KR20010014470A - Ｈｉｖ-1 및 ｈｉｖ-2를 효율적으로 검출하기 위한올리고뉴클레오타이드 역전사 프라이머 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본원에는 사람 개체의 생물학적 샘플내의 사람 면역결핍 바이러스를 검출하는 방법 및 키트가 기재되어 있다. 또한, 사람 면역결핍 바이러스를 검출하기 위한 방법 및 키트에 사용하기 위한 올리고뉴클레오타이드 역전사 프라이머가 기재되어 있다.

Description

ＨＩＶ-1 및 ＨＩＶ-2를 효율적으로 검출하기 위한 올리고뉴클레오타이드 역전사 프라이머 및 이의 사용 방법{Oligonucleotide reverse transcription primers for efficient detection of HIV-1 and HIV-2 and methods of use thereof}
본 발명은 생물학적 샘플내의 핵산 서열, 특히 감염성 미생물로부터 유도된 서열을 검출하는 개선된 방법에 관한 것이다.
전세계적으로, 수백만명의 사람이 사람 면역결핍 바이러스(HIV)에 감염되어 있다. 따라서, HIV 감염은 심각한 공중 위생 관심사이다. 오염된 혈액 생성물에 의한 HIV 감염의 확산은 환자 샘플내의 소량의 HIV RNA를 검출할 수 있는 스크리닝 방법이 필요하다는 것을 의미한다. 더욱이, 개선된 HIV 감염 치료의 이용성을 증대시킨다는 것은 적절한 치료 중재를 개시하기 위해 초기에 환자의 감염을 검출하는 것이 중요하다는 것을 의미한다.
따라서, 진단 및 스크리닝에 사용될 수 있는 HIV의 고도의 민감한 검출 방법이 본 기술 분야에서 요구되고 있다.
도 1은 역전사 프라이머로서 (a) 랜덤 헥사머 프라이머(레인 2 내지 10); 또는 (b) 랜덤 헥사머 프라이머와 LTR8RT의 혼합물(레인 12 내지 20)을 사용하여 수득한 HIV-1-특이적 증폭 생성물을 나타내는, 에티디움 브로마이드로 염색된 4% 아가로즈 겔의 사진 설명도이다. 레인 1은 마커를 포함하며, 레인 22, 24 및 26은 대조군 샘플이다.
도 2는 역전사 프라이머로서 (a) 랜덤 헥사머 프라이머와 POL3RT의 혼합물(레인 2 내지 10) 또는 (b) LTR8RT와 POL3RT의 혼합물(레인 12 내지 20)을 사용하여 수득한 HIV-1-특이적 증폭 생성물을 나타내는, 에티디움 브로마이드로 염색된 4% 아가로즈 겔의 사진 설명도이다. 레인 1은 마커를 포함하며, 레인 22, 24 및 26은 대조군 샘플이다.
도 3은 (a) 랜덤 헥사머 프라이머(레인 2 내지 13) 또는 (b) 랜덤 헥사머 및 POL3RT, LTR8RT, 2LTRRT 및 2EnvRT의 혼합물(레인 15 내지 26)을 사용하여 수득한 HIV-1-특이적 증폭 생성물을 나타내는, 에티디움 브로마이드로 염색된 4% 아가로즈 겔의 사진 설명도이다. 레인 1은 마커를 포함한다.
도 4는 (a) 랜덤 헥사머 프라이머(레인 2 내지 15) 또는 (b) 랜덤 헥사머 및 POL3RT, LTR8RT, 2LTRRT 및 2EnvRT의 혼합물(레인 16 내지 29)을 사용하여 수득한 HIV-1-특이적 증폭 생성물을 나타내는, 에티디움 브로마이드로 염색된 4% 아가로즈 겔의 사진 설명도이다. 레인 1 및 30은 마커를 포함한다.
