JPH02268683A - 単一プライマーを用いる核酸の増幅 - Google Patents

単一プライマーを用いる核酸の増幅

Info

Publication number
JPH02268683A
JPH02268683A JP2010457A JP1045790A JPH02268683A JP H02268683 A JPH02268683 A JP H02268683A JP 2010457 A JP2010457 A JP 2010457A JP 1045790 A JP1045790 A JP 1045790A JP H02268683 A JPH02268683 A JP H02268683A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polynucleotide
sequence
primer
analyte
stranded
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2010457A
Other languages
English (en)
Other versions
JP3109810B2 (ja
Inventor
Samuel Rose
サムエル　ローズ
Thomas C Goodman
トーマス　シー．グッドマン
Linda M Western
リンダ　エム．ウェスタン
Martin Becker
マーチン　ベッカー
Edwin F Ullman
エドウィン　エフ．フルマン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Syntex USA LLC
Original Assignee
Syntex USA LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Syntex USA LLC filed Critical Syntex USA LLC
Publication of JPH02268683A publication Critical patent/JPH02268683A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3109810B2 publication Critical patent/JP3109810B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/682—Signal amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6862—Ligase chain reaction [LCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
発明の背景 （１）発明の分野 核酸ハイブリダイゼーシヨンは、核酸の同一性の検討に
、また存在の確立に使用されてきた。ハイブリダイゼー
ションは相補性塩基の対合に基づくものである。相補性
の一本鎖核酸を一緒にインキュベートすると、相補性塩
基配列は対合し、二本鎖のハイブリッド分子を形成する
。−本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）またはリボ核
酸（））Ｎ△）が相補性の核酸配列と水素結合構造を形
成する能力は、分子生物学の研究において分析手段とし
て利用されてきた。高い比活性をもつ放射性ヌクレオシ
ド三リン酸の利用、またＴ４キノ−一ゼによるＤＮＡの
３２Ｐ標識は、生物学的に興味ある様々な核酸配列の同
定、単離および特性の解明を可能にしてきＩＣ０核酸ハ
イブリダイゼーシヨンは、独特の核酸配列に関連する病
的状態の診断に威力を発揮する可能性がある。これらの
独特の核酸配列は、挿入、欠失、点突然変異、または細
菌、かび、真菌およびウィルスの感染による外因性ＤＮ
ＡもしくはＲＮＡの獲得に由来するＤＮＡの遺伝的また
は環境的変化によって生じるものである。核酸ハイブリ
ダイゼーションはこれまで、主として、学問的および工
業的な分子生物学実験室で行われてきた。疾患関連ＤＮ
ＡまたはＲＮＡの患者体液中濃度は多くの場合きわめて
低く、十分な感受性のある核酸ハイブリダイゼーション
分析法がなかったことから、臨床医学における診断手段
としての核酸ハイブリダイゼーションの応用は限られて
いる。 特定の核酸配列の最近の検出方法は、一般に、固体支持
体たとえばニトロセルロースろ紙、セルロースろ紙、ジ
アゾ化ろ紙、またはナイロン膜上へ標的核酸の固定化を
包含するものである。標的核酸が支持体上に固定された
のち、支持体を適当に標識したプローブ核酸と約２〜４
８時間接触させる。上記時間の経過後、固体支持体を制
御された湿度で数回洗浄して、ハイブリダイズしなかっ
たプローブを除去する。支持体をついで乾燥し、ハイブ
リダイズした物質をオートラジオグラフィーまたは分光
測光法によって検出する。 きわめて低い濃度を検出しなければならない場合には、
この現在の方法は時間がかかり、労力を要し、また放射
標識はど容易には検出できない非同位元素標識の使用は
多くの場合適当ではない。 したがって、核酸配列の検出に単純な、迅速な、非同位
元素の、均一もしくは不均一法の使用を可能にする感受
性を高めた方法の開発が望まれていた。 最近、ＤＮＡの特異的セグメントを酵素的に増幅する、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰｃＲ）法として知られた方法
が報告された。このｉｎ　ｖｉｔｒｏ増幅操作は、変性
、オリゴヌクレオチドプライマーアニーリングＪ３よび
好熱性ポリメラーゼによるプライマー伸張にサイクルを
反復し、プライマーに隣接する領域のコピーを指数的に
増加させることを基づくものである。ＤＮＡの対立鎖に
アニーリングしたＰＣＲプライマーは、一つのプライマ
ーのポリメラーゼ触媒伸張生成物が他のプライマーの鋳
型鎖として働くように配置され、オリゴヌクレオチドプ
ライマーの５′末端間の距離によって決定される長さを
イー８１’る不連続ノラグメントの蓄積を招くことにな
る。 （２）　　従来技術の説明 核酸配列の増幅、検出および／またはり〇−二ングの方
法は、米国特許用４．６８３．１９５号および第４，６
８３．２０２号に開示されている。 ポリメラーゼ連鎖反応による配列重合化は、５ａｉｋｉ
ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３０　：　１３５０〜１３５４
．１９８６）によって記載されている。オリゴヌクレオ
ヂドの製造方法は、ヨーロッパ特許出願第０１９４５４
５Ａ２号に記載されている。ベルギー特訂出願ＢＥ９０
４４０２ＭにはＤＮＡ検出プローブを製造するための鋳
型が開示されている。真核細胞内での遺伝子増幅は米国
特許用４．６５６゜１３４号に開示されている。 Ｌａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａ
ｄ、　　Ｓｅｉ、　　ＵＳＡ、　　７８　：６６３３〜
６６３７．１９８１）は、ビオチン標識ポリヌクレオヂ
ドの酵素的合成およびこれらの物質の新規な核酸親和性
プローブとしての使用を開示している。ビオチン標識ハ
イブリダイゼーシ３ンブローブを用いる、培養細胞およ
びパラフィン包埋組織片中のウィルスゲノムの検出はｅ
ｒｉｇａｔｉらＢ；ｒｏ＋ｏｏｙ、　１２６　：　３２
〜５０．１９８３）によって論じられている。米ｆＩｌ
特許第４゜４８６．５３９号には、−工程サンドイッチ
ハイブリダイゼーション試験による微生物の核酸の検出
が開示されている。ＤＮＡの検出に基づく感度の高い悪
性疾患の試験法が米国特許用４，４９０゜４７２号に記
述されている。米国特許用４，４８０．０４０号には、
診断すべきウィロイドまたはウィルスの核酸と相補性の
放（ト）性標ＩＤＮへを使用する植物ウィロイド疾患お
よびウィルスの高感度かつ迅速な診断法が示されている
。ヨーロッパ特許出願８３　１０６　１１２．２号＜１
９８２年６月２３日付米国特許出願３９１．４４０号に
基づく優先権主張）には、改良された標識ヌクレオチド
およびポリメクレオチド、ならびにその製造、使用およ
び検出方法が教示されている。細胞ＤＮＡの検出および
定量のための方法および組成物は、米国特許用４．４２
３．１５３号に開示されている。、診断微生物における
特異的ＤＮＡプローブは米国特許用４，３５８，５３５
号に論じられている。多形性の制限部位Ｊ３よび核酸配
列の検出方法はヨーロッパ特許用！［０１６４０５４△
１号に記載されている。米国特許用４．６６３゜２８３
号には二本鎖ＤＮＡの変換方法が記載されている。 転写シクエンシングによるゲノムの増幅は５ｔｏｒｔｅ
ｔら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　　２３９：４９１．１９８８
）によって論じられている。熱安定性ＤＮＡポリメラー
ゼによるプライマーに向けられた酵素的なりＮＡの増幅
は５ａｉｋｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２３９　：　４８
７．１９８８）に記載されている。米国特許第特許第４
，７２４．２０２号には、核酸ハイブリダイゼーション
の検出のためのハイブリダイズ不能核酸の使用が開示さ
れている。Ｂｕｇａｖａｎらは、出生前診断および法医
学的なｌ−（Ｌ　Ａ分類のため、酵素的に増幅させたＤ
ＮＡを分析する非放射性オリゴヌクレオチドプローブの
利用を報告している。 均一な、反復した増幅核酸配列の検出、単離については
米国特許用４，６７５．２８３号に開示されている。そ
れ自体にまたは他の核酸に反復ハイブリダイズして増幅
された実体を形成する能力をもつ一本鎖自己ハイブリダ
イゼーシコン核酸プローブは、米国特許出願第８８８．
０５８号（１９８６年７月２２日出願）に記載されてい
る。米国特許出願第４．６８３．１９５号および第４゜
６８３．２０２号には、試薬複合体からの置換ＲＮＡ−
本領ポリヌクレオチドの消化および別個の相補性核酸鎖
の２種のオリゴヌクレオチドプライマー処理での核酸配
列の増幅による均一系ポリメクレオチド置換アッセイが
開示されている。 ヨーロッパ特許出願０２００３６２号には、核酸配列の
増幅、検出またはクローニング方法で、疾患の診断およ
びトランスホーメーションベクターの製造に有用な方法
が記載されている。細胞質ドツトハイシリダイぜ一ジョ
ンによる多数の小サンプル中の相対的核酸レベルの簡単
な分析方法が米国特許第４．６７７．０５４号に記載さ
れている。ヂオヌクレオチド含有プローブで核酸間Ｔｊ
ＩＪを検出するためのハイブリダイゼーション方法は米
国持具１第４．６４７．５２９号に記載されている。 ＤＮＡをセルロースに共有結合させるための簡単で効率
的な酵素的り法、ならびにハイブリダイゼーション制限
分析およびＤＮＡブＯ−ブのすｖｉｔｒｏ合成へのその
応用は、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５１４：９１７
１〜９１９１．１９８６に記載されている。一本鎖オリ
ゴヌクレオチドのＥｃｏ　Ｒｌ制限エンドヌクレアーゼ
による切断はＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、　　１
５　：　７０９〜７１６．１９８７に記載されている。 組換えＲＮＡハイブリダイゼーシコンブローブの指数的
増幅はＬｉｚａｒｄｉら（Ｂｉｏ　／　Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｑｙ６：１１９７〜１２０２．１９８８）によって報
告サレテイル。Ｆａｈｒｌａｎｄｅｒらは、ＤＮＡプロ
ーブシグナルの増幅：クリスマスツリー・アプローチに
ついＣ論じているＣＢｉｏ　／Ｔｅｃｈｔ＋ｏｌｏａｙ
、　６　：　１１６５〜１１６８．１９８８）。 標的配列に架橋可能なプローブを用いる核酸ハイブリダ
イぜ−シコンアツセイは、米国特許第４゜５９９．３０
３号に記載されている。この方法は、二官能性の架橋分
子が共有結合で導入された特異的一本鎖すボ核醗または
デオキシリボ核酸分子の製造を包含する６導入は、架橋
分子がプローブの標的である細菌、ウィルスまたは吐乳
動物染色体の核酸との第二の反応を受け、共有結合の架
橋を形成する能力を維持づるように行われる。架橋後、
非架橋プローブを、共有結合による架橋ブローブー標的
複合体から、一本鎖ブローブと二二水制共イｊ結合ブロ
ーブー標的複合体を区別する数棟の操作のひとつを用い
て分離する。 遺伝的異常疾患の診断のため、診断および隣接プローブ
を用いるハイブリダイビーシコンによる、とくに自動操
作での、核酸中の標的配列の検出は、］−ロッパ特許出
験０　１８５　４９４　　Ａ２号に記載されている。こ
の方法では、サンプルを、標的配列の診断部分と相補性
のプローブ（診断プローブ）および診断部分と隣接した
ヌクレオチド配列と相補性のプローブ（隣接プローブ）
と、診断ブ［Ｊ−ブが標的配列を含むサンプル核酸にの
み結合したままでいる条件下にハイブリダイズさせる。 次に診断ブし１−ブと隣接プローブを共有結合さけて標
的配列と相補性の標的ブＩＪ−ブを生成させ、結合しな
いプローブを除去する。好ましい様式においては、ブ１
コープの一方を［識して、標的配列の存イ１または不存
在が、サンプル核酸標的プローブ二重らせん構造の融解
、解離した標的ブ１コープの溶出および標識についての
試験によって調べられる。 上述の方法には、少なくとも、隣接配列を要するという
欠点がある。この方法を実施するためには、診断配列と
隣接配列を同定し、これらの配列と相補性の診断プロー
ブと隣接プローブを作成しなければならない。診断配列
および隣接配列が正確に同定されていないと、診断プロ
ーブおよび隣接プローブのハイブリダイゼーシヨンが十
分ではなく、アッセイの特異性および感度が失われまた
低下することになる。 発明の要約 ここにｍ１示される発明は、単一のポリヌクレオチドプ
ライマーを使用して、・一本鎖ポリヌクレオヂドの多数
の」ビーを生成する方法およびそのための試薬に関する
。結果どして、公知の方法に比べ、試薬およびアッセイ
工程の数が減少する。 本発明の一態様に３３いては、（２）ヌクレオシド三リ
ン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの
存在下に、一本鎖ポリヌクレオチドに沿って、少なくと
もその３′末端には上記一本鎖ポリヌクレオチドの３′
末端における第二の隣接配列とハイブリダイゼーション
可能な少なくとも１０塩基配列を有するポリヌクレオチ
ドプライマーの延長を形成させ、この場合上記第二の隣
接配列は上記一本鎖ボリメクレオヂドの５′末端におけ
る少なくとも１０塩基の第一の隣接配列と部分的にまた
は完全に相補性であり、（ｂ）延長されたポリヌクレオ
チドプライマーと一本鎖ポリヌクレオチドを解離させ、
す工程（２）を反復することからなる方法によって、一
本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも１個のコピーを生成
させる。 本発朗の他の態様は、ポリヌクレオチド配列の多数のコ
ピーを生成させる方法に関する。この方法は、（ｉ）上
記ポリヌクレオチド配列を有し、各末端には部分的にま
たは完全に相補性の第一および第二の隣接配列が隣接し
ている一本鎖ポリヌクレオチド、（ｉｉ）その３′末端
における少なくとも１０塩基部分は上記第一および第二
隣接配列の構成要素すなわち上記一本鎖ポリヌクレオチ
ドの３′末端にハイブリダイぜ−シコン可能なポリヌク
レオチドプライマー、（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸
、および（！■）鋳型依存性ポリメクレオチドポリメラ
ーゼの混合物を準備ｌるものである。この混合物を、完
全にまたは部分的に、順次または同時に、（＋）−重鎮
ボリヌクレオヂドをそれとハイブリダイズした相補性配
列があればそれからｗｉｔＩｋさせ、（ｉｉ）−本鎗ボ
リヌクレオチドの３′末端における隣接配列とポリヌク
レオチドプライマーをハイブリダイズさせ、（ｉｉｉ）
ポリヌクレＡ−チドプライマーを一重鎮ボリヌクレオチ
ドに沿って延長させて第一の延長されたポリヌクレオチ
ドプライマーを与え、（１ｖ）第一の延長されたポリヌ
クレオチドプライマーと一末鎖ポリメクレオチドを解離
させ、（ｖ）第一の延長されたポリヌクレオチドプライ
マーをポリヌクレオチドプライマーとハイブリダイズさ
せ、（ｖｌ）このポリヌクレオチドプライマーを第一の
延長されたポリヌクレオチドプライマーに沿って延長さ
せて第二の延長されたポリヌクレオチドプライマーを与
え、（ｖｉｉ）第二の延長されたポリヌクレオチドプラ
イマーを第一の延長されたポリヌクレオチドプライマー
から解離させ、（ｖｉｉｉ）上記工程（ｖ）〜（ｖｉｉ
）を反復させる条件下に、インキュベートする。 他の態様は、互いに部分的にまたは完全に相補性の一対
の隣接配列を有する異なる構成要素によって各末端が隣
接されている配列のポリヌクレオチド内でポリヌクレオ
チド配列の多数のコピーを生成させる方法に関する。こ
の方法では、（２）ポリメクレオチドを、そのポリヌク
レオチド配列の３′末端における一対の隣接配列の構成
要素の少なくとも部分と少なくとも部分的に相補性でハ
イブリダイゼーション可能な終結配列を少なくともその
３′末端に有する単一のポリヌクレオチドプライマー、
ヌクレオシド三リン酸、および鋳型依存性ポリヌクレオ
チドポリメラーゼと混合する。 この混合物を、完全にまたは部分的に、順次または同時
に、［ｉ）ポリヌクレオチド配列をそれとハイブリダイ
ゼーション可能な配列からｗ４−離させて一本鎖ポリヌ
クレオチドを与え、（１１）一本鎖ポリヌクレオチドの
３′末端における隣接配列とポリヌクレオチドプライマ
ーをハイブリダイズさけ、（ｉｉｉ）ポリヌクレオチド
プライマーを・一本鎖ポリヌクレオチドに沿って延長さ
せて延長されたポリヌクレオチドプライマーを与え、（
１ｖ）第一の延長されたポリヌクレオチドプライマーと
一末鎖ポリメクレＡチドプライマーを解離させ、（ｖ）
第一の延長されたポリヌクレオチドプライマーとポリヌ
クレオチドプライマーとハイブリダイズさせ、（ｖｉ）
ポリヌクレオチドプライマーを第一の延長されたポリヌ
クレオチドプライマーに沿って延長させて第二の延長さ
れたポリヌクレオチドプライマーを与え、（■白）第二
の延長されたプライマーを第一の延長されたポリヌクレ
オチドプライマーから解離させ、（ｖｉｉｉ）上記工程
（５）〜（７）を反復さＶる条件下にインキュベートす
る。 上述の方法は、ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑わ
れるサンプル中のポリヌクレオチド分析の存在の決定を
容易にするのに応用できる。標的ポリヌクレオチド配列
はＤＮＡｒムＲＮ　Ａでもよい。 本発明のこの特徴における一態様においては、この方法
は（２）分析対象の存在の結果として、相補性の第一お
よび第二隣接配列によって隣接された一末鎖ボリヌクレ
オヂドを形成させ、（ｂ）この−重鎮ボリヌクレオヂド
および隣接配列の多数の］ビーを形成させ、Ｑ一本鎖ポ
リヌクレオチドを検出することからなる。特異的な＠酸
またはポリヌクレオチドを検出するだめの任意の方法が
使用できる。一本鎖ポリヌクレオチドの多数のコピーは
、たとえば上述の方法のいずれかで製造できる。 上記−態様における方法の工程に）として、（１）ヌク
レオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチドポ
リメラーゼの存在下に第一の一本鎖ポリヌクレオチドに
沿って上記分析対象またはそのフラグメントの延長を形
成させ（延長されたポリヌクレオチド分析対象）、二本
鎖ポリヌクレオチド１をつくり、（ｉｉ）一本鎖の延長
されたポリヌクレオチド分析対象を上記ポリヌクレオチ
ド１から解離させ、（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸お
よび鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの存在下
に上記−本編ポリヌクレオチド分析対象に沿って、少な
くともその３′末端は上記一本鎖の延長されたポリヌク
レオチド分析対象の少なくとも１部とハイブリダイゼー
ション可能な少なくとも１０塩基の配列を有する第一の
ポリヌクレオチドプライマーの延長を形成させ、二本鎖
ポリヌクレオチド２をつくり、（ｉｖ）上記ポリメクレ
オチド２から一本鎖の延長された第一のポリヌクレオチ
ドプライマーを解離させ、（ｖ）ヌクレオシド三リンｍ
および鋳型依存性ポリメクレＡチドボリメラーゼの存在
下に第二のポリヌクレオチドプライマーに沿って上記一
本鎖の延長された第一のポリヌクレオチドプライマーの
延長を形成させ、この場合、少なくとも上記第二のポリ
ヌクレオチドプライマーの３′末端は上記一本鎖の延長
された第一のポリヌクレオチドプライマーの少なくとも
１部とハイブリダイゼータ３ン可能な少なくとも１０塩
基の配列を有し、二本鎖ポリメクレオチド３をつくり、
この場合、一本鎖の２回延長された第一のポリヌクレオ
チドプライマーの３′末端および５′末端は各々少なく
とも部分的に相補性の１０塩基の配列を有し、そして（
ｖｉ）上記ポリメクレオチド３から上記一本鎖の２回延
