JP3122106B2 - 標的核酸の検出方法及びプローブの製造方法 - Google Patents
標的核酸の検出方法及びプローブの製造方法Info
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- JP3122106B2 JP3122106B2 JP02003338A JP333890A JP3122106B2 JP 3122106 B2 JP3122106 B2 JP 3122106B2 JP 02003338 A JP02003338 A JP 02003338A JP 333890 A JP333890 A JP 333890A JP 3122106 B2 JP3122106 B2 JP 3122106B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、プローブ核酸を用いた標的核酸の検出方法
及び該プローブ核酸の製造方法に関する。
及び該プローブ核酸の製造方法に関する。
［従来の技術］ ハイブリダイゼーション反応において、同定されるべ
く標的核酸と相補的な塩基配列を有し、標識されたオリ
ゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いたプロー
ブ核酸は該標的核酸と塩基対を形成しうる。この特性を
利用して、種々のハイブリダイゼーション法が核酸の検
出に用いられている。直接的ハイブリダイゼーション法
では、試料を溶液中に固定する方法あるいは固体担体に
固定する方法がある。試料中に標的核酸が存在する場合
は、１つの標識されたプローブ核酸とのハイブリダイゼ
ーションによって同定される。このうち、近年、短時間
かつ簡便な操作で行うことができる溶液中でのハイブリ
ダイゼーション法が注目されている。
く標的核酸と相補的な塩基配列を有し、標識されたオリ
ゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを用いたプロー
ブ核酸は該標的核酸と塩基対を形成しうる。この特性を
利用して、種々のハイブリダイゼーション法が核酸の検
出に用いられている。直接的ハイブリダイゼーション法
では、試料を溶液中に固定する方法あるいは固体担体に
固定する方法がある。試料中に標的核酸が存在する場合
は、１つの標識されたプローブ核酸とのハイブリダイゼ
ーションによって同定される。このうち、近年、短時間
かつ簡便な操作で行うことができる溶液中でのハイブリ
ダイゼーション法が注目されている。
溶液中でハイブリダイゼーション反応を行なった場
合、標的核酸とプローブ核酸反応生成物を何らかの形で
未反応物から分離し、抽出することが必要である。一般
に、プローブ核酸を不溶性担体に固定したのち標的核酸
とハイブリッドを形成させ、その後遠心分離法によりハ
イブリッドを分離する方法が知られている。その一例と
しては、特開昭63−117262などがある。すなわち、これ
らの方法では、まず標的核酸の特定の塩基配列に対して
相補的な塩基配列を含む一本鎖の状態の核酸を、有機高
分子物質からなり表面が非多孔質の粒径0.01〜50μｍの
粒子の表面に結合させ、不溶性担体に結合したハイブリ
ッド形成用プローブ核酸を形成させる。次に、このプロ
ーブ核酸と試料とを反応させ、特定の塩基配列を含む標
的核酸とハイブリッドを形成させる。担体上のプローブ
核酸とハイブリッド形成しなかった核酸およびその他の
夾雑物を遠心分離法などで除去することにより、ハイブ
リッドを形成している標的核酸を検出する方法である。
合、標的核酸とプローブ核酸反応生成物を何らかの形で
未反応物から分離し、抽出することが必要である。一般
に、プローブ核酸を不溶性担体に固定したのち標的核酸
とハイブリッドを形成させ、その後遠心分離法によりハ
イブリッドを分離する方法が知られている。その一例と
しては、特開昭63−117262などがある。すなわち、これ
らの方法では、まず標的核酸の特定の塩基配列に対して
相補的な塩基配列を含む一本鎖の状態の核酸を、有機高
分子物質からなり表面が非多孔質の粒径0.01〜50μｍの
粒子の表面に結合させ、不溶性担体に結合したハイブリ
ッド形成用プローブ核酸を形成させる。次に、このプロ
ーブ核酸と試料とを反応させ、特定の塩基配列を含む標
的核酸とハイブリッドを形成させる。担体上のプローブ
核酸とハイブリッド形成しなかった核酸およびその他の
夾雑物を遠心分離法などで除去することにより、ハイブ
リッドを形成している標的核酸を検出する方法である。
不溶性担体とプローブ核酸の固定方法としては、次の
２つの方法が知られている。
２つの方法が知られている。
その一つの方法として、プローブ核酸の５′又は３′
末端を化学的に修飾し担体に固定化する方法があげら
れ、具体的な例としては、特開昭63−243875に示されて
いるようにターミナルデオキシヌクレチジルトランスフ
ェラーゼ（Terminal Deoxynucletidyl Transferase）を
用いて不溶性担体を捕捉する物質をプローブ核酸の３′
末端側に結合させる方法がある。
末端を化学的に修飾し担体に固定化する方法があげら
れ、具体的な例としては、特開昭63−243875に示されて
いるようにターミナルデオキシヌクレチジルトランスフ
ェラーゼ（Terminal Deoxynucletidyl Transferase）を
用いて不溶性担体を捕捉する物質をプローブ核酸の３′
末端側に結合させる方法がある。
第二の方法としては、有機溶媒を用いて核酸全体を固
定する方法がある。これは特開昭59−122499などに詳し
く述べられている。
定する方法がある。これは特開昭59−122499などに詳し
く述べられている。
［発明が解決しようとする課題］ 前述のプローブ核酸の末端を化学的に修飾し担体に固
定化する方法では、一般にプローブ核酸として利用され
るオリゴヌクレオチドの長さが長ければ長いほど、ハイ
ブリダイゼーション時の標的核酸とプローブ核酸の相補
的結合の誤りが防げる。しかし、プローブ核酸の鎖長が
長い場合、そのプローブ核酸中に相補的配列が存在する
確率が高まり、ハイブリダイゼーション反応中にプロー
ブ核酸自身が反応し高次構造を形成してプローブ核酸の
機能を果たさなくなりハイブリッド形成の効率が著しく
減少することがある。
定化する方法では、一般にプローブ核酸として利用され
るオリゴヌクレオチドの長さが長ければ長いほど、ハイ
ブリダイゼーション時の標的核酸とプローブ核酸の相補
的結合の誤りが防げる。しかし、プローブ核酸の鎖長が
長い場合、そのプローブ核酸中に相補的配列が存在する
確率が高まり、ハイブリダイゼーション反応中にプロー
ブ核酸自身が反応し高次構造を形成してプローブ核酸の
機能を果たさなくなりハイブリッド形成の効率が著しく
減少することがある。
また、有機溶媒を用いて核酸全体を担持させる方法で
は、上記のようなプローブ核酸自身が高次構造を取るこ
とは避けられるが、極性が異なるため核酸全体の特性を
変えずに核酸を固定化する条件を捜し出すことは容易で
はなく実用的ではない。
は、上記のようなプローブ核酸自身が高次構造を取るこ
とは避けられるが、極性が異なるため核酸全体の特性を
変えずに核酸を固定化する条件を捜し出すことは容易で
はなく実用的ではない。
本発明は、溶液中におけるハイブリダイゼーション法
を利用する前記の従来技術の問題点を解決するために鋭