본 발명은 (a) 생물학적 샘플로부터 유도된 사람 면역결핍 바이러스(HIV) RNA를 (i) 5'-CTTGTATTACTACTG-3'(서열 1), (ii) 5'-CCCTGTGGCGCC-3'(서열 2), (iii) 5'-GCGACTAGGAGAGA-3'(서열 3), (iv) 5'-CCCAGACGGTCAGT-3'(서열 4) 또는 (v) 상기 서열의 임의의 배합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 올리고뉴클레오타이드가 상기 RNA의 일부분 이상에 상보성인 DNA의 합성을 프라이밍하는 조건하에 상기 올리고뉴클레오타이드와 접촉시킴을 포함하여, 생물학적 샘플내의 사람 면역결핍 바이러스(HIV) RNA를 역전사시키는 방법을 제공한다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 (a) 주형으로서 생물학적 샘플로부터 유도된 HIV RNA를 사용하고 프라이머로서 상기 RNA내에 포함된 뉴클레오타이드 서열에 상보성인 올리고뉴클레오타이드(여기서, 프라이머는 (i) 5'-CTTGTATTACTACTG-3'(서열 1), (ii) 5'-CCCTGTGGCGCC-3'(서열 2), (iii) 5'-GCGACTAGGAGAGA-3'(서열 3), (iv) 5'-CCCAGACGGTCAGT-3'(서열 4) 또는 (v) 상기 서열의 임의의 배합물로 이루어진 그룹중에서 선택된다)를 사용하여 역전사 반응을 수행함으로써 HIV-특이적 역전사 생성물을 생성하는 단계;
(b) 상기 역전사 반응의 생성물을 증폭시켜 증폭 생성물을 생성하는 단계; 및
(c) 증폭 생성물을 검출하는 단계(여기서, 증폭 생성물의 검출은 샘플내에 HIV RNA의 존재를 나타낸다)를 포함하여, 생물학적 샘플내의 HIV RNA의 존재를 검출하는 방법을 제공한다.
증폭은 임의의 방법, 바람직하게는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 수행할 수 있다. 본 발명에 따른 HIV-특이적 역전사 프라이머의 사용은 샘플, 바람직하게는 혈장내의 HIV-1 및/또는 HIV-2를 검출하는 민감한 방법을 제공한다.
또다른 양태에 있어서, 본 발명은 (a) 5'-CTTGTATTACTACTG-3'(서열 1),
(b) 5'-CCCTGTGGCGCC-3'(서열 2),
(c) 5'-GCGACTAGGAGAGA-3'(서열 3),
(d) 5'-CCCAGACGGTCAGT-3'(서열 4) 또는
(e) 상기 서열의 임의의 배합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 역전사 프라이머를 포함하는, 생물학적 샘플내의 HIV-1, HIV-2 또는 이의 배합물을 검출하기 위한 키트를 제공한다. 또한, 본 발명의 키트는 역전사, 증폭 및 생성물 검출을 위한 시약 및 지침을 포함할 수 있다.
본 발명자들은 HIV RNA에 존재하는 특정한 서열에 상보성인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드가 역전사용 프라이머로서 사용되는 경우 생물학적 샘플내의 사람 면역결핍 바이러스(HIV) RNA 검출이 더욱 효율적임을 발견하였다. 바람직하게는, 상기 프라이머의 서열은 HIV RNA의 3' 말단에 인접한 서열에 상응한다.
분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 단백질 생화학내의 많은 기술, 예를 들어 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997(F.M., Ausubel ed.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, 1985(D.N. Glover ed.); Oligonucleotide Synthesis, 1984, (M.L. Gait ed.); Transcription and Translation, 1984(Hames and Higgins eds.); A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); and Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.]에 설명된 기술이 본 발명의 실시에 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드"는 임의의 길이의 푸린- 및 피리미딘-함유 중합체, 즉 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 또는 혼합된 폴리리보-폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 의미한다. 여기에는 일본쇄 및 이본쇄 분자, 예를 들어 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 하이브리드 뿐만 아니라 아미노산 백본(backbone)에 염기를 접합시켜 형성된 "단백질 핵산"(PNA)가 포함된다. 또한, 여기에는 변형된 염기를 함유하는 핵산이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이 핵산 서열의 "상보체"는 최초 서열과의 왓슨-크릭 염기쌍 짝짓기에 관여하는 안티센스 서열을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 "프라이머"는 당해 일본쇄 핵산 서열과 듀플렉스(duplex)를 형성하고 예를 들어 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제를 사용하여 상보성 스트랜드의 중합화를 가능케 하는, 약 5 내지 약 50개 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 약 6 내지 약 25개 뉴클레오타이드 길이 및 가장 바람직하게는 약 6 내지 약 18개 뉴클레오타이드 길이의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이 "단리된" 핵산 또는 폴리펩타이드는 이의 최초 환경(예: 천연 발생인 경우에는 이의 천연 환경 또는 합성인 경우에는 반응 혼합물)로부터 제거된 성분을 의미한다. 단리된 핵산 또는 폴리펩타이드는 전형적으로 약 50% 미만, 바람직하게는 약 75% 미만 및 가장 바람직하게는 약 90% 미만의 최초 관련된 성분을 함유한다.
지정된 서열로부터 "유도된" 핵산 서열은 지정된 서열 영역에 상응하는 서열을 의미한다. 이것은 당해 서열과 상동성 또는 상보성인 서열을 포함한다.