長された第一のポリヌクレオチドプライマーを解離させ
：そして 同方法の工程（ｂ）として、（１）ヌクレオシド三リン
ｍおよび鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの存
在下に上記一本鎖の２回延長された第一のポリヌクレオ
チドプライマーに沿って上記第一のポリヌクレオチドプ
ライマーの延長を形成させ、二本鎖ポリヌクレオチド４
をつくり、（ｉｉ）ポリメクレオチド４から一本鎖の延
長された第一のポリヌクレオチドプライマーを解離させ
、そして（＋ｉｉ）　工程１）を反復させる各工程から
なる方法をあげることができる。より詳細には例２を参
照。 ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑われるサンプル中
の上記分析対象の存在を決定する特定の一方法において
は、それぞれ少なくとも１５個の塩基を有し少なくとも
８０％の相補性を示す第一および第二隣接配列によって
隣接された一本鎖ポリヌクレオチドを、上記分析対象の
存在の結果として形成させる。ヌクレオシド三リン酸お
よび鋳型依存性ポリメラーゼの存在下に、少なくともそ
の３′末端で一末鎖ポリヌクレオチドの３′末端におけ
る第二の配列とハイブリダイゼーション可能なポリヌク
レオチドプライマーの延長を形成させる。一本鎖ポリヌ
クレオチドと同一および／または相補性の配列を含有す
る延長されたポリヌクレオチドプライマーを検出すると
、その存在はポリヌクレオチド分析対象の存在を指示す
る。 本発明の他のＦｌは、分析対象の含有が疑われるサンプ
ルを第一および第二のポリヌクレオチドプローブと接触
させる分析方法に関する。第一のプローブは、分析対象
の一方の鎖の第一の部分に相補性の３′末端における配
列と第一の隣接配列からなる。第二のプローブは、分析
対象の同じ鎖の第二の部分に相補性の５′末端における
配列と第二の隣接配列からなる。接触は、第一および第
二のプローブが分析対象と結合する条件下に実施される
。条件は、第一および第二のポリヌクレオチドプローブ
に結合した場合にのみ、互いに連結するように設定され
る。ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリメクレ
オブードポリメラーゼの存在下に、少なくともその３′
末端は隣接配列とハイブリダイゼーション可能なポリヌ
クレオチドプライマーの延長が形成される。第一のプロ
ーブと相補性の配列を含有する延長されたポリヌクレオ
チドプライマーを検出すると、その存在は分析対象の存
在を指示する。 木発咀の他の特徴は、ポリヌクレオチド分析対象の含イ
ｊが時ねれるサンプル中の上記分析対象の存在を検出す
る方法に関する。この方法は、（→ポリヌクレオヂドブ
ローブの第三および第四配列を連結させ、この場合、第
三の配列はＭＭ３’末端を、第四の配列は遊離５′末端
を有し、それぞれが分析対象の別個の部分にハイブリダ
イゼーション可能でまた、上記分析対象の存在下にのみ
連結可能であるかもしくは連結可能になることができさ
らにト記ポリヌクレオチドブローブは第一および第二の
隣接配列からなり、この第一配列は第三の配列の５′で
あり、第二配列は第一配列の５′であり、第四の配列は
第二配列の５′であり、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸お
よび鋳型依存性ポリヌクレオヂドポリメラーゼの存在下
、少なくともその３′末端でポリヌクレオヂドブローブ
の第二隣接配列とハイブリダイゼーション可能なポリヌ
クレオチドプライマーの延長を形成させ、分析対象の別
個の部分に相補性の、連結した第三もしくは第四配列の
少なくとも部分と同一および／もしくは相補性の配列を
検出する各工程からなる。 本発明による伯の分析方法は、分析対象の含有が疑われ
るサンプルを第一〇よび第二のポリヌクレオチドプロー
ブと接触させるものである。第一のブ［］−ブは（１）
第二のプローブ中の第二の隣接配列と部分的または完全
に相補性の第一の隣接配列、および（１１）第二のプロ
ーブと部分的または完全に相補性の部分以外の分析対象
の部分に相補性の配列からなる。第一および第二のプロ
ーブは、分析対象に結合した場合にのみ、互いに連結１
ｊＪ能であるかまたは連結可能になることができる。こ
の方法はさらに、ヌクレオシド三リン酸と鋳型依存性ポ
リヌクレオブドポリメラービの存在下に、他のプローブ
の３′末端に連結しているブ■コープの隣接配列と少な
くともその部分がハイブリダイゼーション可能なポリヌ
クレオチドプライマーの延長を形成させるものである。 ついで、延長されたポリヌクレオチドプライマーおよび
／またｔよ連結した第一および第二ポリヌクレオヂドブ
ローブが検出される。 特異的態様の説明 本発明は、一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも１個の
コピー、好ましくは多数のコピーの生成を可能にする。 一本鎖ポリヌクレオチドはメジウム中に存在していても
よいし、またポリヌクレオチド分析対象の含有が疑われ
るサンプル中にその分析対象の存在によって形成されて
もよい。一本鎖ポリメクレオチドの多数の］ビーの生成
に際しては、以下の成分、ずなわら（ｉ）一本鎖ポリヌ
クレオチド、（ｉ　ｉ　）−・重鎮ポリヌクレオチドの
３′末喝に接続する第二の隣接配列とハイブリダイゼー
ション可能な少なくとも１０塩基好ましくは１５塩基配
列を少なくともその３′末端に有するポリヌクレオチド
プライマー、（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸、Ｊ３よ
び（１ｖ）鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼを
準備する。一本鎖ポリヌクレオチド配列に接続する第二
の隣接配列は通常、一本鎖ポリヌクレオチドの５′末端
に接続する少なくとも１０塩基、好ましくは１５塩基の
第一のＦＪ！ｌ接配列色配列くとも６５％の相補性を有
する。一本鎖ポリヌクレオヂドＪ３よび第一の隣接配列
に沿ってプライマーを延長させたのち、延長されたポリ
ヌクレオチド配列を一末鎖ポリヌクレオチド配列から解
離させる。所望の数のコピーが得られるまで、延長と解
離を反復する。 本発明のひとつの特徴は、一本鎖ポリヌクレオチドの形
成をひき起こし、多数のコピーを生成させるための上述
の方法を行うことによって、ポリヌクレオチド分析対象
を定ωづることである。この方法では、一本鎖ポリヌク
レオチドは、分析対象の配列または分析対象と相補性の
配列とは異なる第一および第二のポリメクレオチド隣接
配列によって隣接される。分析対象の存在は、第二の隣
接配列の５′末端もしくはその先にある配列に結合した
第一の隣接配列の３′末端もしくはその先にある配列を
検出することによって定量される。 本発明の特異的態様の説明をさらに続ける前に、多数の
用語について定義する。 ポリヌクレオチド分析対象−約２０〜５００゜ＯＯＯも
しくはそれ以上のヌクレオチド、通常は約１００〜２０
０，０００のヌクレオチド、多くの場合５００〜１５，
０００ヌクレオチドを有する重合ヌクレオチドである、
測定すべき化合物または組成物。ポリヌクレオチド分析
対象は、精製または非精製型の任意の起原の核酸、たと
えばＤＮＡ　（ｄｓＤＮＡおよび５ｓＤＮＡ）およびＲ
ＮＡ、ｔ−ＲＮＡ、ｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡ、ミトコン
ドリアＤＮＡおよびＲＮＡ、葉緑体Ｄ　ＮＡおよびＲＮ
Ａ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたはそれらのＵ合物
、遺伝子、染色体、プラスミド、微生物たとえば細菌、
酵母、１クイルス、ウィロイド、かび、菌類、植物、動
物ヒトのような生物材料のゲノムおよびそれらのフラグ
メント等を包含する。ポリヌクレオチド分析対象は、本
技術分野でよく知られた操作により、様々な生物材料か
ら得ることができる。このような生物材料の例の一部を
以下の第１表に丞すが、これは例示の目的であって本発
明を限定するものではない。 第１表 ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｄｉｐｈｔｈｅｒ
ｉａ肺炎球菌 Ｄｉｐｌｏｅｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅストレ
プトコッカス ５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｒｏｇｅｎｅｓＳｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　５ａｌｉｖａｒｕｓブドウ球
菌 ５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｃｕｓＳｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｅｅｕｓ　ａｌｂｕｓナイセリア Ｎｃｉｓｓｅｒｉａ　ｎ１ｃｎ＋ｎｇｉｔ＋ｄ＋５Ｎｅ
ｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｅａ腸内細菌 Ｅｓｅｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ　　大腸菌
群Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎ＋ａｅＳａｌ
ｉｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｏｓａＳａｌｉｏｎｅｌｌａ
　ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓサルモネラ属Ｓａ１ｍｏｎ
ｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕａ＋３ｈｉｇｅｌｌａ
　ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａＳｈｉｇｅｌｌａ　　ｓｅｈｌ
ｔｚｉｉＳｈｉｇｅｌ　Ｉａ　ａｒａｂｉｎｏｔａｒｄ
ａＳｈｉｇｅｌｌａ　　ｆｌｃｘｎｅｒｉＳｈｉｇｅｌ
ｌａ　ｂｏｙｄｉｉ Ｓｈｉ（ｌｅｌｌａ　５Ｏｎｎｅｉ 他の腸内細菌 ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ ｐｒｏｔｅｕｓ　　ｍｏｒｇａｎｉ ＰＳｅｕｄＯＩｌｌＯｎａＳ　ａｅｒｕｌＪｌｎＯ８ａ
Ａｌｃａ！１ａｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓＶｉｂｒｉ
ｏ　ｅｈｏｌｅｒａｅ 好血菌群 Ｈｅｍｏｐｈｉ！ｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ、　ｔｌ。 Ｈｃｖｏｐｈｉｌｕｓ　ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓＨｅｎｏ
ｐｈｉｌｕｓ　ａｅｇｙｐｔｉｅｕｓｌｌｅｍｏｐｈｉ
ｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｕｃｒｙ シゲラ属 プロテウス種 Ｂｏｒｄｅｔｃｌｌａ　　ｐｃｒｔｕｓｓｉｓパスツレ
ラ Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ＤｅＳｔｉＳＰａｓｔｅｕｒ
ｅｌｌａ　ｔｕｌａｒｅｕｓｉｓプルセラ Ｂｒｕｃｅｌｌａ　ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓＢｒｕｃｅｌ
ｌａ　５ｕｂｔｉｌｉｓ Ｂｒｕｃｅ！Ｉａ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍＢｒｕｃｅｌ
ｌａ　ｃｅｒｅｕｓ 嫌気性胞芽形成桿菌 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｏｔｕｌｉｎｕｍＣｌｏｓ
ｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓＣＩ
Ｏ３ｔｒｉｄｉｕｌ　ｎ０ＶＶ ＣＩＯ３ｔｒｉｄｉｕｌＲＳｅｐｔｉＣｔｌｌｌｌＣｌ
ｏｓｔｒｉｄｉｕｒａｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍＣｌｏ
ｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅｒｔｉｕｍＣｌｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ　ｂｉｒｅｒｍｅｎｔａｎｓＣｌｏｓｔｒｉｃｌｉ
ｕｗ　ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓＨｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
＠　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　　ｈｏｍｉｎｉｓＨｙ
ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｂｏｖｉｓＨｙＣＯｂａＣ
ｔｅｒｉ（ＩＩＩ　　ａｖｉｕ＊ＨｙＣＯｂａＣｔｅｒ
ｉｔｌｌｌ　　ｌｅｐｒａｅＨｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ　　ｐａｒａｔＬＩｂｅｒｃ（ＩＩＯ３ＩＳ放線菌（
かび様細菌） Ａｃｔｉｎｏｅｉｙｅｅｓ　ｌ５ａｅｌｉ八ｃｔ；ｎｏ
ｍｙｃｃｓ　ｂｏｖｔｓ ＾Ｃｔｉｎ０１ｙｃｅＳ　ｎａｅｓｌｕｎｄｉＮＯＣａ
ｒｄｉａ　ａｓｔｏｒｏｉｄｅｓＮｏｃａｒｄｉａ　ｂ
ｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓスピロヘータ Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍＴｒｅｐＯｎｅ
ｌａ　　ｐｅｒｔｅｎｕｅＳｐｉｒｉｌｌｕｍ　　ｍｉ
ｎｕｓ ＳｔｒｅｐｔＯｂａＣｉｌｌｌＪＳ ｍｏｎｏｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ト ＴｒｅＤＯｎｅｌａ　　ＣａｒａｔｅｌｌｍＢｏｒｒｅ
ｌｉａ　ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓＬｅｐｔｏｓｐｉｒａ
　　ｉｃｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅＬＣ！ｐｔ
Ｏ３ｐｉｒａ　　ｃａｎｉｃｏｌａリパノゾーマ ？イコプラズマ ８１／Ｃ０ｐｌａＳＩＩｌａ　ｐｎｅｔｌｌｌｏｒｌｉ
ａｅ他の病原体 ｔｙｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｅｙｔｏｃ＋ｅｎｅｓＥｒ
ｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ　ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａ
ｅＳｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｏｎｉｌｉｆｏ
ｒｍｉｓＤＯｎＶａｎｉａ　ＱｒａｎｕｌＯｆｆｉａｔ
ｉ３Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ　ｂａｃｉｌｌｔｆｏｒｎｉ
ｓリケッチア（細菌様寄生体） ＲｉＣｋｅｔｔＳｉａ　ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉＲｉｃｋ
ｅｔｔｓｉａ　　ｇ＋ｏｏｓｅｒｉＲｉｃｋｃｔｔｓｉ
ａ　ｒｔｃｋｅｔｔｓｉａＲｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｃｏ
ｎｏｒｉ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ａｕｓｔｒａｌｉｓＲｉｃｋｅ
ｔｔｓｉａ　５ｉｂｉｒｉｃｕｓＲｉｃｋｅｔｔｓｌａ
　ａｋａｒｉ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈ＋Ｒ
ｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｂｕｒｎｅｔｔＲｉＣｋｅｔｔＳ
ｉａ　ｑｕ＋ｎｔａｎａクラミジア（分類不能奇生体、
細菌／ウィルス）Ｃｈｌａｓｙｄｉａ　ａｇｅｎｔｓ　
（名称不確定）かび ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｒｏｒｍａｎｓ８１
ａＳｔ０１ＶＣｅＳ　ｄｅｒｌａｔｉｄｉｓ旧５Ｏｐｌ
ａＳＩｌａ　ＣａｐＳＬｌｌａｔｔｊｌＣｏｃｃｉｄｉ
ｏｉｄｅｓ　ｉａ＋ｍ１ｔｉｓＰａｒａｅｏｃｃｉｄｉ
ｏｉｄｅｓ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓＣａｎｄｉｄａ
　ａｌｂｉｃａｎｓ Ａｓｐｅｒｏｉｌｌｕｓ　　ｆｔ１ｌｉｉ）ａｔｔｊｓ
Ｈｕｃｏｒ　ｃｏｒｙ＋ａｂｉｆｃｒ（＾ｂｓｉｄｉａ
　ｃｏｒｙｍｂｉｒｅｒａ）Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙ
ｚａｅ Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ａｒｒｈｉｚｕａ　Ｐｈｙｃｏｍｙ
ｃｅｔｅｓＲｈｉｚｏｐｕｓ　ｎｉｇｒｉｃａｎｓＳｐ
ｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ　５ｃｈｅｎｋｉｉＦｌｏｎｓｅ
ｃａｅａ　ｐｅｄｒｏｓｏｉＦｏｎｓｅｃａｅ　ｃｏｍ
ｐａｃｔ Ｃ１ａｄＯ３ｐＯｒｉｕｌ　ｃａｒｒｉｏｎｉｉＰｈｉ
ａｌｏｌ）ｈｏｒａ　ＶｅｒｒｔｌＣＯ３ａ八ｓｐｅｒ
ｇｉｌｌへｓ　　ｎ１ｄｕｌａｎｓＨａｄｕｒｅｌｌａ
　ｍｙｃｅｔｏｍｉＨａｄｕｒｅｌｌａ　　ｇｒｉｓｅ
ａ Ａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ　ｂｏｙｄｉｔＰｈｉａｌＯｐ
ｈＯｒａ　ｊｏａｎｓｅｌｌｅｉＨｉ（ｒＯ３ｐＯｒｕ
ｌ　ＱＶＤＳｅＵｌｌＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｍｅ
ｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓＫａｒａｔｉｎｏｉｙｃｅｓ
　ａｄｊｅｌｌｏｉＨ＋ｃｒｏ　　３ｐＯｒｕｌｌ　　
ｃａｎｔｓＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ　ｒｔｌｂｒｔｌ
ｌｌＨＩＣｒＯ３ｐＯｒｕｍ　ａｄｏｕｉｎウィルス アデノウィルス ヘルペスウィルス 単純ヘルペス 水痘 帯状庖疹 Ｂウィルス サイトメガロウィルス ポックスウィルス 痘癒 ワタシニア 牛痘 パラワクシニア 伝染性軟属腫 ピコルナウィルス ポリオウィルス コクサラキーウィルス エコーウィルス ラインウィルス ミクソウィルス インフルエンザ（Ａ、ＢおよびＣ） バラインフルエンザ（１〜４） おたふくかぜウィルス ニューカッスル病ウィルス はしかウィルス 牛疫ウィルス イヌジステンパーウィルス ＲＳウィルス 風疹ウィルス アルボウィルス 東部マウス脳炎ウィルス 西部マウス脳炎ウィルス シンドビスウイルス チクングニャウイルス はムリキ森林熱ウイルス マヤロウイルス セントルイス脳炎ウィルス カリフォルニア脳炎ウィルス コロラドダニ熱ウィルス 黄熱病ウィルス デング熱ウィルス レオウィルス レトロウィルス ヒト免疫不全ウィルス（Ｈ［Ｖ） ヒト■細胞白血病ウィルスＩ＆ＩＩ（ＨＴＬＶ）肝炎 Ａ型肝炎ウィルス Ｂ型肝炎ウィルス 非△非Ｂ肝炎ウィルス 腫瘍ウィルス ラウシャー白血病ウィルス クロスウィルス マロニー白血病ウィルス ヒトパピローマウィルス ポリヌクレオチド分析対象は、必要に応じて処理し、た
とえば剪断、または制限エンドヌクレアーゼもしくは他
の部位特異性化学切断法処理によって分析対象を切断し
、標的ポリヌクレオチド配列を含有するフラグメントを
得ることができる。 本発明の目的においては、ポリヌクレオチド分析対象、
またはポリヌクレオチド分析対象から得られた切断フラ
グメンｉ〜は通常、少なくとも部分的に変性しているか
一本鎖であり、または変性させるか一本鎖に覆るために
処理される。このような処理は本技術分野においてはよ
く知られていて、たとえば熱またはアルカリ処理がある
。たとえば、二本鎖ＤＮＡを９０〜１００℃に約１〜１
０分間加熱すると変性物質を得ることができる。 標的ポリヌクレオチド配列−同定すべきヌクレオチドの
配列。その同一性は、この標的配列の少なくとも部分と
相補性でハイブリダイゼーシコン可能なポリヌクレオチ
ドプローブの製造ができるのに十分な程度わかっている
。標的ポリヌクレオチド配列は通常、約１２〜１．００
０もしくはそれ以上のヌクレオチド、好ましくは２０〜
１００のヌクレオチドを含有する。標的ポリヌクレオチ
ド配列は、多くの場合、ポリヌクレオチド分析対象の部
分である。標的ポリヌクレオチド配列は、一般に、大分
