CN1271020A - 有效检测hiv－1和hiv－2的寡核苷酸逆转录引物及其应用方法 - Google Patents

有效检测hiv－1和hiv－2的寡核苷酸逆转录引物及其应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了检测人的生物样品中人免疫缺陷病毒的方法和试剂盒。还描述了寡核苷酸逆转录引物在这种检测人免疫缺陷病毒的方法和试剂盒中的应用。

Description

有效检测HIV-1和HIV-2的寡 核苷酸逆转录引物及其应用方法
本发明涉及改进的检测生物样品核酸序列的方法，特别是检测来源于感染性微生物的序列的方法。
全世界数百万人感染有人免疫缺陷病毒(HIV)。因此，HIV感染成了严重的社会健康问题。HIV感染经过污染的血液制品传播，这就意味着迫切需要能够在患者的样品中检测出少量HIV RNA的筛选方法。而且，改进的HIV感染治疗方法有效性的提高意味着感染患者的早期检测非常重要，以便开始进行适宜的治疗。
因此，本领域中需要可用于诊断和筛选的高度敏感的HIV的检测方法。
本发明提供一种逆转录生物样品中人免疫缺陷病毒(HIV)RNA的方法，此方法包括：
(a)用一种寡核苷酸与来源于上述样品的RNA接触，条件是其中所述的寡核苷酸引发与上述RNA的至少一部分互补的DNA的合成；
其中所述的寡核苷酸选自下列寡核苷酸组成的组：
    (i)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列1>、
    (ii)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列2>、
    (iii)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列3>、
    (iv)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列4>、或者
    (v)上述的任意组合。
另一方面，本发明提供一种检测生物样品中人免疫缺陷病毒(HIV)RNA存在的方法，此方法包括：
(a)进行逆转录反应，用来源于样品的RNA作为一种模板，并且用一种寡核苷酸产生HIV-特异性逆转录产物，此寡核苷酸与RNA中所包括的核苷酸序列互补，它在此为一种引物，
其中的引物选自由下列组成的组：
    (i)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列1>、
    (ii)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列2>、
    (iii)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列3>、
    (iv)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列4>、或者
    (v)上述任意的组合；
(b)扩增逆转录反应的产物以产生扩增产物；以及
(c)检测扩增产物；
其中扩增产物的检出显示样品中HIVRNA的存在。
扩增可以通过任何方法完成，优选聚合酶链反应(PCR)。本发明HIV-特异性逆转录引物的使用提供了一种用于检测样品(优选血浆)中HIV-1和/或HIV-2的敏感的方法。
再一方面，本发明提供了检测生物样品中HIV-1、HIV-2、或其组合的试剂盒，其中试剂盒包括一种逆转录引物，该引物选自由下列组成的组：
    (a)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列1>、
    (b)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列2>、
    (c)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列3>、
    (d)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列4>、或者
    (e)上述任意的组合。
此试剂盒还可以包括用于逆转录、扩增和产物检测的试剂和说明。
附图1是用溴化乙锭染色的4％琼脂糖凝胶的显影说明，它显示应用(a)随机六聚体引物(泳道2-10)；或(b)随机六聚体引物和LTR8RT的混合物(泳道12-20)作为一种逆转录引物而获得的HIV-1-特异性扩增产物。泳道1含有标记物，泳道22、24和26为对照样品。
