノ
ムの３′末端付近の配列に相当する。プライマー配列は
ＨＩＶの特定の分離株（例えばＨＩＶ−１およびＨＩＶ
−２の分離株）を具体的に同定するために使うことがで
きる。プライマーは、それが異なる分離株からのＲＮＡ
にはハイブリダイズしないような条件下で特定の分離株
に由来するＲＮＡにハイブリダイズすることにより特定
の分離株を同定してもよく、即ちプライマーそれ自体が
分離株間で異なる配列を含んでもよい。あるいは、プラ
イマー配列は分離株間で異なるＨＩＶ ＲＮＡの断片の
合成を開始させるのに使ってもよく、即ち、分離株間で
異なる配列がプライマー配列の下流にあってもよい。
リゴヌクレオチドプライマーが前記抽出されたＲＮＡの
少なくとも一部分に相補的なＤＮＡの合成を開始させる
ような条件下で、前記オリゴヌクレオチドプライマーと
接触させる。オリゴヌクレオチドプライマーの配列はＨ
ＩＶの配列に由来する。それらのプライマーはＨＩＶＲ
ＮＡの一領域に相当するが、その領域は検出が所望され
る領域より下流、即ち３′側であってもよい。それらの
領域としては、例えば、ＬＴＲ領域（long terminal re
gion）、ウイルス逆転写酵素(Pol) をコードする領域、
Gag タンパク質、Tat タンパク質、エンベロープ糖タン
パク質、Vif タンパク質、Vpr タンパク質およびVpu タ
ンパク質、並びに転写因子応答要素をコードするRev 領
域が挙げられる。好ましくは、プライマーはＨＩＶゲノ
ムの３′末端付近の配列に相当する。プライマー配列は
ＨＩＶの特定の分離株（例えばＨＩＶ−１およびＨＩＶ
−２の分離株）を具体的に同定するために使うことがで
きる。プライマーは、それが異なる分離株からのＲＮＡ
にはハイブリダイズしないような条件下で特定の分離株
に由来するＲＮＡにハイブリダイズすることにより特定
の分離株を同定してもよく、即ちプライマーそれ自体が
分離株間で異なる配列を含んでもよい。あるいは、プラ
イマー配列は分離株間で異なるＨＩＶ ＲＮＡの断片の
合成を開始させるのに使ってもよく、即ち、分離株間で
異なる配列がプライマー配列の下流にあってもよい。
【００２５】本発明の実施に際して有用な逆転写プライ
マーは、配列保存、分子内および分子間相互作用、並び
にアンプリコンおよび隣接配列の推定上の二次構造の理
論的考察に基づいて選択される。更に、本発明のプライ
マーおよびアッセイ系は、ＨＩＶゲノムの多領域、多ウ
イルス種および内部陽性対照（ＩＰＣ）ＲＮＡ（または
ＤＮＡ）の同時増幅（および同時検出）を可能にするよ
うにデザインされる。本発明の逆転写プライマーの非限
定例を、下の第１表に示す。
マーは、配列保存、分子内および分子間相互作用、並び
にアンプリコンおよび隣接配列の推定上の二次構造の理
論的考察に基づいて選択される。更に、本発明のプライ
マーおよびアッセイ系は、ＨＩＶゲノムの多領域、多ウ
イルス種および内部陽性対照（ＩＰＣ）ＲＮＡ（または
ＤＮＡ）の同時増幅（および同時検出）を可能にするよ
うにデザインされる。本発明の逆転写プライマーの非限
定例を、下の第１表に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】逆転写は上記プライマーの１つまたは複数
を使って行われる。ランダムプライマー、例えば、ラン
ダムヘキサマー逆転写プライマー（Ｎ６，Pharmacia Bi
otech, Piscataway, NJ ）を加えてもよい。逆転写は、
例えばCurrent Protocols inMolecular Biology, 第Ｉ,
IIおよびIII 巻, 1997 (F.M. Ausubel編) ; 米国特許
第5,322,770 号明細書 ; Young他, J. Clin. Microbio
l. 31(4):882 (1993) ;Myers他, Biochemistry 30(3):7
661 (1991)または同時係属米国特許出願第 号, 代理人書
類番号2094/0E287中に記載されたような、常用手段を使
って実施される。
を使って行われる。ランダムプライマー、例えば、ラン
ダムヘキサマー逆転写プライマー（Ｎ６，Pharmacia Bi
otech, Piscataway, NJ ）を加えてもよい。逆転写は、
例えばCurrent Protocols inMolecular Biology, 第Ｉ,
IIおよびIII 巻, 1997 (F.M. Ausubel編) ; 米国特許
第5,322,770 号明細書 ; Young他, J. Clin. Microbio
l. 31(4):882 (1993) ;Myers他, Biochemistry 30(3):7
