JPH074275B2 - 核酸を増幅して検出するための方法及び診断試験キット - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応で核酸を検出するため
の方法に関する。本発明は、ゲノム、細菌またはウイル
スDNAに関連する核酸を興味の対象とする診断アッセイ
または遺伝子研究で核酸を検出するために使用すること
ができる。

〔従来の技術〕

近年、核酸プローブ法は、研究者が試験試料中に非常に
少量存在する種々の疾患、生物体または遺伝子の特徴の
検出にその価値を見い出すにつれ急速に発達した。プロ
ーブの使用は、相補性の概念に基づく。DNAでは、２本
の鎖が相補的ヌクレオチド間で水素結合によって相互に
結合している（ヌクレオチド対としても知られてい
る）。

このDNA複合物は通常安定であるが、水素結合を破壊す
る条件によってそれらの鎖は分離（変性）することがで
きる。解離された一本鎖は相補的配列のヌクレオチド類
を有する他の鎖と再結合しうるだけであろう。このハイ
ブリッド形成工程は溶液中または固体支持体上で起こり
うる。

標的生物体または細胞のDNAまたはRNAの標的核酸配列
は、全体的な鎖がほんの小さな部分である可能性があ
り、殆どの既知標識DNAプローブを使用してもその存在
を検出することが非常に困難である。プローブの感度や
核酸合成の改良を初めとする多くの研究はこの課題を解
決するために行われてきた。

当該技術分野における有意な進展は、米国特許第4,683,
195号および同4,683,202号明細書に記載されている。広
範囲にわたり詳細に論ずることなく、これらの特許はプ
ライマーが重合剤（例えば、ポリメラーゼ）やヌクレオ
シド三リン酸の存在下で核酸の鋳型にハイブリッド形成
し、次いでこれらのプライマー類からエクステンション
産物が生成される増幅方法を記載する。これらの産物は
変性され、次いでそれらのその後の検出を容易にするた
め存在する核酸の数および量を増幅する周期的な反応の
鋳型として使用される。この増幅方法は、少量の標的核
酸配列から多量の検出可能な物質を生成するのにかなり
長時間かけて周期的に実施することができる。

DNA配列決定に関するより最近の進展は、ギレンステン
（Gyllensten）ら（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,7652〜
7656ページ,1988年,10月）に記載されている。一本鎖DN
Aが一組になったプライマーの限定された量のプライマ
ー類の１つを使用するPCR手段によって生成されてい
る。このようなDNAは遺伝子、例えばHLA−DQ_α遺伝子座
の直接的な配列決定やハイブリッド形成プローブの発生
に使用することができる。配列決定における核酸断片の
検出は放射性同位体標識デオキシリボヌクレオシド三リ
ン酸の使用によって行われている。放射性同位体も標識
プローブも同様に調製されている。

しかしながら、この技術ではPCR検出方法で一様でない
プライマー濃度の使用またはそれが特定のアッセイを提
供するかも知れない利点を考慮しそこなっている。

〔発明が解決しようとする課題〕

核酸検出用標識として放射性同位体の使用は既知であ
り、そして一定の利点を提供するかも知れないが、簡便
で、安全でかつ単純な方法の製品や保存期限の長い診断
試験キットにおいては相当な欠点を有する。放射性同位
体の使用に由来する危険性が取り扱い上の難点であるこ
とは明白である。医院や遠隔地で使用する目的で試験キ
ット中にそれらを包装することは容易でないであろう。
さらに、核酸プローブで普通に使用される同位体は短い
（すなわち、２ないし３日）半減期を有する。従って、
それらは保存期限が制限されてきた。

放射性同位体の使用によって提起される課題を回避する
ことが有利であろう。このような手段は、種々の免疫学
的なアッセイに普通に使用されている酵素標識によって
提供されるかも知れない。しかしながら、ペルオキシダ
ーゼを初めとする多くの酵素は、熱感受性であり高温で
失活する。PCR法では、検出前にプライマーエクステン
ション産物の変性を初めとする特定の工程で高温をしば
しば必要とする。変性工程で失活を避けるべく注意がは
らわれなかった場合にはその変性中に酵素標識が失活さ
れうる可能性がある。従って、診断試験キットが許容さ
れる保存期限を有すると共に、核酸検出の安全で、簡便
でかつ単純な方法を提供する手段について絶えることの
ない欲求が存在する。