附图2是用溴化乙锭染色的4％琼脂糖凝胶的显影说明，它显示应用(a)随机六聚体引物和POL3RT的混合物(泳道2-10)或(b)LTR8RT和POL3RT的混合物(泳道12-20)作为一种逆转录引物而获得的HIV-1-特异性扩增产物。泳道1含有标记物，泳道22、24和26为对照样品。
附图3是用溴乙锭染色的4％琼脂糖凝胶的显影说明，它显示应用(a)随机六聚体引物(泳道2-13)或(b)随机六聚体引物与POL3RT、LTR8RT、2LTRRT和2EnvRT的混合物(泳道15-26)而获得的HIV-1-特异性扩增产物。泳道1含有标记物。
附图4是用溴乙锭染色的4％琼脂糖凝胶的显影说明，它显示应用(a)随机六聚体引物(泳道2-15)；或(b)随机六聚体引物与POL3RT、LTR8RT、2LTRRT和2EnvRT的混合物(泳道16-29)而获得的HIV-1-特异性扩增产物。泳道1和30含有标记物。
本发明人已经发现：当具有与HIV RNA中某些序列存在互补的序列的寡核苷酸用作逆转录的引物时，检测生物样品中人免疫缺陷病毒(HIV)更有效。优选，引物的序列与HIV RNA的3’端附近的序列对应。
许多分子生物学、微生物学、重组DNA和蛋白质生物化学中的技术用于实施本发明，例如下列中所述，《现代分子生物学技术》，第1、II和III卷，1997(F.M.，Ausubel编)；Sambrook等，1989，《分子克隆：实验室手册》，第二版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约；《DNA克隆：一种实用手册》，第I、II卷，1985(D.N.，Glover编)；《寡核苷酸合成》，1984(M.L.，Gait编)；《转录和翻译》，1984(Hames和Higgins编)；《分子克隆的操作指南》；丛书，《酶学方法》(学术出版社，Inc.)；以及《蛋白质的纯化：原理和操作》，第二版(Springer-Verlag，纽约)。
这里所用的“核酸”或“多核苷酸”是指任何长度的含嘌呤和嘧啶的聚合物，可以是多核糖核苷酸，可以是多脱氧核糖核苷酸，或是混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸。它包括单链和双链分子，例如DNA-DNA，DNA-RNA和RNA-RNA杂交体，以及通过与氨基酸主链共轭碱基形成的“蛋白质核酸”(PNA)。它还包括含有修饰碱基的核酸。
这里所用的核酸序列的“互补体”是指参与与原始序列沃森-克里克碱基配对的反义序列。
这里所用的“引物”是长度约为5个至50个核苷酸的寡核苷酸，优选长度为大约6个至25个核苷酸，特别优选长度为大约6个至18个核苷酸，它与相关的单链核酸序列形成一个双链体，并且可以用例如逆转录酶或DNA聚合酶使互补链发生聚合反应。
这里所用的“分离的”核酸或多肽是指一种从它的原始环境(例如如果它是天然产生的，是指它的天然环境，或如果它是合成的，是指它的反应混合物)中去除的成分。分离的核酸或多肽一般所含的与其原始成分相关的成分通常小于约50％左右，优选小于约75％左右，特别优选小于约90％左右。
“来源于”指定序列的核酸序列是指对应于指定序列区域的序列。它包含与此序列同源或互补的序列。
内部阳性对照≌(IPC)靶核酸是指一种被克隆到质粒载体中的合成核酸序列，此质粒载体然后通常通过限制性内切核酸酶的作用线性化。一种IPC通常有多引物结合序列包围基因探针结合区，并且它在核酸扩增反应中充当假阴性结果的基因对照。
优选的内部阳性对照靶DNA的序列为：5’-CGCCAGCGTGGACCATCAAGTAGTAATGAACGCACGGACGAGGACATCATAGAGATTACACCTTTATCCACAGTTCTCGGTCTAACGCAGCAGTCAGTGTATCAGCACCAGCATCCGTAGTGAGTCTTCAGTGTCTGCTCCAGGATCGTG-3’<序列5>。
在此所用适宜的逆转录条件为一种寡核苷酸引发cDNA的合成，它包括在一定温度下，将RNA和引物寡核苷酸与一种逆转录酶和核苷酸在一定温度下保温一定时间，以产生cDNA的合成。
可通过常用的方法制备核酸，此核酸包含此处或随后公开的序列。例如，可通过化学方法合成DNA，例如应用Matteucci等人的“氨基亚磷酸酯载体方法”，1981，J.Am.Chem Soc.103：3185，Yoo等的方法，1989，J.Biol.Chem.764：17078或其它已熟知的方法。也可通过本领域已知的许多方法修饰此核酸。这种修饰的非限制性的实例包括甲基化，“加帽”，用一种类似物取代一个或多个天然核苷酸，和核苷酸间修饰，诸如不带电连结(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸盐、氨基甲酸酯等)或带电连结(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。