JPH06500021A - 均質検定システム - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 均質検定システム 本発明は一般に核酸化学の分野に関連したものである。

より特定的には、本発明は核酸ポリメラーゼの５′→３°　ヌクレアーゼ活性を 利用して、標識されたオリゴヌクレオチドとターゲットであるオリゴヌクレオ、 チド配列か構成する雑種形成二重鎖より標識されたオリゴヌクレオチドを分解し 検出可能な標識断片を得ようとするものである。

診断用の検定法として微生物学的技術による試験法が通常行なわれている。例と して米国特許第４．３５８゜５３５号では病因菌を検出する方法として以下の方 法を開示している；サンプル（血液、細胞、唾液など）をフィルターにトロセル ロースフィルターなど）上にスポットし、細胞をとかし、化学的に変性し加熱し てＤＮＡを固定する。次に標識したＤＮＡプローブを加え固定したサンプルＤＮ Ａとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたことにより病因菌のＤＮＡが存在 していたことを示す。この場合のサンプルＤＮＡはフィルター上の細胞あるいは 生体を培養することによって増幅することも可能である。

ＤＮＡ増幅法の際だった改良法としてポリメラーゼチェーン反応法（ＰＣＲ）が 米国特許第４．６８３．２０２号、４，６８３，１９５号、４，８００．１５９ 号、４，９６５．１８８号に開示されている。これらのうち最も単純化された形 式としては、ＰＣＲはターゲットＤＮＡの注目する領域をはさんで互いの鎖にハ イブリダイズするような二つのオリゴヌクレオチドブライマーを用いて特定のＤ ＮＡシーケンスを酵素によりｉｎ　ｖＨｒｏで生成する方法である。鋳型ＤＮＡ の変性、プライマーのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるアニールしたプ ライマーの伸張反応を含む一連の反応を繰り返すことによりプライマーの５゛端 を特徴とする特定の断片が指数的に増幅され蓄積される。ＰＣＲ法は特定のＤＮ Ａシーケンスを選択的に１０”のファクターで生成することが可能である。ＰＣ Ｒ法は５ａｉｋｉ　らにより１９８５年の５ｃｉｅｎｃｅ　２３０巻１３５０ペ ージにも示されている。

検出法は通常、ハイブリダイゼーション検定において標識されたプローブと増幅 されたＤＮＡを用いて標準的なＰＣＲ法によって行なわれる。すなわちＥＰ出版 第２３７．３６２号及びＰＣＴ出版第８９／１１５４８号に開示されているよう にＰＣＲて増幅したＤＮＡをフィルターに固定し、特定のオリゴヌクレオチドプ ローブをそれに加えてハイブリダイズさせる。プローブは３２Ｐ１ビオチン、西 洋ワサビ（ＨＲＰ）などて標識しハイブリダイゼーションが検出てきるようにし ておくのが望ましい。この逆の方法も呈示されていて、すなわちプローブをかわ りにメンブレンフィルター上に固定し次にＰＣＲ増幅したＤＮＡを加えるという ものである。

他の検出方法として断片長の多様性を利用するもので（ＰＣＲ−ＦＬＰ）　、ア レーレ特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（Ａ　Ｓ　Ｏ）を用いてハイブリダ イズを行なう方法や（Ｓａｉｌ＜ｉ　ら１９８６年Ｎａｔｕｒｅ３２４巻１６３ ページ）、クローン化されたＤＮＡのかわりに増幅したＤＮＡを使ってグイデオ キシ法により直接シーケンスする方法がある。標準的なＰＣＲ法により二つのプ ライマーではさまれたＤＮＡシーケンスを複製し、それぞれのプライマーの５′ 端を特徴とする特定の長さのＤＮＡシーケンスの反応産物をつくる。従ってプラ イマー間に挿入あるいは欠失があると異なった長さの産物シーケンスが生成され ることになりこれはＰＣＲ−ＦＬＰ産物のサイズ決定を行なうことにより検出さ れる。ＡＳＯハイブリダイゼーションを例に取ると、増幅されたＤＮＡはドツト プロットと呼ばれる方法でナイロンフィルター上に固定され（紫外線照射などで ）、ＨＲＰで標識されたオリゴヌクレオチドプローブと厳しい条件の下でハイブ リダイズされる。未反応プローブ洗浄後、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）と 過酸化水素が加えられる：ＨＲＰは過酸化水素によるＴＭＢの酸化による可溶性 の青色の色素の沈着を触媒し、その結果プローブかハイブリダイズしていること が確認される。

ＰＣＲ法は実際に実施されているように核酸シーケンスを増幅させる非常に強力 な方法であるが、増幅を受けた材料の検出には、ターゲットとなるＤＮＡか実際 に存在するかの決定にはＰＣＲ産物に対するさらに別の操作あるいは取り扱いか 要求される。増幅された材料の検出に要求される操作のステップ数はなるべく少 ないほうか望ましい。”均質”検定システムは、ターゲットのシーケンスか増幅 中にシグナルか得られ従って増幅後の操作数を最小とするような理想的なシステ ムの−っである。

本発明は検体中のターゲットとなる核酸シーケンスの検出を行なう操作法を呈示 しており、この操作法は以下から構成されている、 （ａ）−重鎖核酸からなるサンプルがターゲットとなる核酸の領域に対する相補 的なシーケンスを有する一つのオリゴヌクレオチドと、第一のオリゴヌクレオチ ドで決められる核酸シーケンスは含まないで同じターゲットの核酸の別の領域に 相補的なシーケンスを有する標識されたオリゴヌクレオチドと接触し、ハイブリ ダイゼーションが起こる条件でターゲットの核酸と第一のオリゴヌクレオチドと 標識されたオリゴヌクレオチドが第一のオリゴヌクレオチドの３′端が標識され たオリゴヌクレオチドの５′端に近接してアニールした二重鎖を生成し；（ｂ） ステップ（ａ）のミクスチャと鋳型依存性の５゛−３′　ヌクレアーゼ活性を有 する核酸ポリメラーゼとを、ポリメラーゼの５′→３′　ヌクレアーゼ活性が働 いてアニールされた標識オリゴヌクレオチドか切断され標識された断片が遊離さ れるような条件を保ち：（Ｃ）遊離された標識断片を検出しあるいは測定する。

本方法は特にＰＣＲ法によって増幅された核酸の解析に適している。本方法の既 知のＰＣＲ検出法を改良したものであってターゲットの増幅と検出のため標識物 の遊離を増幅産物に対し更に多くの取り扱いステップを要求せずひとつの反応系 で実現している。従って、本発明の他の具現化したものとして、ＰＣＲ法を現行 の与えられたサンプル中の核酸シーケンスの増幅と検出法にも用いている。これ は以下のステップがらなっている；（ａ）サンプルと少なくとも一つのターゲッ トの核酸に相補的なシーケンスをふくむ標識されたオリゴヌクレオチドを含むＰ ＣＲ検定系が与えられ、ここで標識されたオリゴヌクレオチドはステップ（ｂ） のオリゴヌクレオチドブライマーで決められる核酸シーケンスのターゲット領域 内にアニールし； （ｂ）１セツトのプライマー、すなわち第一のプライマーはターゲットの核酸シ ーケンスの一方の鎖に相補的なシーケンスを有しＤＮＡ相補鎖の合成の開始を行 ない、第二のプライマーはターゲットの核酸シーケンスのもう一方の鎖に相補的 なシーケンスを有しＤＮＡ相補鎖の合成の開始を行なうようなプライマーのセッ トを与え、ここでそれぞれのオリゴヌクレオチドブライマーは同じ核酸鎖にアニ ールした標識オリゴヌクレオチドより上流の相補的な鋳型績にアニールするよう に選ばれていて；（Ｃ）ターゲットとなる核酸ソーケンスを５′→３゛　ヌクレ アーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを鋳型鎖依存性のポリメラーゼとして（ｉ ）プライマーと標識オリゴヌクレオチドをターゲット領域内の鋳型核酸シーケン スにアニールさせ、（ｉｉ）プライマーの伸張を行なうＰＣＲサイクリングステ ップを行なって増幅させ、ここて核酸ポリメラーゼはプライマー伸張物を合成し なから同時に核酸ポリメラーゼの５゛→３°　ヌクレアーゼ活性か標識オリゴヌ クレオチドとその相補的な核酸鎖から構成される了ニールされた二重鎖より標識 された断片を遊離させることによって標識断片が検出可能となり：（ｄ）遊離さ れた標識断片を検出あるいは測定することによって、検体中にターゲットのシー ケンスが存在するか否かを決める方法である。