〔課題を解決するための手段〕

従来方法の課題は、次の工程を含んでなる２つの相補鎖
を有する核酸の検出方法を用いて解決された。

A.ハイブリッド形成条件下で、変性された核酸の相補鎖
に実質的に相補的である一組のプライマーを使用してプ
ライマーエクステンション産物を形成する工程であっ
て、エクステンション産物がそれらの相補体から分離さ
れたとき前記エクステンション産物の合成用鋳型として
働くことができ、そして前記各プライマーが少なくとも
2:1のモル比で増幅の初期時点から存在し、その過多量
で存在するプライマーがビオチン化されている前記工
程、 B.前記プライマーエクステンション産物を、それらが合
成された鋳型から分離する工程、 C.前記分離されたプライマーエクステンション産物を増
幅条件にかける工程、ならびに D.工程Ｃで形成された増幅産物をさらに変性させること
なく、過多の前記ビオチン化プライマーによって形成さ
れた前記プライマーエクステンション産物の存在を比色
的または蛍光的に検出する工程であって、前記検出が、
ビオチンと反応する特異的結合部位をもった酵素標識試
薬を使用しその基質の存在下で検出可能な比色シグナル
または蛍光シグナルを提供するように行われ、そして過
多の前記ビオチン化プライマーによって形成された前記
プライマーエクステンション産物は、前記プライマーエ
クステンション産物に相補的であり且つハイブリダイズ
可能な捕捉プローブを用いて捕捉されることを特徴とす
る工程。

さらに、本発明は、 ａ）混合物中の標的核酸に対する、少なくとも約2:1の
モル比で存在し過多量のプライマーがビオチン化されて
いる一組のプライマー、 ｂ）DNAポリメラーゼ、 ｃ）デオキシリボヌクレオチド−５′−三リン酸、 ｄ）ビオチンと反応する特異的結合部位をもった酵素標
識試薬、及び ｅ）過多のビオチン化プライマーによって形成されたプ
ライマーエクステンション産物に相補的であり且つハイ
ブリダイズ可能な捕捉プローブ、 を含む、標的核酸を増幅して検出するための診断試験キ
ットを提供する。

以下、本発明を具体的に説明する。

本発明は、試験被検体中で予定された（すなわち、標
的）１種以上の核酸に存在する特異的な核酸配列１種以
上の検出に向けられる。このような試料としては細胞
質、ウイルス体、毛髪、体液または検出することができ
る細菌、ウイルス、ゲノムDNAもしくはゲノムRNAを含有
する他の物質が挙げられる。

本発明は、使用される反応工程数に対し指数的量で予定
された核酸配列少なくとも１種を生産する連鎖反応と組
み合わせた場合に特に有用である。産物は、使用された
特異的核酸末端に対応する末端を有する個々の核酸複製
物であろう。精製または未精製のいずれかの核酸起源が
提供される出発原料として利用することができ、それは
増幅または検出を目差す特異的核酸を含むかまたは含む
ことが予測される。必要があれば核酸混合物を使用する
ことができる。複製せしめられる配列はフラグメントま
たは核酸全体であることができる。さらに、増幅せしめ
る各配列に対する一組（または対）のプライマーを使用
することによって１種を越える核酸配列を同時に増幅す
ることができる。

これらの配列は同一または相違する核酸であることがで
きる。

核酸は、プラスミドまたは植物、動物またはヒトのいず
れかを起源とする天然に見い出されるDNAを初めとする
各種起源から得ることができる。それは、血液、末梢血
単球、組織または当該技術分野で既知の他の起源を初め
とする各種組織から抽出することができる。この発明
は、感染個体内およびその間で異質性がいたるところに
存在しているウイルスによって感染された流体および細
胞から抽出されるウイルスDNA（例、ヒト乳頭腫ウイル
ス）、RNAウイルスおよびレトロウイルス（例、HIV−
Ｉ）の増幅および検出にとって特に有用である。