核酸可包含一个或多个附加的共价连结部分，诸如蛋白(核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚左旋赖氨酸等)、嵌入剂(丫啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如金属、放射性金属、铁、氧化金属等)和烷化剂。名词“核酸”也包含PNA。此核酸可衍生自一种甲基或乙基磷酸三酯或一种烷基氨基磷酸盐连结的形成。而且，本发明的核酸序列也可用一种标记物进行修饰，此标记物可直接地或者间接地提供检测信号。典型的标记物包括放射性同位素、荧光分子、生物素等等。
在此所用的扩增是指一种重复的方法，通过此方法复制核酸。适宜的扩增方法包括聚合酶链反应、连接酶链反应和转录介导的扩增，但不局限于这些。
在此所用的人免疫缺陷病毒(HIV)指逆转录病毒属的物种，包括：HIV-1、HIV-2和SIV，以及它们的变种。本发明可检测的HIV分离群包括HIV-1和HIV-2，但并不局限于此。
本发明提供自生物样品逆转录HIV RNA的方法，此方法用于检测生物样品中的HIV。检测到HIV特异扩增产物表明此样品中存在HIV RNA。
根据本发明，通过任何常规方法获得患者的生物样品。适宜的生物样品包括但不局限于血、血清、血浆、尿、乳汁、组织样品和脑脊液。优选血浆作为HIV RNA的来源。
可通过任意方法处理生物样品，以便逆转录试剂接近RNA，特别是样品中包含的HIV RNA。“来源于”生物样品的RNA为开始存在于样品中，并且通过处理样品而获得接近途径的各种RNA。优选应用本领域所熟知的任意方法提取RNA，诸如应用硫氰酸瓜的方法，或者应用市售的试剂或方法，诸如Gentra SystemsInc.的PureScriptθ(Minneapolis MN)。可应用任意能够分离核糖核酸酶的RNA、其它蛋白质、和/或其它任何可干扰逆转录的组分的提取方法。
然后将样品中提取的RNA与寡核苷酸引物接触，在此寡核苷酸引发DNA合成，所合成的DNA与所提取RNA的至少一部分互补。寡核苷酸引物的序列来源于HIV的序列。此引物对应于HIV RNA的区域可能为下游序列，即3’端，此区的检测是需要的。这些区可包括，例如长末端重复序列(LTR)区，此区编码病毒逆转录酶(Pol)、Gag蛋白、Tat蛋白、包膜糖蛋白、Vif、Vpr和Vpu蛋白，以及Rev区，它编码一种转录因子反应成分。优选此引物对应于HIV基因组近3’端的序列。此引物序列可用于特异性地鉴别HIV特异分离物(例如HIV-1和HIV-2的分离物)。通过引物与来源于此分离物的RNA杂交，引物可鉴别一种特异的分离物，在此条件下它不与其他分离物的RNA杂交，即引物自身含有其分离物之间不同的序列。可替代的方法为，可应用此引物的序列引发一个HIV RNA片段的合成，此片段在不同分离物之间是不同的，即分离物之间不同的序列可能为引物序列的下游序列。
根据序列保守的理论考虑、分子内和分子间的相互作用、以及预测的扩增子和环境序列的二级结构来选择可用于实施本发明的逆转录引物。而且设计此引物和检测系统，以进行HIV基因组、多病毒种和内部阳性对照(IPC)RNA(或DNA)的联合扩增(和联合检测)。
非限制性的本发明逆转录引物的实例显示于表1中。
                           表1
来源   标示     序  列   序列号
HIV-1  POL3RT  5’-CTTGTATTACTACTG-3’     1
HIV-1  LTR8RT  5’-CCCTGTGGCGCC-3’     2
HIV-2  2LTR1RT  5’-GCGACTAGGAGAGA-3’     3
HIV-2  2Env2RT  5’-CCCAGACGGTCAGT-3’     4
应用一个或多个上述引物进行逆转录。也可加入随机引物，诸如随机六聚体逆转录引物(N6，Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。应用常规方法进行逆转录，诸如在《当代分子生物学技术》，第I、II和III卷，1997(F.M.，Ausubel编)中；在美国专利5,322,770中；Young等在J.Clin.Microbiol.31(4)：882(1993)中；Myers等在《生物化学》30(3)：7661(1991)中；或者序列号＿＿，代理号2094/0E287的待审专利申请中所述的方法。