내부 포지티브 대조군(IPC) 표적 핵산은 전형적으로 제한 엔도뉴클레아제의 작용에 의해 연속적으로 선형화되는 플라스미드 벡터내로 클론된 합성 핵산 서열을 의미한다. IPC는 전형적으로 일반적인 프로브-결합 영역을 둘러싸고 있는 다중 프라이머 결합 서열을 포함하며, 핵산 증폭 반응에서 펄스 네가티브 결과에 대한 일반적인 대조군으로서 작용할 것이다.
바람직한 내부 포지티브 대조군 표적 DNA의 서열은 다음과 같다:
5'-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTAT CCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3'(서열 5).
본원에 사용된 바와 같이, 역전사에 적합한 조건, 즉 올리고뉴클레오타이드가 cDNA 합성을 프라이밍하는 조건은 RNA 및 프라이머 올리고뉴클레오타이드를 역전사효소 및 뉴클레오타이드와 함께 cDNA의 합성을 생성하는 온도에서 및 시간 동안 항온처리하는 것을 포함한다.
본원에 기술된 임의의 서열 또는 이의 아서열을 포함하는 핵산은 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, DNA는 포스포르아미디트 고체 지지체 방법[참조: Matteucci et al., 1981, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185], 문헌[참조: Yoo et al., 1989, J. Biol. Chem. 764: 17078]의 방법, 또는 기타 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 핵산은 본 기술 분야에 공지된 다수의 수단에 의해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예에는 메틸화, "caps", 동족체에 의한 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오타이드의 치환, 및 예를 들어 비하전된 결합(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 결합(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)에 의한 것과 같은 뉴클레오타이드간 변형이 포함된다. 핵산은 하나 이상의 추가의 공유 결합된 잔기, 예를 들어 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입체(예: 아크리딘, 소랄렌 등), 킬레이트제(예: 금속, 방사활성 금속, 철, 산화 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다. PNA가 또한 용어 "핵산"에 포함된다. 핵산은 메틸 또는 에틸 포스포트리에스테르 또는 알킬 포스포르아미데이트 결합을 형성함으로써 유도체화될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 핵산 서열은 또한 직접 또는 간접적으로 검출가능한 시그날을 제공할 수 있는 표지로 변형시킬 수 있다. 예시적인 표지에는 방사선동위원소, 형광 분자, 비오틴 등이 포함된다.
본원에 사용된 증폭은 핵산이 카피되는 반복 과정을 의미한다. 증폭에 적합한 방법에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 폴리머라제 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응 및 전사-매개된 증폭이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이 사람 면역결핍 바이러스(HIV)는 HIV-1, HIV-2 및 SIV를 포함하여 레트로비리다에(Retroviridae)속의 종 및 이의 변이체 균주를 의미한다. 본 발명에 의해 검출될 수 있는 HIV의 분리체에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, HIV-1 및 HIV-2가 포함된다.
본 발명은 생물학적 샘플내의 HIV 검출에 유용한, 생물학적 샘플로부터의 HIV RNA를 역전사시키는 방법을 제공한다. HIV-특이적 증폭 생성물의 검출은 당해 샘플내에 HIV RNA의 존재를 나타낸다.
본 발명에 따르면, 생물학적 샘플은 모든 통상적인 수단에 의해 환자로부터 수득된다. 적합한 생물학적 샘플에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 모유, 조직 샘플 및 뇌척수액이 포함된다. 바람직하게는, 혈장이 HIV RNA의 공급원으로서 사용된다.
생물학적 샘플은 샘플내에 포함된 RNA, 특히 HIV RNA에 역전사 시약의 접근을 제공하는 모든 방법으로 처리된다. 생물학적 샘플로부터 "유도된" RNA는 샘플내에 본래 존재하고 접근이 샘플의 처리에 의해 수득되는 모든 RNA이다. 바람직하게는, RNA는 본 기술 분야에 공지된 모든 방법, 예를 들어 구아니디늄 티오시아네이트를 사용하거나 상업상 입수가능한 시약을 사용하는 방법 및 젠트라 시스템 인코포레이티드(Gentra Systems, Inc.)(Minneapolis MN)사의 PureScript9와 같은 방법을 사용하여 샘플로부터 추출한다. RNase의 RNA, 다른 단백질, 및/또는 역전사를 간섭할 수 있는 기타 성분으로부터 분리시키는 모든 추출 공정을 사용할 수 있다.