図１はＤＥＡＥセルロース薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）のオートラジオグラ フでプローブの切断により遊離された標識断片を示している。

図２はＤＥＡＥセルロース薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）のオートラジオグラ フで標識プローブの熱安定性を示している。

図３Ａと３８はＤＥＡＥセルロース薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）のオートラ ジオグラフで遊離される標識プローブ断片の量かＰＣＲサイクル数と反応開始時 の鋳型ＤＮＡの濃度に相関していることを示している。

図４はＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼの５’　−３’　ヌクレアーゼ活性がポリマ ー化反応に依存していないことをプローブの上流０−２０塩基にアニールする一 連のプライマーを用いてオートラジオグラフで示したものである。

図５は標識プローブ断片の遊離をインキュベーション温度と時間を増加させたと きの様子をオートラジオグラフで示したもので、プローブの５゛端はＧＣリッチ な構成となっている。

図６は標識プローブ断片の遊離をインキュベーション温度と時間を増加させたと きの様子をオートラジオグラフて示したものて、プローブの５′端はＡＴグリッ チ構成となっている。

図７は５％アクリルアミドゲルによる電気泳動で１４２塩基対のＨＩＶの産物を 解析したもので、標識プローブの存在、非存在下て増幅を行なっている。

図８はＰＣＲ増輻産物のＴＬＣ解析の二つのオートラジオグラフをまとめたもの で、反応開始時の鋳型ＤＮＡの量とサーモサイクリング数を増やすにしたがって 放射性標識物の遊離が見られその量も増加していくことが示されている。

図９はＮＨ３活性を存するビオチンのエステル誘導体がオリゴヌクレオチドプロ ーブの３′アミノ基に付加される反応を図示している。

図１０はビオチンヒドラザイドを使って３′端にリボヌクレオタイドを持つオリ ゴヌクレオチドプローブに標識する反応を図示している。

図１１はビオチンフォスフオラミダイトを使ってオリゴヌクレオチドプローブを ビオチン標識する方法を図示している。

図１２はビオチンですりゴヌクレオチドブローブを標識するための試薬を示して いる。

図１３はオリゴヌクレオチドプローブをローダミン−Ｘ−５９０とクリスタルバ イオレットで標識する方法を示している。

図１４はクリスタルバイオレットにアシルアザイド活性を生じさせる反応を図示 している。

図１５はオリゴヌクレオチドプローブに標識物を結合させるためのサイミジンに アミンを付加する反応を図示している。

図１６は拳法てＢａｋｅｒｂｏｎｄ　Ｔ　ＭのＰＥＩ固相抽出物を使用したとき の、得られるシグナルと与えたターゲット数の結果とその相関について典型的な 例を示したものである。

ここで使われている”検体”とは核酸を含むあるいは含むと考えられる全てのも ので、個体から由来する組織あるいは液性物てたとえば皮膚、血漿、血清、を髄 液、リンパ液、関節液、尿、涙、血液細胞、臓器、腫瘍組織あるいはインビトロ の細胞培養物（培養培地中で育った細胞に由来するコンディションドメディウム 、組換体細胞、細胞構成物などを含む）なとであるが、これらに限定されるもの ではない。

ここで使われている”核酸”、”ポリヌクレオタイド”あるいは”オリゴヌクレ オチド”はプライマー、プローブ、検出の対象となるオリゴマー断片、対照とし てのオリゴマーおよびブロッキングのための未標識オリゴマーおよびポリデオキ シヌクレオタイド（２−デオキシ−Ｄ−リポースを含む）、ポリリポヌクレオタ イド（Ｄ−リボースを含む）の一群て、プリンあるいはピリミジン塩基のＮ−グ ルコシド形である任意のタイプのポリヌクレオタイト、あるいはプリン、ピリミ ジン塩基の修飾形なども含まれる。”核酸”、”ポリヌクレオタイド”あるいは ”オリゴヌクレオチド”には長さの区別は考えてなく、これらの用語は相互に交 換可能である。これらの単語は分子の一次構造について述べているだけである。

従って、これらの単語には二本鎖及び−重鎖ＤＮＡが含まれていて、同様に二本 鎖及び−重鎖ＲＮＡも含まれている。オリゴヌクレオチドは最低約６塩基のシー ケンスから構成されるが、より望ましくは最低１０−１２塩基からなっていて、 さらに必要とされる核酸シーケンスの領域の最低１５−２０塩基に一致する塩基 から構成されることが望ましい。”一致した”とは指定したシーケンスに対して 同一あるいは相補的であることを示す。

オリゴヌクレオチドは実在するものあるいは自然界にあるシーケンスに由来する 必要はなく、化学的合成、ＤＮＡ複製、逆転写あるいはこれらの組み合わせなど 任意の方法で作りえる。′オリゴヌクレオチド”あるいは”核酸”とは遺伝子Ｄ ＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成物あるいは、（１）自然物に関係したポリヌク レオタイドの一部あるいは全部とは関係していないものを起源とするもの、ある いは（２）自然物に関係している部分以外のポリヌクレオタイドに関係したもの を起源とするもの、あるいは（３）自然界には全く存在しないものを起源とする ものからの合成物を指している。

モノヌクレオタイドは、一つのモノヌクレオタイドの５炭糖環の５′端のリン酸 基がフオスフォダイエステル結合を介して隣の３′端酸素に一方向性を保って結 合しオリゴヌクレオチドを形成するので、オリゴヌクレオチドの端部のうちその ５′　リン酸基がモノヌクレオタイドの３′端の酸素と結合していない部分を５ ゛端”と呼び、３゛酸素かモノヌクレオタイドの５炭糖環の５′　リン酸基と結 合していない部分を”３′端”と呼ぶ。同様にして、より大きいオリゴヌクレオ チド内の核酸シーケンスにおいても５′端、３′端を持つと言うことができる。

二つの異なった、重なり合いのないオリゴヌクレオチドが同一の相補的な核酸シ ーケンスに異なった領域でアニールするとき、一方のオリゴヌクレオチドの３゛ 端が他方の５°端に向かっているような配置の時、前者を”上流”のオリゴヌク レオチド、後者を“下流”のオリゴヌクレオチドと呼ぶ。

”プライマー”とは一種以上のプライマーを指し、制限酵素消化なとて自然に得 られるようなものあるいは合成により得られるオリゴヌクレオチドで、核酸鎖に 相補的なプライマー伸張産物の合成が触媒されるような条件の下におかれたとき に、合成の開始点として働くことのできるものである。ここでの条件とは、４種 の異なった基質のデオキシリポヌクレオシド３リン酸、ＤＮＡポリメラーゼある いは逆転写酵素なとのポリマー化を行なうもの、適切なバッファーじバッファー ”には補助因子、ｐＨ、イオン強度などに作用するものを含んでいる）および適 切な温度か含まれている。プライマーは増幅を最大の高率で達成するためには一 本鎖であることが望ましい。

ここで使われている核酸シーケンスに相補的であるとは、オリゴヌクレオチドが 核酸シーケンスと一方の５′端がもう一方の３′端と”アンチパラレル”な様式 で配向している状態を示す。通常自然物の核酸中には認められないある種の塩基 即ちイノシンやアシアザグアニンなども本発明の核酸に含めるとする。完璧な相 補性は要求されず、安定な二本鎖複合体にはミスマツチの塩基対あるいはマツチ しない塩基対が含まれていてもよい。核酸技術における熟練者は二本鎖複合体の 安定性をいくつかの変数すなわちオリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチ ドのシーケンスとその構成する塩基、イオン強度、ミスマツチの塩基対の割合な どから経験的に判断できる。

核酸の二本鎖複合体の安定性はメルティング温度あるいは”Ｔｍ”を測定して行 なうことができる。Ｔｍはある特定の条件化である核酸かその塩基対の半分か解 離しているときの温度である。

ここで使われている”ターゲットシーケンス”あるいは”ターゲット核酸ソーケ ンス”とは、増幅あるいは検出の対象となるオリゴヌクレオチドの領域を指して いる。

ターゲットシーケンスは増幅反応に使われる２つのブライマーシーケンスに挟ま れている。

ここで使われている”プローブとは標識されたオリゴヌクレオチドで、ターゲッ ト領域内のシーケンスとプローブ内の少なくとも一つのシーケンスの相補性によ って、ターゲット核酸シーケンスと二本鎖複合体を形成するものを指す。プロー ブにはＰＣＲ反応開始に使われるシーケンス配列に相補的なシーケンスは含まな いことが望ましい。普通、プローブの３′端はプローブはプライマー伸張物中に 取り込まれることを防ぐために”ブロック化”されている。”ブロッキングは非 相補的な塩基配列を用いて行なわれたり、ビオチンあるいはリン酸基などの化学 分子を末端塩基の３゛水酸基に付加して行なわれるか、使われる分子にもよるが 引き続く検出のための標識あるいは標識された核酸の捕獲という二重の目的に働 きつる。ブロッキングはまた３′水酸基を取り除いたり、３°水酸基を持たない ダイデオキシヌクレオタイドを使用することによっても行なわれる。