661 (1991)または同時係属米国特許出願第 号, 代理人書
類番号2094/0E287中に記載されたような、常用手段を使
って実施される。
【００２８】逆転写反応の後、１または複数のｃＤＮＡ
生成物を常法により単離・回収することができる。好ま
しくは、１または複数のｃＤＮＡを増幅させる。任意の
増幅方法を使ってもよく、増幅方法の非限定例として
は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反
応、鎖置換反応、転写媒介増幅または核酸一塩基増幅が
挙げられる。好ましくはＰＣＲが使われる。典型的に
は、ＰＣＲに必要な全ての成分（ＨＩＶ特異的増幅プラ
イマーを含む）を含有する反応混合物に直接逆転写反応
混合物を添加する。次いで、使用するプライマー対によ
り特定される条件を使って増幅反応を実施する。適当な
増幅プライマー対は、例えば米国特許出願第 号，代理人
書類番号2094/0E285および下記の実施例中に開示されて
いる。
生成物を常法により単離・回収することができる。好ま
しくは、１または複数のｃＤＮＡを増幅させる。任意の
増幅方法を使ってもよく、増幅方法の非限定例として
は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反
応、鎖置換反応、転写媒介増幅または核酸一塩基増幅が
挙げられる。好ましくはＰＣＲが使われる。典型的に
は、ＰＣＲに必要な全ての成分（ＨＩＶ特異的増幅プラ
イマーを含む）を含有する反応混合物に直接逆転写反応
混合物を添加する。次いで、使用するプライマー対によ
り特定される条件を使って増幅反応を実施する。適当な
増幅プライマー対は、例えば米国特許出願第 号，代理人
書類番号2094/0E285および下記の実施例中に開示されて
いる。
【００２９】増幅後、任意の方法を使って増幅生成物を
検出することができ、そのような方法としては、非限定
的に、アガロースまたはアクリルアミド中での電気泳
動；固体支持体上への増幅生成物の捕捉とそれに続く比
色検出法（例えば下記の実施例１を参照のこと）；ＥＣ
ｉ検出法；蛍光検出法、放射性同位体標識検出法および
化学発光法が挙げられる。そのような検出方法のための
試薬は、例えば、Molecular Probes, Eugene, Oregonお
よびOrtho-Clinical Diagnostics, Rochester, NY から
市販されている。
検出することができ、そのような方法としては、非限定
的に、アガロースまたはアクリルアミド中での電気泳
動；固体支持体上への増幅生成物の捕捉とそれに続く比
色検出法（例えば下記の実施例１を参照のこと）；ＥＣ
ｉ検出法；蛍光検出法、放射性同位体標識検出法および
化学発光法が挙げられる。そのような検出方法のための
試薬は、例えば、Molecular Probes, Eugene, Oregonお
よびOrtho-Clinical Diagnostics, Rochester, NY から
市販されている。
【００３０】ＨＩＶ特異的増幅生成物の検出は、試料中
にＨＩＶ ＲＮＡが存在することを示す。ゲル電気泳動
を用いる場合、ＨＩＶ特異的増幅生成物は、反応に使用
した増幅プライマーに対応する配列のＨＩＶ ＲＮＡ中
の位置により推測されるようなそれらのサイズによって
確認される。
にＨＩＶ ＲＮＡが存在することを示す。ゲル電気泳動
を用いる場合、ＨＩＶ特異的増幅生成物は、反応に使用
した増幅プライマーに対応する配列のＨＩＶ ＲＮＡ中
の位置により推測されるようなそれらのサイズによって
確認される。
【００３１】本発明は、上記第１表に示した１または複
数の逆転写プライマーを含んで成る、生物学的試料中の
ＨＩＶ ＲＮＡの検出用のキットを提供する。このキッ
トは、逆転写用の試薬に加えて、例えばＰＣＲによる、
ＨＩＶ ｃＤＮＡの検出のための追加の試薬を含んでも
よい。
数の逆転写プライマーを含んで成る、生物学的試料中の
ＨＩＶ ＲＮＡの検出用のキットを提供する。このキッ
トは、逆転写用の試薬に加えて、例えばＰＣＲによる、
ＨＩＶ ｃＤＮＡの検出のための追加の試薬を含んでも
よい。
【００３２】
【実施例】次の実施例は、非限定的に、本発明を説明す
る。方法 １．試料調製：血漿試料から、チオシアン酸グアジニウ
ムまたはPureScriptTMＲＮＡ単離試薬（Gentra System
s, Minneapolis MN）を使ってＲＮＡを調製した。体液
についての製造業者のプロトコルへの変更として、20 g
ではなく40 gのグリコーゲンをウイルスＲＮＡの沈澱に