이어서, 샘플로부터 추출된 RNA를 당해 올리고뉴클레오타이드가 추출된 RNA의 적어도 일부분과 상보성인 DNA의 합성을 프라이밍하는 조건하에 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 접촉시킨다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 서열은 HIV의 서열로부터 유도된다. 당해 프라이머는 검출이 요구되는 영역의 하부(즉, 3')에 존재할 수 있는 HIV RNA 영역에 상응한다. 이 영역은 예를 들어 긴 말단 반복(LTR) 영역; 바이러스 역전사효소(Pol), Gag 단백질, Tat 단백질, 엔벨로프 당단백질, Vif, Vpr 및 Vpu 단백질를 암호화하는 영역; 및 전사 인자 반응 요소를 암호화하는 Rev 영역을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 HIV 게놈의 3' 말단에 인접한 서열에 상응한다. 프라이머 서열은 HIV의 특정한 분리체(예: HIV-1 및 HIV-2의 분리체)를 특이적으로 확인하기 위해 사용될 수 있다. 프라이머는 상이한 분리체로부터의 RNA와 하이브리드화하지 않는 조건(즉, 프라이머 자체는 분리체간에 상이한 서열을 포함할 수 있다)하에 특정한 분리체로부터 유도된 RNA와 하이브리드화시킴으로써 특정한 분리체를 확인할 수 있다. 한편, 프라이머 서열은 분리체간에 상이한 HIV RNA의 단편(즉, 분리체간에 상이한 서열은 프라이머 서열의 하부에 존재할 수 있다)의 합성을 프라이밍하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 실시에 유용한 역전사 프라이머는 서열 보존의 이론적 연구, 분자내 및 분자간 상호작용, 및 증폭 및 주변 서열의 추정되는 제2 구조에 기초하여 선별한다. 더욱이, 프라이머 및 검정 시스템은 HIV 게놈의 다중 영역, 다중 바이러스 종, 및 내부 포지티브 대조군(IPC) RNA(또는 DNA)의 공-증폭(및 공-검출)을 가능하게 하도록 디자인한다.
본 발명에 따른 역전사 프라이머의 비제한적 예는 하기 표 1에 제시되어 있다.
공급원 명칭 서열 서열 번호
HIV-1 POL3RT 5'-CTTGTATTACTACTG-3' 1
HIV-1 LTR8RT 5'-CCCTGTGGCGCC-3' 2
HIV-2 2LTR1RT 5'-GCGACTAGGAGAGA-3' 3
HIV-2 2Env2RT 5'-CCCAGACGGTCAGT-3' 4
역전사는 하나 이상의 상기 프라이머를 사용하여 수행한다. 예를 들어 랜덤 헥사머 역전사 프라이머(N6, Pharmacia Biotech, Piscataway, NY)와 같은 랜덤 프라이머를 부가할 수도 있다. 역전사는 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II, and III, 1997(F.M., Ausubel ed.)]; 미국 특허 제5,322,770호; 문헌[참조: Young, et al., J. Clin. Microbiol. 31(4): 882(1993); Myers et al., Biochemistry 30(3): 7661(1991)] 또는 대리인 도켓 번호 2094/0E287로 공동 계류중인 특허원 제 호에 기재된 바와 같은 통상의 공정을 사용하여 수행한다.
역전사 반응시킨 후, cDNA 생성물 또는 생성물들을 통상의 방법으로 단리하여 회수할 수 있다. 바람직하게는, cDNA 생성물 또는 생성물들을 증폭시킨다. 모든 증폭 방법을 사용할 수 있으며, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응, 스트랜드 치환 증폭, 전사 매개된 증폭 및 핵산 단일 염기 증폭이 포함된다. 바람직하게는, PCR이 사용된다. 전형적으로, PCR을 위한 모든 필요한 성분(HIV-특이적 증폭 프라이머 포함)을 함유하는 반응 혼합물을 역전사 반응 혼합물에 직접 가한다. 이어서, 사용되는 프라이머 쌍에 의해 명시된 조건을 사용하여 증폭을 수행한다. 적합한 증폭 프라이머 쌍은 예를 들어 대리인 도켓 번호 제2094/0E285호의 미국 특허원 제 호 및 하기 실시예에 기재되어 있다.
증폭시킨 후, 본 기술 분야에 공지된 모든 방법, 예를 들어 이로써 제한되는 것은 아니지만, 아가로즈 또는 아크릴아미드내에서의 겔 전기영동; 고체 지지체상에서 증폭 생성물의 포획 및 이어서 비색 검출(하기 실시예 1 참조); ECi 검출; 형광, 방사선동위원소 검출 및 화학발광을 사용하여 증폭 생성물을 검출할 수 있다. 이와 같은 검출 방법용 시약은 예를 들어 Molecular Probes, Eugene, Oregon and Ortho Clinical Diagnostics(Rochester, NY)로부터 상업상 입수가능하다.