意検討した結果なされたものであり、プローブ核酸とし
て用いるオリゴヌクレオチドを伸展させる過程におい
て、一端に捕捉体を結合した側鎖を有するヌクレオチド
を複数個導入することにより不溶性担体とプローブ核酸
との結合接点を増し、さらにプローブ核酸自身のハイブ
リダイゼーションによる高次構造形成を回避することに
よって、安定性の高いプローブ核酸と不溶性担体との結
合体を形成する方法及びその結合体を提供することを目
的とする。
を利用する前記の従来技術の問題点を解決するために鋭
意検討した結果なされたものであり、プローブ核酸とし
て用いるオリゴヌクレオチドを伸展させる過程におい
て、一端に捕捉体を結合した側鎖を有するヌクレオチド
を複数個導入することにより不溶性担体とプローブ核酸
との結合接点を増し、さらにプローブ核酸自身のハイブ
リダイゼーションによる高次構造形成を回避することに
よって、安定性の高いプローブ核酸と不溶性担体との結
合体を形成する方法及びその結合体を提供することを目
的とする。
［課題を解決するための手段］ 本発明は、以下の各態様を包含する。
本発明の第１の態様としての標的核酸の検出方法は、 （ａ）下記の（ｉ）〜（iv）の工程によって担体に固定
された一本鎖プローブ核酸を調製する工程； （ｉ）３′末端にて相補的に結合可能な第１及び第２の
一本鎖オリゴヌクレオチドを合成する工程； （ii）該第１及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを互
いに相補的な３′末端において結合して部分的に二本鎖
構造を有するオリゴヌクレオチドを形成し、次いでヌク
レオチドを含み、該ヌクレオチドの一部または全部が固
定化物質が結合したものである反応溶液中で伸展反応を
行なうことによって該部分的に二本鎖構造を有するオリ
ゴヌクレオチドの３′末端を起点として前記ヌクレオチ
ドを重合させ、複数の固定化物質が導入されたオリゴヌ
クレオチド伸展部分を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
を形成する工程； （iii）該二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖化して、
複数の固定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展
部分を有する一本鎖プローブ核酸を形成する工程；及び （iv）該一本鎖プローブ核酸を、該一本鎖プローブ核酸
のオリゴヌクレオチド伸展部分に導入されている複数の
固定化物質を用いて担体に結合する工程； （ｂ）該担体に結合された該一本鎖プローブ核酸と、標
識化されている一本鎖標的核酸とのハイブリッドを形成
する工程；及び （ｃ）該ハイブリッド中に導入されている標識化合物を
用いて該ハイブリッドを検出する工程； を有することを特徴とする。
された一本鎖プローブ核酸を調製する工程； （ｉ）３′末端にて相補的に結合可能な第１及び第２の
一本鎖オリゴヌクレオチドを合成する工程； （ii）該第１及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを互
いに相補的な３′末端において結合して部分的に二本鎖
構造を有するオリゴヌクレオチドを形成し、次いでヌク
レオチドを含み、該ヌクレオチドの一部または全部が固
定化物質が結合したものである反応溶液中で伸展反応を
行なうことによって該部分的に二本鎖構造を有するオリ
ゴヌクレオチドの３′末端を起点として前記ヌクレオチ
ドを重合させ、複数の固定化物質が導入されたオリゴヌ
クレオチド伸展部分を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
を形成する工程； （iii）該二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖化して、
複数の固定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展
部分を有する一本鎖プローブ核酸を形成する工程；及び （iv）該一本鎖プローブ核酸を、該一本鎖プローブ核酸
のオリゴヌクレオチド伸展部分に導入されている複数の
固定化物質を用いて担体に結合する工程； （ｂ）該担体に結合された該一本鎖プローブ核酸と、標
識化されている一本鎖標的核酸とのハイブリッドを形成
する工程；及び （ｃ）該ハイブリッド中に導入されている標識化合物を
用いて該ハイブリッドを検出する工程； を有することを特徴とする。
本発明の第２の態様としての固定化一本鎖プローブ核
酸の製造方法は、複数箇所において担体に固定している
一本鎖プローブ核酸の製造方法であって、 （ｉ）３′末端にて相補的に結合可能な第１及び第２の
一本鎖オリゴヌクレオチドを合成する工程； （ii）該第１及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを互
いに相補的な３′末端において結合して部分的に二本鎖
構造を有するオリゴヌクレオチドを形成し、次いでヌク
レオチドを含み、該ヌクレオチドの一部または全部が固
定化物質が結合したものである反応溶液中で伸展反応を
行なうことによって該部分的に二本鎖構造を有するオリ
ゴヌクレオチドの３′末端を起点として前記ヌクレオチ
ドを重合させ、複数の固定化物質が導入されたオリゴヌ
クレオチド伸展部分を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
を形成する工程； （iii）該二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖化して、
複数の固定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展
部分を有する一本鎖プローブ核酸を形成する工程；及び （iv）該一本鎖プローブ核酸のオリゴヌクレオチド伸展
部分に導入されている複数の固定化物質を用いて該一本
鎖プローブ核酸を担体に結合する工程； を有することを特徴とする。
酸の製造方法は、複数箇所において担体に固定している
一本鎖プローブ核酸の製造方法であって、 （ｉ）３′末端にて相補的に結合可能な第１及び第２の
一本鎖オリゴヌクレオチドを合成する工程； （ii）該第１及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを互
いに相補的な３′末端において結合して部分的に二本鎖
構造を有するオリゴヌクレオチドを形成し、次いでヌク
レオチドを含み、該ヌクレオチドの一部または全部が固
定化物質が結合したものである反応溶液中で伸展反応を
行なうことによって該部分的に二本鎖構造を有するオリ
ゴヌクレオチドの３′末端を起点として前記ヌクレオチ
ドを重合させ、複数の固定化物質が導入されたオリゴヌ
クレオチド伸展部分を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
を形成する工程； （iii）該二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖化して、
複数の固定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展
部分を有する一本鎖プローブ核酸を形成する工程；及び （iv）該一本鎖プローブ核酸のオリゴヌクレオチド伸展