子の分画であるが、また実質的にその全分子であっても
よい。標的ポリヌクレオチド配列のサンプル中における
存在がサンプル中のポリヌクレオチド分析対象の存在の
確実なインジケーターとなるような、標的ポリメクレオ
チド配列中の最小限のヌクレオチド数を選択する。大ざ
っばにいって、配列の長さは通常、約１．６０（Ｊ　Ｌ
ヌクレオチド以上とする。この場合、しはザンブルの生
物起原のゲノムにおける塩基対の数である。標的配列中
のヌクレオチドの最大数は、ポリヌクレオチド分析対象
の良さ、および剪断、内因性ヌクレオチドまたは標的配
列の切断に用いられる試薬によるその切れ易さによって
決定される。 一末鎖ポリヌクレオヂドー天然または合成のヌクレオチ
ド配列で、天然に存在するか予め形成されるか、または
分析対象の存在の結果としてプローブから形成される。 通常、標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも部分と同
一または相補性の配列を少なくとも含有し、またその相
補性配列した結合した場合にはリプレッサー、ＩＩＩ限
酵素等のような受容体に対する特異的結合部位である配
列１個もしくは２個以上を含んでいてもよい。一本鎖ポ
リメクレＡヂドは、少なくとも５０％相補性の塩基配列
、通常は少なくとも６５％相補性の塩基配列、多くの場
合少なくとも８０％相補性の塩基配列を有する第一の隣
接配列および第二の隣接配列によって隣接されている。 第一および第二隣接配列はそれぞれ一末鎖ポリヌクレオ
ブドの３′末端および５′末端に結合していて、それぞ
れ少なくとも１０個好ましくは少なくとも１５個のヌク
レオチド、デオキヌクレオチドおよび／またはそれらの
誘導体から構成されている。 一本鎖ポリヌクレオチドはそれに結合した隣接配列とと
もに通常、３０〜３，０００のヌクレオチド、好ましく
は５０〜５００のヌクレオチドを含有する。一本鎖ポリ
ヌクレオチドはＲＮＡでもＤＮＡでもよく、また合成オ
リゴヌクレオチドであってもよい。第一および第二配列
によって隣接された一末鎖ポリヌクレオヂドが相補性の
鎖どハイブリダイズすると、多くの場合、逆方向反復配
列が形成される。 ポリヌクレオチドプライマーーー末鎖ポリヌクレオチド
の３′末端に、１３ける第二隣接配列とハイブリダイゼ
ーション司能な配列をその３′末端に含有するポリヌク
レオチド。第二隣接配列とハイブリダイゼーション可能
なヌクレオチドプライマー中のヌクレオチド数は、ポリ
ヌクレオブードプライマーをハイブリダイズさせるため
に用いられる緊縮条件が過剰のランダムな非特異的ハイ
ブリダイゼーションを防止するように選択されるべきで
ある。ポリヌクレオチドプライマー中のヌクレオチドの
数は、少なくとも第二隣接配列中の数と同程度、すなわ
ち、少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくと
も１５ヌクレオチド、一般には約１０〜２．０００好ま
しくは２０〜１００メクレオチドである。 特異的結合ベアの構成要素（ｓｂｐ構成要素）−表面上
または空洞内に他分子と特異的に結合する領域を有し、
他分子の特定の空間的および極性的機構と相補性である
と定義される２つの異なる分子の一方。特異的結合ベア
の構成要素は、リガンドと受容体（アンチリガンド）と
も呼ばれる。 こわらは、抗原−抗体のような免疫学的ベアの構成要素
、また、オペレーター−リプレッサー、ヌクレアーぜ一
ヌクレオチドビオチンーアビジン、ホルモン−ホルモン
受容体、核酸二重鎖、ｌ０Ｇ−プロティンＡ、ＤＮＡ−
ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡ等である。 リガンド−天然に受容体が存在するかまたは受容体を製
造できる任意の化合物。 受容体（抗リガンド）−分子の特定の空間的Ｊ３よび極
性的機構を認識できる任意の化合物または組成物、たと
えばエピトープまたは抗原決定部位。受容体の例として
は、天然の受容体、たとえばサイロキシン結合グ１コブ
リン、抗体、酵素、Ｆａｂフラグメント、レクチン、核
酸、リプレッサー、保護酵素、プロティンへ１補体成分
Ｃ１ｑ。 ＤＮＡ結合タンパク賀またはリガンド等がある。 小有機分子−分子量１５００未満、好ましくは１００〜
１０００、さらに好ましくは３００〜６００の化合物、
たとえばビデオン、フルオレセイン、ローダミンおよび
他の染料、テトラサイクリンおよび他のタンパク質結合
分子、ならびにハブテン等である。小有機分子はヌクレ
オチド配列の標識または支持体への結合のための手段を
与えることができる。 支持体または表面−多孔性または非多孔性の水不溶性物
質。支持体は親水性であるがまたは親水性とすることが
可能で、無機粉末たとえばシリカ、硫酸マグネシウムお
よびアルミナ、天然重合材料とくにセルロース性材料お
よびセルロースがら誘導される材料たとえば紙を含めた
繊維たとえばろ紙、クロマトグラフィー用紙等、合成ま
たは改良天然重合体たとえばニトロセルロース、セルロ
ースアセテート、ポリ（Ｆ化ビニル）、ポリアクリルア
ミド、架橋ゲキストラン、アガロース、ポリアクリレー
ト、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチル
ブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレ−１・、ポリ
（エチレンテトラフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニ
ルブチレート）等、それ自体でまたは他の材料と抱合し
１用いられる材料、Ｂｉｏｇｌａｓｓどして入手可能な
ガラス、セラミック、金属等が包含される。天然または
合成集合体たとえばリポソーム、リン脂質小胞および細
胞も使用（・きる。 支持体または表面へのｓｂｐ構成要素の結合は、文献で
一般に利用されているよく知られた技術で達成できる（
たとえば、”　Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅ
Ｉｃｈｉｒｏ　Ｃｈｉｂａｔａ　　Ｈａｌｓｔｅｄ　Ｐ
ｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９７８およびＣｕ
ａｔｒｅｃａｓａｓ　：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ
、、　２４５：３０５９．１つ７０参照）。表面は、多
数の形状のひとつ、たとえばストリップ、１］ツド、ビ
ーズを含む粒子等とすることができる。 表面は通常、多官能性であるかもしくは多官能性化が可
能であるか、またはオリゴヌクレオチドもしくはｓｂｐ
構成要素を特異的もしくは非特異的な共有結合もしくは
非共り結合的相互作用を介して結合させることができる
。広範囲の官能基が存在し、また導入できる。官能基に
は、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エ
チレン基、ヒドロキシル基、メルカプト基等が包含され
る。広範囲の化合物を粒子に連結する様式はよく知られ
ていて、文献に詳細に例示されている（たとえばＣａｕ
ｔｒｅｃａｓａｓ　　：　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ
、、　　２４５　：３０５９．１９７０参照）。オリゴ
ヌクレオチドまたはｓｂｐ構成要素に対する連結基の長
さは、連結される化合物の性質、連結される化合物と粒
子間の距離の配列のハイブリダイゼーシヨンへの影響等
によって、広範囲に変動させることができる。オリゴヌ
クレオチドまたはｓｂｐ構成要素は主として粒子の外表
面に結合する。 表面として使用される粒子は、直接、または常法によっ
て粒子に結合させた蛍光性化合物もしくは蛍光体によっ
て蛍光性とすることがＣきる。蛍光体は通常、粒子中に
溶解するかまたは粒子に共有結合も１ノくは非共有結合
で結合させ、多くの場合、粒子全体に均一に結合させる
。蛍光性付与ラテックス粒子は米国特許第３．８５３．
９８７号に教示されている。 ￥Ａ識またはレポーター基−プローブに抱合または結合
して、直接検出できるかまたは特異的結合反応を介して
検出可能なシグナルを生成できるシグナル生成系の構成
要素。標識には、増幅もしくは連結のための鋳型を与え
るかまたはりブレッザータンパク質に対するようなりガ
ントして作用できるポリヌクレオチドプライマーまたは
特異的ポリヌクレオブード配列が包含される。好ましく
は、ポリヌクレオチドプローブのひとつが標識をもつか
または標識をもたせることが口Ｊ能である。一般に、検
出可能な任意の８１識が使用できる。標識は同位元素で
も非同位元素でもよく、通常は非同位元素であり、触媒
、染料、蛍光分子、化学発光体、補酵素、酵素、基質、
放射性基、ラテックスもしくは炭素粒子のような粒子、
金属ゾル、クリスタライト、リポソーム、Ｉｌｌ胞等で
、さらに染料、触媒もしくは他の検出可能基等で標識で
きる。標識はシグナル生成系の構成要素であり、単独で
またはシグナル生成系の伯の構成要素とともに検出可能
なシグナルを発生できる。標識はヌクレオチド配列に直
接結合してもよく、ヌクレオチド配合に結合するｓｂｐ
構成要素と相補性のｓｂρ構成要素と結合することによ
ってヌクレオチド配列に結合可能になる。 シグナル生成系−シグナル生成系は１個または２個以上
の成分を有し、少なくとも１個の成分は標識またはレポ
ーター基である。シグナル生成系は、サンプル中のポリ
ヌクレオチド分析対象の存在または量に関連するシグナ
ルを発生する。シグナル生成系は測定可能なシグナルの
生成に必要なすべての試薬を包含する。標識がヌクレオ
チド・配列と抱合しない場合は、標識は通常、メクレオ
チド配列に結合するかヌクレオチド配列の部分であるｓ
ｂｐ構成要素と相補性のｓｂｐ構成要素に結合する。シ
グナル生成系の他の成分はデベロッパー溶液中に含有さ
せることができ、基質、エンハンサ−、アクティベータ
ー、化学発光化合物、補因子、インヒビター、スカベン
ジャー、金底イオン、シグナル発生物質の結合に必要な
特異的結合物質等が包含される。シグナル生成システム
の他の成分は、補酵素、酵素産生物と反応する物質、伯
の酵素および触媒等とすることができる。シグナル生成
系は外部手段、電磁線の使用、望ましくは肉眼的検査に
よって検出可能なシグナルを提供する。 シグナル生成系は少なくとも１種の触媒、通常は酵素と
、少なくとも１種の基質を包含し、また２種もしくはそ
れ以上の触媒および複数個の基質を包含していてもよく
、１種の酵素の基質が他の酵素の生成物である酵素の組
合せを包含することができる。シグナル生成系の機能は
、サンプル中のポリヌクレオチド分析対象の量に関連す
る検出可能なシグナルを提供する生成物を生成すること
である。 シグナル生成系に有用な多数の酵素Ｊ３よび補酵素が、
米国特許第４，２７５．１４９号第１９〜２３１１１１
および米国特許第４，３１８．９８０号第１０〜１４′
ｍに示されている。これらの開示は参考として本明細書
に導入する。多数の酵素の組合せが米国特許第４．２７
５，１４９号第２３〜２８ａｌに掲げられている。これ
らの組合せは本発明に使用することができる。この開示
を参考として本川ｍ偶に導入する。 過酸化水素の産生に関与する酵素および染料前駆体を染
料へ酸化するだめの過酸化水束の使用はとくに興味があ
る。特定の組合せには、糖オキシダーゼたとえばグルコ
ースおよびガラクトースオキシダーぜ、異項環オキシダ
ーぜたとえばウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ
と、過酸化水素を染料前駆体の酸化に使用する酵素、す
なわちペルオキシダーゼたとえば西洋ワサビペルオキシ
ダーゼ、ラクトペルオキシダーゼまたはミクロペルオキ
シダーゼとの組合せが包含される。その他の酵素の組合
せは、参考として導入した文献中に見出される。単一の
酵素を８Ｉ識として使用する場合、使用できる他の酵素
にはヒドロラーゼ、トランスノェラーゼおよびオキシド
レダクターゼがあり、ヒドロラーゼとしてはアルカリホ
スファターぜおよびβ−ガラクトシダーゼを挙げること
ができる。また、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシ
フェラーゼのようなルシフェラーゼも使用できる。 使用できる補酵素の例には、ＮＡＤ　［Ｈ］、ＮＡＩ）
Ｐ［Ｈ］、ピリドキサールリン酸、ＦＡ　Ｄ［Ｈ］　、
ＦＭＮ　［Ｈ］等があり、通常、補酵素は環化反応に関
与する（とくに米国特許第４，３１８．９８０号参照）
。 酵素反応の生成物は通常、染料または蛍光体である。蛍
光体の多数の例が米国特許第４，２７５゜１４９号第３
０　Ｊ５よび３１欄に示されている。この開示を参考と
して本明細内に導入する。 シグナル生成システムには、直径少なくとも約５Ｑｒｖ
で約５０ミクロン未満、通常は少なくとも約１１００ｎ
で約２５ミクロン未満、好ましくは約０．２〜５ミクロ
ンの不溶性粒子である１種または２種以上の粒子を包含
できる。粒子は有様または無機の、多孔性または非多孔
性の、好ましくは水と密度がほぼ等しい、一般に約０．
７〜約１、！１Ｍ／ｄの密度をもつ粒子であり、透明、
半透明または不透明の材料で構成される。 有機粒子は通常、付加または綜合重合体のいずれかの重
合体で、検定メジウム中に容易に分散される。粒子の表
面は、直接または間接的にオリゴヌクレオヂドまたはｓ
ｂｐ構成要素が結合するように吸着性であるかまたは官
能性化が可能である。 粒子の性質については前述した。 興味のある蛍光体は一般的に、３５０ｎｍ以上、通常は
４００　ｎｎ以上、好ましくは４５０ｎｍ以上の波長の
光を放出する。望ましくは、蛍光体は、高い量子効率、
大きなストークスシフトを有し、それらの接合および使
用条件下で化学的に安定である。蛍光体の語は、電ｔａ
線照射または化学的活性化による活性化で光を放出する
物質であり、蛍光およびリン光物質、シンチレータ−な
らびに化学発光物質を包含することを意図するものであ
る。 興味ある蛍光体は、ある種の主要官能性をイｉする様々
のノＪテゴリーに分類される。これらの主要官能性には
、１−および２−アミノナフタレン、ｐ、ｐ−ジアミノ
スチルベン、ピレン、四級フェナンスリジン塩、９−ア
ミノアクリジン、ｐ。 ｐ′−ジアミノスチルベンイミン、アントラセン、オキ
サカルボキシ７ニン、メロシアニン、３−アミンエクイ
レニン、ペリレン、ビスーベンズＡキサゾール、ビス−
ｐ−オキサシリルベンゼン、１゜２−ベンゾフェナジン
、レチナール、ビス−３＝アミンピリジニウム塩、ヘレ
ブリゲニン、テトラザイクリン、ステロフェノール、ベ
ンズイミダゾリルフェニルアミン、２−オキソ−３−ク
ロメン、インドール、キサンチン、７−ヒドロキシクマ
リン、４．５−ベンズイミダゾール、フェノキサジン、
サリチレート、ストロフアンチジン、ポルフィリン、ト
リアリールメタン、フラビンならびに希土類キレートオ
キシドＪ３よび塩が包含される。 蛍光体の例は米国特許箱４．３１８．７０７号第７およ
び８欄に説明されている。この開示は参考として本明細
書に導入する。 さらに、エネルギー吸収または消光粒子を使用すること
ができる。これは、少なくとも直径約５０ｎｌ１１の固
体不溶性粒子で、プローブのポリメクレオチド分析対象
とのハイブリダイゼーションまたは特異的結合ベアの構
成要素間の特異的結合から生じた距離内では蛍光粒子の
蛍光の消光が可能である。消光粒子は蛍光粒子と同種ま
たは異種であるが、通常は異種である。通常、消光粒子
は、粒子の表面から測定して約５０人以」−１好ましく
は約５００Å以上、さらに好ましくは約２０００Å以上
の距離で実質的な消光を与えるものである。 光放出を修飾するためには多くの異なる種類の粒子が使
用できる。炭素粒子、たとえば木炭末、油煙、グラファ
イト、コロイド状炭素等はとくに興味がある。炭素粒子
のほかに金属ゾル、とくに負金属、金、銀および白金が
使用できる。他の金属誘導粒子には、金８スルファイド
たとえば鉛、銀もしくは銅スルフフィト、または金属酸
化物たとえば鉄もしくは銅酸化物が包含される。 検出可能なシグナルとして別の光源には化学発光源があ
る。化学発光源は、化学反応によって電子的に励起され
、検出可能なシグナルとして働く光を放出するかまたは
蛍光受容体にエネルギーを付与する化合物が関与するも
のである。 様々な化合物群が様々な条件下に化学発光を与えること
が明らかにされている。−群の化合物として、２．３−
ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンがある。最も一般
的な化合物は、上記化合物の５−アミノ類縁体のルミノ
ールである。この群の他の化合物としては、５−アミノ
−６，７，８−トリメトキシ〜およびジメチルアミノ−
［Ｃａｌベンズ類縁体がある。これらの化合物は、アル
カリ性過酸化水素または次亜塩素酸カルシウムと塩基に
よって発光させることができる。他の化合物群は、２，
４．５−トリフェニルイミダゾールであり、母体化合物
は一般名ローフィンと呼ばれる化合物である。化学発光
類縁体はｐ−ジメチルアミノーおよびｐ−メトキシ置換
基を包合する。 化学発光はまた、オキシレート、通常オキザリル、活性
エステルたとえばｐ−二トＵフェニルおよび過酸化物た
とえば過酸化水素により、塩基性条件下に得られる。ま
た、ルシフェリンをルシフェラーゼまたはルシゲニンと
組合せて使用することができる。 補助材料−様々な補助材料が、本発明による検定にはし
ばしば用いられる。たとえば緩衝剤が通常、検定メジウ
ム中に添加され、また検定メジウムおよび検定成分に対
する安定剤が用いられる。 これらの添加物に加えて、しばしば、アルブミンのよう
なタンパク質、ホルムアミドのような有機溶媒、四級ア
ンモニウム塩、デキストラン硫酸のようなポリカチオン
、界面活性剤とくに非イオン界面活性剤、結合エンハン
サ−たとえばポリアルキレングリコール等が包含される
。 ン ヌクレオｆド三すンｆｌＩ−５’三リンＷａ置換基をン 有するヌクレオ７ド、好ましくはデオキシヌクレオシド
三リン酸。メクレＡシトは、プリンまたはピリミジン誘
導体のいずれかの窒素塩基のペントース糖誘導体で、窒
素塩基はベン１−−ス糖の１′炭素原子に共有結合して
いる。プリン塩阜には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ
）、イノシンおよびそれらの誘導体、類縁体がある。ピ
リミジン塩基には、シトシン（Ｃ）、チミン（王）、ウ
ラシル（Ｕ）、ならびにそれらの誘導体および類縁体が
ある。 誘導体Ｊ３よび類縁体とは、非誘導ヌクレオシド三リン
酸と同様に認識され、重合されるその誘導体および類縁
体をいう。このような誘導体または類縁体の例としては
、レボータ基によって修飾された誘導体、ビオチン化、
アミン修飾、放射標識、アルキル化等を受けた誘導体、
またチオリン酸、ホスファイト、環原子の修飾誘導体が
包含されるが、これらは単に例示したものであって、本
発明を限定するものではない。レポーター基は、フルオ
レセインのような蛍充填、ルミノールのような化学発光
基、ｄ延蛍光によって検出できるＮ（ヒドロキシエチル
）エヂレンジアミン三酢酸のようなテルビウムキレ−１
へ剤等であってもよい。 ポリヌクレオヂドポリメラーゼーー末鎖ポリヌクレオチ
ドを含むｌ）　Ｎ　ＡまたはＲＮ　Ａ鋳型に沿って、そ
れらと相補性の、ポリヌクレオチドプライマーの延長を
形成させるための触媒、通常は酵素。 ポリヌクレオチドポリメラーゼは鋳型依存性ポリヌクレ
オチドポリメラーゼであり、ポリヌクレオチドプライマ
ーの３′末端を延長するための構築ブロックとしてヌク
レオシド三リン酸を使用１ノで、一本鎖ポリヌクレオチ
ドと相補性の配列を与える。 通常、触媒は酵素であり、たとえばＲＮ△ポリメラーゼ
、好ましくはＤＮＡポリメラーゼであり、任意の起源た
とえばｍ胞、細菌たとえば大腸菌、植物、動物、ウィル
ス、好熱菌等に由来する原核生物ＤＮＡポリメラーぜ（
■、■または■）、Ｔ４ＤＮ△ポリメラーぜ、Ｔ７ＤＮ
Ａポリメラーゼ、フレノウフラグメント、逆転写酵素、
ＲＮΔＮブレカーゼ等である。 完全または部分的に順次−本発明に用いられるサンプル
Ｊ３よび各種試薬は、同時以外の方法で混合され、１種
または２種以上の試薬が残りの１種または２種以上の：
Ｉｔ桑と混合され、部分混合物を形成する。各部分混合
物はついで本方法の１または２以上の工程に付される。 １″なりら、それぞれの部分混合物は１または２以上の
所望の結果が達成される条件下にインキコベ−１−する
ことかできる。 ハイブリダイゼーション（ｂイブリダイズ）おＪ、び結
合−ヌクレオチド配列に関してはこれらのれ？ｊは本明
細占では同等に用いられている。２個のヌクレオチドが
互いにハイブリダイズする能力は、２個のヌクレオチド
配列の相補性の程度に基づくものであり、合致した相補
性ヌクレオチド対の分画に基づくものである。与えられ
た配列中に、他の配列と相補性のヌクレオチドが多いほ
ど、両者のハイブリダイゼーションの程度は大きくなる
。 ハイブリダイゼーションの度合はまた、粘度条件または
温度、溶媒比、１！濃等を含む緊縮度にも依存する。 第一のポリヌクレオチドプローブーその３′末端に、そ
の配列の少なくとも部分、好ましくは全配列が、標的ポ
リヌクレオチド分析対象の部分と、標的ポリヌクレオチ
ド分析対象のある領域と部分的に相補性、通常は完全に
相補性であるがためにハイブリダイゼーション可能であ