HIV-특이적 증폭 생성물의 검출은 샘플내에 HIV RNA의 존재를 나타낸다. 겔 전기영동을 사용하는 경우, HIV-특이적 증폭 생성물은 반응에 사용된 증폭 프라이머에 상응하는 서열의 HIV RNA내의 위치에 의해 예상되는 바와 같이 크기에 따라 확인된다.
본 발명은 상기 표 1에 제시된 하나 이상의 역전사 프라이머를 포함하는, 생물학적 샘플내의 HIV RNA의 검출을 위한 키트를 제공한다. 또한, 본 발명의 키트는 역전사를 위한 시약 뿐만 아니라 예를 들어 PCR에 의한 HIV cDNA의 검출을 위한 추가의 시약을 포함할 수 있다.
바람직한 양태의 상세한 설명
하기 실시예는 제한 없이 본 발명을 설명한다.
방법:
1. 샘플 제조:
RNA는 구아니디늄 티오시아네이트 또는 PureScript9 RNA 단리 시약(Gentra Systems, Minneapolis MN)을 사용하여 혈장 샘플로부터 제조한다. 제조업자의 프로토콜에 따른 체액의 변형은 바이러스 RNA의 침전을 보조하기 위한 담체로서 20g 글리코겐보다는 오히려 40g 글리코겐을 사용하는 것을 포함한다. 또한, 대부분의 경우, RNA를 이소프로필 알콜로 침전시키고 RNA 펠렛을 에탄올로 세척시킨 후, RNA 펠렛을 제조업자가 제공한 RNA 수용액보다는 오히려 RT 완충 혼합물에 재현탁시킨다.
2. 역전사:
RNA로부터 cDNA의 합성은 50mM 트리스-HCl(pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM DTT, 각각 0.4mM dNTP(Pharmacia Biotech), 4M 랜덤 헥사머(Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 및/또는 특이적 역전사 프라이머의 50L 용액중의 100U 재조합 몰로니 쥐 백혈구 바이러스(M-MLV) 역전사효소(RT)(Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland) 및 디에틸피로카보네이트(DEPC)-처리된 물중의 20단위 RNasin(Promega, Madison, Wisconsin)을 첨가하여 촉매한다. 42EC에서 30분 동안 항온처리한 후, RT 반응물을 100EC에서 5분 동안 유지시켜 RT 활성을 파괴시킨다. 각각의 반응물을 1분 동안 냉각시킨 다음 16000×g에서 4초 동안 미세원심분리한다.
3. PCR 증폭:
PCR은 25mM 트리스-HCl, 3mM MgCl2, 0.725mM EDTA, 54mM KCl, 3.72mM NaCl, 40M DTT, 108g/ml 젤라틴(타입 IV), 9.5% 글리세롤, 0.02% 트윈 20, 0.02% NP40, 송아지 흉선 DNA(2g), 각각 1.2mM dNTP, 각각 0.4M 프라이머, 10개 카피의 선형화된 내부 포지티브 대조군(IPC) 플라스미드 DNA 및 16U Taq 폴리머라제의 100L 용액중에서 IN A PE9600 써모사이클러(Perkin-Elmer)로 수행한다. 제조 방법이 미국 특허 제5,338,671호에 기재되어 있는 Taq, TP1-12 및 TP4-9에 대한 모노클로날 항체를 각각 50:1 및 5:1의 몰비에서 반응물에 가하여 55:1 몰비의 항체 대 Taq 폴리머라제를 수득한다. 96EC에서 3분 동안 초기 변성시킨 후, 96EC에서 5초 동안 및 68EC에서 40초 동안 40주기 증폭시킨다. 순환 말기에, 5분 동안 103EC에서 후가열 단계를 수행하여 Taq 폴리머라제를 불활성화시킨다. 사용된 증폭 프라이머는 하기 표 2에 제시되어 있다.