在逆转录反应后，可通过常规方法分离并回收cDNA产物或其它产物。优选扩增cDNA产物或其它产物。可应用任意方法进行扩增，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应、链置换扩增、转录介导扩增和核酸单碱基扩增，但并不仅仅限制于这些。优选应用PCR。通常将含有所有为实施PCR而必需的组分的反应混合物(包括HIV-特异扩增引物)直接加入逆转录反应混合物。然后应用所用引物对指定的条件完成扩增。例如在序列号＿＿，代理号2094/0E285的美国专利申请和下面实施例中公开了适宜的扩增引物对。
扩增后，应用本领域已知的任意方法检测扩增产物，包括琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳；在载体上获得扩增产物(例如参见下面的实施例1)，然后进行比色检测；ECi检测；荧光、放射性同位素检测和化学发光检测，但并不仅仅限制于这些。可在市场上获得用于这些检测方法的试剂，例如Molecular Probes、Eugene、Oregon和Ortho Clinical Diagnostics，Rochester，NY。
检测到HIV-特异扩增产物表明样品中存在HIV RNA。当应用凝胶电泳时，通过其大小确定HIV-特异扩增产物，正如根据与反应中所用扩增引物对应的序列在HIV RNA中的定位所预测的一样。
本发明提供检测生物样品中HIV RNA的试剂盒，它包含上面表1中所示的一个或多个逆转录引物。此试剂盒还包含用于逆转录的试剂，以及例如通过PCR检测HIV cDNA的附加试剂。
下面的实施例是对本发明进行举例说明，并不是来限制本发明。方法：
 1、样品制备：
应用硫氰酸瓜或PureScriptθRNA分离试剂(Gentra Systems，Minneapolis MN)制备血浆样品的RNA。对厂家用于体液的技术方案进行改进，包括应用40g糖原而不是用20g作为载体以促进病毒RNA的沉淀。另外，在大多数情况下，进行RNA的异丙醇沉淀，并用乙醇冲洗此RNA球后，将此RNA球再悬浮于RT缓冲混合物中，而不是将其悬浮于厂家所提供的RNA水合溶液中。
2、逆转录：
通过将100U重组Moloney鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶(RT)(GibcoBRL，Gaithersburg，Maryland)加入到50L溶液中，该溶液含有50mM Tris-HCl(PH8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM的每种dNTP(PharmaciaBiotech)、4M随机六聚体(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)和/或特异性逆转录引物，以及20单位RNA酶抑制剂(Promega，Madison，Wisconsin)的焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水溶液，来催化由RNA合成cDNA。在42EC保温30分钟后，在100EC进行RT反应5分钟，以破坏RT的活性。将每个反应冷却1分钟，然后以16000xg微量离心4秒。
3、PCR扩增：
于一种PE9600热循环器(Perkin-Elmer)中，在含25mM Tris-HCl、3mMMgCl2、0.725mM EDTA、54mM KCl、3.72mM NaCl、40M DTT、108g/ml明胶(IV型)、9.5％甘油、0.02％Tween 20、0.02％NP40、小牛胸腺DNA(2g)、1.2mM的每种dNTP、0.4M每种引物、10份线性化内部阳性对照(IPC)质粒DNA和16U的Taq聚合酶的100L溶液中进行PCR。将Taq、TP1-12和TP4-9的单克隆抗体加入此反应，它们与Taq聚合酶的摩尔比分别为50∶1和5∶1，这样使抗体与Taq聚合酶的摩尔比为55∶1，这些抗体的制备方法公开在美国专利5,338,671中。在96EC进行初变性3分钟后，40轮的扩增在96EC进行5秒，并在68EC进行40秒。循环结束时，在103EC进行一种热后步骤5分钟，以灭活Taq聚合酶。所用的扩增引物显示于下面表2中。
                                表2
 ID   来源         序列    序列号
 JBLTR4   HIV-1(s)  5’-CTG GTT AAG CCT CAATAA AGC TTG CCT TGA-3’     6
 JBLTR6   HIV-1(as)  5’-GGG TCT GAG GGA TCTCTA GTT ACC AGA GT-3’     7
 JBLTR8   HIV-1(as)  5’-TGT TCG GGC GCC ACTGCT AGA GA-3’     8