DNAは、多くのものは当該技術分野で周知のものであっ
て、その方法がDNAを分解しない限りいずれか適当な方
法を使用して被検体から単離される。例えば、Kanら、N
ew Eng.J.Med.297,1080〜1084ページ（1977）やNature,
251,392〜393ページ（1974）に記載されるように、DNA
が分解される傾向を低減した温度およびpHで緩衝化され
たプロテアーゼまたはプロティナーゼＫを使用して細胞
からDNAは抽出されうる。他の抽出法は、Maniatisら（M
olecular Cloning, A Loboratory Manual, Cold Spring
Harbor Laboratory,1982）、ヨーロッパ特許公開第145
356号、同240191号および同245945号公報ならびにNunbe
rgら、Proc.Nat.Acad.Sci.（USA），75（11）,5553〜55
56ページ、1978およびSaikiら、Bio/Technology,３,100
8〜1012ページ（1985）に記載されている。

抽出されたDNAは、透析、クロマトグラフィー、相補的
核酸を使用する親和性捕捉によるか、または当業者に自
明の他の適当な方法によって精製することができる。

単離されたDNAが得られると、それは関連する工程数に
対し指数的な量の分子を生産する増幅方法にかけられ
る。数種のDNA分子を興味の対象とする場合には、本発
明の増幅方法を使用してそれらのすべてを複製すること
ができるものと理解しなければならない。最終的結果物
は、その後評価のための類別手段にかけることができる
多量の検出可能な核酸である。

通常使用される増幅方法は、米国特許第4,683,195号お
よび同第4,683,202号（前述）にかなり詳細に記載され
ている。

プライマーは、一般的に、興味の対象とする核酸配列に
完全に相補的であるが、プライミングやプライマーエク
ステンション産物の生成に著しく悪影響を及ぼさない場
合、標的とプライマー間にある程度のミスマッチが存在
してもよい。このことは、「実質的に相補的」によって
表わされる。

この発明における増幅では個々の核酸に特異的な一対
（一組）のプライマーを使用することができる。このよ
うな対のプライマーでは、プライマーのモル濃度が一様
でないことが必須であり、一般に2:1を越えるモル比に
ある。好ましくは、モル比が少なくとも5:1であって、
必要によりさらに大きな比率であることもできる。プラ
イマー対の各々について多量に存在するプライマーは、
過多に存在するプライマーとみなしている。与えられた
標的核酸について適切なモル比は、標的核酸量、使用さ
れる増幅周波数および検出試薬の感度に依存するであろ
うし、当業者によって容易に決定されるであろう。その
比は、ポリメラーゼ連鎖反応における効率的な増幅およ
び変性を必要とすることなく１種のプライマーエクステ
ンション産物の効率的な検出のために設定することが重
要である。

与えられたプライマー対において少量で存在するプライ
マーの量もまた、公知文献および適当な実験から当業者
によって容易に決定されるであろう。一般的に、それ
は、少なくとも0.001マイクロモル濃度の量で存在し、
0.005〜0.5マイクロモル濃度であることが好ましい。一
般的に、この量が標的鎖の十分な増幅を提供するのに有
効である。

プライマー類は、通常一本鎖である。各プライマーの正
確な鎖長は、考慮されている用途、標的核酸の複雑さ、
反応温度およびプライマーの起源に応じて変動しうる。
一般的に、この発明で使用されるプライマー類は、15〜
50個のヌクレオチドを有し、そして好ましくは、それら
は20〜30個のヌクレオチドを有するであろう。

本発明で有用なプライマー類は各種起源から得るか、あ
るいは、例えば、ABI DNAシンセサイザー（Synthesize
r）（Applied Biosystemから入手可能）またはBiosearc
h（商標）8600シリーズ、8700シリーズもしくは8800シ
リーズのシンセサイザー（Milligen-Biosearch,Inc.よ
り入手可能）およびそれらの既知の使用方法を初めとす
る既知の技法および装置を使用して調製することができ
る。生物学的起源から単離された天然に見い出されるプ
ライマー類もまた有用である（例えば制限エンドヌクレ
アーゼ消化物）。