ID 공급원 서열 서열 번호
JBLT R4 HIV-1(s) 5'-CTG CTT AAG CCT CAA TAA AGC TTG CCT TGA-3' 6
JBLT R6 HIV-1(as) 5'-GGG TCT GAG GGA TCT CTA GTT ACC AGA GT-3' 7
JBLT R8 HIV-1(as) 5'-TGT TCG GGC GCC ACT GCT AGA GA-3' 8
2LTRe HIV-2(s) 5'-GGG AGG TTC TCT CCA GCA CTA GCA-3' 9
2LTR-R1 HIV-2(as) 5'-GCG ACT AGG AGA GAT GGG AAC ACA CA-3' 10
4. PCR 생성물의 검출:
PCR 생성물은 (i) 겔 전기영동시킨 다음 에티디움 브로마이드로 염색하거나; (ii) 증폭중에 5'-비오틴-표지된 프라이머(센스 스트랜드)를 사용하여 검출한다. 이 경우, 증폭 생성물은 막(SureCell9 시험물, Ortho Clinical Diagnostics, Rochester, NY)을 통해 유동 표면상에 침착된 라텍스 입자에 공유 결합된 올리고뉴클레오타이드 프로브와 하이브리드화시켜 포획한다. HIV-1 프로브는 5'-CAACAGACGGGCACACACTACT-3'(JBLTRpr)(서열 11) 및 5'-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3'(JBLTRpr4)(서열 12)이고; HIV-2 프로브는 5'-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3'(2LTRpr1)(서열 13)이다. 프로브/생성물 복합체는 염료 전구체의 염료(블루 칼라)로의 산화적 전환을 촉매하는 스트렙트아비딘(SA)-서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 접합체와 반응한다. 블루 칼라 강도는 채색 강도를 채색 표준물과 비교하여 시각적으로 스코어링한다(0 내지 10). 3보다 큰 모든 시각 채색 스코어를 포지티브 결과인 것으로 간주한다.
실시예 1
HIV-특이적 프라이머 또는 랜덤 프라이머를 사용한 역전사 효능
하기 실시예는 본 발명에 따른 HIV-특이적 프라이머 또는 랜덤 헥사머 역전사 프라이머(N6, Pharmacia Biotech)를 사용하여 사람 혈장 샘플로부터 유도된 HIV RNA의 역전사 효능을 비교하기 위해 수행한다.
사람 혈장은 100L당 1000카피의 HIV RNA를 함유하도록 희석시켜 반응당 대략 100카피의 HIV RNA를 수득한다. RNA는 구아니디늄 티오시아네이트를 사용하여 혈장으로부터 추출한다. RNA 펠렛을 디에틸피로카보네이트-처리된 물 26L에 용해시킨다.
역전사 반응물은 RNA 13L, 역전사 혼합물(제1-스트랜드 완충제, 0.1M DTT, 20U RNasin(Promega, Madison, WI), 각각 0.4mM dNTP, 및 200단위의 몰로니 쥐 백혈구 바이러스(M-MLV) 역전사효소를 함유함)10L를 함유한다. 하기 프라이머 혼합물(모두 50M) 2L를 처리 조건에 따라 추가로 가한다: (1) N6 랜덤 프라이머 2L; (2) N6 랜덤 프라이머 1L + LTR8RT 프라이머 1L; (3) N6 랜덤 프라이머 1L + POL3RT 프라이머 1L; (4) LTR8RT 1L + POL3RT 1L. 역전사 반응물을 42EC에서 30분 동안 항온처리하고, 100EC에서 5분 동안 가열한 다음 얼음상에서 1분 동안 냉각시킨다. 이어서, PCR 마스터 혼합물 75L를 cDNA-함유 반응 혼합물에 가하고, PCR을 하기 조건하에 수행한다: 96EC에서 3분간 예비가열, 이어서 96EC에서 5주기 용융시킨 다음 62EC에서 5초 동안 어닐링 및 증폭, 이어서 96EC에서 35주기 용융시킨 다음 68EC에서 40초 동안 어닐링 및 증폭. 이어서, 증폭 생성물을 4% 아가로즈 겔에서 분해시키고, 에티디움 브로마이드를 사용하여 가시화한다.
결과: 도 1 및 2에 설명된 바와 같이, HIV-특이적 역전사 프라이머를 단독으로 또는 랜덤 헥사머 프라이머와 배합하여 사용하는 것은 현저히 많은 HIV-1-특이적 증폭 생성물을 검출시킨다. 도 1의 레인 2 내지 10(랜덤 프라이머 단독)을 도 1의 레인 12 내지 20(LTR8RT + 랜덤 프라이머); 도 2의 레인 2 내지 10(POL3RT + 랜덤 프라이머) 및 도 2의 레인 12 내지 20(LTR8RT + POL3RT)과 비교하라. 또한, 이 결과는 100M 또는 200M 랜덤 프라이머를 사용하는 경우에도 관찰되었다.