役立つ担体として使用することを含んだ。更に、大部分
において、ＲＮＡのイソプロピルアルコール沈澱とエタ
ノールによるＲＮＡペレットの洗浄の後に、製造業者に
より与えられたＲＮＡハイブリダイゼーション溶液では
なく、ＲＴ緩衝液混合物中にＲＮＡペレットを再懸濁し
た。
る。方法 １．試料調製：血漿試料から、チオシアン酸グアジニウ
ムまたはPureScriptTMＲＮＡ単離試薬（Gentra System
s, Minneapolis MN）を使ってＲＮＡを調製した。体液
についての製造業者のプロトコルへの変更として、20 g
ではなく40 gのグリコーゲンをウイルスＲＮＡの沈澱に
役立つ担体として使用することを含んだ。更に、大部分
において、ＲＮＡのイソプロピルアルコール沈澱とエタ
ノールによるＲＮＡペレットの洗浄の後に、製造業者に
より与えられたＲＮＡハイブリダイゼーション溶液では
なく、ＲＴ緩衝液混合物中にＲＮＡペレットを再懸濁し
た。
【００３３】２．逆転写：ジエチルピロカルボネート
（DEPC）で処理した水の中に50 mM Tris-HCl (pH 8.3),
75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.4 mM 各dNTP
(Pharmacia Biotech), 4 M のランダムヘキサマー（Pha
rmacia Biotech, Piscataway, NJ ）および／または特
異的逆転写プライマー並びに20単位のRNasin（Promega,
Madison, Wisoconsin）を含有する溶液 50 Ｌ中の100
Ｕの組換えモロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV）逆転
写酵素（ＲＴ）（Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland
）を添加することにより、ＲＮＡからのｃＤＮＡの合
成を触媒した。42℃で30分間のインキュベーション後、
ＲＴ反応液を100 ℃に５分間維持してＲＴ活性を破壊し
た。各反応液を１分間冷却した後、16000 ×ｇで４秒間
超遠心した。
（DEPC）で処理した水の中に50 mM Tris-HCl (pH 8.3),
75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.4 mM 各dNTP
(Pharmacia Biotech), 4 M のランダムヘキサマー（Pha
rmacia Biotech, Piscataway, NJ ）および／または特
異的逆転写プライマー並びに20単位のRNasin（Promega,
Madison, Wisoconsin）を含有する溶液 50 Ｌ中の100
Ｕの組換えモロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV）逆転
写酵素（ＲＴ）（Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland
）を添加することにより、ＲＮＡからのｃＤＮＡの合
成を触媒した。42℃で30分間のインキュベーション後、
ＲＴ反応液を100 ℃に５分間維持してＲＴ活性を破壊し
た。各反応液を１分間冷却した後、16000 ×ｇで４秒間
超遠心した。
【００３４】３．ＰＣＲ増幅：ＰＣＲは、25 mM Tris-H
Cl, 3 mM MgCl2, 0.725 mM EDTA, 54 mM KCl, 3.72 mM
NaCl, 40 M DTT, 108 g/mlのゼラチン（IV型）, 9.5 ％
グリセロール, 0.02％Tween 20, 0.02％NP40, 子ウシ胸
腺ＤＮＡ(2 g), 1.2 mM の各dNTP, 0.4 M の各プライマ
ー, 10コピーの線状化した内部陽性対照（ＩＰＣ）プラ
スミドＤＮＡおよび16ＵのTaq ポリメラーゼを含む溶液
100 Ｌ中でPE9600サーモサイクラー（Perkin-Elmer）中
で行った。Taq に対するモノクローナル抗体 TP1-12 と
TP4-9 （それらの調製は米国特許第5,338,671 号明細書
に開示されている）をそれぞれ50：１と５：１のモル比
で反応液に添加して、Taq ポリメラーゼに対する抗体の
モル比55：１を提供した。96℃で３分間の最初の変性の
後、96℃で５秒と68℃で40秒から成る40サイクルの増幅
を行った。サイクルの終了後、103 ℃で５分間の最終加
熱段階を行ってTaq ポリメラーゼを失活させた。使用し
た増幅プライマーを下記の第２表に示す。