標的DNAが抽出され（必要があれば）そして変性された
時、それらの核酸鎖は、プライマー類と標的DNA鎖のハ
イブリッド形成産物の混合物が生成されるような条件下
で本明細書に記載されるプライマー対と接触される。こ
のような条件は、米国特許第4,683,202号明細書に記載
されるような増幅に通常使用されるものである。次に、
プライマーエクステンション産物が少なくとも１種のハ
イブリッド形成産物と共に生成され、次いで追加のプラ
イが施され、エクステンション産物が生成される。増幅
の最終周期後、過多のプライマーによって生成された産
物は、最終的に加熱（または変性）工程を必要としない
適当な方法で検出される。

プライマーエクステンション産物は、一般に、pH7〜９
に緩衝化された水性溶液でプライマーを使用することに
よって調製することができる。この合成混合液に適当量
のデオキシヌクレオシド三リン酸dATP,dCTP,DGTPおよび
dTTPも加えられ、次いで変性が必要な場合には、得られ
た溶液が10分未満90〜100℃に加熱される。この加熱
後、溶液が好ましくは室温まで冷却され、次いでプライ
マーエクステンション産物の生成を誘導するのに適する
剤（または触媒）が導入される。この誘導剤は、一般に
重合剤として当該技術分野で知られている。これらの産
物を生成するための反応は、既知の条件下で行われる
（一般に、室温から重合がもはや起らなくなるまでの温
度）。

重合剤は、酵素（例えば、大腸菌DNAポリメラーゼＩ、T
4 DNAポリメラーゼ、クレノウポリメラーゼ、逆転写酵
素および当該技術分野で既知の他の酵素）を初めとする
プライマーエクステンション産物の合成を遂行するよう
に作用するいずれかの化合物または試薬類の組み合わせ
であってよい。特に、有用な酵素は、クローン化された
かまたは天然の、例えば、種々の好熱細菌株から得られ
る熱安定性酵素である。

好ましい熱安定性酵素は、サーマス・アクアチクス（Th
ermus aquaticus）またはサーマス・サーモフィラス（T
hermus thermophilus）から単離されるか、あるいはヨ
ーロッパ特許公開第258017号および国際公開第89/06691
号公報に記載されるようなクローニング法によってゲノ
ムから合成的に調製されたDNAポリメラーゼである。

新たに合成された核酸鎖とそれらの個々のプライマー類
を含んでなる新たに生成されたプライマーエクステンシ
ョン産物は、本発明の方法の次の工程で使用される最初
の標的鎖と二本鎖分子を形成する。次に、これらの核酸
鎖は前述のように変性することによって分離されて一本
鎖分子類を提供し、そして前述のようにその上で新たな
核酸が合成される。この増幅工程の進行を維持するのに
追加の試薬が必要であるかも知れないが、その後の殆ど
のエクステンション産物はプライマーと結合した特異的
核酸配列（すなわち、相補産物）からなるであろう。

標準的な分離およびエクステンション産物の合成工程を
必要なだけ繰り返して使用し、例えば検出に必要とする
所定量の特異的核酸を生成することができる。一般に、
一連の工程（周期として通常知られている）は少なくと
も一度、好ましくは15〜50度繰り返すことができる。増
幅処理のある時点で少量で存在するプライマーは消費さ
れてしまうであろうが、もう一種のプライマーによって
増幅は進行する。従って、過多のプライマーエクステン
ション産物の一種がもう一種の産物より多く生成される
であろう。この過多の産物が本発明によって検出するこ
とができる。

最初の核酸またはその混合物から特定の核酸を１種より
多く生成することが望まれる場合には、上述される一般
的な工程で適当な数組のプライマー類を使用する。

通常、ひとたび所定量の過多のプライマーエクステンシ
ョン産物が発生したならば、適当な酵素基質の存在下で
直接的または間接的に比色シグナルまたは蛍光シグナル
を提供する酵素標識試薬を使用して前記産物を検出する
ことができる。有用な酵素と基質は以下により詳細に検
討する。