ここで使われる”標識”とは検出可能な信号を与えるような（定量可能であるよ うなものか望ましいカリ任意の原子あるいは分子で、核酸あるいは蛋白に結合て きるようなものである。標識物とは蛍光、放射活性、比色法、質量分析法、Ｘ線 散乱あるいは吸収、磁性、酵素活性その他で検出可能な信号を与えるものである 。

ここで定義されている”５′→３′　ヌクレアーゼ活性”あるいは”５゛から３ °方向性のヌクレアーゼ活性”とは鋳型特異的な核酸ポリメラーゼか持つ活性で 、いくつかのＤＮＡポリメラーゼに存在することか従来より知られていたオリゴ ヌクレオチドの５′端より核酸を逐次的に除去していく５′→３′エキソヌクレ アーゼ活性（すなわち大腸菌Ｅ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼはこの活性を持 つかクレノー断片はこの活性を持たない）と、５′端より一箇所以上の場所で切 断する活性をもつ５′→３′エンドヌクレアーゼ活性のどちらかあるいは両方を 指すものである。

ここで使われている”隣接した”とは鋳型核酸の相補鎖上でプライマーとプロー ブとの位置関係について述べたものである。プライマーとプローブとは検出操作 がポリマー反応には依存しないように、１−２０塩基、より望ましくは１−１０ 塩基、あるいは直接互いに隣接しているような状態にあることが望ましい。ある いは本発明かＰＣＲ増幅法と検出法に使われているように、ポリマー反応と依存 するような場合、”隣接性“とは増幅されるシーケンス内の任意の部分、あるい はプライマー伸張産物により位置が決められるポリメラーゼによるブローブの切 断かおこる場所、すなわちプライマーの下流の任意の場所を指している。

ここで使われている”耐熱性核酸ポリメラーゼとは、大腸菌由来のポリメラーゼ に比べ比較的熱に対して安定な酵素を指し、ヌクレオシド３リン酸のポリマー反 応を触媒する酵素を指す。一般にこの酵素はターゲットの核酸シーケンスにアニ ールしたプライマーの３′端より反応を開始させ、鋳型に沿って５′方向に反応 を進行させ、もし５゛→３′　ヌクレアーゼ活性を有する場合介在するアニール したプローブを水解し、合成反応か終了するまで標識あるいは未標識のプローブ の遊離を行なう。

Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｅｕｓ（Ｔ　ａ　ｑ　）から精製された代表的な 耐熱性酵素については米国特許第４，８８９，８１８号に開示されており、通常 のＰＣＲ法での本酵素の使用法については５ａｉｋｉ　らの１９８８年５ＣＩｅ ｎＣｅ　２７２３９巻４８７ページに述へられている。

Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ合成に依存した鎖置換５’　−３’　エキ ソヌクレアーゼ活性を育している（Ｇｅｌｆａｎｄ著、”Ｔａｑ　ＤＮＡ　Ｐｏ ｌｙｍｅｒａｓｅ″Ｅｒ１ｉｃｈ編ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒ１ｎｃｉ ｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡＡｍｐｌｉｆｉ ｃａｔｉｏｎ　５ｔｏｃｋｔｏｎ出版社ニューヨーク１９８９年第２章を参照） 。溶液中では、わずかだが標識オリゴヌクレオチドの分解か認められる。

本発明の施行に当たっては、勿論他の技術も必要だか、従来の分子生物の技術、 微生物、組換ＤＮＡの技術か用いられるか、これらは技術界は確立されている。

これら技術については放置に良く記載されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｆｒ１ｔｓｃｈ　＆　Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｉ ｇ；Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、　２版１９８９年、Ｏｌｉｇｏｎ ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ、　Ｊ、　Ｇａ１ｔ編、１９８４ 年）　、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ、Ｄ、Ｈａ ｍｅｓ　＆　Ｓ、Ｊ、Ｈｉｇｇｉｎｓ編１９８４年、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　 Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ　 。

１９８４年）およびＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅ ｍｉｃＰｒｅｓｓ　）の一連のシリーズを読まれたい。本書類の前出あるいは後 出する全ての特許、特許出願、出版物は参考文献として編入されている。

本発明の種々の特長は核酸ポリメラーゼの特殊な性質；−よるものである。核酸 ポリメラーゼは種々の活性を持ちうるちので、そのうちでも５′→３゛　ヌクレ アーゼ活性により核酸ポリメラーゼは大きい相補的なポリヌクレオタイトにアニ ールしているオリゴヌクレオチドからモノヌクレオタイドあるいは小さいオリゴ ヌクレオチドを切り出す。切り出しが効率的に起こるためには、上流のオリゴヌ クレオチドも同じ大きいポリヌクレオタイドにアニールしていることが必要であ る。

この上流に位置するオリゴヌクレオチドの３′端は核酸ポリメラーゼに最初に結 合するサイトを与えている。

結合したポリメラーゼか下流に位置するオリゴヌクレオチドの５°端に遭遇する と、ポリメラーゼはモノヌクレオタイトあるいは小さいオリゴヌクレオチドをそ こから切り出す。

この二つのオリゴヌクレオチドは相補的なターゲット核酸上で近接してアニール し、上流のオリゴヌクレオチドの３′端に結合した核酸ポリメラーゼが下流のオ リゴヌクレオチドの５゛端に自動的に接するように設定することか出きる。この 反応は核酸ポリメラーゼが切り出しを行なえる位置に達するためにポリマー反応 を必要としないため、”ポリマー反応非依存性切り出し“と呼ぶ。

一方、二つのオリゴヌクレオチドがターゲットの核酸上でもっと離れてアニール した場合、核酸ポリメラーゼが下流のオリゴヌクレオチドの５゛端に到達する前 にポリマー反応か起こらなければならない。ポリマー反応の進行に伴って、ポリ メラーゼは下流のオリゴヌクレオチドの５゛端よりモノヌクレオタイトあるいは 小さいオリゴヌクレオチドを切り出していく。、二の切り出し反応は下流のオリ ゴヌクレオチドの残りの部分が不安定となって鋳型分子より解離するまで続く。

この反応を”ポリマー反応依存性切り出し”と呼ぶ。

本発明では、標識は下流のオリゴヌクレオチドに対して行なわれている。従って 、ポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性により切り出されたモノヌクレオ タイドあるいは小さいオリゴヌクレオチドはその検出が可能である。

従って、切り出された断片と切り出されなかった標識オリゴヌクレオチドを区別 するための戦略か行なわれる。

このようにして、本発明は上流と下流のオリゴヌクレオチドに相補的なシーケン スを含む核酸サンプルの同定を行なうものである。

本発明ではＰＣＲ法にポリメラーゼの５゛→３゛　ヌクレアーゼ活性を組み合わ せている。この点か先に記載されているＰＣＲ増幅法でＰＣＲ増幅後のターゲッ トオリゴヌクレオチドをプローブとハイブリダイズさせ、ターゲラ１〜ソーケン スと厳しいあるいは中低層の厳しさの条件の下でハイブリダイズおよび洗浄を行 なって安定な二本鎖複合体を形成させて検出を行なう方法と異なっている。これ らの既知のＰＣＲ増幅後に検出を行なう方法と比較して、本発明ではターゲット 核酸の増幅反応中に検出を行なうことを可能としている。本発明では標識したオ リゴヌクレオチドをＰＣＲ開始時にプライマーと共に加え、プローブからの標識 ヌクレオチドの氷解物からシグナルより、増幅反応中のターゲットシーケンスの 検出を行なえる方法を呈示している。

しかしながら、本発明は他の増幅反応系すなわちターゲットシーケンスのＲＮＡ コピーを作り出すためのブローモータ一部をコードするＰＣＲプライマーを使っ ておこなわれる転写増幅系などにも適用可能である。同様にして本発明は、一定 の温度下で種々の酵素を用いてＲＮＡ転写産物を作り次にＤＮＡコピーを作り出 す５ｅｌｆ−ｓｕｓｔａｎｅｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ複製系（３ＳＲ）にも適用で きる。ポリメラーゼ５′−３°エキソヌクレアーゼ活性をライゲースチェーン反 応系（ＬＣＲ）に組み込み、適当なオリゴヌクレオチドを使うことにより本発明 をＬＣＲ産物の検出に適用することも可能である。