 2LTRe   HIV-2(s)  5’-GGG AGG TTC TCT CCAGCA CTA GCA-3’     9
 2LTR-R1   HIV-2(as)  5’-GCG ACT AGG AGA GATGGG AAC ACA CA-3’     10
4、PCR产物的检测：
可通过(i)凝胶电泳，然后进行溴化乙锭染色；也可通过(ii)在扩增过程中应用5’-生物素标记的引物(有义链)来检测PCR的产物。在这种情况中，通过杂交到寡核苷酸探针而捕获此扩增产物，此寡核苷酸探针与胶乳颗粒共价连接，这些胶乳颗粒沉积在一种流通膜(SureCellθtests，Ortho ClinicalDiagnostics，Rochester，NY)的表面。HIV-1探针为：5’-CAACAGACGGGCACACACTACT-3’(JBLTRpr)<序列号11>和5’-GAACAGATGGGCACACACTGCT-3’(JBLTRpr4)<序列号12>；HIV-2探针为：5’-CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC-3’(2LTRpr1)<序列号13>。将探针/产物复合体与链霉亲和素(SA)-辣根过氧化物酶(HRP)结合物反应，它可催化一种染料前体氧化转变为一种染料(蓝色)。将颜色强度与颜色标准进行对比，通过视觉对蓝色强度进行计分(0-10)。所有视觉颜色得分＞3者被认为是阳性结果。实施例1：应用HIV-特异引物或随机引物的逆转录效率
应用本发明HIV-特异引物或随机六聚体逆转录引物(N6，PharmaciaBiotech)进行下面的实验，以比较来源于人血浆样品的HIV RNA的逆转录效率。
稀释人血浆，使每100L中含有1000份HIV RNA，这样每个反应中大约含有100份HIV RNA。用硫氰酸胍从血浆中提取RNA。将此RNA球溶解在26L焦碳酸二乙酯处理水中。
此逆转录反应物包含：13L RNA、10L逆转录混合物(它含有first-strand缓冲剂、0.1M DTT、20U RNA酶(Promega，Madison，WI)、0.4mM的每种dNTP和200单位Moloney Murine Leukemia Virus(M-MLV)逆转录酶)。然后根据被检测的条件加入另外2L下面的引物混合物(它们均为50M)，这些引物混合物为：(1)2LN6随机引物；(2)1LN6随机引物+1LLTR8RT引物；(3)1LN6随机引物+1LPOL3RT引物；(4)1LLTR8RT+1LPOL3RT。将此逆转录反应在42EC保温30分钟；加热至100EC保持5分钟；然后在冰上冷却1分钟。然后将75L PCR主混合物加入含cDNA的反应混合物中，在下面的条件下进行PCR：在96EC预热3分钟，在96EC进行5轮解链，然后在62EC进行退火和扩增5秒，然后在96EC进行35轮解链，并在68EC进行退火和扩增40秒。然后在4％琼脂糖凝胶中解析扩增产物，并用溴化乙锭显色。
结果：如附图1和2中所示，应用HIV-特异逆转录引物，不论是单独使用，还是与随机六聚体引物一起使用，都可使检测到的HIV-1-特异扩增产物显著地增多。将附图1的泳道2-10(仅应用随机引物)与附图1泳道12-20(LTR8RT+随机引物)、附图2的泳道2-10(POL3RT+随机引物)和附图2的泳道12-20(LTR8RT+POL3RT)进行比较。还观察了应用100M或200M随机引物时的结果。实施例2：患者样品中HIV RNA的检测
进行下面的研究，应用随机六聚体逆转录引物和联合应用随机引物与HIV-特异逆转录引物对患者样品中HIV RNA的检测进行比较。
从CD4 T细胞计数大于500的患者中采集HIV阳性血浆样品，这表明他们是无症状的，并且其病毒含量比较低。
按照上面实施例1中所述的方法，从血浆样品中提取RNA。将13L的这种RNA溶液稀释于15L水中。将每个样品分为12L的二等份，以进行逆转录。按照上面实施例1所述的方法制备这2个逆转录反应混合物。每个混合物或者包含2L的100M随机引物+1L水，或者包含2L的100M随机引物+1L 50M的HIV特异引物混合物，此混合物含有等量下面的引物：(1)POL3RT；(2)LTR8RT；(3)2LTRRT和(4)2EnvRT。按照上面实施例1所述的方法进行逆转录和扩增反应。
通过在4％琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳，并用溴乙锭染色而检测HIV特异扩增产物，并且也可通过上述SureCellθ比色法进行检测。
结果：附图3和4显示的是通过凝胶电泳检测的扩增产物。表3是通过相对值表示用比色法检测的HIV特异扩增产物。IPC表示内部阳性对照≌引物。