過多のプライマーから生成されたプライマーエクステン
ション産物の検出は、標準的なドットブロット（dot bl
ot）処理および装置を初めとする適当な技法を使用して
行うことができる。

一の態様では、試薬が、検出されるプライマーエクステ
ンション産物の核酸配列少なくとも１つと相補的である
酵素標識プローブである。このようなプローブ類は、当
該技術分野で既知の手段および化学、例えば、ペルオキ
シダーゼ標識プローブを公表する技術文献の代表的なも
のである国際公開第89/02932号公報に記載されるような
手段を使用して調製することができる。このようなプロ
ーブ類が、過多に存在するプライマーエクステンション
産物とハイブリッドを形成し、そして得られたハイブリ
ッド形成産物が適当な手段、例えば、ポリマービーズに
結合されたアビジンを有する不溶性試薬のような捕捉試
薬を使用することによってハイブリッドを形成しなかっ
た物質と分離された後、そのハイブリッド形成産物を検
出することができる。

もう一つの態様では、酵素標識試薬が特異的バインディ
ング部分に結合した酵素を含んでなる。得られた結合体
は、過多に存在するプライマーエクステンション産物上
の対応する受容体とバインディング部分との複合化によ
って興味の対象とするプライマーエクステンション産物
を伴うことができる。例えば、アビジンとペルオキシダ
ーゼ結合体を使用して過多に存在するビオチン化プライ
マーエクステンション産物と複合体を形成することがで
きる。他の特異的バインディング複合体を同様に設計し
使用することもできる（例えば、糖とレクチンおよび抗
体とハプテン）。このような物質および調製手段は当該
技術分野で周知である。ビオチン化プライマーエクステ
ンション産物とアビジン−ペルオキシダーゼ結合体の得
られた複合体は、そのプライマーエクステンション産物
に相補的である捕捉プローブを使用して未複合化物質か
ら分離することができる。捕捉プローブは当該技術分野
で周知であり、オリゴヌクレオチドが適当に結合された
ポリマー粒子が挙げられる。

不溶化されたハイブリッド形成産物の分離が必要である
場合には、遠心、濾過および洗浄を初めとするいずれか
適当な分離手段を使用することができる。好ましくは、
微孔質濾過膜が使用され、このものは診断試験キットの
一部として供給される。特に有用な微孔質濾過膜として
は、Pall Corpから市販されているポリアミド膜〔例え
ば、Ultipore（商標）、Loprodyne（商標）またはBiody
ne（商標）膜〕が挙げられる。必要があればこれらの膜
は、タンパク質類（例えばカゼイン、スクシニル化カゼ
イン）または非イオン界面活性剤を塗布してもよい。

これらの膜は、流体と可溶性物質を集めるのに適する容
器類を伴う分離支持体として使用することができる。ま
た、それらは試験装置の一部として固定されていること
が好ましい。各種の装置が米国特許第3,825,410号、同
3,888,629号同3,970,429号および同4,446,232号明細書
に記載されるものを初めとして当該技術分野で既知であ
る。特に有用な装置は、ヨーロッパ特許公開第308231号
公報で記載されている。

酵素標識試薬とプライマーエクステンション産物との接
触と共に、適当な基質と検出可能な比色シグナルまたは
蛍光シグナルを発生するのに必要ないずれか他の試薬類
が供給される。有用な酵素標識としては、ペルオキシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼが挙げられ
る。ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが
好ましく、ペルオキシダーゼが最も好ましいものであ
る。

有用な基質と色素供給試薬は、与えられる酵素について
当該技術分野で既知である。例えば、ペルオキシダーゼ
について有用な色素供給試薬としては、テトラメチルベ
ンジジンおよびその誘導体、ならびに米国特許第4,089,
747号に記載されているトリアリールイミダゾールロイ
コ染料のようなロイコ染料が挙げられる。特に有用な色
素供給組成物としては、例えば、特開平１−100453号公
報に記載される特定の安定化剤との組み合わせで使用さ
れるトリアリールイミダゾールロイコ染料が挙げられ
る。