Cl, 3 mM MgCl2, 0.725 mM EDTA, 54 mM KCl, 3.72 mM
NaCl, 40 M DTT, 108 g/mlのゼラチン（IV型）, 9.5 ％
グリセロール, 0.02％Tween 20, 0.02％NP40, 子ウシ胸
腺ＤＮＡ(2 g), 1.2 mM の各dNTP, 0.4 M の各プライマ
ー, 10コピーの線状化した内部陽性対照（ＩＰＣ）プラ
スミドＤＮＡおよび16ＵのTaq ポリメラーゼを含む溶液
100 Ｌ中でPE9600サーモサイクラー（Perkin-Elmer）中
で行った。Taq に対するモノクローナル抗体 TP1-12 と
TP4-9 （それらの調製は米国特許第5,338,671 号明細書
に開示されている）をそれぞれ50：１と５：１のモル比
で反応液に添加して、Taq ポリメラーゼに対する抗体の
モル比55：１を提供した。96℃で３分間の最初の変性の
後、96℃で５秒と68℃で40秒から成る40サイクルの増幅
を行った。サイクルの終了後、103 ℃で５分間の最終加
熱段階を行ってTaq ポリメラーゼを失活させた。使用し
た増幅プライマーを下記の第２表に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】４．ＰＣＲ生成物の検出：ＰＣＲ生成物
は、(i) ゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色または(i
i)増幅中の５′−ビオチン標識プライマー（センス鎖）
の使用のいずれかにより検出した。この場合、フロース
ルー膜の表面上に付着させたラテックス粒子に共有結合
せしめたオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイ
セーションにより、生成物を捕捉した（SureCellTM試
験, Ortho Ckinical Diagnositcs, Rochester, NY ）。
ＨＩＶ−１プローブは5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'
(JBLTRpr)〔配列番号11〕および5'-GAACAGATGGGCACACAC
TGCT-3' (JBLTRpr4) 〔配列番号12〕であり、そしてＨ
ＩＶ−２プローブは5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'
(2LTRpr1) 〔配列番号13〕であった。生じたプローブ／
生成物複合体を、色素前駆体から色素（青色）への酸化
的変換を触媒するストレプトアビジン（ＳＡ）−西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合体で処理した。色
の強度を色標準に比較することにより、青色の強度を目
視により採点した（０〜10）。目に見える色の得点＞３
は、全て陽性結果であると見なした。
は、(i) ゲル電気泳動後の臭化エチジウム染色または(i
i)増幅中の５′−ビオチン標識プライマー（センス鎖）
の使用のいずれかにより検出した。この場合、フロース
ルー膜の表面上に付着させたラテックス粒子に共有結合
せしめたオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイ
セーションにより、生成物を捕捉した（SureCellTM試
験, Ortho Ckinical Diagnositcs, Rochester, NY ）。
ＨＩＶ−１プローブは5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'
(JBLTRpr)〔配列番号11〕および5'-GAACAGATGGGCACACAC
TGCT-3' (JBLTRpr4) 〔配列番号12〕であり、そしてＨ
ＩＶ−２プローブは5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'
(2LTRpr1) 〔配列番号13〕であった。生じたプローブ／
生成物複合体を、色素前駆体から色素（青色）への酸化
的変換を触媒するストレプトアビジン（ＳＡ）−西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）接合体で処理した。色
の強度を色標準に比較することにより、青色の強度を目
視により採点した（０〜10）。目に見える色の得点＞３
は、全て陽性結果であると見なした。
【００３７】実施例１：ＨＩＶ特異的プライマーまたは
ランダムプライマーを使った逆転写の効率 本発明のＨＩＶ特異的プライマーまたはランダムヘキサ