실시예 2
환자 샘플내의 HIV RNA의 검출
하기 연구는 랜덤 헥사머 역전사 프라이머 또는 랜덤 프라이머를 HIV-특이적 역전사 프라이머와 배합 사용하여 환자 샘플에서 HIV RNA의 검출을 비교하기 위해 수행된다.
HIV-포지티브 혈장 샘플은 CD4 T-세포 수가 500을 초과하는 환자로부터 수집하는데, 이는 이들이 무증후성이고 바이러스 로딩이 비교적 낮다는 것을 나타낸다.
RNA를 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 혈장 샘플로부터 추출한다. RNA 용액 13L를 물 15L에 희석시킨다. 각각의 샘플은 역전사를 위해 2개의 12L 분액으로 나눈다. 2개의 역전사 반응 혼합물은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조한다. 각각의 혼합물은 100M 랜덤 프라이머 2L + 물 1L, 또는 100M 랜덤 프라이머 2L + 동일한 양의 하기 프라이머를 함유하는 50M HIV-특이적 프라이머 혼합물 1L를 함유한다: (1) POL3RT; (2) LTR8RT; (3) 2LTRRT; 및 (4) 2EnvRT. 역전사 및 증폭 반응은 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행한다.
HIV-특이적 증폭 생성물은 에티디움 브로마이드로 염색한 4% 아가로즈 겔상에서 겔 전기영동에 의해 또는 상기 기재된 SureCell9 비색 방법에 의해 검출한다.
결과: 도 3 및 도 4는 겔 전기영동에 의해 검출된 증폭 생성물을 설명한다. 비색 방법에 의한 HIV-특이적 증폭 생성물의 검출은 표 3에 비교 값으로 나타낸다. IPC는 내부 포지티브 대조군프라이머를 나타낸다.
랜던 프라이머 단독 N6 + RT 프라이머
LTR POL IPC LTR POL IPC
샘플 3/4 3/4 1P 3/4 3/4 1P
1 0 0 8 0 0 8
2 8 7 8 8 7 7.5
3 5 6 8 7 7 7.5
4 5 5 8 5 5 8
5 7 5 8 7.5 7.5 8
6 na na na na na na
7 6 7 8 5 7.5 8
8 8 8 8 8 8 8
9 2 2 8 3 0 8
10 5 7 8 7 8 8
11 6 7 8 6 6 8
12 8 8.5 8 7.5 9 7.5
13 8 7.5 8 8 7.5 8
14 0 0 8 0 0 9
15 0 0 8 0 0 8
16 2 0 8 7 8 9
17 7.5 7.5 8 7.5 7.5 8
18 6 7 8 6 7 8
19 7.5 7.5 7.5 7.5 8 8
20 2 1 8 5 5 8
21 6.5 6.5 8 7 7.5 7
22 1 1 8 3 5 8
23 3 1 8 2 2 8
24 7 9 8 7 9 7
25 na na na na na na
26 9 9 7 9 9 6.5
27 3 4 7 5 7 8.5
28 2 2 8 2 2 8.5
Neg 0 0 7 0 0 7
Pos 5 5 7 5 5 7
샘플 3 및 10에 있어서, 랜덤 헥사머 프라이머에 HIV-특이적 RT 프라이머의 부가는 랜덤 프라이머 단독을 사용하는 것보다 큰 증폭도를 나타냈다. 또한, 비색 방법에 의해 검출된 생성물의 양은 HIV-특이적 RT 프라이머가 사용되는 경우보다 이들 샘플에서 더욱 많았다.
샘플 16, 20 및 22에서는 역전사 반응에서 단지 랜덤 프라이머만을 사용하는 경우에 겔 전기영동 또는 비색에 의해 검출되지 않았다. 그러나, 이들 샘플은 HIV-특이적 RT 프라이머가 랜덤 프라이머에 부가하여 사용되는 경우에 포지티브였다.
이들 결과는 본 발명의 방법 및 조성물이 HIV에 대한 환자 또는 혈액 공급물의 스크리닝에 있어서 펄스 네가티브 결과의 빈도를 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
상기 언급된 모든 특허, 특허원, 문헌, 간행물 및 시험 방법은 전체로서 본원에서 참조로 인용된다.
본 발명의 많은 변형은 상기 상세한 설명에 비추어 본 기술 분야의 통상의 지식을 가진자에게 자명할 것이다. 이와 같은 명백한 변형은 첨부된 특허청구범위의 의도된 범위내에 포함된다.
본 발명의 방법 및 조성물은 HIV에 대한 환자 또는 혈액 공급물의 스크리닝에 있어서 펄스 네가티브 결과의 빈도를 감소시킬 수 있다.