不溶性物質中の色素の存在が試験された被検体における
標的DNAの存在の指標となる。色素は、しばしば機器を
用いることなく肉眼的に観察することができるが、幾つ
かの例では、色素濃度が希薄であるかまたは電磁スペク
トルの可視領域外にあるため適正な検出に適する検出機
器（すなわち、分光光度計）が必要である。これを行う
ための方法は、当該技術分野で周知である。

この発明の方法を使用して感染症、遺伝子疾患またはガ
ンのような細胞性疾患に関連する核酸を増幅または検出
することができる。各種感染症は、細菌、酵母、プロト
ゾアまたはウイルスのような生物体に関する臨床被検体
中の少量DNAの存在によって診断することができる。

一の態様では、２つの相補鎖を有する核酸の検出方法が
下記工程を含んでなる。

A.プライマー類とそれらの相補的核酸鎖のハイブリッド
形成産物を生成するようなハイブリッド形成条件下で、
変性された核酸の相補鎖とデオキシリボヌクレオシド−
５′−三リン酸、サーマス・アクアティカス（Thermus
aquaticus）またはそれのゲノム由来のクローンから単
離されたDNAポリメラーゼおよび前記変性された核酸鎖
に実質的に相補的である一組のプライマーを接触させる
工程であって、エクステンション産物の相補体から分離
した場合にそれらが前記エクステンション産物の合成鋳
型として働くことができそして前記プライマー類が少な
くとも5:1のモル比で存在する工程、 B.前記プライマーエクステンション産物が合成された鋳
型からそれらを分離する工程、 C.前記分離されたプライマーエクステンション産物を少
なくとも15周期の増幅条件にかける工程、ならびに D.工程Ｃで生成された増幅産物のさらなる変性を伴うこ
となく、過多に存在するプライマーを使用して生成され
たプライマーエクステンション産物の存在を比色的に検
出する工程であって、 この検出が、ペルオキシダーゼ応答性ロイコ染料と過酸
化水素の存在下で色素を提供することができ、検出され
るプライマーエクステンション産物と組み合わさって存
在しうるペルオキシダーゼ標識試薬と、検出されるプラ
イマーエクステンション産物に相補的な捕捉プローブを
使用して行われる工程。

〔実施例〕

例１および2:最終変性工程を伴わない酵素標識を使用す
るHLAの検出 これらの例では、酵素標識試薬、捕捉プローブおよび比
色検出ならびに２つの種々の一様でないプライマー比を
使用する本発明の方法を示す。この方法では増幅後に最
終的な変性工程を含まない。

材 料 DNA試料は、HLAホモ接合リンパ芽球細胞系LBF（GM 0316
3, Human Genetic Mutant Cell Depository-Camden, N.
J.−より入手）からプロテイナーゼＫ消化および標準的
な手順を用いるフェノール／クロロホルム抽出によって
単離した。

使用したプライマー類は、標準的な略号Ａ（アデニ
ン）、Ｇ（グアニン）、Ｔ（チミン）およびＣ（シトシ
ン）を用いる下記の配列を有していた。

プライマー１〔（−）鎖に相補性〕 ５′−Ｘ−GTGCTGCAGGTGTAAACTTGTACCAG−３′、 プライマー２〔（＋）鎖に相補性〕 ５′−Ｘ−CACGGATCCGGTAGCAGCGGTAGAGTTG−３′ 上式中、Ｘは、国際公開第89/02931号公報に記載された
方法を用い、アミノテトラエチレングリコールスペーサ
ー基を介して結合したビオチンを表わす。

捕捉プローブは、前記（−）鎖に相補的なオリゴヌクレ
オチドが共有結合したポリ（スチレン−コ−アクリル
酸）（70:30、モル比、平均直径0.7マイクロメーター）
のポリマー粒子形成物から構成した。このオリゴヌクレ
オチドは、下記配列を有する。