勿論本発明は増幅反応を含まない系にも適用することか出来る。実際、本発明は ポリマー反応を必要としない。

ポリマー反応依存性反応の利点はターゲットシーケンスの増幅を必要としない点 にある。プライマー伸張か行なわれていない状態ではターゲットの核酸は本質的 には一本鎖の状態である。プライマーと標識されたオリゴヌクレオチドが近接し てターゲットの核酸に結合しているとき、オリゴヌクレオチドのアニーリングと 標識断片の切り出しが連続して行なわれる。従って十分な量の標識断片が生成さ れ、ポリマー反応なしで検出が可能となる。

技術界の熟練者には理解されると思うが、ＰＣＲ増幅中につくりだされるシグナ ルはこのポリマー反応非依存性活性により増大するだろう。

ここに記載されているいずれの方法を取るにせよ、関心とされる特定のオリゴヌ クレオチドのシーケンスすなわち”ターゲットの核酸“を含むと思われる試料が 与えられる。試料中のターゲット核酸は、もし必要ならまず逆転写されてｃＤＮ Ａとし、次に適当な変性方法、すなわち技術界て良く知られている物理的、化学 的、酵素的な方法で変性される。鎖を分離する物理的な望ましい方法は核酸を加 熱して完全に（９９％以上）変性させる方法である。典型的な熱変性法は温度が ８０°Ｃから１０５°Ｃで時間は数秒から数分加熱して行なう。変性の代わりに 一本鎖ＲＮＡあるいはＤＮＡウィルスなどのように試料中のターゲット核酸が一 本鎖の形で存在している場合もある。

変性された核酸は次に予め選んであったオリゴヌクレオチドプライマーと標識オ リゴヌクレオチド（”プローブとも呼ぶ）と、プライマーとプローブが一本鎖核 酸鎖に結合するようなハイブリダイモーションの条件下でインキュベートする。

良く知られているように、プライマーの二本鎖複合体上の相対的位置関係が、一 方のプライマーから伸張産物が合成され、その伸張産物が鋳型績（相補鎖）より 離れ、それか他のプライマーよりの伸張産物の鋳型となって、一定の長さの複製 チェーンをおこすようにプライマーは選ばれている。

相補鎖の方はプローブあるいはプライマーより長いので、一定の時間内で相補鎖 の方が多くの点で接触し互いに遭遇する機会も多い。プローブとプライマーのモ ル数を非常に過剰にすることによって、鋳型績同志の再アニーリングよりあるい はプローブとのアニーリングを起こるようにしている。

プライマーはポリマー反応を起こす物質の存在の下で伸張産物の合成が起こるた めの十分な長さを持っている必要がある。実際要求される長さとプライマーの構 成は、アニーリング反応の温度、プライマーの由来構成、プライマーのアニール する場所とプローブのアニーリングする場所との近接の程度、プライマーとプロ ーブの濃度比なと多くの要因に左右される。例えばターゲットシーケンスの複雑 性にもよるか、オリゴヌクレオチドブライマーは１５−３０塩基長の長さである ことか普通で、一方プライマーの塩基長はそれより長い場合も短い場合もある。

プライマーはその対象となる相補鎖に選択的にアニールして安定な二本鎖複合体 を形成するために十分相補性を持っていることが必要である。

ここで使用されているプライマーはそれぞれ特定のシーケンスか増幅されるよう に各々の鎖に対して本質的には相補的となるようにしである。プライマーは鋳型 績のシーケンスを忠実に反映している必要はないが、それぞれのプライマーに対 応した鎖に選択的にハイブリダイズするように十分相補性を保っていることが必 要である。

鋳型績と安定な二本鎖複合体を形成できる程度の相補性が保たれる範囲であれば 、非相補的な塩基あるいは余分なシーケンスをプライマー中に挿入したりプライ マ一端部に加えることも可能である。プライマーの非相補的な塩基配列中には制 限酵素の認識部位を含ませることも可能である。

本発明の実施にあたってはまず標識オリゴヌクレオチドプローブと相補核酸のア ニールを行ない、次いで核酸ポリメラーゼかこの二本鎖複合体の領域に遭遇し、 ５′→３′　ヌクレアーゼ活性により標識オリゴヌクレオチド断片の切り出しと 遊離を行なう。

プライマー伸張産物かこの二本鎖複合体に到達する前あるいはポリマー反応依存 的過程においてポリメラーゼか上流のオリゴヌクレオチドに結合する前に標識オ リゴヌクレオチドかそれに対する相補鎖核酸にアニールしやすくなるために種々 の技巧か用いられうる。ポリマー反応依存的過程においてはプローブの５′端が プライマーの３′端と十分能れるように配置することによってプライマー伸張産 物によるプローブの結合サイトの阻害が起こる前にプローブか十分アニールでき る時間が生じる。

短いプライマーは普通ターゲットの核酸と十分安定な複合体を形成するのに低い 温度を必要とする。従って標識オリゴヌクレオチドはプライマーとのアニーリン グに比較してより高い温度でターゲットとアニールするようにプライマーより長 くなるように設定する。

また異なった熱安定性のプライマーと標識オリゴヌクレオチドを使用することも 可能である。例えば、標識オリゴヌクレオチドの塩基構成をＧ／Ｃ含量か大きく なるように選ぶと熱安定性はプライマーより高くなる。同様にして、自然界に存 在する核酸より安定な塩基対を形成する塩基の同族体を含む修飾ヌクレオチドを プローブ中に取り込ませることも可能である。

本検定法においてプライマーの結合に先立ってプローブの結合の効率を最大限に するためのプローブの修飾にはプローブ内にプラスの荷電あるいは中性のフォス フォダイエステル結合を取り入れてプローブとターゲットの多荷のマイナス荷電 による反発力を軽減させる効果もある（　Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、■９８８年Ｊ 、Ａｍｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　１１０巻４４７０ページ参照）；プローブ中 に５ブロモウリジンのようなアルキル化あるいはハロゲン化した塩基を取り込ま せると塩基のスタッキングが増加し；プローブ中にリボヌクレオチドを取り込ま せるとプローブとターゲットの複合体をＡ型に移行させ塩基のスタッキングか増 加し；プローブ中のアデノシンのいくつかあるいは全てを２，６−ダイアミノブ リン（アミノアデノシン）に置き換える。本発明でこのようにプローブの修飾を 行なうに当たって、二本鎖複合体形成において律速段階となるのは”ヌクレーシ ョン”すなわち一本鎖部の形成であり、従ってプローブ生物物理的性質を変えて 十分満足の行く結果をなるのは３′端あるいは５′端の部分のみである。

更に、プローブの３゛端部（３′端の８−１２ヌクレオチド）はポリメラーゼに よる５゛端部のエキソヌクレアーゼによる分解に続いて解離するので、３゛端の 修飾はポリメラーゼ／ヌクレアーゼの干渉を考慮に入れる必要がなく行なえる。

熱サイクリングのパラメータも標識オリゴヌクレオチドとプライマーの熱安定性 の違いを利用して変えることかてきる。たとえば熱サイクル中の変性ステップに 続いて標識オリゴヌクレオチドは結合するかプライマーは結合しないような中間 の温度を導入し、続いて温度を下げてプライマーのアニーリングと伸張がおこる ようにさせる。適切な結果を得るためにはプローブの切り出しはＰＣＲ反応の後 の方のサイクルでのみ行なわれるべきである。このようにして最初はプライマー か優位にプローブに結合するか、プライマー伸張反応を通してプライマー濃度か 減少し、サイクルの後半ではプローブが優位にプライマーに結合するように反応 混合液を設定することかできる。

プライマーより前に標識オリゴヌクレオチドを結合させるためにプライマー濃度 に比ベモル数の過剰な標識オリゴヌクレオチドを使うことも可能である。実際こ の方法を行なうには、プライマー濃度の２−２０倍以上の標識オリゴヌクレオチ ド濃度にし、これは普通０．５−５ｘ　１０−７Ｍである。オリゴヌクレオチド の濃度、長さ、塩基構成は反応液中のオリゴヌクレオチドのＴｍに関係する重要 な要因であることは良く知られている。これらの要因を操作してプローブのアニ ーリングがプライマーのアニーリングに勝るように熱力学的なバイアスをかける ことも可能である。