るポリヌクレオチド配列（３′標的結合配列）を有する
化合物であり、したがって第一のポリヌクレオチドプロ
ーブは標的ポリヌクレオチド分析対象のト述の領域に結
合することになる。第一のポリヌクレオチドプローブは
また、第二のポリヌクレオチドプローブの第二の隣接配
列と少なくとも５０％、通常は少なくとも６５％相補性
の第一の隣接配列からなる。第一のポリヌクレオチドプ
ローブは、標的ポリヌクレオチド結合配列と第一の隣接
配列の間に位置し、標的ポリヌクレオチド結合配列の末
梢に第一の隣接配列と結合１−る付加的配列を含有して
いてもよい。 第一のポリヌクレオチドプローブの主要な選択基準は：
（＋）３’　末端標的結合配列は信頼できるものでなけ
ればならない。すなわち、標的ヌクレオチド配列の少な
くとも部分とほぼまたは正確に相補性で、安定かつ特異
的な結合を与えるのに十分な長さをもたなければならな
い。（ｉｉ）３′末端は、１ｌｌ１３’　−ヒト１−］
キシル基を形成するかまたは形成できるものでなければ
ならない。最小の第一隣接配列は、通常、少なくとも１
０、好ましくは少なくとも１５のヌクレオシド長を有す
る。 ３′末端標的結合配列と第一の隣接配列の間に通常位置
１−る付加的配列は、２種の基の間の距離を増大させ、
すなわち増幅時のＤＮＡ合成を増大させ、増幅生成物の
検出を可能にする受容体結合部位を与えるように選択さ
れる。−船釣に、第一のポリヌクレオチドプローブは約
３０〜５，０００ヌクレオチド艮を、多くの場合、４０
〜１，０００メクレオヂド長を有する。第一および第二
ポリヌクレオチドブＤ−ブのハイブリダイゼーション部
分を合わせた長さは少なくとも約２０ヌクレオチド、好
ましくは約４０〜２．０００ヌクレオチドである。生物
学的に合成された未知配列のランダムフラグメントを使
用できるが、核酸は一本鎖で、標的ヌクレオチド配列ま
ｌ、：はポリヌクレオチド分析対象と相補性であること
が条件になる。 第二のポリヌクレオチドプローブ−第二のポリヌクレオ
チドプローブは、その５′末端に、少なくともその部分
好ましく
【よそのすべてが、第一のポリヌクレオチドプ
ローブがハイブリダイズする領域以外の領域で標的ポリ
ヌクレオチド分析対象とハイブリダイゼーション可能な
配列（５′−標的結合配列）を有する。第二のポリヌク
レオチドプローブは、第一のポリヌクレオチドプローブ
の第一の隣接配列と少なくとも５０％、通常は少なくと
も６５％相補性で、第二の隣接配’Ｉｌｌと命名される
配列を有する。すなわち、第一および第一のポリヌクレ
オチドプローブは、それぞれ、他の配列と少なくとも部
分的に相補性のポリヌクレオチド配列を有する。第二の
ポリヌクレオチドプローブは、標的ポリヌクレオチド結
合配列と第二の隣接配列の間に位置し、標的ポリヌクレ
オチド結合配列の末梢に第二の隣接配列と結合Ｊる付加
的な受容体結合またはスベーザー配列を含有していても
よい。 第一および第二ポリヌクレオチドプローブに相補性の標
的ポリヌクレオチド分析対象の２＠の領域は通常、分析
対象の実質的な分画で２個の領域が確実に連結されるよ
うに、互いに十分な近位に存在する。２個の領域は、０
〜５０ヌクレオヂド、好ましくは０〜１ヌクレオヂドの
恥囲内にある。 これらの領域が２個以上のヌクレオチドで分離されてい
る場合には、多くの場合、第一のブロー１が標的に結合
したならばヌクレオヂドポリメラーゼとヌクレオシド三
リン酸によって延長され、プローブ間の距離を短縮する
ことが望ましい。 非連続−ハイブリダイズした第一のポリヌクレオチドプ
ローブの５′末端と第二のポリヌクレオチドプローブの
３′末端の間の標的ポリヌクレオチド配列に少なくとも
１個のヌクレオチドが存在すれば、プローブは標的ヌク
レオチド配列の非連続部分にハイブリダイズするという
。 ′１１統一第一のプローブおよび第二のプローブのヌク
レオチド配列が標的ポリヌクレオチド分析対象とハイブ
リダイズしたとき、第一のプローブ配列の５′末端と第
二のプローブ配列の３′末端の間にヌクレオチドがない
場合、ブ１］−ブは連続性であるという。 コビーーー末鎖ポリヌクレオヂド配列と相補性の配列か
ら分化されるような一本鎖ポリヌクレオチドの直接コピ
ーである配列を意味する。本発明では、一本鎖ポリヌク
レオチドの相補性配列が最初、ポリヌクレＡ−チドプラ
イマーの延長の結果として生成され、一本鎖ポリヌクレ
オチドの直接コピーである配列は上述の相補性配列から
ついで得られる。 共有結合的イー」着−第一のポリヌクレオチドプローブ
と第一のポリヌクレオチドプローブの間に化学結合を形
成すること。 化学結合は、プローブが標的ポリヌクレオチド分析対象
に結合した場合、通常Ｏまたは１ヌクレオチド分離して
いる場合、プローブが連続であっても非連続でも、形成
することができる。共有結金的付着は酵素的に、たとえ
ばリガーゼを用いて達成できる。プローブの連結に先立
って、標的ポリヌクレオチド分析対象とハイブリダイズ
した他のプローブの方向に延長６７能な３′末端をもつ
プローブは処理して、他のプローブと連続または事実上
連続とすることができる。たとえば、酵素的リゲーシコ
ンまたは化学的カップリングが起こり得る場合、プ１］
−ブは事実上連続である。−殻内には、両プローブが１
〜３ヌクレオチドの範囲内で離れているとき、事実上連
続である。鎖の延長はたとえば、ポリヌクレオチドポリ
メラーゼとヌクレオシド三リン酸の添加または一方のプ
ローブに、ハイブリダイズしたプローブ間の標的ポリヌ
クレオチド分析対象の非連続領域と相補性のヌクレオチ
ド配列を連結リ−ることによって達成できる。 共有結合的付着は、プローブのリン酸残基間に化学結合
を形成させることによって化学的にも達成できる。 プローブの延長手段−プローブが標的ポリヌクレオチド
配列と結合した場合、ブロー１を連結するためには、多
くの場合、プローブを連続にすることが望ましい。上に
説明したように、他のプローブの方向に延長できる３′
末端を有づるプローブは、標的ポリヌクレオチド分析対
象にハイブリダイズしたプローブをポリヌクレオチドポ
リメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸と、プローブが
延長される条件下に混合することによって延長できる。 別法として、プローブ間の標的ポリヌクレオチド分析対
象の非連続部分と相補性のヌクレオチド配列をプローブ
の一方に連結することもできる。 本発明の一態様は、一本鎖ヌクレオヂドまたはそれと相
補性の配列の少なくとも１個のコピーを生成させる方法
に関する。この方法は、ヌクレオシド三リン酸および鋳
型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの存在下に、一
本鎖ポリメクレオチドの３′末端において第一の隣接配
列とハイブリダイゼーション可能な配列を有１−るポリ
ヌクレオチドプライマーの延長を形成させ、この場合、
第一の隣接配列は一本鎖ポリヌクレオヂドの第二の隣接
配列と少なくとも部分的に相補性であり、延長されたポ
リヌクレオチドプライマーと一本鎖ポリヌクレオチドを
解離させることからなる。上述の工程を反復して、適当
なコピーを生成させる。 −殻内には、液体メジウム中に、（１）内部的にハイブ
リダイゼーション可能な第一および第二隣接配列で各末
端が隣接されたポリヌクレオチド配列を有する一本鎖ポ
リヌクレオチド、（１１）その３′末端の少なくとも１
（ｌ基部分は、一本鎖ポリヌクレオチドの３′末端にお
ける第一および第二の隣接配列の構成要素と相補性であ
るポリヌクレオチドプライマー、（ｉｉｉ）ヌクレオシ
ド三リン酸、および（ｉｖ）鋳型依存性ポリヌクレオチ
ドポリメラーゼからなる混合物を準備する。この混合物
を、（ｉ）内部でハイブリダイズした第一および第二の
隣接配列があればこれを解離させ、（ｉｉ）ポリヌクレ
オチドプライマーを、−重鎮ポリヌクレオヂドに隣接す
るその相補性配列とハイブリダイズさせ、（ｉｉｉ）ポ
リヌクレオチドプライマーを一本鎖ポリヌクレオチドに
沿って延長させて第一の延長されたポリヌクレオチドプ
ライマーを与え、（ｉｖ）第一の延長されたポリヌクレ
オチドプライマーと一本鎖ポリヌクレオチドを解離させ
、（ｖ）第一の延長されたポリヌクレオチドプライマー
をポリヌクレオチドプライマーとハイブリダイズさせ、
（ｖｉ）ポリヌクレオチドプライマーを第一の延長され
たポリヌクレオチドプライマーに沿って延長させて第二
の延長されたポリヌクレオチドプライマーを与え、（ｖ
ｉｉ）第二の延長されたポリヌクレオチドプライマーを
第一の延長されたポリヌクレオチドプライマーから解離
させ、そして（ｖｉｉｉ）上記工程（ｖ）〜（ｖｉｉ）
を反復させる条件下にインキュベートする。 本発明の一態様を反応式１に例示するが、これは例示の
目的であって、本発明を限定するものではない。 反沈・八゛ １Ｖａ（エエ） Ｖｌｌ（Ｈ工） ＶｌａｆＩＶｌ 分子Ｉはたとえば、相補性配列１ａおよび１ｂで逆方向
反復配列を有づる二本ｍＤＮＡである。 このＤＮＡを一本鎖にすると分子■となることができる
。また分子■は１ａおよび１ｂ配列を有するＲＮＡであ
ってもよい。ポリヌクレオチドブライマ−１Ｃを分子■
とハイブリダイズすると分子■が生成する。プライマー
１Ｃは配列１ａと実質的に同一または類似のポリヌクレ
オチド配列を有する。ＤＮＡポリメラーゼとヌクレオシ
ド三リン酸の存在下に、プライマー１Ｃは分子■に沿っ
て延長して分子ＩＶを生成覆る。分子ＩＶを解離さ往る
と一本鎖ＩＶ　ａおよびＩｖｂを生じる。分子ＩＶ　ａ
は未変化の分子■であって相補性の配列１ａおよび１ｂ
を右し、分子Ｉｖｂは相補性の配列１Ｃと１ｄを有する
。明らかなように、１Ｃは１ａに相当し、１ｄは１ｂに
相当づる。ポリヌクレオチドブライマ−１Ｃは■ａの領
域１ｂおよびＩＶ　ｂの領域１ｄにハイブリダイズして
分子Ｖａ（Ｉ［［）およびｖｂをそれぞれ生成する。プ
ライマー１Ｃを■ａおよびｖｂに沿って上述の条件下に
延長させると、それぞれ分子■ａ　（ＩＶ）およびＶＩ
　ｂを生成する。分子Ｖｉａおよび■ｂは一本鎖ポリヌ
クレオチドに解離づることができ、これがついでプライ
マー１Ｃとハイブリダイズして鎖の延長が反復される。 この方法で、分子■の配列１ａ１１３よび１ｂの間の配
列を含む最初の一本鎖ポリヌクレＡチドの多数の一］ビ
ーおよびそれと相補性の配列が得られる。 こ、の方法の実施に際しては、水性メジウムが使用され
る。他の極性共溶媒も使用できる。通常は、炭素原子１
〜６個、より通常には炭素原子１〜４個を有する酸素含
有有機溶媒、たとえばアルコール、１−チル等が用いら
れる。これらの共溶媒は通常、約７０重量％未満、より
通常には約３０重量％未満、添加される。 メジウムのＥ）Ｈは通常的４．５〜９．５の範囲、より
通常には約５．５〜８．５の範囲、好ましくは約６〜８
の範囲である。ｐＨおよび温度は、各場合に応じて選択
され、変動されて、同時にまたは順次、一本鎖ポリヌク
レオチド配列中に内部でハイブリダイズした配列があれ
ばその解離、一本鎖ポリメクレオチドとポリヌクレオチ
ドプライマーのハイブリダイゼーシヨン、プライマーの
延長、延長したプライマーの＠−離、延長したプライマ
ーとプライマーのハイブリダイゼーション、ハイブリダ
イズしたプライマーの延長、延長したプライマーの解離
が行われる。場合によっては、上記工程を順次または同
時に実施しているかの問題はあいまいになってくる。所
望のｐＨを達成し、定量時そのｐＨを維持するためには
、様々な緩衝剤が使用できる。緩衝剤の例としては、ホ
ウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、７ｒｉＳ、バルビタール等
を挙げることができる。使用する特定の緩衝剤に関して
本発明には制限はないが、個々の方法ではある緩衝剤が
他の緩衝剤より好ましいということはあり得る。 この方法の実施に際しては、通常、穏和な温度が使用さ
れる。この方法の実施中には一定の温度を用いることが
望ましいが、しばしばメジウムは２〜３種の温度の間を
循環させることが必要な場合もある。一定の場合には、
温度は−本鎖ボリヌクレオチドと延長されたポリヌクレ
オチドプライマーの複合体の＠ｗＩ−温度付近とづる。 この方法の温度は、−膜内には約１０〜１００℃の範囲
、より通常には約２０〜９５℃、好ましくは３５〜７０
℃の範囲である。しかしながら、上記工程が順次または
同時に行われるかによって、温度は変動させることがで
きる。たとえば、延長工程では、約２０〜４０℃の比較
的低温が用いられ、一方、変性およびハイブリダイぜ−
シコンは、約５０〜９５℃の温度で実施できる。 本発明の方法を実施するための時間は、−膜内には、一
本鎖ポリヌクレオチドのコピーまたはそれと相補性の配
列の所望数が術られるのに十分な時間である。一方、こ
れは、増幅を行う目的、たとえばポリヌクレオチド分析
対象のアッセイに依存する。−膜内には、この方法の実
施に葭づ゛る時間は１サイクルあたり約１〜１０分で、
４ノイクルは１回から２００回もしくはそれ以上、通常
は１〜８０回、多くの場合２０〜８０回行われる。便宜
上、所鮫時間およびサイクル数は通常、最小限とするこ
とが望ましい。一般に、与えられた程度の増幅を達成す
るための時間は、たとえば、ポリヌクレオチドポリメラ
ーゼを飽和させるのに１−分なヌクレオシド三リン酸の
濃度の選択、またはポリヌクレオチドポリメラーゼおよ
びポリヌクレオチドプライマーの濃度の増加によって短
縮できる。 ］ビーされる一本鎖ポリヌクレオチドの量は、サンプル
中１または２分子という僅か１．【ｆｆｉでもよいが、
−膜内にはサンプル巾約１０２・、、　−＋　ｏ　１０
さらに通常では約１０　−１０８分子の範囲である。ポ
リヌクレオチドプライマーの量は、少なくとら所望の」
ビー数と１１）】程度で、通常、サンプルが１０へ−１
，０００μｌの場合、サンプル中１０　〜１０−９モル
である。通常、ブラ、イマーは少なくとも１０−１２Ｍ
、好ましくは少なくと６１０”１０Ｍ、さらに好ましく
は少なくとも約１０’Ｍ存在させる。ポリヌクレオチド
プライマーの濃度は過剰にすることが好ましく、一本鎖
ポリヌクレオヂドの濃度の、好ましくは少なくとし１０
０倍とする。 各試薬の最終濃度は、標的配列の」ビー数が最適になる
ように、通常、経験的に決定される。 デオキシヌクレオシド三リン酸のメジウム中濃度は広範
囲に変動させることができ、これらの試薬は過剰量存在
させるのが好ましい。デオキシヌクレオシド三リン酸は
通常、ｉｏ’へ−１０−”Ｍ、りｆましくは１０−５へ
一１０’Ｍ存在させる。 鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの濃度は通常
、経験的に決定される。好ましくは、さらに濃度を高め
ても増幅に要する時間が５倍まで、好ましくは２倍まで
しか短縮しないようになる濃度が用いられる。−次的な
制限因子は一般的には試薬の経費である。 各試薬を混合して混合物を形成させるときの混合順序は
様々である。−膜内には、第一および第二の隣接配列を
もつ一本鎖ポリヌクレオヂドがそれ自体サンプル中の標
的ポリメクレオチド配列であるか、またはサンプル中の
ポリヌクレオチド分析対象の存在の関数として形成され
る。これを、予め［４したポリヌクレオチドプライマー
、ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌクレオ
チドポリメラーゼのα合物どＵ合する。しかじながら、
上述の同時添加、ならびに他の段階的または特定の順序
での添加し使用できる。 試薬の温度および添加順序、ならびに方法の条件は、−
膜内に、一本鎖ポリヌクレオチド配列のコピー数および
このような〕ビーが形成される速度を最大にしようとい
う希望によつ−（支配される。 一般に、一本鎖ポリヌクレオチド配列のコピー数は少な
くともファクター１０２、好ましくはファフタ−１０、
さらに好ましくはファクター１０６もしくはそれ以上で
増加することが望ましい。 本発明はサンプル中のポリヌクレオチド分析対象の定量
または検出にどくに応用されるものである。−膜内に、
本発明の方法は、分析対象の存在の結果、とじＬ、第一
および第二のポリヌクレオチド隣接配列によって隣接さ
れた一本鎖ポリヌクレオチド形成させるものである。こ
のようにして形成した一本鎖ポリヌクレオヂドの直接ま
たは間接的検出により分析対象の存在が示される。 一本鎖ポリメクレオチドはリーングルを第一および第二
のポリヌクレオヂドブＵ−ブと接触させることによって
形成できる。第一のプローブは、その３′末端における
分析対象の一本の鎖の第一部分と相補性の配列、および
第一の隣接配列から構成される。第二のプローブは分析
対象の同じ鎖の第二部分と相補性の５′末端における配
列、および第二の隣接配列から構成される。第一および
第、隣接配ダ１はｎいに少なくとも５０〜６５％の相補
性を有し、多くの場合８０〜１００％の相補性を有する
。接触は、第一および第一のプローブが分析対象と結合
する条ｆ１下に行われる。ついで、第一＋１３よび第二
ポリヌクレオチドプローブが、上記分析対象に結合した
場合にのみ、互いに連結する条件を与える。 各種試薬を混合して混合物を形成させるための混合順序
は様々であるが、同時にまたは完全にもしくは一部を順
次行うことができる。一般的には分析対象配列を含有す
るサンプルが得られる。これを、予め調製した第一およ
び第二ポリヌクレオチドプローブ、ヌクレオシド三リン
酸ならびにポリヌクレオチドポリメラーゼの混合物と混
合し、ついでリガーゼを添加する。しかしながら、上述
の同時添加、ならびに他の段階的もしくは他の順序によ
る添加も使用できる。試薬の濃度および添加順序ならび
に方法の条件は、一般的には、づべての標的ポリヌクレ
オチド配列と第一および第二ポリヌクレオチドグローブ
のハイブリダイゼーシヨンならびにハイブリダイズした
第一および第一のポリヌクレオチドプローブの共有結合
的付着を至適化する希望によって決定される。 第一および第二プローブが標的ポリヌクレオチド配列と
ハイブリダイズしＩＣ場合のこれらのブ１」−１を共有
結合的に付着させるための手段には、第一のプローブの
鎖延長により第一および第二ポリヌクレオチドプローブ
を連続性とする方法がある。第一のプローブを延長させ
る一手段には、液体メジウムにポリヌクレオチドポリメ
ラーゼとデＡキシヌクレオシド三リン酸を添加し、第一
および第二のプローブが分析対象とハイブリダイズした
場合、第一のプローブの３′末端の鎖延長が形成して、
第二のポリヌクレオチドプローブと連続性とするもので
ある。 第一および第二のポリヌクレオチドプローブが分析対象
配列とハイブリダイズして、両ポリヌクレオチドプロー
ブがＭ続性になる場合、第一および第二プローブは共有
結合的に付着１″る。第一および第二ポリヌクレオチド
プローブの共有結合的付着を達成する一方法には酵素を
用いる手段がある。好ましくは、分析対象配列とハイブ
リダイズした第一および第二ポリヌクレオチドプローブ
を含＠するメジウムを、一つのプローブの５′末端と他
のプローブの３′末端との間のリン酸ジエステル結合の
形成を触媒するリガーゼで処理する。 ポリヌクレオチド３′−ヒドロキシル基の反応を触媒で
きる任意のＮ索が使用される。このような酵素の例とし
てはたとえば任意の起源のポリヌクレオチドリガーゼ、
たとえばＥ、Ｃ０１ｉｌ［ｌ菌すガーゼ、Ｔ４）７−ジ
ＤＮＡリガーゼ、陶ｎ乳動物ＤＮＡリガーゼ等を挙げる
ことができるが、これらは単に例示したものであって、
本発明を限定するものではない。この場合のｐＨ、温度
、溶媒およびＩｌ￥問については本発明の方法について
上述したのとほぼ同様である。 第一および第二のポリヌクレオチドプローブが分析対象
の非連続部分にハイブリダイズ１ノだ場合の両プローブ
の共有結合を達成づ−るだめの他の手段には、第一およ
び第二ヌクレオチドプローブの間に存在づる分析対象配
列の非連続部分と１分に相補性なヌクレオチド配列の使
用がある。この記載の目的におけるこのようなヌクレオ
ヂド配列は、介在リンカ−配列とも呼ばれる。リンカ−
配列は、たどえば第一および第二ポリヌクレオチドプロ
ーブの製造について上述したような公知の方法によって
製造することができる。このリンカ−配列は、第一およ
び第二ポリヌクレオチドプローブの間の分析対象配列と
ハイブリダイズづることができる。 ついでこのリンカ−配列を、第一および第二ポリヌクレ
オチドプローブの両者に、上述したような酵素的手段で
連結させることができる。第一および第二のポリヌクレ
オチドプローブの配列が分析対象に結合した場合、両プ
ローブ間の連続関係を作るためには、リンカ−配列とポ
リメラーゼの混合物を使用することも可能である。 第一および第二のポリヌクレオチドプローブがポリヌク
レオチド分析対象とハイブリダイズした場合、両プロー
ブを連結させたのち、ハイブリダイズしたポリヌクレオ
チドを解離させる。各プローブは伯方の隣接配列とハイ
ブリダイげ−シコン可能な隣接配列を含有するので、−
木調ポリヌクレオチドもこれらの配列を含有する。つい
で、連結したプローブから生じる一重鎮ポリヌクレオチ
ドの多数のコピーが製造される。ひとつのアプローチで
は、−木調ポリヌクレオチドの多数のコピーは、単一ポ
リヌクレオチドプライマーを用い、上述の操作によって
得られる。他のアプローチでは、−木調ポリヌクレオチ
ドの多数のコピーは、米国特許第４．６８３．１９５号
ｄ３よび第４．６８３．２０２号に記載された二重プラ
イマー法を用いて得ることもできる。これらの開示ｔよ