マー逆転写プライマー（N6, Pharmacia Biotech ）を使
って、ヒト血漿試料から誘導したＨＩＶ ＲＮＡの逆転
写の効率を比較するために、下記の実験を行った。
ランダムプライマーを使った逆転写の効率 本発明のＨＩＶ特異的プライマーまたはランダムヘキサ
マー逆転写プライマー（N6, Pharmacia Biotech ）を使
って、ヒト血漿試料から誘導したＨＩＶ ＲＮＡの逆転
写の効率を比較するために、下記の実験を行った。
【００３８】反応あたり約100 コピーのＨＩＶ ＲＮＡ
を提供するために、100 Ｌあたり1000コピーのＨＩＶ
ＲＮＡを含むようにヒト血漿を希釈した。ＲＮＡはチオ
シアン酸グアニジウムを使って血漿から抽出した。ＲＮ
Ａペレットを 26 Ｌのジエチルピロカルボネート処理し
た水に溶かした。
を提供するために、100 Ｌあたり1000コピーのＨＩＶ
ＲＮＡを含むようにヒト血漿を希釈した。ＲＮＡはチオ
シアン酸グアニジウムを使って血漿から抽出した。ＲＮ
Ａペレットを 26 Ｌのジエチルピロカルボネート処理し
た水に溶かした。
【００３９】逆転写反応液は、13 ＬのＲＮＡ、および
10 Ｌの逆転写混合物〔第一鎖緩衝液、0.1 M DTT, 20
U RNasin (Promega, Madison, WI), 0.4 mM の各dNTPお
よび200 Ｕのモロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV) 逆
転写酵素を含む〕を含んだ。更に2 Ｌの下記のプライマ
ー混合物（全て50 Mずつ）を試験条件に従って添加し
た：(1) 2 ＬのN6ランダムプライマー；(2) 1 ＬのN6ラ
ンダムプライマー＋1 ＬのLTR8RTプライマー；(3) 1 Ｌ
のN6ランダムプライマー＋1 ＬのPOL3RTプライマー；
(4) 1 ＬのLTR8RT＋1 ＬのPOL3RT。逆転写反応液は、42
℃で30分間インキュベートし；100 ℃で５分間加熱し；
次いで氷上で１分間冷却した。次いで 75 ＬのＰＣＲマ
スター混合物をｃＤＮＡ含有反応混合物に添加し、そし
て次の条件下でＰＣＲを行った：96℃で３分間余熱；次
いで96℃での融解と62℃で５秒間のアニーリングと増幅
を５サイクル；次いで96℃での融解と68℃で40秒間のア
ニーリングと増幅を35サイクル。増幅生成物を４％アガ
ロースゲル中での電気泳動により分離しそして臭化エチ
ジウムで視覚化した。
10 Ｌの逆転写混合物〔第一鎖緩衝液、0.1 M DTT, 20
U RNasin (Promega, Madison, WI), 0.4 mM の各dNTPお
よび200 Ｕのモロニーマウス白血病ウイルス(M-MLV) 逆
転写酵素を含む〕を含んだ。更に2 Ｌの下記のプライマ
ー混合物（全て50 Mずつ）を試験条件に従って添加し
た：(1) 2 ＬのN6ランダムプライマー；(2) 1 ＬのN6ラ
ンダムプライマー＋1 ＬのLTR8RTプライマー；(3) 1 Ｌ
のN6ランダムプライマー＋1 ＬのPOL3RTプライマー；
(4) 1 ＬのLTR8RT＋1 ＬのPOL3RT。逆転写反応液は、42
℃で30分間インキュベートし；100 ℃で５分間加熱し；
次いで氷上で１分間冷却した。次いで 75 ＬのＰＣＲマ
スター混合物をｃＤＮＡ含有反応混合物に添加し、そし
て次の条件下でＰＣＲを行った：96℃で３分間余熱；次
いで96℃での融解と62℃で５秒間のアニーリングと増幅
を５サイクル；次いで96℃での融解と68℃で40秒間のア
ニーリングと増幅を35サイクル。増幅生成物を４％アガ
ロースゲル中での電気泳動により分離しそして臭化エチ
ジウムで視覚化した。
【００４０】結果：図１と２に描写されるように、単独
でまたはランダムヘキサマープライマーと組み合わせた
ＨＩＶ特異的逆転写プライマーの使用は、かなり多くの
ＨＩＶ特異的増幅生成物の検出をもたらした。図１のレ
ーン２〜10（ランダムプライマーのみ）を図１のレーン
12〜20（LTR8RT＋ランダムプライマー）、図２のレーン
２〜10（POL3RT＋ランダムプライマー）および図２のレ
ーン12〜20（LTR8RT＋POL3RT）と比較されたい。この結
果は、100 Ｍまたは200 Ｍのランダムプライマーを使っ
た場合にも観察された。
でまたはランダムヘキサマープライマーと組み合わせた
ＨＩＶ特異的逆転写プライマーの使用は、かなり多くの
ＨＩＶ特異的増幅生成物の検出をもたらした。図１のレ
ーン２〜10（ランダムプライマーのみ）を図１のレーン
12〜20（LTR8RT＋ランダムプライマー）、図２のレーン