部分に導入されている複数の固定化物質を用いて該一本
鎖プローブ核酸を担体に結合する工程； を有することを特徴とする。
本発明の第３の態様としての標的核酸の検出方法は、 （ａ）下記の（ｉ）〜（iv）の工程によって担体に固定
された一本鎖プローブ核酸を用意する工程； （ｉ）３′末端にて相補的に結合可能な第１及び第２の
一本鎖オリゴヌクレオチド、該第１又は第２の一本鎖オ
リゴヌクレオチドの５′末端にて相補的に結合可能な第
３の一本鎖オリゴヌクレオチド、及び該第３の一本鎖オ
リゴヌクレオチドの３′末端にて相補的に結合可能な第
４の一本鎖オリゴヌクレオチドを合成する工程； （ii）該第１、第２、第３及び第４の一本鎖オリゴヌク
レオチドを互いに相補的な３′末端及び５′末端におい
て結合して部分的に二本鎖構造を有するオリゴヌクレオ
チドを形成し、次いでヌクレオチドを含み、該ヌクレオ
チドの一部または全部が固定化物質が結合したものであ
る反応溶液中で伸展反応を行なうことによって該部分的
に二本鎖構造を有するオリゴヌクレオチドの３′末端の
各々を起点として該ヌクレオチドを重合させ、複数の固
定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展部分を複
数有する二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程； （iii）該二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖化して、
複数の固定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展
部分を複数有し、該複数のオリゴヌクレオチド伸展部分
の間に該第１、第２又は第３の一本鎖オリゴヌクレオチ
ド由来の、固定化物質を有しない所定の長さの塩基配列
を有する一本鎖プローブ核酸を形成する工程； （iv）該一本鎖プローブ核酸の複数のオリゴヌクレオチ
ド伸展部分を、各々のオリゴヌクレオチド伸展部分に導
入されている複数の固定化物質を用いて担体に結合して
該一本鎖プローブ核酸を複数箇所にて担体に結合する工
程； （ｂ）該担体に結合された該一本鎖プローブ核酸と、標
識化されている一本鎖標的核酸とのハイブリッドを形成
する工程；及び （ｃ）該ハイブリッド中の該標的化合物を用いて該ハイ
ブリッドを検出する工程； を有することを特徴とする。
された一本鎖プローブ核酸を用意する工程； （ｉ）３′末端にて相補的に結合可能な第１及び第２の
一本鎖オリゴヌクレオチド、該第１又は第２の一本鎖オ
リゴヌクレオチドの５′末端にて相補的に結合可能な第
３の一本鎖オリゴヌクレオチド、及び該第３の一本鎖オ
リゴヌクレオチドの３′末端にて相補的に結合可能な第
４の一本鎖オリゴヌクレオチドを合成する工程； （ii）該第１、第２、第３及び第４の一本鎖オリゴヌク
レオチドを互いに相補的な３′末端及び５′末端におい
て結合して部分的に二本鎖構造を有するオリゴヌクレオ
チドを形成し、次いでヌクレオチドを含み、該ヌクレオ
チドの一部または全部が固定化物質が結合したものであ
る反応溶液中で伸展反応を行なうことによって該部分的
に二本鎖構造を有するオリゴヌクレオチドの３′末端の
各々を起点として該ヌクレオチドを重合させ、複数の固
定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展部分を複
数有する二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程； （iii）該二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖化して、
複数の固定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展
部分を複数有し、該複数のオリゴヌクレオチド伸展部分
の間に該第１、第２又は第３の一本鎖オリゴヌクレオチ
ド由来の、固定化物質を有しない所定の長さの塩基配列
を有する一本鎖プローブ核酸を形成する工程； （iv）該一本鎖プローブ核酸の複数のオリゴヌクレオチ
ド伸展部分を、各々のオリゴヌクレオチド伸展部分に導
入されている複数の固定化物質を用いて担体に結合して
該一本鎖プローブ核酸を複数箇所にて担体に結合する工
程； （ｂ）該担体に結合された該一本鎖プローブ核酸と、標
識化されている一本鎖標的核酸とのハイブリッドを形成
する工程；及び （ｃ）該ハイブリッド中の該標的化合物を用いて該ハイ
ブリッドを検出する工程； を有することを特徴とする。
本発明の第４の態様としての固定化一本鎖プローブ核
酸の製造方法は、複数箇所において担体に結合している
一本鎖プローブ核酸の製造方法であって、 （ｉ）３′末端にて相補的に結合可能な第１及び第２の
一本鎖オリゴヌクレオチド、該第１又は第２の一本鎖オ
リゴヌクレオチドの５′末端にて相補的に結合可能な第
３の一本鎖オリゴヌクレオチド、及び該第３の一本鎖オ
リゴヌクレオチドの３′末端にて相補的に結合可能な第
４の一本鎖オリゴヌクレオチドを合成する工程； （ii）該第１、第２、第３及び第４の一本鎖オリゴヌク
レオチドを互いに相補的な３′末端及び５′末端におい
て結合して部分的に二本鎖構造を有するオリゴヌクレオ
チドを形成し、次いでヌクレオチドを含み、該ヌクレオ
チドの一部または全部が固定化物質が結合したものであ
る反応溶液中で伸展反応を行なうことによって該部分的
に二本鎖構造を有するオリゴヌクレオチドの３′末端の
各々を起点として該ヌクレオチドを重合させ、複数の固
定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展部分を複
数有する二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程； （iii）該二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖化して、
複数の固定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展
部分を複数有し、該複数のオリゴヌクレオチド伸展部分
の間に該第１、第２又は第３の一本鎖オリゴヌクレオチ
ド由来の、固定化物質を有しない所定の長さの塩基配列
を有する一本鎖プローブ核酸を形成する工程； （iv）該一本鎖プローブ核酸の複数のオリゴヌクレオチ
ド伸展部分の各々に導入されている固定化物質を用いて
該一本鎖プローブ核酸を該担体に複数箇所で固定する工
程； を有することを特徴とする。
酸の製造方法は、複数箇所において担体に結合している
一本鎖プローブ核酸の製造方法であって、 （ｉ）３′末端にて相補的に結合可能な第１及び第２の
一本鎖オリゴヌクレオチド、該第１又は第２の一本鎖オ
リゴヌクレオチドの５′末端にて相補的に結合可能な第
３の一本鎖オリゴヌクレオチド、及び該第３の一本鎖オ
リゴヌクレオチドの３′末端にて相補的に結合可能な第
４の一本鎖オリゴヌクレオチドを合成する工程； （ii）該第１、第２、第３及び第４の一本鎖オリゴヌク
レオチドを互いに相補的な３′末端及び５′末端におい
て結合して部分的に二本鎖構造を有するオリゴヌクレオ
チドを形成し、次いでヌクレオチドを含み、該ヌクレオ
チドの一部または全部が固定化物質が結合したものであ
る反応溶液中で伸展反応を行なうことによって該部分的