参考として本明細書に導入する。さらに他のアプローチ
では、増幅は米国特許出願第０７６．８０７号（１９８
７年７月２３日出願）に記載されたようにして達成する
こともできる（対応ヨーロッパ特許出願第８８３０６７
１７．５号参照）。これらの開示は参考として本明ｗＩ
占に導入する。多数のコピーを形成させる他の方法が、
分析対象の検出のために本発明で使用できることは、本
技術分野の熟練者には自明のとおりである。 第二の隣接配列に連結した第一の隣接配列の検出または
一本鎖ポリヌクレオチドもしくはその相補性配列の検出
は、サンプル中のそのポリヌクレオチドの存在を指示す
るものである。 ポリヌクレオチド分析対象の定量の例を反応式２に例示
する。これは例示の目的のものであって、本発明を限定
するものではない。 反応式２ ポリヌクレオチド分析対象は■で示されていて、標的分
析対象の部分には２種のポリヌクレオチドプローブがハ
イブリダイズしている。プローブはそれぞれ、互いに少
なくとも部分的に相補性の配列２ａおよび２ｂを含有す
る。分子ＶＩ（！−処理して、プローブを連結可能にし
、プローブを連結させる。 これは上述のようにして達成づることができ、反応式２
中には分子■として示されている。■を解離させると分
子１χを生成し、これは２個の少なくとも部分的に相補
性の配列、２ａおよび２ｂを有する。反応式から明らか
なように、分子１χは反応式１の分子■と類似し、ポリ
ヌクレオヂドブライマ−２０と混合するとこれが分子■
の配列２ｂとハイブリダイズして、分子Ｘを与える。上
述のように、プライマー２Ｃの鎖延長で分子ＸＩが生成
づる。℃を解離させたのち、プライマー２０とハイブリ
ダイズさせ、鎖延長を行うと分子ＩＸの多数のコピーま
たはそれと相補性の配列を生成する。−木調ポリヌクレ
オチドは、一本鎖として検出するかまたはその相補性の
鎖とハイブリダイズさける。 連結したプローブの存在はサンプル中のポリヌクレオチ
ド分析対象の存在を指示する。 本発明の方法をポリヌクレオチド分析対象の検出に応用
して行うに際しては、水性メジウムを使用し、多くの場
合これにはさらに上述したような他の極性溶媒を含有さ
せてもよい。ｐＨ１温度、時間および試薬の濃度は、一
本鎖ポリヌクレオヂドの多数のコピーの形成について上
述したのと同じである。 メジウムのｐＨは通常的４．５〜９．５の範囲、より通
常には約５．５〜８．５の範囲、好ましくは約６〜８の
範囲である。 この方法の温度は、一般に約２０〜９０℃、より通常に
は約３０〜７０℃、好ましくは３７〜５０℃の範囲であ
る。 一般的に、この方法を実施するのに要する時間は約５〜
２００分である。便宜上、所要時間は通常、最小限にす
ることが望ましい。 標的ポリヌクレオチド分析対象の濃度はサンプル中１分
子のような低濃度でもよく、サンプル中受なくとも１０
”Ｍが好ましいが、−殻内には約１０　　　Ｍ〜１０”
Ｍ、より通常には約＝１６ １０　〜１０　”　Ｍの範囲で変動する。第一および第
二のポリヌクレオチドプローブならびにデオキシヌクレ
オシド三リン酸のメジウム中濃度は広範囲に変動させる
ことができる。これらの試薬は、期待される標的分析対
象の負に対して大モル過剰に存在させるのが好ましい。 デオキシヌクレオシド三リン酸は通常１０〜１０’Ｍ、
好ましくは１０−５〜１０’Ｍ存在させる。第二のポリ
ヌクレオチドプローブならびに第一のポリヌクレオチド
プローブは、通常少なくとも１０”Ｍ、好ましくは１０
”Ｍ、さらに好ましくは少なくとも約１０””Ｍ存在さ
せる。 メジウム中のポリメラーゼおよび補因子の温度も実質的
に変動させることができる。これらの試薬は１０−１２
Ｍ程度の低濃度存在させることもできるが、第一および
第二のメクレオチドブローブの濃度と少なくとも同濃度
またはそれ以上のａ亀存在させることができる。 各種試薬の濃度は一般的には、ポリヌクレオチド分析対
象の問題の濃度範囲によって決定されるが、それぞれの
試薬の最終濃度は、興味ある範囲に０つでの検定の感度
を至適にするように経験的に決定される。他の試薬の検
定液中の濃度は一般に、増幅方法について上述したのと
同じ原理に従って決定されることになる。主として考慮
すべき事項は、ポリヌクレオチド分析対象配列に関連す
る一本鎖ポリヌクレオチドの十分な数のコピーが、容易
に検出され、ポリヌクレオチド分析対象の正確な定漬結
果を与えるように生成することである。 メジウムを上述の条件上に同時にまたは順次インキュベ
ートしたのち、存在する一本鎖ポリヌクレオチドまたは
第一および第二プローブの連結した標的結合配列が検出
される。連結した配列の存在は、サンプル中のポリヌク
レオチド分析対象の存在を指示する。連結した配列は多
くの方法で検出することができる。 本発明の方法では、ポリヌクレオチドプライマーの分子
の一部をビオチンのようなリガンド（Ｂ）で標識し、ポ
リヌクレオチドプライマーの分子の他の部分はたとえば
フルオレセインのような検出可能（Ｆ）標識で標識する
ことができる。 反応式３ リガンドは、小有機分子、ポリヌクレオチド配列、タン
パク質等であってもよい。増幅を行うと、二重鎖の混合
物が得られる（反応式３参照）。−部は両末端にリガン
ドを有し、一部は両末端に検出可能標識を有し、一部は
一端にリガンドを他端に検出可能標識を有する。生成物
の比は、２種の標識の異なるプライマーの比を変動させ
ることによって改変できる。二重鎖は、その分子を、リ
ガンドに対する受容体が結合している表面に結合させる
ことによって検出できる。第一および第二隣接配列をも
つ一本鎖ポリヌクレオチドより短い、２種のプライマー
標識を含有する二重鎖は、これらの短い二重鎖のみを解
離させるのに十分な緊縮条件を用いることにより、結合
を防止することができる。非結合物質を除去したのら、
支持体について検出０Ｉ能な標識の存在を検査する。そ
の存在は、サンプル中のポリヌクレオチド分析対象の存
在を指示する。 他のアブローヂにおいては、内部的にハイブリダイゼー
ション可能な配列を選択できる。ハイブリダイズした配
列に結合できる合成または天然の受容体が存在するから
である。これらの配列は通常、それらを標的ポリヌクレ
オチド結合配列とポリヌクレオチドブローブまたは一本
鎖ポリヌクレオヂドの隣接配列との間に包含させること
によって導入される。別法として、これらはポリヌクレ
オチドプライマー分子の部分の５′末端に標識どして導
入づることもできる。テ１ヘラザイクリンレプレッサー
はこのＪ：うな受容体である。このタンパク質はテトラ
リイクリンオペレーターに結合し、ハイブリダイズした
配列は、このオペレーターの一部または全部からなるよ
うに選択できる。レプレッサーは固体支持体に結合させ
、増幅反応溶液から増幅生成物を吸着および＋１縮する
のに使用される。ついで結合した生成物は、アクリジニ
ウオレンジのような染料で染色することにより、吸着体
の物性たとえば電気的性質、光学的性質、前液ｙ４節等
の変化により、またポリヌクレオチドプライマー分子の
他の部分に結合した標識の存在を検出覆−ることにより
検出できる。 他のオペレーター−レプレッサ一対、たとえば、ＤＮＡ
二重鎖の捕捉のためのリガンドおよび受容体として用い
られてきたＪａＣレプレッサーおＪ、びオペレーター、
ならびに１〜リブトフアンレブレツサーおよびオペレー
ターを使用することもできる。 伯のアブローヂでは、ポリヌクレオチドプライマー分子
の部分にブロモデオキシウリジンを導入し、ブロモデオ
キシウリジンに対する抗体を使用することができる。結
合した配列の検出は、任意のト述の方法で実施できる。 一重項ポリヌクレオチドの検出のための好ましいアブロ
ーヂでは、ポリヌクレオチドを同時にまたは順次、加熱
または変性溶媒および溶質の使用によって変性し、たと
えば」二連の方法のひとつで支持体に結合させる。次に
支持体を、核酸配列および標識または受容体結合部位か
らなるプローブと接触させる。核酸配列は、連結した一
本鎖ポリメクレＡヂドの少なくとも部分ど相補性である
か、またはその相補性配列である。ついで、一本鎖ポリ
ヌクレオチドの存在は、支持体上における標識または受
容体結合部位の存在によって指示される。 他の検定フォーマツ１−（反応式４に示したような）に
おいては、内部ハイブリダイゼーション可能配列３　ａ
および３ｂを含有する一本鎖ポリヌクレオヂドが標識と
して用いられる。この方法では、任意の手段たとえばＤ
ＮＡサンドインチの形成を、標識核酸鏡の表面への結合
の発生に使用することができる。サンドインチ法では、
標的分析対象に結合できる２種のプローブが用いられる
。これらのプローブの一方は固体表面に、たとえば、ご
オチンーアビジンのようなりガント−受容体結合の使用
により、結合しているかまたは結合させることができる
。他のプローブは標識として−・重鎖ポリヌクレオチド
をもっている。（ｉ）２種のプローブを標的ポリメクレ
Ａチド配列とハイブリダイズさせ、（ｉｉ）プローブの
−・方がまだ結合していない場合は、表面にその複合体
を結合させ、（ｉｉｉ）表面を洗浄したのち、一本鎖ポ
リヌクレオチドに本発明の増幅過程を行わせ、一本鎖ポ
リヌクレオヂドの検出法として上）！シた方法を含めた
特異的ポリヌクレオチドの任意の検出方法で生成物を検
出する。 反応式４ ５′ １′ ３′ 二本鎖核酸配列を特安的に検出するための任意の標準方
法が使用できる。 核酸を検出する一方法は拡散プローブを使用するもので
ある。この方法は一般に、二１ヘロセルロースろ紙、セ
ルロースろ紙、ジアゾ化ろ紙またはナイロン膜のような
固体支持体上への標的核酸の固定化を包含する。標的核
酸を支持体上に固定したのち、支持体を適当に標識した
プローブ核酸と約１０分〜４８時間接触させる。上記時
間を経過したのち、固体支持体を数回洗浄して、非結合
プローブを除去し、ハイブリダイズした物質をオートラ
ジオグラフィーまたは分光法によって検出する。 プローブを使用する一方法は、米国特Ｂａ１ｍ第７７３
．３８６号（１９８５年９月６日出願）に記載されてい
る。この開示を参考として本明細書に導入する（対応ヨ
ーロッパ特許出願８６３０６８６０．７号も参照）。こ
の方法は検定メジウム中に、サンプルならびに核酸フラ
グメントと相補性の第一および第二のポリヌクレオチド
試薬を混合するものぐある。第一および第二試薬はそれ
ぞれ、核酸フラグメン１−の異なる領域とハイブリダイ
ズする。第一の試薬は第一の：Ｊｔ薬を非共有結合的に
重合可能にする手段を含有する。第一の試薬は第二の試
薬を検出可能にする手段を含有する。 サンプルならびに第一および第二の試薬を検定メジウム
中、第一の試薬が重合し、サンプル中にＤＮＡフラグメ
ントが存在する場合のみ重合した第一の試薬に第二の試
薬が結合するような条件下に混合する。ついで測定は、
第一の試薬が重合した第一の試薬に結合したか否かにつ
いて行われる。 サンプルを含有する検定混合物中で、一本鎖ポリヌクレ
オヂドを他の成分から分離するためには、第一もしくは
第二ポリメクレオチドブ日−ブまたは一本鎖ポリヌクレ
オチドがその配列を固定化するため手段をもつかまたは
もつことが可能であることが望ましく、また環境によっ
ては実際にそれが好ましい。一般に、固定化のためのこ
の手段は支持体である。問題の配列は、それを本発明の
方法に使用づるのに先立って、支持体に結合させる処理
を行うことができる。ヌクレオチド配合を固体支持体に
結合させる方法は多数知られている（たとえば丁、　Ｇ
ＯＩｄｋＯｒｎら：　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　１ｌｅ
ｓ、。 １４：９１７１〜９１９１．１９８６Ｊ３よびその引用
文献参照）。−殻内には、ヌクレオチド配列を支持体に
結合させる操作は、その配列中の一部のヌクレオチドを
、その配列の支持体への結合が可能になるような化学的
修飾に付すものである。 支持体とヌクレオチド配列の間の結合は共イ１結合であ
ることが好ましく、ヌクレオチドと支持体の間には連結
基を含むことがさらに好ましい。たとえば、支持体はマ
レイミド基が導入されるように処理覆ることができ、ヌ
クレオチド配列はチオール括産導入するように処理する
ことができる。ヂオール基はマレイミド基の活性化オレ
フィンと反応性であり、この方式でヌクレオチド配列は
支持体に共有結合させることができる。他の連結基の例
には、ジ７ゾベンジルオキシメヂル基で誘導体化された
セル０−ス（Ｎｏｙｅｓ、　Ｂ、　Ｅ、　＆　５ｔａｒ
ｔＧ、　Ｒ，、Ｃｅ１ｌ、　５　：３０１．１９７５お
よび＾１ｗ１ｎｅ、　Ｊ、Ｃ，ら：　Ｐｒｅｏ。Ｎａｔ
　ｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、υＳ＾。 ７４：５３５０，１９７７）および０−アミノフェニル
チオエーテルで誘導体化されたセルロース（Ｓｅｅｄ、
　Ｂ、　：　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　　
１０　：　１７９９１９８２）がある。 ヌクレオチド配列が最初から支持体に結合していない場
合には、２種の配列の一方を、本発明の方法の実施時の
ある時点で、好ましくは第一および第二の標的ポリヌク
レオチド結合配列がポリヌクレオチド分析対象の存在の
結果として共有結合的に付着したか否かを決定する前に
支持体に結合させることが望ましい。したがって、支持
体およびヌクレオチド配列の一方は、支持体とヌクレオ
チド配列の間の連鎖を与えることができる反応基を含有
しなければならない。反応基の性質は、本発明の方法と
適合性のあるものでなければならない。 このようなシステムのひとつは上述のような、支持体が
マレイミド基をヌクレオチド配列がチオール基を含有す
るシステムである。他の態様においては、ヌクレオブト
配列および支持体が、ビオチン−アビジン等のような相
補性の特異的結合ベアの構成要素を含有する。寸なわら
、本発明の方法は溶液中で行い、適当な時点で支持体を
導入し、相補性ｓｂｐ＠成要素を結合させる。支持体を
洗浄して非結合物質を除去したのら、さらに反応または
定量を進めることができる。 このようなシステムの他の例には、レプレッサーオペレ
ーター相互作用がある。この場合、ヌクレオチド配列の
一方を、固体表面上に固定化した特異的レブレッナーま
たはモジュレータ−タンパク質とのその配列特異的な相
互作用によって、固体表面上に捕捉させる。捕捉相のこ
の態様の利点は、オペレーターＤＮＡのレプレッサーか
らの放出が複合体のインデューサー分子による処理で達
成できる場合があることである。たとえば、テトラザイ
クリンレブレッサーを固体表面上に固定化し、溶液を表
面に接触させた場合に、ヌクレオチド配列の一方または
他方に存在するオペレーター配！／１１を特異的に捕捉
し、保持させる。次に表面を洗浄して非特異的結合を除
去し、最終的には、表面に結合したレプレッサー−オペ
レーター複合体をインデューサー分子（この場合はテト
ラサイクリンまたはその活性類縁体のひとつ）と接触さ
せてオペレーター含有ヌクレオチドを表面から遊離させ
る。 インデューサー分子は、天然の分子と構造的に１ｉ、ｉ
ｌ−であり、生物学的／調節レプレッサー−オペレータ
ー複合体の解離を生じるという意味において「天然のイ
ンデューサー」であってもよく、また、類似のもしくは
増強された結合および複合体解離活性をもつ、天然イン
デューサーの合成類縁体であってもよい。上述の例には
、テトラザイクリンレブレッサーーオペレーター相互作
用およびテトラサイクリンによるその１ｌｉｌｉ−離が
ある（Ｈｉｌｌｅｎ、　ｕ、ら：Ｊ、　Ｈｏｔ、　８ｉ
ｏ１．．１６９　：　７０７〜７２１．１９８３および
に１ｏｃｋ、　Ｇ、ら：Ｊ、Ｂａｃｔ、　　１６１　：
３２６〜３３２．１９８５）。 ヌクレオチド配列が支持体に共有結合によって付着して
いる場合には、たとえば、その配列を増幅またはクロー
ニングするために、その配列を支持体から除くことが望
ましいことがある。この場合には、ヌクレオチド配列と
支持体の間に切断可能な基を導入することが望ましい。 このような切断可能な基の例には、ビロリン酸結合、ジ
スルフィド結合、およびυ１限酵素切断部位がある。 第一および第二のポリヌクレオヂドブローブがポリヌク
レオチド分析対瘉とハイブリダイズした場合には両プロ
ーブが共有結合で付着し、一本鎖ポリヌクレオチド与え
るように準備し、−本ｔｔｉポリヌクレオチドが存在す
ればこれを増幅したのち、共有結合で付着した第一およ
び第二標的ポリヌクレオチド結合配列を定量する。共有
結合での付着の存在は、サンプル中のポリヌクレオチド
分析対象の存在を指示する。上述のように、この定量に
は支持体に結合した、または結合できるヌクレオチド配
列が関与する。支持体をメジウムから分離し、非結合物
質を含まないように洗浄し、ついでたとえば標識または
レポーター基の存在の検出によって、連結した第一およ
び第二標的ボリヌクレＡヂド結合配＋ＩＪを調べる。−
膜内には、この検査は、サンプル中の標的ヌクレオチド
配列の存在に関連したシグナルを生成させるために、支
持体をシグナル生成系の残りの構成要素と接触させるも
のである。 本発明の方法の使用により、支持体は、共有結合による
付着がなくハイブリダイゼーションを行う場合よりも通
常、もっと強力な条件下に洗浄することが可能になる。 多くの場合、この洗浄条件では支持体に結合した二重鎖
が完全に解離してしまう。これらの条件には、カオトロ
ピック剤たとえば尿素の単独またはホルムアミドのよう
な他の変性剤との組み合せを含有し、空温または加温下
に用いられる溶液が包含する。しかしながら、第一およ
び第二ポリヌクレオチドプローブ間の共有結合による付
着、ならびにプローブの一方の表面への結合は影響され
ない。生成した支持体結合標識物質の検出は、サンプル
中の標的ヌクレオチド配列の存在を指示づる。 シグナルの検出は使用したシグナル生成系の性質に依存
する。標識またはレポーター基が酵素であれば、シグナ
ル生成系にはさらに付加的構成要素として酵素基質等が
包含される。酵素反応の生成物は、好ましくは化学発光
体、蛍光体もしくは非蛍光染料、分光測光法で検出でき
る生成物、または他の分光法も１ノくは電気計測法によ
って検出できる生成物である。標識が蛍光分子である場
合には、メジウムを放射して蛍光を測定する。標識が放
射性基の場合には、メジウムを３１数して放射性力・ク
ントを測定する。 分析対象の含有が疑われるサンプル中のポリヌクレオチ
ド分析対象の存在を検出するための方法の他の態様には
、ポリヌクレオチドプローブの第三および第四配列の連
結を含む方法がある。この場合、第三および第四の配列
は分析対象の別個の部分にハイブリダイゼーション可能
で、分析対象の存在時においてのみ連結可能または連結
可能とすることができる。第三および第四の配列が連結
すると、このようにして形成した一本鎖ポリヌクレオチ
ドは環状ポリメクレオチド鎖中に導入することができる
。ポリヌクレオチドプローブはさらに、少なくとも部分
的に相補性の第一および第二の配列を有する。 ポリヌクレオ−チドプライマーの延長は、ヌクレオシド
三リン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラー
ゼの存在下に形成される。少なくともポリヌクレオチド
プライマーの３′末端は、ポリヌクレオチドプローブの
第一または第二の配列とハイブリダイズできる。次に、
延長されたポリヌクレオチドプライマーならびに／また
は分析対象の別個の部分と相補性の、連結した第三もし
くは第四配列の少なくとも部分と同一および／もしくは
相補性の配列が検出される。上述したいずれかの存在は
サンプル中のポリヌクレオチド分析対象の存在を指示す
る。 本発明におけるポリヌクレオチドプライマー第一および
第一のポリヌクレオチドプローブ、または一本鎖ポリヌ
クレオチド配列の製造には様々な技術を使用することが
できる。それらは、生合成でも化学合成によっても得る
ことができる。短い配列（約１００ヌクレオヂドまで）
の場合は、生合成に比較して化学合成の方が経演的であ
る。 経済性に加えて、化学合成は、合成工程で低分子量化合
物および／または修飾塩基の導入に便利である。さらに
、化学合成は、標的ポリヌクレオチド結合配列の良さＪ
３よび領域の選択にきわめて融通性がある。ポリヌクレ
オチドプライマーは標準的方法、たとえば市販の自動核
酸シンセサイザーを用いる方法で製造できる。適当に修
飾したガラスまたは樹脂上でのＤＮＡの化学合成では、
表面に共有結合で付着したＤＮＡを生じる。これは洗浄
およびサンプル処理に有利である。良い配列の場合には
、分子生物学で用いられる標準的な複製方法、たとえば
市販のＲＮＡ製造キット（たとえばＰｒｏｎｅｇａより
）およびＪ、　Ｈｅ５５１ｇ　　（ＭｅｔｈｏｄｓＥｎ
ｚｙｍｏｌ、、　１０１　：　２０〜７８．１９８３）
記載の一本ｕ５ＤＮＡのためのＭ１３を使用することが
できる。 オリゴヌクレオヂド合成の他の方法には、リン酸トリエ
ステルおよびリン酸ジエステル法（Ｎａｒａｎ（ｌら：
　Ｈｅｔｈ、　　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　　６８　：　９
０　、　１９７９）および支持体上での合成（Ｂｅａｕ
ｃａｏｅら：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ、、２
２　：　１８５９〜１８６２゜１９８１）ならびにリン
酸アミデート法（Ｃａｒｕ−ｔｈｅｒｓ　　Ｈ，Ｈ，ら