５′−Ｙ−CCTCTGTTCCACAGACTTAGATTTG−3' 上式中、Ｙは、国際公開第89/02931号公報に記載される
手順によって調製されたアミノテトラエチレングリコー
ルスペーサー基を表わす。

これらのポリマー粒子は、標準的な乳化重合法を使用し
て調製し、次いでアミノテトラエチレングリコールスペ
ーサー基および３−（ジメチルアミノ）プロピルエチル
カルボジイミド塩酸塩のようなカルボジイミド試薬を用
いる標準的な化学方法を使用して前記粒子にオリゴヌク
レオチドを結合した。

Surecell（商標）使い捨て試験装置を使用した。それ
は、カゼインを塗布した（約1g/m²）1.2マイクロメータ
ーの細子寸法のBiodyne（商標）Ａナイロン微孔質膜を
含む。

色素供給組成物は、２−（４−ヒドロキシ−３−メトキ
シフェニル）−4,5−ビス（４−メトキシフェニル）−
イミダゾールロイコ染料（0.008重量％）、ポリ（ビニ
ルピロリドン）（１重量％）、リン酸ナトリウム（10ミ
リモル濃度、pH6.8）、ジエチレントリアミン五酢酸（1
0マイクロモル濃度）、４′−ヒドロキシアセタニリド
（２ミリモル濃度）および過酸化水素（10ミリモル濃
度）を含めた。

アッセイ LBF細胞系由来のDNAを、トリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン塩酸塩緩衝液（５ミリモル濃度、pH8.3）、
塩化マグネシウム（2.5ミリモル濃度）、各dNTP（それ
ぞれ175マイクロモル濃度）、サーマス・アクアティカ
ス（Thermus aquaticus）から単離されたDNAポリメラー
ゼ（２国際単位）、（＋）鎖に相補的なプライマー（0.
2マイクロモル濃度）および（−）鎖に相対的な少量の
プライマー（0.02かまたは0.04マイクロモル濃度）を含
有する100μ反応器中で増幅した。

増幅処理は、市販のPerkin−Elmer Thermal cyclerを使
用して30周期（各周期は、95℃で30秒間の変性、55℃で
30秒間のハイブリダイゼーションおよび70℃で60秒間の
プライマーエクステンションを含んでなる）行った。過
多のプライマーから得られた二本鎖DNA産物は、最終加
熱工程で変性しなかった。

対照増幅は、プライマー類を等しい量で使用し最終変性
工程を５分間95℃で行った以外は同じ試薬と方法を用い
て行った。

増幅された産物の検出は、前述のポリメラーゼ連鎖反応
混合物（100μ）を、リン酸ナトリウム（8.5ミリモル
濃度、pH7.4）、塩化ナトリウム（149ミリモル濃度）、
エチレンジアミン四酢酸（１ミリモル濃度）およびトリ
トン（Triton）（商標）Ｘ−100非イオン界面活性剤
（0.1重量％）を含む溶液の最終容量30μ中で捕捉プ
ローブ（200μｇ）と混合することによって行った。こ
の混合物を10分間42℃でインキュベートして過多の
（−）鎖に前記プローブをハイブリッド形成させた。得
られた懸濁液をSurecell（商標）使い捨て試験装置に加
え、その試験装置の試験ウェル中の膜上に不溶化生成物
を集めた。この不溶化生成物を予め55℃に加温した、リ
ン酸ナトリウム（8.5ミリモル濃度）、塩化ナトリウム
（149ミリモル濃度）、エチレンジアミン四酢酸（１ミ
リモル濃度）およびドデシル硫酸ナトリウム（0.5重量
％）の溶液で洗浄した。

次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ−アジピン結合体
（2.3ng）〔Kodak See-Quence（商標）HLA−DQ_α遺伝子
プローブキットとして入手可能〕を前記試験装置に加え
て不溶化ビオチニル化プライマーエクステンション産物
と反応させた。この試験装置を２分間約20〜25℃でイン
キュベートし、次いでトリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン塩酸塩緩衝液（50ミリモル濃度、pH8.8）、ド
デシル硫酸ナトリウム（2.4重量％）、塩化ナトリウム
（0.5モル濃度）および１−メチル−２−ピロリドン（1
0重量％）の溶液（200μ）で洗浄した。次に、色素供
給組成物（50μ）を加え、次いで５分間20〜25℃でイ
ンキュベートした。アッセイの結果（対照と本発明と共
に）を、０から５の尺度（５が最高の色素濃度である）
を用いる視覚的な色素の読みを下記表に示す。