に二本鎖構造を有するオリゴヌクレオチドの３′末端の
各々を起点として該ヌクレオチドを重合させ、複数の固
定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展部分を複
数有する二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程； （iii）該二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖化して、
複数の固定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展
部分を複数有し、該複数のオリゴヌクレオチド伸展部分
の間に該第１、第２又は第３の一本鎖オリゴヌクレオチ
ド由来の、固定化物質を有しない所定の長さの塩基配列
を有する一本鎖プローブ核酸を形成する工程； （iv）該一本鎖プローブ核酸の複数のオリゴヌクレオチ
ド伸展部分の各々に導入されている固定化物質を用いて
該一本鎖プローブ核酸を該担体に複数箇所で固定する工
程； を有することを特徴とする。
上記の第１〜第４のオリゴヌクレオチドとしてのサブ
オリゴヌクレオチドとしては、第１図のように末端領域
の一部が部分的に互いに相補性をもつように構成された
塩基配列を有し、５′末端がヌクレオチドフォスフェー
トであるオリゴヌクレオチドであればどのようなもので
も利用できるが合成機で手軽に合成できる短かい鎖長の
サブオリゴヌクレオチドが利用し易い。
オリゴヌクレオチドとしては、第１図のように末端領域
の一部が部分的に互いに相補性をもつように構成された
塩基配列を有し、５′末端がヌクレオチドフォスフェー
トであるオリゴヌクレオチドであればどのようなもので
も利用できるが合成機で手軽に合成できる短かい鎖長の
サブオリゴヌクレオチドが利用し易い。
合成するサブオリゴヌクレオチドの長さは、20塩基か
ら40塩基程度が望ましい。各サブオリゴヌクレオチドの
構成としては、該サブオリゴヌクレオチドの３′末端お
よび５′末端に互いに相補性をもつ６から８の塩基を配
列するように合成したものが好ましいが、その塩基数は
それより少なくても多くても利用できる。
ら40塩基程度が望ましい。各サブオリゴヌクレオチドの
構成としては、該サブオリゴヌクレオチドの３′末端お
よび５′末端に互いに相補性をもつ６から８の塩基を配
列するように合成したものが好ましいが、その塩基数は
それより少なくても多くても利用できる。
合成するサブオリゴヌクレオチドの数はミスマッチし
ない程度に複数個合成するのが望ましい。
ない程度に複数個合成するのが望ましい。
各サブオリゴヌクレオチドの５′末端にリン酸基を付
けてヌクレオチドフォスフェートにする方法は、化学的
合成によっても、ATPの存在下でT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ等の酵素による方法でも良い。
けてヌクレオチドフォスフェートにする方法は、化学的
合成によっても、ATPの存在下でT4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ等の酵素による方法でも良い。
また本発明の結合体を用いて、ハイブリダイゼーショ
ン法によって標的核酸の有無の分析及び標的核酸を検出
する場合には、標的核酸の塩基配列に対して相補的な塩
基配列を構成するようにサブオリゴヌクレオチドを有す
るとよい。
ン法によって標的核酸の有無の分析及び標的核酸を検出
する場合には、標的核酸の塩基配列に対して相補的な塩
基配列を構成するようにサブオリゴヌクレオチドを有す
るとよい。
各サブオリゴヌクレオチドの相補的な塩基配列部分で
の二本鎖の形成はアニーリング反応によって行なうこと
ができる。
の二本鎖の形成はアニーリング反応によって行なうこと
ができる。
アニーリング反応では、該複数個の一本鎖サブオリゴ
ヌクレオチド混合物を適当な緩衝液中で、65度以上で１
分間以上、好ましくは、65度にて10分間、或は、95度に
て１分間以上加熱し、その後、溶液を室温に放冷する。
この反応により第２図に示すように、該サブオリゴヌク
レオチドは互いに相補的な塩基配列部分で結合し、部分
的に二本鎖を有するオリゴヌクレオチド鎖を形成するこ
とができる。
ヌクレオチド混合物を適当な緩衝液中で、65度以上で１
分間以上、好ましくは、65度にて10分間、或は、95度に
て１分間以上加熱し、その後、溶液を室温に放冷する。
この反応により第２図に示すように、該サブオリゴヌク
レオチドは互いに相補的な塩基配列部分で結合し、部分
的に二本鎖を有するオリゴヌクレオチド鎖を形成するこ
とができる。
本発明の方法においては、前記のようにして得られた
オリゴヌクレオチド鎖の非結合部分の鎖長を伸展させ二
本鎖化する際に、側鎖に固定化物質としての捕捉体を結
合したヌクレオチドフォスフェートを伸展部分に取り込
ませて捕捉体を複数ケ所に有する二本鎖ヌクレオチドを
形成する。この二本鎖形成の伸展反応では、オリゴヌク
レオチド鎖の非結合部である一本鎖が鋳型となり、その
鋳型を有するサブヌクレオチドと結合しているサブオリ
ゴヌクレオチドの該二本鎖形成部分の一がプライマーと
なって作用し、５′側から３′側方向に捕捉体を結合し
ているヌクレオチドを導入しながら鎖長を伸展し、合成
ヌクレオチドが形成される。
オリゴヌクレオチド鎖の非結合部分の鎖長を伸展させ二
本鎖化する際に、側鎖に固定化物質としての捕捉体を結
合したヌクレオチドフォスフェートを伸展部分に取り込
ませて捕捉体を複数ケ所に有する二本鎖ヌクレオチドを
形成する。この二本鎖形成の伸展反応では、オリゴヌク
レオチド鎖の非結合部である一本鎖が鋳型となり、その
鋳型を有するサブヌクレオチドと結合しているサブオリ
ゴヌクレオチドの該二本鎖形成部分の一がプライマーと
なって作用し、５′側から３′側方向に捕捉体を結合し
ているヌクレオチドを導入しながら鎖長を伸展し、合成
ヌクレオチドが形成される。
合成試薬としてはヌクレオチドトリフォスフェート、
捕捉体を結合した側鎖を有するヌクレオチドトリフォス
フェート及び該ヌクレオチドトリフォスフェートの重合
のための試薬を利用する。ヌクレオチドトリフォスフェ
ートとしてはdATP,dCTP,dGTP,TTPおよび捕捉体を側鎖に
結合したdATP,dCTP,dGTP,TTPを利用することができる。
この場合、該捕捉体結合のヌクレオチドトリフォスフェ
ートのみを加えてもよいし、捕捉体の非結合ヌクレオチ
ドトリフォスフェートを混在させてもよい。例えば捕捉
体非結合のヌクレオチドトリフォスフェートを全く加え
ず、捕捉体結合のヌクレオチドトリフォスフェートのみ
を加えて反応させた場合、作成された合成オリゴヌクレ
オチドの塩基配列は、捕捉体結合のヌクレオチドトリフ
ォスフェートを取り込んだ領域と取り込んでいない領域
が交互になるように構成されたものになる。
捕捉体を結合した側鎖を有するヌクレオチドトリフォス
フェート及び該ヌクレオチドトリフォスフェートの重合
のための試薬を利用する。ヌクレオチドトリフォスフェ
ートとしてはdATP,dCTP,dGTP,TTPおよび捕捉体を側鎖に
結合したdATP,dCTP,dGTP,TTPを利用することができる。
この場合、該捕捉体結合のヌクレオチドトリフォスフェ
ートのみを加えてもよいし、捕捉体の非結合ヌクレオチ
ドトリフォスフェートを混在させてもよい。例えば捕捉