２〜10（POL3RT＋ランダムプライマー）および図２のレ
ーン12〜20（LTR8RT＋POL3RT）と比較されたい。この結
果は、100 Ｍまたは200 Ｍのランダムプライマーを使っ
た場合にも観察された。
【００４１】実施例２：患者試料中のＨＩＶ ＲＮＡの
検出 次の実験は、ランダムヘキサマー逆転写プライマーのみ
かまたはＨＩＶ特異的逆転写プライマーと組み合わせた
ランダムプライマーのいずれかを使って、患者試料中の
ＨＩＶ ＲＮＡの検出を比較するために行った。CD4 Ｔ
細胞計数が500 より大きい患者（これらの患者は無症状
であり比較的低いウイルス負荷量を有する）からＨＩＶ
血漿試料を採取した。
検出 次の実験は、ランダムヘキサマー逆転写プライマーのみ
かまたはＨＩＶ特異的逆転写プライマーと組み合わせた
ランダムプライマーのいずれかを使って、患者試料中の
ＨＩＶ ＲＮＡの検出を比較するために行った。CD4 Ｔ
細胞計数が500 より大きい患者（これらの患者は無症状
であり比較的低いウイルス負荷量を有する）からＨＩＶ
血漿試料を採取した。
【００４２】上記実施例１に記載したのと同様に、血漿
試料からＲＮＡを抽出した。13ＬのＲＮＡ溶液を 15 Ｌ
の水に希釈した。各試料を逆転写用に２つの 12 Ｌアリ
コートに分けた。上記実施例１に記載した通りに２つの
逆転写反応混合物を調製した。各混合物は2 Ｌの100 Ｍ
ランダムプライマー＋1 Ｌの水か、2 Ｌの100 Ｍランダ
ムプライマー＋等量の次のプライマー：(1) POL3RT,
(2) LTR8RT, (3) 2LTRRTおよび(4) 2EnvRTを含む1 Ｌの
50 M ＨＩＶ特異的プライマー混合物、のいずれかを含
有した。逆転写反応および増幅反応は上記実施例１に記
載した通りに実施した。
試料からＲＮＡを抽出した。13ＬのＲＮＡ溶液を 15 Ｌ
の水に希釈した。各試料を逆転写用に２つの 12 Ｌアリ
コートに分けた。上記実施例１に記載した通りに２つの
逆転写反応混合物を調製した。各混合物は2 Ｌの100 Ｍ
ランダムプライマー＋1 Ｌの水か、2 Ｌの100 Ｍランダ
ムプライマー＋等量の次のプライマー：(1) POL3RT,
(2) LTR8RT, (3) 2LTRRTおよび(4) 2EnvRTを含む1 Ｌの
50 M ＨＩＶ特異的プライマー混合物、のいずれかを含
有した。逆転写反応および増幅反応は上記実施例１に記
載した通りに実施した。
【００４３】臭化エチジウム染色した４％アガロースゲ
ル上でのゲル電気泳動および更に上述したSureCell比色
法により、ＨＩＶ特異的増幅生成物を検出した。
ル上でのゲル電気泳動および更に上述したSureCell比色
法により、ＨＩＶ特異的増幅生成物を検出した。
【００４４】結果：図３および図４はゲル電気泳動によ
り検出した増幅生成物を描写する。比色法によるＨＩＶ
特異的増幅生成物の検出は、第３表において相対値とし
て示される。ＩＰＣは陽性対照プライマーを意味する。
り検出した増幅生成物を描写する。比色法によるＨＩＶ
特異的増幅生成物の検出は、第３表において相対値とし
て示される。ＩＰＣは陽性対照プライマーを意味する。
【００４５】
【表３】
【００４６】
【表４】
【００４７】試料３と10で、ランダムヘキサマーへのＨ
ＩＶ特異的ＲＴプライマーの添加は、ランダムプライマ
ーのみを使うよりも大きな増幅の度合いをもたらした。
比色法によりそれらの試料中に検出される生成物の量
も、ＨＩＶ特異的ＲＴプライマーを使用するとより大き
かった。
ＩＶ特異的ＲＴプライマーの添加は、ランダムプライマ
ーのみを使うよりも大きな増幅の度合いをもたらした。
比色法によりそれらの試料中に検出される生成物の量
も、ＨＩＶ特異的ＲＴプライマーを使用するとより大き
かった。
【００４８】試料16, 20および22は、逆転写反応におい
てランダムプライマーのみを使うと、ゲル電気泳動また
は比色法により検出されなかった。しかしながら、それ
らの試料は、ランダムプライマーに加えてＨＩＶ特異的
ＲＴプライマーを使うと陽性であった。
てランダムプライマーのみを使うと、ゲル電気泳動また
は比色法により検出されなかった。しかしながら、それ
らの試料は、ランダムプライマーに加えてＨＩＶ特異的
ＲＴプライマーを使うと陽性であった。
【００４９】これらの結果は、本発明の方法および組成
物が、ＨＩＶについての患者または血液製剤のスクリー
ニングにおいて、偽陽性結果の発生率を減少できること
を示す。
物が、ＨＩＶについての患者または血液製剤のスクリー
ニングにおいて、偽陽性結果の発生率を減少できること
を示す。
【図１】図１は、逆転写プライマーとして(a) ランダム