：　Ｈｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ＋ｌ１ｏｌｏｏｙ
、　Ｖ。 １、ｐｐ２８７〜３１４．１９８８）および“５ｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ　　ａｎｄ　　Ａｌ１１ＤｌｉｃａｔｉＯｎ
Ｓ　　ｏｆ　　ＤＮＡ　　ａｎｄＲＮ＾”　、　Ｓ、　
Ａ、　Ｎａｒａｎｇ編、　ＡｃａｄｅＩＩＩｉｃ　Ｐｒ
ｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ　　１９８７およびその引用
文献の他の記載が包含される。 一本鎖ポリヌクレオチドまたは第一および第二ポリヌク
レオチドプローブはＰｊＩＰ′ＩＡＭ結によって製造で
きる。２種の適当な相補性オリゴヌクレオチドは標準的
な自動化技術で合成できる。ついでこれらを他のポリヌ
クレオチド配列にＭ素的に、たとえば［４リガーゼによ
って連結させ一本鎖ポリヌクレオチドを［ｉするか、ま
たはそれぞれを周側に、ポリヌクレオチド分析対象の部
分にハイブリダイズできる別個のポリヌクレオチド配列
に連結させる。ついで所望の生成物を、たとえば、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマ１−
グラフィー（ＨＰ　１．、、　Ｃ）によって単離できる
。 ある場合には、一本鎖ポリヌクレオヂドまたは第一ポリ
ヌクレオチドプローブの３′末端を、鋳型依存性ＤＮＡ
との反応を防止するようにまたは結合配列を付加して修
飾づる。３′末端はたとえば、ジデオキシヌクレオヂド
またはりボヌクレＡチドの連結によって修飾し、ついで
生成したジアルデヒドをボロハイドライドおよび大きな
アミンたとえばアミノブキスミーランとともに還元アミ
ン化に付すことができる。 ポリヌクレオチドプライマーは、標準的な自動化技術で
製造できる。 便宜上、本発明に用いられる試薬は、本方法に用いられ
る試薬の既定量を組み合わせて包装したキラ１〜として
提供することができる。サンゾル中のポリヌクレオチド
分析対象の検定においては、本方法に有用なキラｌ−は
、他の試薬と、標識でさるもしくはそのひとつが支持体
に結合できる、またはその配列を標識するかもしくは支
持体に結合させることができるようにする基を提供でき
るポリヌクレオヂドプライマーならびに第一および第二
のポリヌクレオチドプローブを、組合せて包装したもの
である。上述のキットには、その包装配合物中にさらに
、デオキシヌクレオシド三リン酸たとえばｆオキシアデ
ニン三すンＩＩＩ（ｄＡＴＰ）、ｆオキシグアノシン三
リン酸（ｄＧＴＰ）　、デオキシシヂジン三リン１（ｄ
ＣＴＰ＞およびデオキシチミジン三リン酸（ｄ’ＦＴＰ
）のようなヌクレオシド三リン酸を包含させることがで
きる。キットにはさらに、ポリヌクレオシドポリメラー
、ならびにまた、第一および第二の配列を共有結合ｃ付
着させる手段たとえばリガーゼ、およびシグナル生成系
の格成要素を包含させることができる。 キット中での各種試薬の相対量は、本方法の実施時に進
行させる必要がある反応を実質的に至適にり−る、また
さらに本検定の感度を実質的に至適するような試！１Ｔ
ｉｓ度を提供するため、広範囲に変動させることができ
る。適当ｆ：Ｊ：環境下では、キット中の１種または２
種以トの試薬は、試形剤を含んだ乾燥Ｖ）末、通常は凍
結乾燥粉末として、これを溶解すると本発明による方法
または検定の実施に適当な濃度の試薬溶液が得られる形
で提供することがＣきる。各試薬は、それらの反応性と
所望の貯蔵寿命を考慮して、別個の容器中に包装するこ
ともできるし、また一部の試薬をひとつの容器中に混合
することもできる。 例 本発明をさらに、以１・の例示的実施例によって説明す
る。 例１ オリゴデオキシリボヌクレオヂド配列１，２゜３．４．
５，６．７．８および９： 第一および第二隣接配ｊ１を有する一重項ポリヌクレオ
チド； Ａリゴマ−１ ＴＡＴ　ＴＡＡ　ＧＣＴ　ＴＧＴ　ＧＴＡ　ＡＴＴ　Ｇ
　３第一のポリヌクレオチドブローブ△； オーリゴマ−２ ｊｃＡＡＴＴΔＣＡＣＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＡＴ　ＡＣＡ
　ＴＴＣＣＴＴ　ＣＧＡ　ＧＣＴ　ＣＧＧ　ＴＡＣＣＣ
Ｇ　ＧＧＧ　ＡＴＣＣｒ３ 第一のポリヌクレオチドプローブＢ； オリゴマー３ ５’　　ＣＡＡ　　ＴＴＡ　　ＣＡＣＡＡＧ　　ＣＴＴ
　ＡＡＴ　　ＡＣＡ　　ＴＴＣＣＴＴ　　ＣＧＡ　　Ｇ
ＣＴ　　ＣＧＧ　　ＴＡＣＣＣＧ　ＧＧＧ　ＡＴＣＣ３ 第二のポリヌクレＡチドブローブ； オリゴマー４ ５’　　ＣＴＡ　　ＧＡＧ　　ＴＣＧ　　ＡＣＣ−ＴＧ
ＣＡＧＧ　　ＣＡＴ　　ＧＣＡ　　ＡＧＧ　　ＡＡＴ　
　ＧＴＡ　　ＴＴＡ　　ＡＧＣ丁丁Ｇ　　ＴＧＴ　　Ａ
ＡＴ　　ＴＧ　　３書ボリヌクレＡヂドプライマー オリゴマ−５ ５’　ＣＡＡ　ＴＴＡ　ＣＡＣＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＡＴ
　ＡＣＡ　ＴＴＣＣ３’オリゴマー６ ５　’　　ＣＣＧ　　ＧＧＧ　　ＡＴＣＣＴＣＴＡＧ　
　ＡＧＴ　　ＣＧＡ　　ＣＣ３’オリゴマー７ ５’　　ＣＣＧ　　ＧＧＧ　　ＡＴＣＣＣＴ　ＡＧＡ　
　ＧＴＣＧＡＣＣ３菅オリゴマ〜８ ５’　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＧＴＣＧＡＣＣＴＧ　ＣＡＧ　
ＧＣＡ　ＴＧＣＡ　３オリゴマー９ ５１　　ＴＧＣＡＴＧ　　ＣＣＴ　　ＧＣＡ　　ＧＣＴ
　ＣＧＡ　　ＣＴＣＴＡＧ　　Ａ　　３をリン酸アミダ
イト法で合成し、変性ポリアクリルアミドゲル上で精製
した。１００マーオリゴマー１の２７の５′終末塩基お
よび２７の３′終末塩基は自己相補性であり、したがっ
てこの分子は「ヘアピン」またはステム−ループ！！４
造を形成する。オリゴマー２および４はそれぞれ、オリ
ゴマー１の５′の５０塩基および３′の５０個のｊＳｎ
基である。オリゴマー５はオリゴマー１および４の３′
末端２５塩基と相補性である。オリゴマー６（７）はオ
リゴマ−１の中央２３　（２２）塩基にハイブリダイズ
するが、オリゴマー７は一塩培欠失がある（チミジン残
基）。オリゴマー８および９は相補性である。オリゴマ
ー８はオリゴマー１の塩基５０から７４までと同一であ
る。 ポリヌクレオチドプライマーとしてオリゴマー５を用い
るオリゴマー１のＤＮＡ増幅のプロトコールを記述する
。このブロトニ］−ルの変法は以後の例に）ホベる。１
ピコモル（１ｐｍｏｌｅ　）のオリゴ？−１と６０ｐＩ
１１０１のオリゴマー５を、５ＱｍＨＴｒ　ｉ　５−Ｈ
Ｃｊ！　（１）Ｈ８，４，２５℃）、５０ｍＭＫＣｌ、
２．５１１１Ｈｖｏｃｉ　、０．２■／ｍｌゼラチンの
Ｍ前液中、各ｄ　Ｎ　−ｒ　Ｐ　１０ナノモル（ａ＋５
ｏｌｅ　）と混合する。最終容量５０μｌに対してＴａ
ｑポリメラーゼ酵素５単位を加える。９４’Ｃ（１分）
、３７℃（２分）および７２℃（３分）の温度サイクリ
ングを、プログラム可能な熱サイクラ−（Ｅｒｉｃｏｍ
ｐ、　Ｉｎｃ、　）を用い、３つの温度を通して多数サ
イクル実施する。これらの反応液の一部を様々な段階で
採取し、Ｇｅｎｅ　５ｃｒｅｅｎ　ＰｌｕｓＬ９ナイロ
ン膜（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ　）上、製造業者の推薦プロト」
−ルを用いてドツト−プロットする。 乾燥した膜を、０．７５Ｍ　　ＮａＣ１，０、１５Ｍ　
　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，Ｏ）　、１０ｍ
ＨＥＤＴＡ、５Ｘデンハルト溶液（１ｇＦｉｃｏｌｌ、
　　１ｇポリビニルピロリドン、１！？ＢＳＡを総容量
１０００ｄの水中に含む）、２０ｍＨリン酸ナトリウム
、２５０η／−剪断変性ウシ胸腺ＤＮＡおよび０．５％
ＳＤＳ中、６５℃で３時間プレハイブリダイズする。増
幅オリゴマー１の形成を検定するためには、３２Ｐ５′
末端？！識オリゴデオキシヌクレオヂドブローブ（約１
１０７ＤＰ、１００〜１００００　ｔ　／ｍ　ｍｏｌｅ
）を新たなプレハイブリダイゼーション溶液とともに加
え、−夜穏かに６０℃で攪拌しながら一部ハイブリダイ
ズする。ハイブリダイズした膜は、通常、０，３ＭＮａ
Ｃｊ！　　、　　０．０６Ｍ　　　　Ｔｒｉｓ　　−ト
１ｃＪ（ｐＨ８，０）、４ｍＨＥＤＴＡおよび０．５％
ＳＤＳの！１衝液中、６０℃で３０分間、１回緩衝液を
交換して洗浄する。洗浄した膜をにｏｄａｋ　Ｘ　−Ｏ
ｍａｔ。 ＡＲフィルムに、様々な時間の長さ、場合によっては単
一の強化スクリーン（ＤｕＰｏｎｔ　Ｃｒｏｎｅｘ■Ｌ
ｉｏｈｔｎｉｎｇ−Ｐｌｕｓ）を用いて露出する。 第１図は、（３Ｑ　ｐｍｏｌｅのポリヌクレオチドプラ
イマー、オリゴマー５の存在下における１　ｐｍｏｌｅ
のオリゴマ−１の増幅の結果を示す。この場合のプロー
ブはオリゴマー５で、標準（レーンＡ、　１〜１０）は
様々な量のオリゴマー１である。；４リゴマー５を増幅
反応から除くと検出可能なハイブリダイゼーションは起
こらない。オリゴマー１を加えないと、生酒のオリゴマ
ー５の増幅が検出される。 このブロワ［・を室温で１０分間、０．４ＮＮ　ａ　Ｏ
Ｈ中において洗浄し、１Ｍ　　ＴｒｉＳＨＣＪ　（ｐＨ
７，５＞、０．３Ｍ　　ＮａＣ１，４ｍＨＥ　Ｄ丁Δ中
で中和づることによって放射性プローブを取除いた。膜
をついで５．　３２Ｐ標識オリゴマー９にハイブリダイ
ズしたく第２図参照）。この場合、増幅はオリゴマー１
および５の両者を含む反応中に検出され、１または５の
一方を別個に含む反応中にｔま検出されない。 例２ Ａリボヌクレオチド配列１，２．３，４，５ニ一本鎖ポ
リヌクレオチド標的： オリゴマ−１ 第一のポリヌクレオチド基質； オリゴマー２ ５’　　ＡＣＧ　　ＧＴＴ　　ＣＣＡ　　ＴＣＡ　　Ａ
ＡＡ　　ＧＧＧ　　ＧＧＧ　　ＡＡＴ　　ＴＣＡ　　Ｇ
ＴＴ　　ＴＴＣＴＣＴ　　ＡＴＣＡＣＴ　ＧＡＴ　ＡＧ
Ｇ　ＧＡＧ　ＴＧＧ　ＴＡＡ　ＡＡＴ　ＡＡＣＴＣＴ　
ＡＴＣＡＡＴ　ＧＡＴ　ＡＧＡ　ＧＡＣ丁丁ＣＡＧＴ　
　ＴＧＴ　　ＴＧＡ　　ＴＣＣＧＡＣＴＴＣＧＡＡ　　
ＧＡＧ　　Ｃ第二のポリヌクレオチド基質； オリゴマー３ ５’　　ＡＣＧ　　ＧＴＴ　　ＣＣＡ　　ＴＣＡ　　Ａ
ＡＡ　　ＧＧＧ　　ＧＧＧ　　ＡＡＴ　　ＴＣＴ　　Ｇ
ＴＧ　　ＴＧＧ　　ＡＡＴ　　ＴＧＴＧＡＧ　ＣＧＧ　
ＡＴＡ　ＡＣＡ　ＡＴＴ　ＴＣＡ　ＣＡＣＡＡＣＴＴＧ
　ＧＧＣＴＡＴ’ＣＡＣＴＴＣＣＣＴＧＧＡ　　ＴＣＣ
ＣＣＡ　　Ｔ　　３’ヌクレＡチドプライマー： 到りゴマ−４ ＡＣＧ　ＧＴＴ　ＣＣＡ　ＴＣＡ　ＡＡＡ　ＧＧＧ　Ｇ
Ｇポポリクレオチドプローブ： オリゴマー５ ５　’　ＴＡＡ　ＴＡＧ　ＡＧＡ　ＡＣＧ　ＡＧＣＡＡ
Ｇ　ＧＣＴ　ＴＣＡ　Ａ　３’オリゴマー１はＮ、　ｇ
ｏｎｏｒｒｏｅａｅ　　（Ｎ。９．）ゲノムクローンか
らの二本鎖Ｒ８ａＩ制限フラグメントの一本鎖である。 全クローン化ＤＮＡ挿入体は−Ｎ、ａ、１２５株（米国
、アトセンタ、Ｃ９Ｄ、Ｃ（センター　フォー　デイシ
ーズ　コントロール）から得た）に由来１′る７キロベ
ース（にｂ）Ｓａｕ　　３ＡＩ制限フラグメントである
。この７にｂフラグメン］〜をｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏ
ｔｅｃｈからのＢａｍ日１線状化ベクター［）ＧＥＭ　
　３Ｚｆ　（＋）に挿入した。 オリゴマー１の３′末端２０塩基はオリゴマー２の塩基
番号８０〜９９にハイブリダイズする（反応式５．Ａ）
。これが、ＴａＱポリメラーゼによって触媒されて、オ
リゴマー１の３′末端力翫らオリゴマー２を鋳型とした
ＤＮＡ重合のための開始基質を形成する。この重合の１
８５塩基長’ＩＥ成物は、熱変性によって一本鎖にした
場合、その３′末端２０塩基でオリゴマー４と塩基対を
形成する（反応式５．Ｂ）。これはＴａａポリメラーゼ
に対ｌる阜買で、プライムされた１８５塩基鋳型上で重
合し、１８５塩基の相補鎖生成物を形成する。 上述の重合の変性生成物は３′末端に２０個の１！基を
有し、これはオリゴマー３にヌクレオチド６２〜８１で
ハイブリダイズし、したがって、ｒａＱボリポリーぜが
オリゴマー３鋳型」ｌに６１塩基を延長する基質である
。生成物を熱変性すると、反応式５における２４６塩基
長のポリヌクレオチド６が生成する。 ポリヌクレオチド６は、５′および３′末端における相
補性配列の２０堪り対のステムで、ステム−ループ構造
を形成する。したがって、６の補体もステム−ループ構
造を形成する。６とその補体の両者はその各３′末端で
、ブライン−、オリゴマー４にハイブリダイズし、Ｔａ
Ｑポリメラーゼに対する基質を与え、その際、ｐＡｌに
記載した型の単一プライマーポリヌクレオチド増幅が可
能になる。要約すると、オリゴマー１の存在が、プライ
ムされた鋳型のポリメラーゼ延長と熱変性の交替によっ
てオリゴマー２および３と相補性の配列の連結を１可能
にし、ポリヌクレオチド６を形成する。 以下の実験はこの方法の例である。以下の成分を含有す
る５種の検定を実施した。 １０倍（ＩＯＸ）緩衝液は、０．１Ｍ Ｔｒ　　ｉ　　５−ＨＣｊ！、ｐＨ３，４（２５℃）、
０．５Ｍ　　ＫＧ矛、６０！ｌＨＭｇＣｌ２．２ＩＩｔ
ｇ／Ｉｄゼラヂンである。検定の最終容積は１００μ２
とした。 Ｔ　ａ　Ｑポリメラーゼを除く全成分はエツベンドルフ
管で添加し、５０μｌの鉱油で覆って９５℃に３分間加
熱した。管を徐々に、３０分を要して５０″Ｃ未満に冷
−ｆＪＩ　した。次に５Ｉｉ位の１“ａｑポポリラーゼ
を加えて、熱サイクリングをＥｒｉｃｏｍｐ熱ブロック
中で開始した。すなわち、９４℃３０秒、５０℃３０秒
、７２℃２分で、この３温度基準（１サイクル）を反復
した。５種の検定の１０μでのサンプルを２０．４０Ｊ
５よび６０サイクルで採取し、凍結した。 凍結サンプル５μｌを解凍し、ａｅｎｅｓｃｒｅｅｎＰ
ＩＩＪＳ■ナイロン１Ｉ（ｏｕＰｏｎｔ）上、製造業者
の推薦プロトコールを用い、ドツトブロッティングによ
って分析した。プロットを例１に記載したと同様に処理
した。３２Ｐ−キナーゼ標識ブＯ−ブオリゴマー５　（
１００〜１０００Ｃｉ　／Ｉｌ１ｍｏｌｅ、約１０７ｄ
ｌ）Ｉｌｌ）を用いてドラ１〜ブロツ］へにハイブリダ
イズした。オリゴマー５は標的オリゴマー１の塩基３８
〜６２と同一である。 第３図のプロットは、６０温度サイクルまでに、標的Ｄ
ＮＡ含有検定液はすべて、プローブにハイブリダイぜ一
ジョンｑ能ｈＤＮＡ２５ｆｍｏｌｃ　１５μｍ以上を示
した。ドツトプロット５Ｅにおいては、５Ｘ１０−１８
１１ＩＯＩＣのハイブリダイゼーション可能配列が＞　
２５　Ｘ　１０”　ｍｏｌｅのハイブリダイゼーション
可能配列に増幅したこと、ずなわら約５×１０３倍の増
幅を示している。 反応式５ 単一プライマー増幅が可能なヘアピン分子基質の標的依
存性形成方法の概略 ４、 図面の簡単な説明 第１図は、単一プライマーポリヌクレオチド増幅生成物
への３２Ｐオリゴマー５のドッｌ−ブロツ１〜ハイブリ
ダイぜ一ジョンを示す。 Ａ列、レーン１〜１０はオリゴマー＃１゜１、　８．　
０．　９．　０．　４５４．　　Ｏｌ　１８゜０．０９
．０．０４５．０．０１８，０．００９゜０．００４５
．０．００１８ｎ　ｍｏｌｅの標準、Ａ列、レーン１１
は剪断、変性ウシ胸腺ＤＮ△１μ９の陰性対照、８列、
レーン７−１１は、６Ｑ　ｐｎｏｌｅのオリゴマー５を
含有するがオリゴマー１は含まない増幅反応での１０．
２０，３０．４０および５０温度サイクル時のサンプル
５μｌの結果である。オリゴマー５ブＤ−ブに、５０ザ
イクルから生成物のハイブリダイゼーションを認める。 ０列レーン１〜５は、オリゴマ−１のみ（１ｐｍｏｌｅ
　）を含有する１０．２０，３０．４０および５０ザイ
クル時のサンプル５μｌの結果である。検出可能な増幅
生成物は認められない。０列、レーン７〜１１はオリゴ
マー１０よび５の両者を含有する場合の１０．２０．３
０．４０および５０ザイクル時のサンプル５μｌについ
ての結果である。２０００倍を越える増幅が認められる
（　１ｐ＠ｏｌｅが＞　１　、　８ｎ　ｍｏｌｅに）。 第２図は、単一プライマーポリヌクレオチド増幅生成物
への３２ｐオリゴマー９のドツトプロットハイブリダイ
ぜ一ジョンを示す。 第１図におけるプロットをハイブリダイズした３２ｐオ
リゴマー５から取除き、３２ｐオリゴマー９１０−ブに
ハイブリダイズした。結果は第１図の場合とほぼ同様で
あるが、８列レーン７〜１１におけるハイブリダイぜ一
シコンはこのプローブでは検出できない。 第３図は検定１〜５の増幅生成物への３２Ｐオリゴマー
５のドツトプロットハイブリダイゼーションをホす。 Δ列、レーン１〜４　：２５．２．５．０．２５および
０．　Ｏ２５ｆｍｏｌｅのＮ、　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａ
ｅゲノムクローンのａｔｅ　：　ｃ列、レーン１〜５：
検定１〜５それぞれの２０温度サイクル時の５μｌサン
プル；０列、レーン１〜５：検定１へ・５それぞれの４
０温度サイクル時の５μｉリンプル、Ｅｅｌ、レーン１
〜５：検定１へ−５それぞれの６０温度サイクル時の５
μｌザンブルの結果である。

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも１個のコピ
    ーを生成させるにあたり、（ａ）ヌクレオシド三リン酸
    および鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの存在
    下に一本鎖ポリヌクレオチドに沿つて、少なくともその
    ３′末端には上記一本鎖ポリヌクレオチドの３′末端に
    連結した第二の隣接配列とハイブリダイゼーシヨン可能
    な少なくとも１０塩基配列を有するポリヌクレオチドプ
    ライマーの延長を形成させ、この場合上記第二の隣接配
    列は上記一本鎖ポリヌクレオチドの５′末端に連結した
    少なくとも１０塩基の第一の隣接配列と少なくとも部分
    的に相補性であり、（ｂ）上述の延長されたポリヌクレ
    オチドプライマーと上記一本鎖ポリヌクレオチドを解離
    させ、（ｃ）工程（ａ）を反復することを特徴とする方
    法。
  2. （２）ポリヌクレオチドプライマーの３′末端の最後の
    １０個のヌクレオチドは第二の隣接配列と同じ配列であ
    る請求項（１）記載の方法。
  3. （３）工程（ａ）の反復後に形成された生成物は逆方向
    反復配列を含有する請求項（１）または（２）のいずれ
    か一つに記載の方法。
  4. （４）ポリヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼー
    シヨン可能配列の長さは１５〜１００ヌクレオチドであ
    る請求項（１）〜（３）のいずれか一つに記載の方法。
  5. （５）鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼはＤＮ
    Ａポリメラーゼであり、ヌクレオシド三リン酸はｄＡＴ
    Ｐ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰである請求項（
    １）〜（４）のいずれか一つに記載の方法。
  6. （６）ポリヌクレオチド配列の多数のコピーを生成させ
    るにあたり、（ａ）（ｉ）上記ポリヌクレオチド配列を
    有し、各末端には少なくとも部分的に相補性の第一およ
    び第二の隣接配列が隣接している一本鎖ポリヌクレオチ
    ド、（ｉｉ）その３′末端における少なくとも１０塩基
    部分は上記第一および第二隣接配列の構成要素すなわち
    上記一本鎖ポリヌクレオチドの３′末端とハイブリダイ
    ゼーション可能であるポリヌクレオチドプライマー、（
    ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸、（ｉｖ）鋳型依存性ポ
    リヌクレオチドポリメラーゼの配合物を準備し、（ｂ）
    上記配合物を完全にまたは部分的に、順次または同時に
    （ｉ）上記一本鎖ポリヌクレオチドを相補性配列から解
    離させ、（ｉｉ）この一本鎖ポリヌクレオチドの３′末
    端における隣接配列をポリヌクレオチドプライマーとハ
    イブリダイズさせ、（ｉｉｉ）このポリヌクレオチドプ
    ライマーを一本鎖ポリヌクレオチドに沿つて延長させて
    第一の延長されたポリヌクレオチドプライマーを与え、
    （ｉｖ）第一の延長されたポリヌクレオチドプライマー
    と一本鎖ポリヌクレオチドを解離させ、（ｖ）第一の延
    長されたポリヌクレオチドプライマーを上記ポリヌクレ
    オチドプライマーとハイブリダイズさせ、（ｖｉ）この
    ポリヌクレオチドプライマーを第一の延長されたポリヌ
    クレオチドプライマーに沿って延長させて第二の延長さ
    れたポリヌクレオチドプライマーを与え、（ｖｉｉ）第
    二の延長されたポリヌクレオチドプライマーを第一の延
    長されたポリヌクレオチドプライマーから解離させ、（
    ｖｉｉｉ）上記工程（ｖ）〜（ｖｉｉ）を反復させる条
    件下にインキュベートする請求項（１）〜（５）のいず
    れか一つに記載の方法。
  7. （７）第一および第二の配列は相補性である請求項（６
    ）記載の方法。