Claims (18)

  1. (a) 생물학적 샘플로부터 유도된 사람 면역결핍 바이러스(HIV) RNA를, (i) 5'-CTTGTATTACTACTG-3'(서열 1), (ii) 5'-CCCTGTGGCGCC-3'(서열 2), (iii) 5'-GCGACTAGGAGAGA-3'(서열 3), (iv) 5'-CCCAGACGGTCAGT-3'(서열 4) 및 (v) 상기 서열의 배합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 올리고뉴클레오타이드가 상기 RNA의 일부분 이상에 상보성인 DNA의 합성을 프라이밍하는 조건하에 상기 올리고뉴클레오타이드와 접촉시킴을 포함하여, 생물학적 샘플내의 사람 면역결핍 바이러스(HIV) RNA를 역전사시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 샘플이 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 타액 및 뇌척수액으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, (b) 상기 cDNA를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. (a) 주형으로서 생물학적 샘플로부터 유도된 HIV RNA를 사용하고, 역전사 프라이머로서 상기 RNA내에 포함된 뉴클레오타이드 서열에 상보성인 올리고뉴클레오타이드(여기서, 역전사 프라이머는 (i) 5'-CTTGTATTACTACTG-3'(서열 1), (ii) 5'-CCCTGTGGCGCC-3'(서열 2), (iii) 5'-GCGACTAGGAGAGA-3'(서열 3), (iv) 5'-CCCAGACGGTCAGT-3'(서열 4) 및 (v) 상기 서열의 배합물로 이루어진 그룹중에서 선택된다)를 사용하여 역전사 반응을 수행함으로써 HIV-특이적 역전사 생성물을 생성하는 단계;
    (b) 상기 역전사 생성물을 증폭시켜 증폭 생성물을 생성하는 단계; 및
    (c) 증폭 생성물을 검출하는 단계를 포함하고, 증폭 생성물의 검출이 샘플내에 HIV RNA의 존재를 나타내는, 생물학적 샘플내의 HIV RNA의 존재의 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서, 샘플이 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 타액 및 뇌척수액으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 증폭이 폴리머라제 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응 및 스트랜드 치환 증폭으로 이루어진 그룹중에서 선택된 방법에 의해 수행되는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 검출이 증폭 생성물의 겔 전기영동, 고체 지지체상에서 증폭 생성물의 포획 및 증폭 생성물의 화학발광 검출로 이루어진 그룹중에서 선택된 방법에 의해 수행되는 방법.
  8. 올리고뉴클레오타이드 5'-CTTGTATTACTACTG-3'(서열 1).
  9. 올리고뉴클레오타이드 5'-CCCTGTGGCGCC-3'(서열 2).
  10. 올리고뉴클레오타이드 5'-GCGACTAGGAGAGA-3'(서열 3).
  11. 올리고뉴클레오타이드 5'-CCCAGACGGTCAGT-3'(서열 4).
  12. 올리고뉴클레오타이드 5'-CTTGTATTACTACTG-3'(서열 1)을 포함하는 HIV-특이적 역전사 프라이머.
  13. 올리고뉴클레오타이드 5'-CCCTGTGGCGCC-3'(서열 2)을 포함하는 HIV-특이적 역전사 프라이머.
  14. 올리고뉴클레오타이드 5'-GCGACTAGGAGAGA-3'(서열 3)을 포함하는 HIV-특이적 역전사 프라이머.
  15. 올리고뉴클레오타이드 5'-CCCAGACGGTCAGT-3'(서열 4)을 포함하는 HIV-특이적 역전사 프라이머.
  16. (a) 5'-CTTGTATTACTACTG-3'(서열 1),
    (b) 5'-CCCTGTGGCGCC-3'(서열 2),
    (c) 5'-GCGACTAGGAGAGA-3'(서열 3),
    (d) 5'-CCCAGACGGTCAGT-3'(서열 4) 및
    (e) 상기 서열의 배합물로 이루어진 그룹중에서 선택된 역전사 프라이머를 포함하는, 생물학적 샘플내의 HIV-1, HIV-2 또는 이의 배합물을 검출하기 위한 키트.
  17. 제1항에 있어서, 생물학적 샘플로부터 유도된 HIV RNA를, 랜덤 헥사머 올리고뉴클레오타이드가 상기 RNA의 일부분 이상에 상보성인 DNA의 합성을 프라이밍하는 조건하에 랜덤 헥사머 올리고뉴클레오타이드와 동시에 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제4항에 있어서, 단계 (a)에서 랜덤 헥사머 올리고뉴클레오타이드가 추가로 역전사 프라이머로서 사용되는 방법.
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