体非結合のヌクレオチドトリフォスフェートを全く加え
ず、捕捉体結合のヌクレオチドトリフォスフェートのみ
を加えて反応させた場合、作成された合成オリゴヌクレ
オチドの塩基配列は、捕捉体結合のヌクレオチドトリフ
ォスフェートを取り込んだ領域と取り込んでいない領域
が交互になるように構成されたものになる。
重合試薬として用いる酵素には、E.coli DNAポリメ
ラーゼＩ、DNAポリメラーゼのKlenow断片、T4DNAポリメ
ラーゼ（T.Maniatis,et.al.Molecular Cloning 108,Col
d spring Harbar Laboratory）、T7DNAポリメラーゼ
（S.Tabor et.al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,4767−47
71（1987））、熱安定性DNAポリメラーゼ（R.K.Saiki,e
t.al.Science,239,487−491（1988））、他の入手可能
なDNAポリメラーゼ類、逆転写酵素、及び他の酵素、例
えば、各核酸の相補的であるプライマー伸展生成物を形
成するために適切な態様でのヌクレオチドの結合を促進
する酵素が含まれる。
ラーゼＩ、DNAポリメラーゼのKlenow断片、T4DNAポリメ
ラーゼ（T.Maniatis,et.al.Molecular Cloning 108,Col
d spring Harbar Laboratory）、T7DNAポリメラーゼ
（S.Tabor et.al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,4767−47
71（1987））、熱安定性DNAポリメラーゼ（R.K.Saiki,e
t.al.Science,239,487−491（1988））、他の入手可能
なDNAポリメラーゼ類、逆転写酵素、及び他の酵素、例
えば、各核酸の相補的であるプライマー伸展生成物を形
成するために適切な態様でのヌクレオチドの結合を促進
する酵素が含まれる。
連結試薬として用いる酵素としては、DNAリガーゼが
ある。DNAリガーゼは、E.coli由来のものでもファージT
4由来のものでも良いし、或は、同じ様な働きをする他
の酵素で良い。
ある。DNAリガーゼは、E.coli由来のものでもファージT
4由来のものでも良いし、或は、同じ様な働きをする他
の酵素で良い。
伸展されたヌクレオチドにニック（切れ目）が入って
いる場合には、T4ライゲースなどの酵素により切れ目が
ないように連結することができる。
いる場合には、T4ライゲースなどの酵素により切れ目が
ないように連結することができる。
該反応生成物である二本鎖ヌクレオチドからの一本鎖
合成オリゴヌクレオチドの形成は、変成条件下で処理す
ることによって得られる。変性は熱変性でも、アルカリ
による方法でも、二本鎖を一本鎖に分離する方法であれ
ば他の方法でも良い。例えば熱変性であれば95℃下５分
の加熱処理で一本鎖に解離することができる。
合成オリゴヌクレオチドの形成は、変成条件下で処理す
ることによって得られる。変性は熱変性でも、アルカリ
による方法でも、二本鎖を一本鎖に分離する方法であれ
ば他の方法でも良い。例えば熱変性であれば95℃下５分
の加熱処理で一本鎖に解離することができる。
一方、不溶性担体はその表面上に捕捉体と特異的に結
合するリガトンを結合させることによって、合成オリゴ
ヌクレオチドを結合させることができる。表面処理され
た該不溶性担体は、捕捉体とリガンドとの結合により一
本鎖にした合成オリゴヌクレオチドと結合する。
合するリガトンを結合させることによって、合成オリゴ
ヌクレオチドを結合させることができる。表面処理され
た該不溶性担体は、捕捉体とリガンドとの結合により一
本鎖にした合成オリゴヌクレオチドと結合する。
捕捉体としては、後述する不溶性担体表面に結合する
ことができるリガンドと選択特異的に結合可能な物質で
あり、かつヌクレオチドの側鎖に結合できる物質であれ
ばどのようなものでも利用することができる。
ことができるリガンドと選択特異的に結合可能な物質で
あり、かつヌクレオチドの側鎖に結合できる物質であれ
ばどのようなものでも利用することができる。
例えば、具体的な捕捉体とリガンドとしてはビチオン
−アビジン、ハプテン−抗体、フラビンアデニンジヌク
レオチド（FAD）−グルコースオキシダーゼ、ビオチン
−抗ビオチン抗体等の抗原−抗体があげられる。
−アビジン、ハプテン−抗体、フラビンアデニンジヌク
レオチド（FAD）−グルコースオキシダーゼ、ビオチン
−抗ビオチン抗体等の抗原−抗体があげられる。
担体に用いられる有機高分子物質としては、芳香族ビ
ニル化合物、不飽和カルボン酸のエステル類もしくはア
ミド類、不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合
物、共役ジエン化合物、並びに低級脂肪酸ビニルエステ
ルからなるビニル系単量体の一種以上を重合して得られ
る水不溶性の有機高分子物質や該有機高分子物質を化学
的に変性して得られる水不溶性の有機高分子物質、もし
くはアガロース、デキストラン、セルロースなどの多糖
類の架橋体やメチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲ
ン、カゼインなどの架橋体をあげることができる。
ニル化合物、不飽和カルボン酸のエステル類もしくはア
ミド類、不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビニル化合
物、共役ジエン化合物、並びに低級脂肪酸ビニルエステ
ルからなるビニル系単量体の一種以上を重合して得られ
る水不溶性の有機高分子物質や該有機高分子物質を化学
的に変性して得られる水不溶性の有機高分子物質、もし
くはアガロース、デキストラン、セルロースなどの多糖
類の架橋体やメチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲ
ン、カゼインなどの架橋体をあげることができる。
［実施例］ a.合成オリゴヌクレオチドの作製 プラスミドpUC19の塩基配列の一部に相補的に対応す
る塩基配列を含む下記のような四種類のサブオリゴヌク
レオチドをDNA合成装置（Applid Biosystems社381A）に
より合成した。
る塩基配列を含む下記のような四種類のサブオリゴヌク
レオチドをDNA合成装置（Applid Biosystems社381A）に
より合成した。
このうちの３′末端、或は３′末端及び５′末端から
の８塩基はそれぞれ他の各サブオリゴヌクレオチド中に
互いに相補的な塩基配列をもつように合成されている。
の８塩基はそれぞれ他の各サブオリゴヌクレオチド中に
互いに相補的な塩基配列をもつように合成されている。
これらの合成されたオリゴヌクレオチドの一部につい
て、7M尿素を含む20％ポリアクリルアミド電気泳動を行
ないその純度を調べた。その結果、95％以上の純度であ
ったので、それ以上の精製を行なわずに以下の反応に用
いた。
て、7M尿素を含む20％ポリアクリルアミド電気泳動を行
ないその純度を調べた。その結果、95％以上の純度であ
ったので、それ以上の精製を行なわずに以下の反応に用
いた。
各サブオリゴヌクレオチド２μｇ（約130pmole）をエ
ッペンドルフチューブに入れ、10×キナーゼ緩衝液（0.