  8. （８）ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑われるサン
    プル中の上記分析対象の存在を決定するにあたり、（ａ
    ）上記分析対象の存在の結果として、相補性の第一およ
    び第二隣接配列によって隣接された一本鎖ポリヌクレオ
    チドを形成させ、（ｂ）上記一本鎖ポリヌクレオチドお
    よび上記隣接配列の多数のコピーを形成させ、（ｃ）上
    記一本鎖ポリヌクレオチドを検出する各工程からなる方
    法。
  9. （９）第一および第二隣接配列は、少なくとも１０塩基
    の相補性配列である請求項（８）記載の方法。
  10. （１０）ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑われるサ
    ンプル中の上記分析対象の存在を決定するにあたり、（
    ａ）上記分析対象の存在の結果として、それぞれ少なく
    とも１５個の塩基を有し少なくとも８０％相補性の第一
    および第二隣接配列によつて隣接された一本鎖ポリヌク
    レオチドを形成させ、（ｂ）ヌクレオシド三リン酸およ
    び鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの存在下に
    、少なくともその３′末端で上記一本鎖ポリヌクレオチ
    ド配列の３′末端における隣接配列とハイブリダイゼー
    シヨン可能なポリヌクレオチドプライマーの延長を形成
    させ、この場合、工程（ａ）および（ｂ）は完全にまた
    は部分的に、順次または同時に行うものとし、ついで（
    ｃ）上記ポリヌクレオチド配列と同一および／または相
    補性の配列を含有する延長されたポリヌクレオチドプラ
    イマーを検出する各工程からなる方法。
  11. （１１）ポリヌクレオチドプライマーの一部は第一のレ
    ポーター基で標識され、また一部は第二のレポーター基
    で標識されている請求項（１０）記載の方法。
  12. （１２）ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑われるサ
    ンプル中の上記分析対象の存在を決定するにあたり、（
    ａ）上記サンプルを、上記分析対象の一方の鎖の第一の
    部分に対しその３′末端で相補性の標的ポリヌクレオチ
    ド結合配列と第一の隣接配列からなる第一のポリヌクレ
    オチドプローブおよび上記分析対象の同じ鎖の第二の部
    分に対しその５′末端で相補性の標的ポリヌクレオチド
    結合配列と第二の隣接配列からなる第二のポリヌクレオ
    チドプローブであって、上記第一および第二隣接配列は
    少なくとも６５％の相補性を有する両プローブと、第一
    および第二のプローブが上記分析対象と結合する条件下
    に接触させ、（ｂ）上記第一および第二のポリヌクレオ
    チドプローブが上記分析対象に結合した場合にのみ互い
    に連結するような条件を与え、（ｃ）ヌクレオシド三リ
    ン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼの
    存在下に、少なくともその３′末端は上記第二の隣接配
    列とハイブリダイゼーシヨン可能なポリヌクレオチドプ
    ライマーの延長を形成させ、（ｄ）上記第一のプローブ
    と相補性の配列を含有する延長されたポリヌクレオチド
    プライマーを検出することからなる請求項（８）〜（１
    １）のいずれか一つに記載の方法。
  13. （１３）ポリヌクレオチドプライマーは、蛍光体、化学
    発光体、触媒、補酵素、放射性物質、増幅可能なポリヌ
    クレオチド配列および小有機分子からなる群より選ばれ
    るレポーター基で標識されている請求項（１２）記載の
    方法。
  14. （１４）第一および第二のポリヌクレオチドプローブは
    分析対象とハイブリダイズした場合少なくともヌクレオ
    チド１個離れていて、第一および第二のポリヌクレオチ
    ドプローブの連結条件には、（ａ）ハイブリダイズ部分
    を連続的にするためのヌクレオシド三リン酸およびポリ
    ヌクレオチドポリメラーゼの添加、および上記ハイブリ
    ダイズ部分を連結させるためのリガーゼの添加を包含す
    る請求項（１２）または（１３）のいずれか一つに記載
    の方法。
  15. （１５）ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑われるサ
    ンプル中の上記分析対象の存在を検出するにあたり、（
    ａ）ポリヌクレオチドプローブの第三および第四配列を
    連結させ、この場合、上記第三の配列は遊離３′末端を
    、上記第四の配列は遊離５′末端を有し、それぞれが上
    記分析対象の別個の部分にハイブリダイゼーシヨン可能
    でまた上記分析対象の存在下にのみ連結可能であるかも
    しくは連結可能になることができ、さらに上記ポリヌク
    レオチドプローブは少なくとも部分的に相補性の第一お
    よび第二隣接配列からなり、この第一配列は上記第三配
    列の５′であり、第二配列は第一配列の５′であり、第
    四配列は第二配列の５′であり、（ｂ）ヌクレオシド三
    リン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼ
    の存在下、少なくともその３′末端で上記ポリヌクレオ
    チドプローブの第一の隣接配列とハイブリダイゼーシヨ
    ン可能なポリヌクレオチドプライマーの延長を形成させ
    、この場合、工程（ａ）と（ｂ）は完全にまたは部分的
    に、順次または同時に実施し、延長したポリヌクレオチ
    ドプライマーおよび／または上記分析対象の上記別個の
    部分に相補性の連結した第三もしくは第四配列の少なく
    とも部分と同一および／もしくはそれと相補性の配列を
    検出する各工程からなる請求項（８）記載の方法。
  16. （１６）プローブはオペレーター配列を含有する請求項
    （１５）記載の方法。
  17. （１７）ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑われるサ
    ンプル中の上記分析対象の存在を検出するにあたり、（
    ａ）検定メジウム中でサンプルを第一および第二ポリヌ
    クレオチドプローブと混合し、この場合、第一のプロー
    ブは第二のプローブ中の第二の隣接配列と少なくとも部
    分的に相補性で、その３′末端において上記分析対象の
    一方の鎖の第一部分とハイブリダイゼーシヨン可能な配
    列と結合する第一の隣接配列からなり、一方、第二の隣
    接配列は上記分析対象の同一の鎖の第二部分とハイブリ
    ダイゼーシヨン可能な配列とその５′末端において結合
    していて、（ｂ）上記検定メジウムを、第一および第二
    のプローブが分析対象と結合する条件下にインキュベー
    トし、この場合、第一および第二のプローブは上記分析
    対象と結合した場合にのみ互いに連結可能であるかまた
    は連結可能になることができ、（ｃ）第一および第二の
    プローブを、両者がそうしないと連結可能でない場合は
    必要に応じて第一および第二のプローブを連結可能にし
    たのち連結させ、（ｄ）上記検定メジウムを、第二のプ
    ローブ中の第二の隣接配列と相補性の３′末端配列を有
    するポリヌクレオチドプライマーと混合し、（ｅ）この
    検定メジウムを、完全にまたは部分的に、順次または同
    時に（ｉ）連結した第一および第二プローブの内部ハイ
    ブリダイゼーシヨンがあればこれを解離させ、（ｉｉ）
    上記ポリヌクレオチドプライマーを連結した第一および
    第二プローブとハイブリダイズさせ、（ｉｉｉ）このポ
    リヌクレオチドプライマーを連結した第一および第二プ
    ローブに沿って延長させ、（ｉｖ）延長されたポリヌク
    レオチドプライマーと連結した第一および第二のプロー
    ブのハイブリダイゼーシヨンを解離させ、（ｖ）延長さ
    れたポリヌクレオチドプライマーを上記ポリヌクレオチ
    ドプライマーとハイブリダイズさせ、（ｖｉ）このポリ
    ヌクレオチドプライマーを上記延長されたポリヌクレオ
    チドプライマーに沿って延長させ、（ｖｉｉ）延長され
    たプライマーのハイブリダイゼーシヨンを解離させ、そ
    して（ｖｉｉｉ）上記工程（ｖ）〜（ｖｉｉ）を反復さ
    せる条件下にインキュベートし、この場合、工程（ａ）
    〜（ｄ）は完全にまたは部分的に、順次または同時に実
    施したのち工程（ｅ）を行い、ついで（ｆ）上記延長さ
    れたプライマーを検出する請求項（８）記載の方法。
  18. （１８）ポリヌクレオチドプライマーの別個の分子は、
    表面に結合できるようになる基で標識されている請求項
    （１７）記載の方法。
  19. （１９）ポリヌクレオチドプライマーの連結した第一お
    よび第二プローブに沿った延長ではオペレーターの少な
    くとも一部が形成され、検出には（ａ）固体支持体に結
    合したリプレッサーの添加および（ｂ）第一のポリヌク
    レオチドプローブ中の配列と同一または相補性である、
    上記固体支持体に結合した配列の検出が包含される接触
    点（１７）または（１８）のいずれか一つに記載の方法
    。
  20. （２０）ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑われるサ
    ンプル中の上記分析対象の存在を決定するにあたり、（
    ａ）上記サンプルを第一および第二のポリヌクレオチド
    プローブと接触させ、この場合、第一のプローブは（ｉ
    ）第二のプローブ中の第二の隣接配列と相補性の第一の
    隣接配列および（ｉｉ）第二のプローブと相補性の部分
    以外の上記分析対象の部分と相補性の配列からなり、接
    触は上記第一および第二のプローブが上記分析対象に結
    合する条件下に行い、第一および第二のプローブは上記
    分析対象に結合した場合にのみ互いに連結可能であるか
    または連結可能になることができ、（ｂ）ヌクレオシド
    三リン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラー
    ゼの存在下、少なくともその部分が上記第一または第二
    のプローブとハイブリダイズするポリヌクレオチドプラ
    イマーの延長を形成させ、この場合、工程（ａ）および
    （ｂ）は完全にまたは部分的に、順次または同時に実施
    し、ついで上記延長されたポリヌクレオチドプライマー
    および／または連結した第一および第二のポリヌクレオ
    チドプローブを検出する請求項（８）記載の方法。
  21. （２１）ポリヌクレオチド分析対象の定量に使用するキ
    ットであつて、上記ポリヌクレオチド分析対象の第一の
    部分にハイブリダイゼーシヨン可能な第一のヌクレオチ
    ド配列を有する第一のポリヌクレオチドプローブ、上記
    ポリヌクレオチド分析対象の同じ鎖の上記第一のポリヌ
    クレオチドプローブの上記第一のヌクレオチド配列によ
    つて認識される部分以外の第二の部分にハイブリダイゼ
    ーシヨン可能な第二のヌクレオチド配列を有する第二の
    ポリヌクレオチドプローブ、上記第一および第二のポリ
    ヌクレオチドプローブが上記ポリヌクレオチド分析対象
    とハイブリダイズした場合この第一および第二のポリヌ
    クレオチド配列を共有結合させる手段、ならびに上記第
    二のポリヌクレオチドプローブとハイブリダイゼーシヨ
    ン可能で上記の共有結合したプローブに沿って上記第一
    のポリヌクレオチドプローブの方向に延長されるポリヌ
    クレオチドプライマーを組合せて包装したキット。
  22. （２２）ポリヌクレオチド分析対象の含有が疑われるサ
    ンプル中の上記分析対象の存在を決定する請求項（８）
    記載の方法において、請求項（８）の工程（ａ）として
    、（ｉ）ヌクレオシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌ
    クレオチドポリメラーゼの存在下に第一の一本鎖ポリヌ
    クレオチドに沿つて上記分析対象またはそのフラグメン
    トの延長を形成させ（延長されたポリヌクレオチド分析
    対象）、二本鎖ポリヌクレオチド１をつくり、（ｉｉ）
    一本鎖の延長されたポリヌクレオチド分析対象を上記ポ
    リヌクレオチド１から解離させ、（ｉｉｉ）ヌクレオシ
    ド三リン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラ
    ーゼの存在下に上記一本鎖ポリヌクレオチド分析対象に
    沿つて、少なくともその３′末端に上記一本鎖の延長さ
    れたポリヌクレオチド分析対象の少なくとも１部とハイ
    ブリダイゼーシヨン可能な少なくとも１０塩基の配列を
    有する第一のポリヌクレオチドプライマーの延長を形成
    させ、一本鎖ポリヌクレオチド２をつくり、（ｉｖ）上
    記ポリヌクレオチド２から一本鎖の延長された第一のに
    ポリヌクレオチドプライマーを解離させ、（ｖ）ヌクレ
    オシド三リン酸および鋳型依存性ポリヌクレオチドポリ
    メラーゼの存在下に第二のポリヌクレオチドプライマー
    に沿って上記一本鎖の延長された第一のポリヌクレオチ
    ドプライマーの延長を形成させ、この場合、少なくとも
    上記第二のポリヌクレオチドプライマーの３′末端は上
    記一本鎖の延長された第一のポリヌクレオチドプライマ
    ーの少なくとも１部とハイブリダイゼーシヨン可能な少
    なくとも１０塩基の配列を有し、二本鎖ポリヌクレオチ
    ド３をつくり、この場合、一本鎖の２回延長された第一
    のポリヌクレオチドプライマーの３′末端および５′末
    端は各々少なくとも部分的に相補性の１０塩基の配列を
    有し、そして（ｖｉ）上記ポリヌクレオチド３から上記
    一本鎖の２回延長された第一のポリヌクレオチドプライ
    マーを解離させ；そして 請求項（８）の工程（ｂ）として、（ｉ）ヌクレオシド
    三リン酸および鋳型依存性ポリメクレオチドポリメラー
    ゼの存在下に上記一本鎖の２回延長された第一のポリヌ
    クレオチドプライマーに沿って上記第一のポリヌクレオ
    チドプライマーの延長を形成させ、二本鎖ポリヌクレオ
    チド４をつくり、（ｉｉ）ポリヌクレオチド４から一本
    鎖の延長された第一のポリヌクレオチドプライマーを解
    離させ、そして（ｉｉｉ）工程（ｉ）を反復させる各工
    程からなる請求項（８）記載の方法。
JP02010457A 1989-01-19 1990-01-19 単一プライマーを用いる核酸の増幅 Expired - Fee Related JP3109810B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29928289A 1989-01-19 1989-01-19
US299282 1989-01-19
US39979589A 1989-08-29 1989-08-29
US399795 1989-08-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH02268683A true JPH02268683A (ja) 1990-11-02
JP3109810B2 JP3109810B2 (ja) 2000-11-20

Family

ID=26971136

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP02010457A Expired - Fee Related JP3109810B2 (ja) 1989-01-19 1990-01-19 単一プライマーを用いる核酸の増幅

Country Status (7)

Country Link
US (2) US5827649A (ja)
EP (1) EP0379369B1 (ja)
JP (1) JP3109810B2 (ja)
AT (1) ATE142272T1 (ja)
CA (1) CA2008096A1 (ja)
DE (1) DE69028325T2 (ja)
ES (1) ES2093633T3 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07505763A (ja) * 1991-12-11 1995-06-29 イゲン，インコーポレーテッド 単不対プライマーによる核酸の指数増幅方法
JP2002534986A (ja) * 1999-01-19 2002-10-22 アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテツド オリゴヌクレオチドの伸長の制御方法

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5439793A (en) * 1990-07-19 1995-08-08 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for producing a polynucleotide having an intramolecularly base-paired structure
US5595891A (en) * 1990-07-19 1997-01-21 Behringwerke Ag Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification
CA2049879A1 (en) * 1990-08-30 1992-03-01 Keith C. Backman Controlled initial target-dependent production of templates for ligase chain reaction
CA2046713A1 (en) * 1990-10-16 1992-04-17 Richard M. Martinelli Amplification of midivariant dna templates
WO1992020820A1 (en) * 1991-05-15 1992-11-26 Vanderbilt University Method to determine metastatic potential of tumor cells
ATE161586T1 (de) 1991-10-11 1998-01-15 Behringwerke Ag Verfahren zur herstellung eines polynukleotids zum gebrauch in ''single-primer'' amplifizierung und phosphorothioat-enthaltende oligonukleotide als primer in nukleinsäureamplifizierung
EP0567635B1 (en) * 1991-11-15 2000-05-31 Igen International, Inc. Rapid assays for amplification products
DE69333650T2 (de) * 1992-02-19 2006-01-12 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Neue anordnungn von oligonukleotiden und ihr nutzen zum sortieren, isolieren, sequenzieren und manipulieren von nukleinsäuren
DK0652973T3 (da) * 1992-07-31 1997-09-15 Behringwerke Ag Fremgangsmåde til indføring af definerede sekvenser ved 3-enden af polynukleotider
FR2703053B1 (fr) * 1993-03-26 1995-06-16 Genset Sa Oligonucleotides agrafes et semi-agrafes, procede de preparation et applications .
US6294323B1 (en) * 1993-04-14 2001-09-25 Behringwerke Ag Self initiating single primer amplification of nucleic acids
US5422252A (en) * 1993-06-04 1995-06-06 Becton, Dickinson And Company Simultaneous amplification of multiple targets