                                 表3
          仅用随机引物              N6+RT引物
    LTR     POL     IPC     LTR     POL     IPC
   样品     3/4     3/4     1P     3/4     3/4     1P
    1     0     0     8     0     0     8
    2     8     7     8     8     7     7.5
    3     5     6     8     7     7     7.5
    4     5     5     8     5     5     8
    5     7     5     8     7.5     7.5     8
    6     无     无     无     无     无     无
    7     6     7     8     5     7.5     8
    8     8     8     8     8     8     8
    9     2     2     8     3     0     8
    10     5     7     8     7     8     8
    11     6     7     8     6     6     8
    12     8     8.5     8     7.5     9     7.5
    13     8     7.5     8     8     7.5     8
    14     0     0     8     0     0     9
    15     0     0     8     0     0     8
    16     2     0     8     7     8     9
    17     7.5     7.5     8     7.5     7.5     8
    18     6     7     8     6     7     8
    19     7.5     7.5     7.5     7.5     8     8
    20     2     1     8     5     5     8
    21     6.5     6.5     8     7     7.5     7
    22     1     1     8     3     5     8
    23     3     1     8     2     2     8
    24     7     9     8     7     9     7
    25     无     无     无     无     无     无
    26     9     9     7     9     9     6.5
    27     3     4     7     5     7     8.5
    28     2     2     8     2     2     8.5
    阴性     0     0     7     0     0     7
    阳性     5     5     7     5     5     7
样品3和10中，在随机六聚体引物中加入HIV特异逆转录引物比单独应用随机引物所引起的扩增反应的程度大。在应用HIV特异逆转录引物的样品中用比色法检测的产物的量也较多。
在逆转录反应中仅用随机引物时，既没有用凝胶电泳，也没有用比色法检测样品16、20和22。但当一起应用随机引物和HIV特异逆转录引物时，这些样品为阳性。
这些结果表明本发明的方法和组合物在筛选患者和供血者的HIV时可减少假阴性结果的发生率。
前面提到的所有专利、申请、论文、出版物和试验方法在这里全部作为参考文献引用。
本领域的技术人员可根据上面本发明的说明书对本发明进行一些改变。这些显见的改变均是在所附权利要求书允许的全部预期范围内进行。

Claims (18)

1、一种逆转录生物样品中人免疫缺陷病毒(HIV)RNA的方法，所述方法包括：
(a)用一种寡核苷酸与来源于上述样品的RNA接触，其中所述的寡核苷酸引发DNA的合成，所述DNA与上述RNA的至少一部分互补；
其中所述的寡核苷酸选自下列寡核苷酸组成的组：
    (i)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列号1>、