5×Tris・HCl pH8.0−0.1M MgCl20.1Mβ−メルカプトエ
タノール）10μ、及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ１
μ（10単位）（TOYOBO社製）を加え、37度にて１時間
加温した。
ッペンドルフチューブに入れ、10×キナーゼ緩衝液（0.
5×Tris・HCl pH8.0−0.1M MgCl20.1Mβ−メルカプトエ
タノール）10μ、及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ１
μ（10単位）（TOYOBO社製）を加え、37度にて１時間
加温した。
次に、10×アニーリング溶液（100mMTris・HCl pH8.0
−60mM MgCl2−60mMβ−メルカプトエタノール−500mM
NaCl）を５μ加え、蒸留水にて50μに調整した。こ
れを65度の温水が入ったビーカー中で10分間加温し、そ
の後約１時間かけて室温になるまでゆっくり冷ました。
この反応で４本のサブオリゴヌクレオチドは下図のよう
な部分的二本鎖を有するオリゴヌクレオチド鎖を形成し
た。
−60mM MgCl2−60mMβ−メルカプトエタノール−500mM
NaCl）を５μ加え、蒸留水にて50μに調整した。こ
れを65度の温水が入ったビーカー中で10分間加温し、そ
の後約１時間かけて室温になるまでゆっくり冷ました。
この反応で４本のサブオリゴヌクレオチドは下図のよう
な部分的二本鎖を有するオリゴヌクレオチド鎖を形成し
た。
この溶液50μに1mMdATP,dGTP,及びdCTPをそれぞれ
２μ,0.4mMビチオン化UTP（BRL社製）を５μ,10×
アニーリング溶液５μ，蒸留水32μを加え、よく混
和したあとDNAポリメラーゼＩのKlenow断片（TOYOBO社
製）16単位を加え、37度にて１時間加温し、オリゴヌク
レオチド鎖の一本鎖部分の伸展反応を行なった。反応後
65度で５分間加熱し反応を停止させた後フェノール処理
し除タンパクを行なった。
２μ,0.4mMビチオン化UTP（BRL社製）を５μ,10×
アニーリング溶液５μ，蒸留水32μを加え、よく混
和したあとDNAポリメラーゼＩのKlenow断片（TOYOBO社
製）16単位を加え、37度にて１時間加温し、オリゴヌク
レオチド鎖の一本鎖部分の伸展反応を行なった。反応後
65度で５分間加熱し反応を停止させた後フェノール処理
し除タンパクを行なった。
次に、未反応のビオチン化UTPを除去するために、反
応溶液をゲル濾過カラム（Bio−gel P2;Bio−Rad社製
0.5×5cm）で精製した。目的の捕捉体修飾合成ヌクレオ
チドはほとんどカラムを素通りした分画に回収された。
各フラクションを0.5mlずつ収集し、それぞれ２μを
ニトロセルロースフィルターに吸着させ、BRL社のプロ
トコールに従って発色反応を行なったところ、２番目の
フラクションが強く発色し、目的の二本鎖合成ヌクレオ
チドがビオチンを含有していることが確認できた。
応溶液をゲル濾過カラム（Bio−gel P2;Bio−Rad社製
0.5×5cm）で精製した。目的の捕捉体修飾合成ヌクレオ
チドはほとんどカラムを素通りした分画に回収された。
各フラクションを0.5mlずつ収集し、それぞれ２μを
ニトロセルロースフィルターに吸着させ、BRL社のプロ
トコールに従って発色反応を行なったところ、２番目の
フラクションが強く発色し、目的の二本鎖合成ヌクレオ
チドがビオチンを含有していることが確認できた。
次に得られた捕捉体を含む二本鎖合成ヌクレオチドを
含む溶液を95度で５分間加熱処理して二本鎖を一本鎖に
解離し、プローブ核酸としての合成オリゴヌクレオチド
を得た。
含む溶液を95度で５分間加熱処理して二本鎖を一本鎖に
解離し、プローブ核酸としての合成オリゴヌクレオチド
を得た。
b.合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体との結合体であ
るプローブの調製 不溶性担体として以下のように処理した約粒径10μｍ
のゲル粒を用いた。ゲル粒は、アガロースゲルを粉砕し
たもので、その表面を臭化シアンで活性化させたあとア
ビジンと結合させた。このアビジン結合のゲル粒と先の
合成オリゴヌクレオチドを含む溶液とを20分間混和させ
た。この時合成オリゴヌクレオチド内に取り込まれたビ
オチンは、ゲル粒表面のアビジンと特異的に結合する。
るプローブの調製 不溶性担体として以下のように処理した約粒径10μｍ
のゲル粒を用いた。ゲル粒は、アガロースゲルを粉砕し
たもので、その表面を臭化シアンで活性化させたあとア
ビジンと結合させた。このアビジン結合のゲル粒と先の
合成オリゴヌクレオチドを含む溶液とを20分間混和させ
た。この時合成オリゴヌクレオチド内に取り込まれたビ
オチンは、ゲル粒表面のアビジンと特異的に結合する。
c.標的核酸の調製 検出を行なう核酸として、pUC19,pBR322及びpUC19とp
BR322の混合物の３種を用意した。
BR322の混合物の３種を用意した。
２μの蒸留水に各核酸試料１μｇを含む３種の各々
の試料に２μの10×TAバッファー、16μのddH2Oを
加えた反応液に10unitのHind IIIを加え、37度２時間で
完全加水分解した。この後フェノール抽出、エタノール
沈殿を行ない沈殿物を10μの蒸留水に溶解した。
の試料に２μの10×TAバッファー、16μのddH2Oを
加えた反応液に10unitのHind IIIを加え、37度２時間で
完全加水分解した。この後フェノール抽出、エタノール
沈殿を行ない沈殿物を10μの蒸留水に溶解した。
これに混合試薬液（0.33MTris−HCl pH7.9,33mM MgCl
2,33mMジチオスリトール）６μ,5mMdCTP1μ,5mMdGT
P1μ,5mMdATP1μ,5mMdTTP1μ，［α−32P］dGTP
（10Ci）１μ，蒸留水７μおよびT4−DNAポリメラ
ーゼ２μ（4unit）を添加し、30分間20度で反応を行
ない放射性標識を施した。
2,33mMジチオスリトール）６μ,5mMdCTP1μ,5mMdGT
P1μ,5mMdATP1μ,5mMdTTP1μ，［α−32P］dGTP
（10Ci）１μ，蒸留水７μおよびT4−DNAポリメラ
ーゼ２μ（4unit）を添加し、30分間20度で反応を行
ない放射性標識を施した。
その後、放射性標識を付した各試料の標的核酸を95度
で５分間加熱処理することによって一本鎖に解離した。
で５分間加熱処理することによって一本鎖に解離した。
d.ハイブリダイゼーション b.で調製した合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体の
結合体に、c.で得た一本鎖に解離した標的核酸溶液及び
10×アニーリング溶液５μｌを加え蒸留水にて50μｌに
調製した。これを軽く攪拌した後、65度の温水が入った
ビーカー中で10分間加温し、その後約１時間室温になる
までゆっくり冷ました。
結合体に、c.で得た一本鎖に解離した標的核酸溶液及び
10×アニーリング溶液５μｌを加え蒸留水にて50μｌに
調製した。これを軽く攪拌した後、65度の温水が入った
ビーカー中で10分間加温し、その後約１時間室温になる
までゆっくり冷ました。
軽く遠心して上清を廃棄し、さらにTE溶液で２度洗浄