対照のアッセイは許容できる視覚的なシグナルを提供す
るが、これは酵素標識試薬が変性工程後に集められた生
成物に加えられるために可能であったにすぎない。これ
が特定アッセイに対する制限である。本発明は、加熱工
程が酵素標識の有効性を損ねるであろう増幅後の最終的
な変性を必要とすることなく、酵素標識試薬を用いて満
足すべき分析結果を得るための手段を提供することが明
らかである。従って、それが酵素標識試薬を使用するア
ッセイに対し一層多くの適用性を付与する。

表 アッセイ プライマー比（モル濃度） 色素濃度 対照１ 1:1 4.5 例 １ 5:1 4.5 例 ２ 10:1 4.5 〔発明の効果〕 本発明は数々の利点を提供するので、核酸検出の技術分
野を進歩させる。本発明は、低濃度で標的核酸に対して
安全かつ感度よく実施するための簡便で単純な方法であ
る。それは、許容される半減期を有する簡単な診断試験
キットを用いて実施することができ、医院や他の試験場
で不必要な危害を与えないであろう。

これらの利点は、標的核酸の存在を示す比色シグナルま
たは蛍光シグナルを提供するのに使用することができる
酵素検出試薬を用いることによって達成される。それら
の欠点を伴う放射性同位体が避けられる。さらに、酵素
検出試薬が増幅処理中で一様でない量のプライマー類と
組み合わせて使用されるので、過多のプライマーに由来
する産物の検出前の変性を避けることができる。こうし
て熱感受性酵素は失活から保護される。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】A.ハイブリッド形成条件下で、変性された
   核酸の相補鎖に実質的に相補的である一組のプライマー
   を使用してプライマーエクステンション産物を形成する
   工程であって、エクステンション産物がそれらの相補体
   から分離されたとき前記エクステンション産物の合成用
   鋳型として働くことができ、そして前記各プライマーが
   少なくとも2:1のモル比で増幅の初期時点から存在し、
   その過多量で存在するプライマーがビオチン化されてい
   る前記工程、 B.前記プライマーエクステンション産物を、それらが合
   成された鋳型から分離する工程、 C.前記分離されたプライマーエクステンション産物を増
   幅条件にかける工程、ならびに D.工程Ｃで形成された増幅産物をさらに変性させること
   なく、過多の前記ビオチン化プライマーによって形成さ
   れた前記プライマーエクステンション産物の存在を比色
   的または蛍光的に検出する工程であって、前記検出が、
   ビオチンと反応する特異的結合部位をもった酵素標識試
   薬を使用しその基質の存在下で検出可能な比色シグナル
   または蛍光シグナルを提供するように行われ、そして過
   多の前記ビオチン化プライマーによって形成された前記
   プライマーエクステンション産物は、前記プライマーエ
   クステンション産物に相補的であり且つハイブリダイズ
   可能な捕捉プローブを用いて捕捉されることを特徴とす
   る工程、 を含んでなる、２つの相補鎖を有する核酸を増幅して検
   出するための方法。
2. 【請求項２】ａ）混合物中の標的核酸に対する、少なく
   とも約2:1のモル比で存在し過多量のプライマーがビオ
   チン化されている一組のプライマー、 ｂ）DNAポリメラーゼ、 ｃ）デオキシリボヌクレオチド−５′−三リン酸、 ｄ）ビオチンと反応する特異的結合部位をもった酵素標
   識試薬、及び ｅ）過多のビオチン化プライマーによって形成されたプ
   ライマーエクステンション産物に相補的であり且つハイ
   ブリダイズ可能な捕捉プローブ、 を含む、標的核酸を増幅して検出するための診断試験キ
   ット。