オリゴヌクレオチドとプライマーは適当な方法により調達できる。特定のシーケ ンス配列のオリゴヌクレオチドを調達するには、よく知られているように適当な 配列からのクローニングおよび制限酵素による方法と直接化学的に合成する方法 などがある。化学合成法には、Ｎａｒａｎｇらによる１９７９年Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６８巻９０ページに記載されているフォスフオ ドライエステル法、Ｂｒｏｗｎらによる１９７９年Ｍｅｔｈｄｏｓ　ｉｎｅｎｚ ｙｍｏｌｏｇｙ　６８巻１０９ページ記載のフォスフすダイエステル法、Ｂｅａ ｕｃａｇｅらによる１９８１年Ｔｅ　ｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｅｒｓ２２巻１ ８５９ページ記載のジエチルフオスフオラミグイト法、米国特許第４，４５８， ０６６号記載の固相支持体法なとかある。

標識オリゴヌクレオチドの塩基構成はヌクレアーゼ活性による鎖の除去（オリゴ ヌクレオチド全体をカバーするモノヌクレオタイドあるいはダイヌクレオタイド の断片）を促進するためにＧＣに富む塩基配列にしたりＡあるいはＴか連続しな いようにしたりプローブ中の標識の位置を適切な場所を設定したりする。相補性 プローブの５′の領域にＡＴに富むシーケンスかあると、切断はそれより４．５ あるいは６塩基後ろで起こる。−吉相補性プローブの５′の領域にＧＣに富むシ ーケンスかあると、切断はそれより１あるいは２塩基後ろで起こる。これとは別 に、標識プローブを化学合成する際に修飾フォスフォダイエステル（フォスフォ ロチオエートあるいはメチルフオスフォネートなと）を取り込ませることにより （Ｎｏｂｌｅら、１９８４年Ｎｕｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ　１２巻３３８７−３４ ０３ページ：　［ｙｅｒら、１９９０年Ｊ、　Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ。

１１２巻＋２５３−１２５４ページ）特定の位置の切断を阻止することができる 。プローブ長、相補性プローブの５°の領域の塩基構成、プローブ中の標識の位 置にもよるか、本発明の標識プローブ断片の長さは短くあるいは長くなるように プローブを設定することか可能である。

以下に示すようにオリゴヌクレオチドの標識は分光学的、光化学的、生化学的、 免疫化学的、あるいは化学的な方法で検出できる分子をとりこませて行なわれる 。標識物をオリゴヌクレオチドプローブに結合させる方法は、用いられる標識物 の種類とプローブ中の標識物の位置に依存している。

本発明て使用するのに適当なプローブの種類としては、プローブにそれらを取り 込ませる方法と同様に技術界では良く知られているが、酵素（アルカリフォスフ ァターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなど）、酵素基質、放射活性原子、蛍光 色素、発色基、化学発光標識物、Ｏｒｉｇｅｎ”　（Ｉｇｅｎ社）などの電気化 学発光標識物、特定の結合相手を持つリガンド、あるいは互いに作用してシグナ ルを増強したり、変えたりまたは減弱させる標識物などがあるがこれだけに制限 されるものではない。勿論、ＰＣＲがサーマルサイクラ−の装置で実行されるな ら、標識物はこの自動化反応に要求される温度サイクリングの開環れずに持ちこ たえる必要がある。

放射性原子のなかでは、２１ｐが望ましい。３１ｐを核酸中に取り込ませる方法 は技術界で良く知られているが、例えば、リン酸化酵素による５゛端標識やニッ クトランスレーション法によりランダムに取り込ませる方法などかある。酵素は その活性を検出することか普通である。

”特定の相手に結合するもの”とはりガント分子に高い特異性で結合する蛋白を 指し、例えば抗原とそれに特異的なモノクロナール抗体がそれにあたる。他の” 特定の相手に結合するもの２には、ビオチンとアビジンあるいはストレプトアビ ジン、ＩｇＧとプロティンＡ、多くのレセプターとそのリガンドなどか知られて いる。先に述べたことは種々の標識物を特定のクラスに分類しようとするもので はなく、というのは同じ標識物を種々の異なった様式でっかうことができるから である。例えば、１１１は放射性標識物として使うことも高電子密度の物質とし でっかうこともできる。ＨＲＰも酵素あるいはそれに対するモノクローナル抗体 の抗原としでっかうことができる。さらに種々の標識物を組み合わせて望んだ効 果を得ることもできる。例えば、ビオチン標識したプローブを使いこのプローブ の存在をｌ２ａ１標識したアビジンで検出し、一方ＨＲＰ標識した抗ビオチンモ ノクローナル抗体で検出することもできる。他の組み合わせ及び可能性は技術に 習熟している人には容易に明らかであるし、簡単な発明の範囲では同等なものと 考えられる。

本発明で標識したプローブを作るのに際し標識物として使用する蛍光物質には、 ローダミンおよびその誘導体であるテキサスレッドなど、フルオレセインおよび その誘導体である５−ブロモメチルフルオレセイン、ルシフ工−ルイエロー、Ｉ 　Ａ　Ｅ　Ｄ　Ａ　Ｎ　Ｓ　、７　Ｍ　ｅ　２　Ｎ−クマリン−４−酢酸、７　 ０８　４ＣＨ３’）マ’）ン　３−酢酸、７−　Ｎ　Ｈ２４−ＣＨ３−クマリン −３＝酢酸（ＡＭＣＡ）　、モノブロモビマネ、カスケードブルーのようなビレ ントリサルフォネート、およびモノブロモトリメチルーアンモニオビマネなどが ある。一般に蛍光基質としては、モノクロモメーターの代わりにフィルターと共 にフルオロメータを使って検出効率があげられるように広いストークスシフトを もつものが望ましい。

またある場合は、ひとつのオリゴヌクレオチドに対して二種類の相互作用する標 識物を、オリゴヌクレオチド上で二つの標識物かある間隔を保つように標識して オリゴヌクレオチドの氷解において標識物が分離するようにして使うこともでき る。

本発明のその他の具現化として、水解された標識プローブの検出をたとえば蛍光 偏光法すなわち大きい分子と小さい分子をその分子振動により区別することも可 能である。大きい分子は（すなわち元のままの標識プローブ）溶液中で小さい分 子に比べよりゆっくり振動していることに基ずく。蛍光分子が対象となる分子（ すなわち標識プローブの５゛端）に結合すると、この蛍光分子は分子振動により 測定（および区別も）が可能となり、もとのままのプローブと消化されたプロー ブを区別することができる。測定はＰＣＲ反応中に直接行なうこともできるし、 ＰＣＲ終了後に行なうこともできる。

また別の具現化として、二本鎖核酸ターゲットのそれぞれの鎖の離れた領域に相 補的で互いには相補的でなく、オリゴヌクレオチドかそれぞれのプライマーの下 流にアニールするような二つの標識オリゴヌクレオチドを使うほうほうかある。

例えば、二種類のプローブか存在すれば一種類のプローブを使って得られるシグ ナルの二倍の強度か得られうろこと、さらにＰＣＲ増幅中にしばしば見られる産 物同志の再アニーリングを低下させうる。プローブはプライマーか結合するすぐ 下流に結合するように設定する。

本発明では多種のプローブを使用することにより別の利点も得られる。たとえば 反応液中に多種類のプローブを加えておくのみで任意の数の病原菌の検査を行な うことか出きる：この際プローブは検出が容易なように異なった標識をしておく のかよい。

また対立遺伝子（アレーレ）特異的あるいは種特異的（すなわちＬｙｍｅ病の原 因菌と考えられるＢｏｒｒｅｌｉａの異なった種）な識別も多種のプローブ使用 で可能で、すなわち異なったＴｍのプローブを使用し一組のプローブ／アレー− 二本鎖複合体にのみ特異的な温度下でアニーリング／切り出しを行なう。例えば 、ＨＴＬＶＩとＨＴＬＶ■両方を増幅するプライマーとＨＴＬＶＩ、ＨＴＬＶＩ ［それぞれに特異的な二つのプローブを使用する。またアレーレ特異的な識別は プローブは一種のみ用いて切断物の種類を調へることによって行なえる。本発明 のこの具現化においては、プローブは最低５゛端の領域で一方のアレーレに完全 に相補的に一致して、他のアレーレとは−ｉしないように設定する。他のアレー レについては、プローブは５′端領域でミスマツチングとなるようにし、完全に 相補的なアレーレにハイブリダイズしたときに切り出されてくう断片と異なった 断片か切り出されるようにする。