した後、沈殿物の強度をシンチレーションカウンターで
数度測定したところpUC19をふくむ試料は106〜107cpmの
値を示し、pBR322のみを試料におけるその値はバックグ
ランドの２倍に満たなかった。
した後、沈殿物の強度をシンチレーションカウンターで
数度測定したところpUC19をふくむ試料は106〜107cpmの
値を示し、pBR322のみを試料におけるその値はバックグ
ランドの２倍に満たなかった。
［発明の効果］ 本発明の方法では、複数個の捕捉体を均一に含有する
合成オリゴヌクレオチドを得ることができた。このこと
により合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体との接点が
増加し、従来法と比較して強固な結合を持ち安定した結
合体を得ることができた。さらに、プローブ自体の高次
構造形成を防ぐこともできた。その結果、ハイブリッド
形成の効率を減少させることなく長い合成オリゴヌクレ
オチドを簡単に不溶性担体に結合させることが可能とな
った。
合成オリゴヌクレオチドを得ることができた。このこと
により合成オリゴヌクレオチドと不溶性担体との接点が
増加し、従来法と比較して強固な結合を持ち安定した結
合体を得ることができた。さらに、プローブ自体の高次
構造形成を防ぐこともできた。その結果、ハイブリッド
形成の効率を減少させることなく長い合成オリゴヌクレ
オチドを簡単に不溶性担体に結合させることが可能とな
った。
第１図は、部分的に互いに相補性をもつように構成され
た塩基配列を有するサブオリゴヌクレオチドを示す模式
図、第２図は第１図で示したサブオリゴヌクレオチドが
相補性を有する部分で結合した状態を示す模式図であ
る。
た塩基配列を有するサブオリゴヌクレオチドを示す模式
図、第２図は第１図で示したサブオリゴヌクレオチドが
相補性を有する部分で結合した状態を示す模式図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 桜永 昌徳 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ ヤノン株式会社内 (56)参考文献 特開 平１−171499（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／10313（ＷＯ，Ａ１) ＮＡＴＵＲＥ，320，ｐ．695−699, 1986 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ，13（５），ｐ．1529−1541, 1985 ＮＡＴＵＲＥ，318，ｐ．334−338, 1985 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，257（16），ｐ．9226−9229，1982 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/68 ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (4)
- 【請求項１】標的核酸の検出方法であって、 （ａ）下記の（ｉ）〜（iv）の工程によって担体に固定
された一本鎖プローブ核酸を調製する工程； （ｉ）３′末端にて相補的に結合可能な第１及び第２の
一本鎖オリゴヌクレオチドを合成する工程； （ii）該第１及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを互
いに相補的な３′末端において結合して部分的に二本鎖
構造を有するオリゴヌクレオチドを形成し、次いでヌク
レオチドを含み、該ヌクレオチドの一部または全部が固
定化物質が結合したものである反応溶液中で伸展反応を
行なうことによって該部分的に二本鎖構造を有するオリ
ゴヌクレオチドの３′末端を起点として前記ヌクレオチ
ドを重合させ、複数の固定化物質が導入されたオリゴヌ
クレオチド伸展部分を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
を形成する工程； （iii）該二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖化して、
複数の固定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展
部分を有する一本鎖プローブ核酸を形成する工程；及び （iv）該一本鎖プローブ核酸を、該一本鎖プローブ核酸
のオリゴヌクレオチド伸展部分に導入されている複数の
固定化物質を用いて担体に結合する工程； （ｂ）該担体に結合された該一本鎖プローブ核酸と、標
識化されている一本鎖標的核酸とのハイブリッドを形成
する工程；及び （ｃ）該ハイブリッド中に導入されている標識化合物を
用いて該ハイブリッドを検出する工程； を有することを特徴とする標的核酸の検出方法。 - 【請求項２】複数箇所において担体に固定している一本
鎖プローブ核酸の製造方法であって、 （ｉ）３′末端にて相補的に結合可能な第１及び第２の
一本鎖オリゴヌクレオチドを合成する工程； （ii）該第１及び第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを互
いに相補的な３′末端において結合して部分的に二本鎖
構造を有するオリゴヌクレオチドを形成し、次いでヌク
レオチドを含み、該ヌクレオチドの一部または全部が固
定化物質が結合したものである反応溶液中で伸展反応を
行なうことによって該部分的に二本鎖構造を有するオリ
ゴヌクレオチドの３′末端を起点として前記ヌクレオチ
ドを重合させ、複数の固定化物質が導入されたオリゴヌ
クレオチド伸展部分を有する二本鎖オリゴヌクレオチド
を形成する工程； （iii）該二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖化して、
複数の固定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展
部分を有する一本鎖プローブ核酸を形成する工程；及び （iv）該一本鎖プローブ核酸のオリゴヌクレオチド伸展
部分に導入されている複数の固定化物質を用いて該一本
鎖プローブ核酸を担体に結合する工程； を有することを特徴とする固定化一本鎖プローブ核酸の
製造方法。 - 【請求項３】標的核酸の検出方法であって、 （ａ）下記の（ｉ）〜（iv）の工程によって担体に固定
された一本鎖プローブ核酸を用意する工程； （ｉ）３′末端にて相補的に結合可能な第１及び第２の
一本鎖オリゴヌクレオチド、該第１又は第２の一本鎖オ
リゴヌクレオチドの５′末端にて相補的に結合可能な第
３の一本鎖オリゴヌクレオチド、及び該第３の一本鎖オ
リゴヌクレオチドの３′末端にて相補的に結合可能な第
４の一本鎖オリゴヌクレオチドを合成する工程； （ii）該第１、第２、第３及び第４の一本鎖オリゴヌク
レオチドを互いに相補的な３′末端及び５′末端におい
て結合して部分的に二本鎖構造を有するオリゴヌクレオ
チドを形成し、次いでヌクレオチドを含み、該ヌクレオ
チドの一部または全部が固定化物質が結合したものであ
る反応溶液中で伸展反応を行なうことによって該部分的
に二本鎖構造を有するオリゴヌクレオチドの３′末端の
各々を起点として該ヌクレオチドを重合させ、複数の固