ヘキサマープライマーのみ（レーン２〜10）；または
(b) ランダムヘキサマープライマーとLTR8RTの混合物
（レーン12〜20）を使って得られたＨＩＶ−１特異的増
幅生成物を示す、臭化エチジウム染色した４％アガロー
スゲルの写真を描写する図面である。レーン１はマーカ
ーを含み、そしてレーン22, 24および26は対照試料であ
る。
ヘキサマープライマーのみ（レーン２〜10）；または
(b) ランダムヘキサマープライマーとLTR8RTの混合物
（レーン12〜20）を使って得られたＨＩＶ−１特異的増
幅生成物を示す、臭化エチジウム染色した４％アガロー
スゲルの写真を描写する図面である。レーン１はマーカ
ーを含み、そしてレーン22, 24および26は対照試料であ
る。
【図２】図２は、逆転写プライマーとして(a) ランダム
ヘキサマープライマーとPOL3RTの混合物（レーン２〜1
0）または(b) LTR8RTとPOL3RTの混合物（レーン12〜2
0）を使って得られたＨＩＶ−１特異的増幅生成物を示
す、臭化エチジウム染色した４％アガロースゲルの写真
を描写する図面である。レーン１はマーカーを含み、そ
してレーン22, 24および26は対照試料である。
ヘキサマープライマーとPOL3RTの混合物（レーン２〜1
0）または(b) LTR8RTとPOL3RTの混合物（レーン12〜2
0）を使って得られたＨＩＶ−１特異的増幅生成物を示
す、臭化エチジウム染色した４％アガロースゲルの写真
を描写する図面である。レーン１はマーカーを含み、そ
してレーン22, 24および26は対照試料である。
【図３】図３は、逆転写プライマーとして(a) ランダム
ヘキサマープライマーのみ（レーン２〜13）または(b)
ランダムヘキサマーとPOL3RT, LTR8RT, 2LTRRTおよび2E
nvRTとの混合物（レーン15〜26）を使って得られたＨＩ
Ｖ−１特異的増幅生成物を示す、臭化エチジウム染色し
た４％アガロースゲルの写真を描写する図面である。レ
ーン１はマーカーを含む。
ヘキサマープライマーのみ（レーン２〜13）または(b)
ランダムヘキサマーとPOL3RT, LTR8RT, 2LTRRTおよび2E
nvRTとの混合物（レーン15〜26）を使って得られたＨＩ
Ｖ−１特異的増幅生成物を示す、臭化エチジウム染色し
た４％アガロースゲルの写真を描写する図面である。レ
ーン１はマーカーを含む。
【図４】図４は、(a) ランダムヘキサマープライマーの
み（レーン２〜15）または(b)ランダムヘキサマーとPOL
3RT, LTR8RT, 2LTRRTおよび2EnvRTとの混合物（レーン1
6〜29）を使って得られたＨＩＶ−１特異的増幅生成物
を示す、臭化エチジウム染色した４％アガロースゲルの
写真を描写する図面である。レーン１と30はマーカーを
含む。
み（レーン２〜15）または(b)ランダムヘキサマーとPOL
3RT, LTR8RT, 2LTRRTおよび2EnvRTとの混合物（レーン1
6〜29）を使って得られたＨＩＶ−１特異的増幅生成物
を示す、臭化エチジウム染色した４％アガロースゲルの
写真を描写する図面である。レーン１と30はマーカーを
含む。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ (72)発明者 ジョン エー．プスカス アメリカ合衆国，ニューヨーク 14613, ロチェスター，ケイ テラス 19 (72)発明者 ケミン ソン アメリカ合衆国，ミズーリ 63021，ボー ルウィン，アーバー グレン 379 (72)発明者 ジェフリー エム．リネン アメリカ合衆国，カリフォルニア 92129, サン ディエゴ，エリンハム ストリート 8978
Claims (18)
- 【請求項１】 生物学的試料中のヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）ＲＮＡを逆転写する方法であって、 (a) オリゴヌクレオチドプライマーが前記ＲＮＡの少な
くとも一部分に相補的なＤＮＡの合成を開始させるよう
な条件下で、前記オリゴヌクレオチドを前記試料から誘
導したＲＮＡと接触させることを含んで成り、 ここで前記オリゴヌクレオチドが (i) 5'-CTTGTATTACTACTG-3' 〔配列番号１〕、 (ii) 5'-CCCTGTGGCGCC-3'〔配列番号２〕、 (iii) 5'-GCGACTAGGAGAGA-3'〔配列番号３〕、 (iv) 5'-CCCAGACGGTCAGT-3'〔配列番号４〕および (v) 前記のものの任意の組合せから成る群より選ばれ
ることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記試料が血液、血清、血漿、尿、唾液
および脳脊髄液から成る群より選ばれる、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項３】 前記ｃＤＮＡを回収することを更に含ん
で成る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 生物学的試料中のヒト免疫不全ウイルス
（ＨＩＶ）ＲＮＡの存在の検出方法であって、 (a) 前記試料から誘導したＲＮＡを鋳型として使用しそ
して前記ＲＮＡ中に含まれるヌクレオチド配列に相補的
なオリゴヌクレオチドを逆転写プライマーとして使用し
て逆転写反応を行うことにより、ＨＩＶ特異的逆転写生
成物を生成させ、 ここで前記逆転写プライマーは (i) 5'-CTTGTATTACTACTG-3' 〔配列番号１〕 (ii) 5'-CCCTGTGGCGCC-3'〔配列番号２〕、 (iii) 5'-GCGACTAGGAGAGA-3'〔配列番号３〕、 (iv) 5'-CCCAGACGGTCAGT-3'〔配列番号４〕および (v) 前記のものの任意の組合せから成る群より選ば
れ； (b) 前記逆転写生成物を増幅させることにより増幅生成
物を生成させ；そして (c) 前記増幅生成物を検出するという各段階を含んで成
り、 前記増幅の増幅生成物の検出が前記試料中のＨＩＶ Ｒ
ＮＡの存在を示す方法。 - 【請求項５】 前記試料が血液、血清、血漿、尿、唾液
および脳脊髄液から成る群より選ばれる、請求項４に記
載の方法。 - 【請求項６】 前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応、リ
ガーゼ連鎖反応および鎖置換増幅から成る群より選ばれ
る、請求項４に記載の方法。 - 【請求項７】 前記検出が、増幅生成物のゲル電気泳
動、固体支持体上への増幅生成物の捕捉および増幅生成
物の化学発光検出から成る群より選ばれた方法により行
われる、請求項４に記載の方法。 - 【請求項８】 オリゴヌクレオチド 5'-CTTGTATTACTACT
G-3'〔配列番号１〕。 - 【請求項９】 オリゴヌクレオチド 5'-CCCTGTGGCGCC-
3' 〔配列番号２〕。 - 【請求項１０】 オリゴヌクレオチド 5'-GCGACTAGGAGA
GA-3' 〔配列番号３〕。 - 【請求項１１】 オリゴヌクレオチド 5'-CCCAGACGGTCA
GT-3' 〔配列番号４〕。 - 【請求項１２】 オリゴヌクレオチド 5'-CTTGTATTACTA
CTG-3'〔配列番号１〕を含んで成る、ＨＩＶ特異的逆転
写プライマー。 - 【請求項１３】 オリゴヌクレオチド 5'-CCCTGTGGCGCC
-3' 〔配列番号２〕を含んで成る、ＨＩＶ特異的逆転写
プライマー。 - 【請求項１４】 オリゴヌクレオチド 5'-GCGACTAGGAGA
GA-3' 〔配列番号３〕を含んで成る、ＨＩＶ特異的逆転
写プライマー。 - 【請求項１５】 オリゴヌクレオチド 5'-CCCAGACGGTCA
GT-3' 〔配列番号４〕を含んで成る、ＨＩＶ特異的逆転
写プライマー。 - 【請求項１６】 生物学的試料中のＨＩＶ−１，ＨＩＶ
−２またはそれらの組合せの検出のためのキットであっ
て、 (a) 5'-CTTGTATTACTACTG-3' 〔配列番号１〕 (b) 5'-CCCTGTGGCGCC-3'〔配列番号２〕、 (c) 5'-GCGACTAGGAGAGA-3'〔配列番号３〕、 (d) 5'-CCCAGACGGTCAGT-3'〔配列番号４〕および (e) 前記のものの任意の組合せから成る群より選ばれた
逆転写プライマーを含んで成るキット。 - 【請求項１７】 ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチ
ドプライマーが前記ＲＮＡの少なくとも一部分に相補的
なＤＮＡの合成を開始するような条件下で、前記試料か
ら誘導されたＲＮＡを前記ランダムヘキサマーオリゴヌ
クレオチドと同時に接触させることを更に含んで成る、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項１８】 ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチ
ドも逆転写プライマーとして段階(a) において使用され
る、請求項４に記載の方法。
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