US5710000A (en) 1994-09-16 1998-01-20 Affymetrix, Inc. Capturing sequences adjacent to Type-IIs restriction sites for genomic library mapping
CA2231184A1 (en) * 1995-09-20 1997-03-27 George Tice Jr. Control for pcr
WO1997020068A2 (en) * 1995-11-25 1997-06-05 Boehringer Mannheim Gmbh Method for generating multiple double stranded nucleic acids
US7070925B1 (en) * 1996-07-16 2006-07-04 Gen-Probe Incorporated Method for determining the presence of an RNA analyte in a sample using a modified oligonucleotide probe
CA2260749A1 (en) * 1996-07-16 1998-01-22 Gen-Probe Incorporated Methods for detecting rna analytes using modified probes
US6326143B1 (en) 1996-11-22 2001-12-04 Roche Diagnostics Gmbh Method for generating multiple double stranded nucleic acids
US6025133A (en) * 1996-12-30 2000-02-15 Gen-Probe Incorporated Promoter-sequestered oligonucleoside and method of use
EP1092047B1 (en) 1998-07-02 2009-08-26 Gen-Probe Incorporated Molecular torches
US6316229B1 (en) 1998-07-20 2001-11-13 Yale University Single molecule analysis target-mediated ligation of bipartite primers
US6703228B1 (en) * 1998-09-25 2004-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to genotyping and DNA analysis
EP1001037A3 (en) * 1998-09-28 2003-10-01 Whitehead Institute For Biomedical Research Pre-selection and isolation of single nucleotide polymorphisms
DE69929542T2 (de) * 1998-10-27 2006-09-14 Affymetrix, Inc., Santa Clara Komplexitätsmanagement und analyse genomischer dna
US6958225B2 (en) 1999-10-27 2005-10-25 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
WO2002050308A1 (en) * 2000-12-19 2002-06-27 Discoverx Strand displacement detection of target nucleic acid
US6872529B2 (en) 2001-07-25 2005-03-29 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
US9487823B2 (en) 2002-12-20 2016-11-08 Qiagen Gmbh Nucleic acid amplification
ES2524048T3 (es) 2003-03-31 2014-12-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Composiciones y métodos para la detección de ciertos flavivirus, incluidos los miembros del serogrupo del virus de la encefalitis japonesa
US8043834B2 (en) 2003-03-31 2011-10-25 Qiagen Gmbh Universal reagents for rolling circle amplification and methods of use
CN1280428C (zh) * 2003-05-19 2006-10-18 清华大学 一种基于微小颗粒的生物芯片系统及其应用
AU2005216549A1 (en) * 2004-02-27 2005-09-09 President And Fellows Of Harvard College Polony fluorescent in situ sequencing beads
JP4728663B2 (ja) * 2004-03-22 2011-07-20 シスメックス株式会社 標的物質検出用プローブセット及び標的物質検出方法
JP2005304489A (ja) * 2004-03-24 2005-11-04 Sysmex Corp 標的物質検出用プローブセット及び標的物質検出方法。
US7939251B2 (en) 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
DE602005020943D1 (de) * 2004-07-01 2010-06-10 Gen Probe Inc Verfahren und zusammensetzungen zum nachweis von nukleinsäuren in einer biologischen probe
EP1623996A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-08 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved method of selecting a desired protein from a library
US8309303B2 (en) 2005-04-01 2012-11-13 Qiagen Gmbh Reverse transcription and amplification of RNA with simultaneous degradation of DNA
EP1762627A1 (de) 2005-09-09 2007-03-14 Qiagen GmbH Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion
US9044715B2 (en) * 2007-08-22 2015-06-02 Colorado School Of Mines Unsupported palladium alloy membranes and methods of making same
US9388457B2 (en) 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
US9074244B2 (en) 2008-03-11 2015-07-07 Affymetrix, Inc. Array-based translocation and rearrangement assays
JP5733796B2 (ja) 2008-05-13 2015-06-10 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド 標的核酸配列の選択的ハイブリダイゼーションおよび捕捉における使用のため不活化可能型標的捕捉オリゴマー
EP2367958B1 (en) * 2008-11-25 2017-08-23 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting small rnas, and uses thereof
US20110059453A1 (en) * 2009-08-23 2011-03-10 Affymetrix, Inc. Poly(A) Tail Length Measurement by PCR
GB2512213B (en) 2010-10-08 2015-02-11 Harvard College High-throughput single cell barcoding
WO2012048340A2 (en) 2010-10-08 2012-04-12 President And Fellows Of Harvard College High-throughput immune sequencing
WO2013055995A2 (en) 2011-10-14 2013-04-18 President And Fellows Of Harvard College Sequencing by structure assembly
US10202628B2 (en) 2012-02-17 2019-02-12 President And Fellows Of Harvard College Assembly of nucleic acid sequences in emulsions
WO2013184754A2 (en) 2012-06-05 2013-12-12 President And Fellows Of Harvard College Spatial sequencing of nucleic acids using dna origami probes
CN108875312A (zh) 2012-07-19 2018-11-23 哈佛大学校长及研究员协会 利用核酸存储信息的方法
US9476089B2 (en) 2012-10-18 2016-10-25 President And Fellows Of Harvard College Methods of making oligonucleotide probes
EP3578666A1 (en) 2013-03-12 2019-12-11 President and Fellows of Harvard College Method of generating a three-dimensional nucleic acid containing matrix
ES2911684T3 (es) 2014-02-21 2022-05-20 Harvard College Diseño de novo de proteínas alostéricas
EP3129493B1 (en) 2014-04-09 2021-07-07 The Scripps Research Institute Import of unnatural or modified nucleoside triphosphates into cells via nucleic acid triphosphate transporters
CA2967036A1 (en) 2014-11-13 2016-05-19 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Bio-engineered hyper-functional "super" helicases
WO2018213803A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 Neon Therapeutics, Inc. Immunogenic neoantigen identification
AU2018300069A1 (en) 2017-07-11 2020-02-27 Synthorx, Inc. Incorporation of unnatural nucleotides and methods thereof
WO2019028425A1 (en) 2017-08-03 2019-02-07 Synthorx, Inc. CONJUGATES OF CYTOKINE FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES
EP3613855A1 (en) 2018-08-23 2020-02-26 Clariant Produkte (Deutschland) GmbH Method for the production of a nucleic acid library
MX2021009259A (es) 2019-02-06 2021-08-24 Synthorx Inc Conjugados de il-2 y metodos de uso del mismo.
WO2024015766A1 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Topogene Inc. Scalable, submicron-resolution replication of dna arrays

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US888058A (en) * 1907-09-25 1908-05-19 Charles Berg Shrubbery-cutter.
US4777129A (en) * 1983-12-12 1988-10-11 Molecular Diagnostics, Inc. Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein
US4883750A (en) * 1984-12-13 1989-11-28 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4882269A (en) * 1985-12-13 1989-11-21 Princeton University Amplified hybridization assay
EP0286642A4 (en) * 1985-12-17 1990-06-27 Genetics Inst TEST PROCEDURE BY MEANS OF POLYNUCLEOTIDE DISPLACEMENT AND REAGENT COMPLEX.
GB8612087D0 (en) * 1986-05-19 1986-06-25 Ici Plc Hybridisation probes
US4908307A (en) * 1986-12-19 1990-03-13 Karin D. Rodland Hybridization method and probe for detecting nucleic acid sequences
AU622104B2 (en) * 1987-03-11 1992-04-02 Sangtec Molecular Diagnostics Ab Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
GB8721072D0 (en) * 1987-09-08 1987-10-14 Volex Group Plc Cable dielectric
US5185243A (en) * 1988-08-25 1993-02-09 Syntex (U.S.A.) Inc. Method for detection of specific nucleic acid sequences
US5508178A (en) * 1989-01-19 1996-04-16 Rose; Samuel Nucleic acid amplification using single primer

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH07505763A (ja) * 1991-12-11 1995-06-29 イゲン，インコーポレーテッド 単不対プライマーによる核酸の指数増幅方法
JP2002534986A (ja) * 1999-01-19 2002-10-22 アベンティス・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテツド オリゴヌクレオチドの伸長の制御方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2008096A1 (en) 1990-07-19
US6124090A (en) 2000-09-26
EP0379369A3 (en) 1991-07-03
DE69028325D1 (de) 1996-10-10
ES2093633T3 (es) 1997-01-01
JP3109810B2 (ja) 2000-11-20
EP0379369A2 (en) 1990-07-25
US5827649A (en) 1998-10-27
EP0379369B1 (en) 1996-09-04
DE69028325T2 (de) 1997-04-17
ATE142272T1 (de) 1996-09-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0379369B1 (en) Nucleic acid amplification using single primer
EP0469755B1 (en) Method producing a polynucleotide for use in single primer amplification
US5508178A (en) Nucleic acid amplification using single primer
JP2788034B2 (ja) ポリヌクレオチドのアツセイのための増幅方法
US5612199A (en) Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification
EP0549107B1 (en) Method for producing a polynucleotide for use in single primer amplification and phosphorothioate-containing oligonucleotides as primers in nucleic acid amplification
US5185243A (en) Method for detection of specific nucleic acid sequences
AU770217B2 (en) Ligation assembly and detection of polynucleotides on solid-support
EP0932700B1 (en) Method of sequencing dna
EP0857218B1 (en) Detection of nucleic acids by formation of template-dependent product
JPH06500021A (ja) 均質検定システム
JPH07509365A (ja) ポリヌクレオチド類の３’末端に特定配列を導入する方法
CN113528628A (zh) 用于基因组应用和治疗应用的核酸分子的克隆复制和扩增的系统和方法
CN115176030A (zh) 检测分析物的方法
EP1590482B1 (en) Nucleic acid amplification using non-standard bases
US5439793A (en) Method for producing a polynucleotide having an intramolecularly base-paired structure
JP2001512301A (ja) 核酸増幅のための内部陽性対照
US5605796A (en) Method for preventing amplification of nucleic acid contaminants in amplification mixtures using nuclease-receptor conjugates
EP0819181B1 (en) Positive controls for use in polynucleotide amplification
US7070962B1 (en) Positive controls in polynucleotide amplification
JPH03127999A (ja) オリゴヌクレオチドの形成方法

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Cancellation because of no payment of annual fees