定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展部分を複
数有する二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程； （iii）該二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖化して、
複数の固定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展
部分を複数有し、該複数のオリゴヌクレオチド伸展部分
の間に該第１、第２又は第３の一本鎖オリゴヌクレオチ
ド由来の、固定化物質を有しない所定の長さの塩基配列
を有する一本鎖プローブ核酸を形成する工程； （iv）該一本鎖プローブ核酸の複数のオリゴヌクレオチ
ド伸展部分を、各々のオリゴヌクレオチド伸展部分に導
入されている複数の固定化物質を用いて担体に結合して
該一本鎖プローブ核酸を複数箇所にて担体に結合する工
程； （ｂ）該担体に結合された該一本鎖プローブ核酸と、標
識化されている一本鎖標的核酸とのハイブリッドを形成
する工程；及び （ｃ）該ハイブリッド中の該標的化合物を用いて該ハイ
ブリッドを検出する工程； を有することを特徴とする標的核酸の検出方法。 - 【請求項４】複数箇所において担体に結合している一本
鎖プローブ核酸の製造方法であって、 （ｉ）３′末端にて相補的に結合可能な第１及び第２の
一本鎖オリゴヌクレオチド、該第１又は第２の一本鎖オ
リゴヌクレオチドの５′末端にて相補的に結合可能な第
３の一本鎖オリゴヌクレオチド、及び該第３の一本鎖オ
リゴヌクレオチドの３′末端にて相補的に結合可能な第
４の一本鎖オリゴヌクレオチドを合成する工程； （ii）該第１、第２、第３及び第４の一本鎖オリゴヌク
レオチドを互いに相補的な３′末端及び５′末端におい
て結合して部分的に二本鎖構造を有するオリゴヌクレオ
チドを形成し、次いでヌクレオチドを含み、該ヌクレオ
チドの一部または全部が固定化物質が結合したものであ
る反応溶液中で伸展反応を行なうことによって該部分的
に二本鎖構造を有するオリゴヌクレオチドの３′末端の
各々を起点として該ヌクレオチドを重合させ、複数の固
定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展部分を複
数有する二本鎖オリゴヌクレオチドを形成する工程； （iii）該二本鎖オリゴヌクレオチドを一本鎖化して、
複数の固定化物質が導入されたオリゴヌクレオチド伸展
部分を複数有し、該複数のオリゴヌクレオチド伸展部分
の間に該第１、第２又は第３の一本鎖オリゴヌクレオチ
ド由来の、固定化物質を有しない所定の長さの塩基配列
を有する一本鎖プローブ核酸を形成する工程； （iv）該一本鎖プローブ核酸の複数のオリゴヌクレオチ
ド伸展部分の各々に導入されている固定化物質を用いて
該一本鎖プローブ核酸を該担体に複数箇所で固定する工
程； を有することを特徴とする固定化一本鎖プローブ核酸の
製造方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02003338A JP3122106B2 (ja) | 1990-01-12 | 1990-01-12 | 標的核酸の検出方法及びプローブの製造方法 |
| DE69028725T DE69028725T2 (de) | 1989-02-28 | 1990-02-27 | Partiell doppelsträngiges Oligonukleotid und Verfahren zu seiner Bildung |
| AT90103830T ATE143696T1 (de) | 1989-02-28 | 1990-02-27 | Partiell doppelsträngiges oligonukleotid und verfahren zu seiner bildung |
| EP90103830A EP0385410B1 (en) | 1989-02-28 | 1990-02-27 | Partially double-stranded oligonucleotide and method for forming oligonucleotide |
| US07/974,303 US5830643A (en) | 1989-02-28 | 1992-11-10 | Partially double-stranded oligonucleotide and method for forming oligonucleotide |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP02003338A JP3122106B2 (ja) | 1990-01-12 | 1990-01-12 | 標的核酸の検出方法及びプローブの製造方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| JPH03210195A JPH03210195A (ja) | 1991-09-13 |
| JP3122106B2 true JP3122106B2 (ja) | 2001-01-09 |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP02003338A Expired - Fee Related JP3122106B2 (ja) | 1989-02-28 | 1990-01-12 | 標的核酸の検出方法及びプローブの製造方法 |
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| JP (1) | JP3122106B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR200490802Y1 (ko) | 2017-10-24 | 2020-01-06 | 이길자 | 다기능 발토시 |
-
1990
- 1990-01-12 JP JP02003338A patent/JP3122106B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ＮＡＴＵＲＥ，３１８，ｐ．３３４−３３８，１９８５ |
| ＮＡＴＵＲＥ，３２０，ｐ．６９５−６９９，１９８６ |
| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３（５），ｐ．１５２９−１５４１，１９８５ |
| Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５７（１６），ｐ．９２２６−９２２９，１９８２ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR200490802Y1 (ko) | 2017-10-24 | 2020-01-06 | 이길자 | 다기능 발토시 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03210195A (ja) | 1991-09-13 |
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