プローブのシーケンスを選ぶことは非常に有益であるか、プローブの標識法をえ らぶことも同様に有益な結果をもたらす。標識物は種々の方法によって直接ある いは間接にオリゴヌクレオチドに結合される。使われる標識物のＮ類によって、 標識はプローブの５°端あるいは３′端、プローブの内部、あるいはシグナルの 相互作用を容易にするような種々の大きさ構造を持ったスペーサーアームを介し て結合している。市販されている）オスフオラミダイト試薬を使うと保護された フォスフォラミダイトを介して５′端あるいは３′端に官能基（チオールあるい は一組アミン）を持つオリゴマーを合成することができ、それへの標識のプロト コルはＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎ ｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｉｎｎｉｓら編アカデミツクプレス、１９９０年 ）などに記載されている。

オリゴヌクレオチドに官能基を与える試薬を用いてオリゴヌクレオチドプローブ 、とくにその５°端に一つ以上のスルフヒドリル基、アミノ基、水酸基を取り込 ませる方法は米国特許第４，９１４，２１０号に記載されている。５゛　リン酸 はポリヌクレオタイドキナーゼとガンマ−’２Ｐ−ＡＴＰを使って放射性アイソ トープとして取り込ませることかできる。ビオチンも、ビオチン−Ｎハイドロキ シサクシニマイドエステルを用いて、アミノサイミジン残基、あるいは６−アミ ノヘキシル残基と作用させて５°端に取り込ませることかできる。３°端への標 識はポリヌクレオタイドターミナルトランスフェラーゼを使って必要な分子たと えばコルディセビン３５３　ｄＡＴＰやビオチン化ｄＵＴＰを取り込ませること かできる。

オリゴヌクレオチドの誘導体も標識物として利用できる。例えば、エテノ−ｄＡ あるいはエテノ−Ａは蛍光性のアデニン塩基でオリゴヌクレオチドに取り込ませ ることができる。同様に、エテノ−ｄＣあるいは２−アミノ−デオキシリボシド はプローブ合成に使われる別の誘導体である。このような塩基誘導体を含むプロ ーブが、ＰＣＲ反応でプライマー伸張を行なっているＤＮＡポリメラーゼの５′ →３′　ヌクレアーゼ活性により水解されると非常に蛍光の強いモノヌクレオタ イドを遊離する。

オリゴヌクレオチドブライマーの鋳型依存性伸張反応は適量の塩、金属イオン、 ｐＨ緩衝系の反応液中に適当量の４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄ ＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）が存在するときポリマー化をおこなう 物質によって触媒される。ポリマー化をおこなうのに適しているのは酵素で、プ ライマー及び鋳型依存性ＤＮＡ合成を行ない５′→３′　ヌクレアーゼ活性も持 っている。知られているＤＮＡポリメラーゼには例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラ ーゼ［、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）のＤＮＡポリメ ラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポ リメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　１ｉｔｏｒａｌｉｓのＤＮＡポリメラ ーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｃｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）のＤＮＡポリメラーゼ などがある。これらポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を触媒する条件はよく知 られている。本発明が有効におこなわれるためには、ポリマー反応を行なう物質 がオリゴヌクレオチドを切り出し標識断片を遊離して直接あるいは間接にシグナ ルが作り出されなければならない。

合成による産物は鋳型鎖とプライマー伸張産物からなる二本鎖分子で、これには ターゲットの塩基配列が含まれている。合成反応による副次的産物は標識された オリゴヌクレオチド断片でモノヌクレオタイド、ダイヌクレオタイドあるいはそ れより長いヌクレオタイドの混合物である。変性、標識オリゴヌクレオチドとプ ライマーのアニーリング、プライマー伸張と標識オリゴヌクレオチドの切断の一 連のサイクルを繰り返すことにより、プライマーによって定まるターゲットの領 域の部分が指数的に蓄積し、標識断片も指数的に産生される。十分なサイクル数 行なうことによりバックグランドより数オーダー高い検出可能な標識物を得られ るが、通常の方法ではこのように高いシグナル／ノイズ比は得られない、望まし い方法では、ＰＣＲ反応は熱安定性酵素を使った自動化された反応て行なわれる 。この反応では反応液は変性のステップ、プローブとプライマーをアニールさせ るステップ、およびプライマー依存性の鋳型伸張反応と同時に切断と解離が起き ている合成のステップを繰り返されるｏ　Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕ ｓ社から市販されている機械のような耐熱性酵素を使うために特別に設計された ＤＮＡサーマルサイクラ−を用いてこの反応か行なわれる。

この自動化反応では熱安定性のポリメラーゼが望ましい、というのはＰＣＲサイ クリング中で二本鎖伸張産物を変性させるのに好ましい方法は高温（９５°Ｃ程 度）にさらすことだからである。米国特許第４，８８９，８１８号にＴｈｅｒｍ ｕｓ　ａｑｕａｔｉｃ’ｓより分離された代表的な熱安定性酵素について開示さ れている。その他の代表的な耐熱性ポリメラーゼは、すなわち以下の耐熱性バク テリアＴｈｅｒｍｕｓ　ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒ ｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ ｐｈｉｌｕｓ　（これはほかのものよりは至適温度がやや低めである）、Ｔｈｅ ｒｍｕｓ　１ａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏ ｇａ　ｍａｒｉｔｉｎａ。

Ｔｈｅｍｏｃｏｃｃｕｓ　１ｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ 　ｆｅｒｖｉｄｕｓより抽出されたものである。

標識オリゴヌクレオチド断片の検出あるいは検証は種種の方法によって行なわれ るが、標識物の種類あるいは標識の方法に左右される。本発明の具現化の簡便な 方法は反応産物を、切断された標識断片も含めてその大きさを解析することであ る。標識核酸断片の大きさを知る方法は良く知られていて、たとえばゲル電気泳 動法、密度勾配による沈降、ゲルエクスクル−ジョンクロマトグラフ法、ホモク ロマトグラフ法なとかある。

増幅反応中あるいは反応後、ＰＣＲ反応液により標識断片の分離は、たとえばＰ ＣＲ反応液を固相抽出物（ＳＰＥ）と接触させることによって行なわれる。例え ば、オリゴヌクレオチドの大きさあるいは荷電によって結合することのできるあ るいはオリゴヌクレオチド塩基と相互作用できるような材料をＰＣＲ反応液に、 未切断標識断片は結合し短い標識断片は結合しない様な条件下で加える。この種 のＰＳＥの材料にはイオン交換樹脂あるいはビーズ、すなわち市販されているも のとして、Ｎｅｎ５ｏｒｂ（デウボン社）　、　Ｎｕｃｌｅｏｇｅｎ（Ｔｈｅ　 Ｎｅ５ｔグループ）、ＰＥＩ、Ｂａｋｅｒ　Ｂｏｎｄ　ＴＭ　ＰＥ１．アミコン ＰＡＥ　１．０００゜５ｅｌｅｃｔａａｃｅｌ　ＴＭ　ＰＥＩ　ホウ素化したＳ ＰＥに３′　リボースプローブを結合したもの、プローブの３′端に相補的な塩 基配列を含んだＳＰＥ、ハイドロキシアパタイトなどがある。具現化の特殊な例 として、二重標識されたオリゴヌクレオチドの３′　ビオチン標識を５°標識か ら区別するのにヌクレアーゼに対する感受性のサイトをシグナルとして利用する 場合、ＰＣＲ反応液を、アビジン、ストレプトアビジンあるいはビオチンにたい するモノクローナル抗体のような特定の結合する相手を含んだ材料と反応させる 。このような材料には、特定の結合する相手を表面にコーティングしたビーズあ るいは粒子があげられ、磁性体粒子の利用も可能である。

ＰＣＲ反応液をＳＰＥと接触させた後、ＳＰＥの材料は濾過、沈降、あるいは磁 力によって取り除かれ未切断の標識オリゴヌクレオチドを含まない標識断片か遊 離され検出か行なえる。

本発明の方法で使用される試薬は診断キットとしてパッケージすることか可能で ある。診断キットには標識オリゴヌクレオチドとプライマーが別々の容器に納め らでいる。オリゴヌクレオチドが未標識の場合、特定の標識用の試薬をキットに 組み込んでも良い。またキットには増幅反応に必要な緩衝液、ｄＮＴＰおよびポ リマー反応をおこなうもの、検出を行なうのに必要な酵素、固相抽出物などの試 薬あるいは材料を検定を行なうための説明書と共に加えても良い。