    (ii)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列号2>、
    (iii)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列号3>、
    (iv)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列号4>、和
    (v)上述的任意组合。
2、一种如权利要求1所述的方法，其中所述的样品选自由血液、血清、血浆、尿、唾液和脑脊液组成的组。
3、一种如权利要求1所述的方法，它还包括(b)回收所述的cDNA。
4、一种检测生物样品中人免疫缺陷病毒(HIV)RNA存在的方法，所述方法包括：
(a)进行逆转录反应，用来源于样品的RNA作为一种模板，并且用一种寡核苷酸产生HIV-特异性逆转录产物，此寡核苷酸与RNA中所包括的核苷酸序列互补，它在此为一种逆转录引物，
其中所述的逆转录引物选自由下列组成的组：
    (i)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列号1>、
    (ii)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列号2>、
    (iii)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列号3>、
    (iv)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列号4>、和
    (v)上述任意的组合；
(b)扩增所述逆转录产物以产生扩增产物；以及
(c)检测所述扩增产物；
其中所述扩增的扩增产物的检测表明样品中HIV RNA的存在。
5、一种如权利要求4所述的方法，其中所述的样品选自由血液、血清、血浆、尿、唾液和脑脊液组成的组。
6、一种如权利要求4所述的方法，其中所述的扩增是通过一种选自聚合酶链反应、连接酶链反应和链置换扩增的方法进行的。
7、一种如权利要求4所述的方法，其中所述的检测是通过一种选自扩增产物凝胶电泳、扩增产物在固体载体上的捕获和扩增产物化学发光检测的方法进行的。
8、寡核苷酸5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列号1>。
9、寡核苷酸5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列号2>。
10、寡核苷酸5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列号3>。
11、寡核苷酸5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列号4>。
12、一种HIV特异逆转录引物，它包含寡核苷酸5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列号1>。
13、一种HIV特异逆转录引物，它包含寡核苷酸5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列号2>。
14、一种HIV特异逆转录引物，它包含寡核苷酸5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列号3>。
15、一种HIV特异逆转录引物，它包含寡核苷酸5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列号4>。
16、一种检测生物样品中HIV-1、HIV-2或其组合的试剂盒，所述试剂盒包含一种逆转录引物，它选自下列组成的组：
      (a)5’-CTTGTATTACTACTG-3’<序列号1>、
      (b)5’-CCCTGTGGCGCC-3’<序列号2>、
      (c)5’-GCGACTAGGAGAGA-3’<序列号3>、
      (d)5’-CCCAGACGGTCAGT-3’<序列号4>、
      (e)上述任意的组合。
17、一种如权利要求1所述的方法，它还包含用随机六聚体寡核苷酸同时与来源于所述样品的RNA接触，条件是其中所述的随机六聚体寡核苷酸引发DNA的合成，所述DNA与上述RNA的至少一部分互补。
18、一种如权利要求4所述的方法，其中在步骤(a)中随机六聚体寡核苷酸也用作逆转录引物。
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