以下に示す例示は本発明の種々の方法および組み合わせを説明しようとするもの である。

例１ ＰＣＲによる標識プローブの遊離 目的の産物が合成されたときに相補的なプローブの２２Ｐて標識された５′端が 遊離されるＰＣＲ増幅反応。

Ａ、ガンマ”Ｐ−ＡＴＰとポリヌクレオタイドキナーゼを用いたプローブの標識 各１０ｐｍｏｌのプローブ（ＢＷ３　Ｌ　ＢＷ３３、ＢＷ５５、塩基配列は後述 ）をそれぞれ１５ユニツトのＴ４ポリヌクレオタイトキナーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、１５．３ｐｍｏｌのガン？”Ｐ−ＡＴＰ（Ｎｅｗ 　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　３０００キユ一リ／ｎｍｏｌ）を５０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，１０ｍＭＭ　ｇ　ＣＩ　！　、　５　ｍＭ ジチオスレイトール、０．１ｍＭスペルミジン、０．ＩｍＭ　ＥＤＴＡを含む５ ０μｌの反応液と混合し３７°Ｃて６０分反応させる。次にＳａｍｂｒｏｏｋら 編のＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ第二版（１９８９年）に記述されてい るように、全量をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿する。前述 のＳａｍｂｒｏｏｋら編に記載されていが、プローブは１００μｌのＴＥバッフ ァに再溶解しセファデクスＧ−５０スピンカラムにかけ取り込まれなかったガン マ”Ｐ−ＡＴＰを取り除く。

反応物のＴＣＡ沈殿は以下のような比活性を示していた。

ＢＷ３５：　１．７７　ｘ　１０６　ｅｐｍ／ｐｒｎｏｌＢ、増幅 増幅を行なった領域はバクテリオファージＭ１３ｍｐ１０ｗ由来のプライマーＢ Ｗ３６、ＢＷ４２ではさまれる３５０塩基対の部分である。ここに示す数字をつ けた各プライマーの塩基配列は標準として使われているＭ１３塩基塩基−従って いる。

三種類の異なったプローブが使用され、各プライマーはＭ１３ｍｐｌＯＷに対し 丁度３０塩基相補的な配列を持っているか５′端領域の非相補的な部分は長さか 異なるようになっている。プローブはＴａｑポリメラーゼによる伸張を防ぐため に３°かＯＨ基でなく３°かＰＯ，基となるように化学合成されている。

５ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・４　ＢＷ３３＝　５°５５４１−５５１２３゜５−”ｇａ ＣＣｓＯ′０ＣＧＣＯＴｋＡＣＣＡＣＣコ％ＣＡＣＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣｉα 、３゜ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５　ＢＷ３５　＝　５°５５４１−５５１２３゜５ ’−”ｃｇｔｃａｃｃｇａ＋Ｃ０ＣＴＯＣＧＱｌｉＴＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣ ＣＧＣＣＯＣＧα−３Ｘ　３’　リン酸基をしめず ａ、ｔ＋　ｇ＋　Ｃ＋　鋳型績に非相補性であることをしめす。

＊ガンマ３２Ｐ−ＡＴＰ標識 ３５０塩基対の断片の増幅を行なうために、１０−’ｐｍｏｌのターゲットのＭ ｌ　３ｍｐ　１０ｗシーケンスを、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃ１１ｐＨ８，３，３ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｊ’　２、ｌ　Ｏｐｍｏ　Ｉの各プラ イマーＢＷ３６とＢＷ４２．２００μＭの各デオキシリポヌクレオシド三リン酸 、■、２５ユニットのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼとＩＳ　１０．２０　ｐｍｏ 　１いずれかの等アイソトープ量となるように希釈したプローブＢＷ３１、ＢＷ ３３、ＢＷ３５を含む５０μｌの反応液に加える。放射性標識物の量は一反応当 たり０．４ｐｍｏｌ一定になるようにし非放射性のプローブＬＩＯ１あるいは２ ０Ｐｍｏｌで希釈する。Ｔａｑポリメラーゼ１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ ８，０１５０ｍＭ　ＫＣＩ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ４０．０．５ ％Ｔｗｅｅｎ２０．５００μｇ／−ゼラチンで０．３１２５ユニツト／μｌに希 釈したものを一反応当たり４μ！加える。

マスターとなる反応液中は適当な量の反応バッファ、ヌクレオシド三リン酸、− 組のプライマー、および酵素を加える。このマスターの反応液を等分し、鋳型と 種々の濃度のプローブを加える。対照とする反応は全ての反応成分のうち鋳型と プローブを除外したちの以外から構成されている。各反応液は蒸発しないように ５ｏＪ、Ｌｌのミネラルオイルが上にのせられ、４５秒遠心後、サーマルサイク ラ−に設置される。反応液は次の増幅反応を行なわれる。

ｌ５サイクル　９６℃　変性　１分 ６０°Ｃアニール／伸張　１．５分 ｌサイクル　９６°Ｃ変性　１分 ６０°Ｃアニール／伸張　５．５分 サイクル終了後、ミネラルオイルは５０μｌのクロロフォルムで抽出され、４° Ｃに保存され、つぎのテストか施行される。

Ｃ９解析 アクリラミドゲルによる解析のために、増幅反応産物の４μｌを３μｌの５×ゲ ルローデイング液（０，１２５％ブロモフェノールブルー、１２．５％フィコー ル４００水溶液）と混ぜ、４％アクリラミドゲル（ＩＯＸＴＢＥ／＜ッファ１Ｏ ｒｎｌ、１０％過硫酸アンモニウムＩｎ／、４９％ビスアクリラミド１９：１　 １０ｍ１，５０μＡのＴＥＭＥＤ、水７９−）にのせ、Ｉ　ＸＴＢＥバッファ（ ０，０８９Ｍ　Ｔｒｉｓｌ　０．０８９Ｍホウ酸、２ｍＭ　ＥＤＴＡ）中で２０ ０ボルト９０分間電気泳動を行なう。エチジウムブロマイド染色後、ＤＮＡをＵ Ｖ蛍光で可視化する。

増幅される産物の量には影響を与えないことがわかった。

プローブを含まないサンプルをのせたレーンには目的の塩基配列に相当する３５ ０塩基長の明瞭な強度の強いバンドが認められる。プローブを含む全てのレーン には幾らか分子量の大きいいくつかの微弱なバンドと共におなじバンドが認めら れる。鋳型を加えていない対照のバンドでは、３０−４０ベースにプライマーを しめず弱いバンドを認めるのみで、３５０ベース付近にはまったくバンドか認め られない。

写真撮影の後、ゲルをワットマン口紙上に移し、サランラップで覆ってオートラ ジオグラフを行なった。−晩の露出により、９０−９５％の放射性標識物がプロ ーブあるいは部分的に分解したプローブがそこまで流れていることを示すゲルの 底にあった。

変性ゲルによる解析のため、増幅反応産物の各２μｌをフォルマミドローディン グバッファ（０，５Ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，００，２ｍｔ’、ブロモフェノール ブルーｌＯ■、キシレンシアツールｌＯ■、フォルマミド１Ｏ−）２μｌに加え 、９６°Ｃ３−５分加熱し、氷上で冷却する。サンプルを６．２％の変性勾配ポ リアクリルアミドゲル（ショ糖とバッファの勾配を設けた７Ｍの尿素による）に 前述のＳａｍｂｒｏｏｋら編に記載されている方法に従ってローディングする。

ゲルの電気泳動を２０００Ｖ、−４５Ｗで９０分行ない、ワットマン口紙に移し 、オートラジオグラフィを行なう。

変性ゲルの結果、各プローブの約５０％がサイズの小さい標識断片に分解されて いた。カウントの約５０−６０％は３０−４０塩基長の位置にあり、未分解のプ ローブに相当している。全ての増幅反応で極めて微弱なバンドか３００塩基長の 位置に認められ、プローブのうち非常に少ない割合のものは３’　ＰＯ，か失わ れたかあるいは元々なく、伸張反応か進んでしまったことを示している。残りの カウントは０−１５塩基長の位置にあった。

この種のゲルの解像力は産物の真の大きさを反映しているわけてはないので、ホ モクロマトグラフィによる解析を行なうほうか良い。

ホモクロマトグラフィの解析のため、各サンプルのｌμｌを１．２ｃｍ間隔て、 予め５μｌのシェアをくわえたニシン精子ＤＮＡ（１５０Ｍｇ／ｍｔ’）をスポ ットし乾燥させておいた２０Ｘ２０ｃＭのポリグラムＣＥＬ３００ＤＥＡＥセル ロース薄層プレート上にスポットする。サンプルが乾いた後、プレートを蒸留水 で満たした水槽に置き、丁度サンプルをのせたすぐ上まで水を昇らせる。

プレートを次に濾過した７Ｍの尿素を含むＲＮＡの部分分解物の水溶液Ｈｏｍｏ −ｍ１ｘＩ［［（Ｊａｙら、１９７９年Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、１巻（３） 、３３１−３５３ページ）の入ったガラスの展開層に置き、７０°Ｃのオーブン 内に置く。毛細管現象によりＨｏｍｏ−ｍ１ｘがプレートの上まで昇った後、プ レートを取り出し、乾燥させサランラップでおおってオートラジオグラフィを行 なう。

ホモクロマトグラフィプレートの一晩の露光の結果、約４０％のプローブか分解 されて小さい断片となっていた。これら断片は各プローブの５′非相補的なテー ルによってそれぞれ特長的な大きさを示していた。図１がＴＬＣプレートのオー トラジオグラフィを示している。プローブＢＷ３１（レーン１−３）はＭｌ　３ ｍｐ　１０ｗの鋳型に完全に相補的で生成された標識断片は主に１−２塩基長で ある。プローブＢＷ３３（レーン４−６）は３塩基の５゛非相補的領域を持って いて、主に４−６塩基長の産物を遊離している。プローブＢＷ３５（レーン７− ９）は１０塩基の５′非相補的領域を持っていて、主に１２−１３塩基長の産物 を遊離している。レーン１０−１２は各ＢＷ３１．ＢＷ３３、ＢＷ３５と鋳型を 除いたＰＣＲ成分による対照反応をｌ５サイクル行なった後のものである。ＤＮ Ａ合成の間に、酵素は最初に遭遇したｌ−２塩基対をはずしてそこで切断してい るが、エンドヌクレアーゼに類似の活性であることを示している。

ここの結果はＰＣＲ反応における産物の蓄積に相関した特異的なプローブの放出 を示している。

例２ 標識プローブの遊離の特異性 標識プローブの遊離の特異性に関して、バクテリオファージラムダとプライマー と非相補的なリン酸化を行なったプローブのシリーズを用いてＰＣＲ反応を行な って調へた。増幅する領域はＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＤＮＡ増幅試薬キット（Ｐｅｒ ｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）のバクテリオファージＤＮＡの５００塩基長 の領域で、やはりＧｅｎｅ　Ａｍｐ　ＤＮＡ増幅試薬キットにふくまれているプ ライマーＰＣＲＯ１とＰＣＲＯ２ではさんで増幅した。

５ＥＱｆＤＮＯ：６　ＰＧｔＯＩ　、５°フ１３１−７１５５３’５°−ＧＡＴ ＧＡσｒｒｃａｒｃ’ｒｃｃσＴＡＣＡＡＣｒＧＧ−３’５ＥＱＩＤＮｏニア　 ＰＣＲＯ２−５’７６３ｏ−７６０６３’；５°−ＧＧＴＩｏＡＴＣＧＡＡＡＴ ＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＯＣＣ−３゜例１に示されている３種の標識プローブＢＷ ３１．ＢＷ３３、ＢＷ３５の等分量を使用したか、これらプローブはすべて鋳型 績とは完全に非相補である。

５００塩基対長の領域の増幅のために、０．５ｎｇのターゲットのラムダＤＮＡ シーケンス（コントロール用テンプレート、ロット番号３２６９．１μｇ／ｍｌ 、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩＳｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡで１：１０に希 釈、１０ｍＭ　ＮａＣｌ！で保存）を５０ｍＭ　ＫＣｌ１，１０ｍＭ　Ｔｒ　１ ｓ−ＨＣｆ１ｐＨ８，３，３ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　ｔ、ｌμＭの各プライマー ＰＣＲＯＩ　（ロット番号３３５５）とＰＣＲＯ２（口・ソト番号３２６８）、 ２００μＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、１．２５ユニツトのＴａｑ 　ＤＮＡポリメラーゼと２．１０．２０ｐｍｏｌいずれかの等アイソトープ量と なるように希釈したプローブＢＷ３１．ＢＷ３３、ＢＷ３５を含む５０μｌの反 応液に加える。放射性標識物の量は一反応当たり０．４ｐｍｏｌ一定になるよう にし非放射性のプローブ１，１０、あるいは２０ｐｍｏ　１で希釈する。Ｔａｑ ポリメラーゼはｌＯｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｆ、ｐＨ８，０，５０ｍＭ　ＫＣｌ、０ 、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．　５％ＮＰ４０．０．５％Ｔｗｅｅｎ２０．５００ μｇ／−ゼラチンで０．３１２５ユニツト／μｌに希釈したものを一反応当たり ４μ！加える。マスターとする反応液は前述したように、プローブを入れないも のあるいは酵素を入れない対照反応液と共に作成する。反応液は例１Ｂに示され たサイクリング条件に従って増幅を行ない以下の解析を行なう。アクリラミドゲ ル解析のため、増幅反応産物の各４μｌを３μｌの５×ゲルローテイング液と混 ぜ、４％アクリラミドゲルにのせ、ＩＸＴＢＥバッファ中で２００ボルト９０分 間電気泳動を行なう。エチジウムブロマイド染色後、ＤＮＡをＵＶ蛍光で可視化 する。

その結果、いずれのプローブの種々の濃度も増幅される産物の量には影響を与え ないことがわかった。プローブを含まないサンプルをのせたレーン、およびプロ ーブを含む全てのレーンには目的の塩基配列に相当する５００塩基長の明瞭な強 度の強いバンドが認められる。酵素を加えていない対照のレーンでは産物に相当 するバンドは認めないが、３０−４０塩基長にプライマーをプローブをしめず弱 いバンドを認める。

図２に示すのはプレートを一晩露光したホモクロマトグラフィ解析の結果で、プ ローブの分解が起こっていないことを示している。カウントの全ては原点に位置 しており、標識断片の遊離が起こっていないことを示している。レーン１−３は プローブＢＷ３１を含む反応、レーン４−６はプローブＢＷ３３、レーン７−９ はプローブＢＷ３５を含む反応で、レーン１０−１２は鋳型績を含まない対照反 応である。この結果はプローブか特異ａｔ＋こ鋳型績に結合しない限り分解され ないことを示しており、またＰＣＲサイクリングの条件に耐えてし）ることも示 している。

変性ゲルによる解析のため、増幅反応産物の各２μｌをフォルマミドローデイン グノ＜・ソファ（例１に記述）２μｌに加え、ヒートブロックで９６℃３−５分 加熱する。

すぐに氷上で冷却し、サンプルを６．２％の変性勾配ポリアクリルアミドゲルに ローディングし、ゲルの電気泳動を２０００Ｖ、９０分行ない、ワ・ソトマンロ 紙（こ移し、サランラップでおおいオートラジオグラフィを行なう。

−晩の露光の結果、カウントの全ては３０−４０塩基長の位置にあり、未分解の プローブに相当してし）た。また、明らかなプローブの分解を認められず、プロ ーブ（よ鋳型績に特異的に結合して始めて分解を受けるとし）う事実をさらに確 証するものである。

例３ 遺伝子ＤＮＡ存在下での標識プローブの遊離の特異性本例では標識プローブの遊 離の特異性を分解あるシ）（よ未分解のヒト遺伝子ＤＮＡの存在の下でＰＣＲ増 幅反応を行なって調へてみた。

本例で使用したリン酸化を行なったプローブＢＷ３３の比活性はリン酸化反応後 のＴＣＡ沈殿により５．２８Ｘ　１０　”　ｃ　ｐｍ／ｐｍｏ　１であった。増 幅を行なう領域はＭｌ　３ｍｐ　１０ｗの３５０塩基対長の部分で、プライマー ＢＷ３６、ＢＷ４２てはさんで行なわれる。プライマーの塩基配列および位置は 例１に示しである。ヒト遺伝子ＤＮＡは細胞株ＨＬ６０のものを使い、未分解あ るいはフレンチプレスで約８００塩基対長に分解して使用している。

各５０μｌの増幅反応液は、１０−”あるいは１０−’ｐｍｏ　Ｉのターゲット シーケンスＭｌ　３ｍｐ　１０ｗ、１μｇの分解あるいは未分解のＨＬ６０遺伝 子ＤＮＡ、５０ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８゜３．３ｍ Ｍ　ＭｇＣｌ２．１０ｐｍｏｌの各プライマーＢＷ３６とＢＷ４２．２００μＭ の各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、１．２５ユニツトのＴａｑ　ＤＮＡポ リメラーゼと１０　ｐｍｏ　１の等アイソトープ量となるように希釈したプロー ブＢＷ３３から構成されている。

マスターとなる反応液には適当量の反応バッファ、ヌクレオシド三リン酸、プラ イマー、プローブ、酵素が含まれている。等分にわけたものにＭｌ　３ｍｐ　Ｉ 　Ｏｗ鋳梨及び／あるいは遺伝子ＤＮＡを加える。対照用の反応液にはＭｌ　３ ｍｐ　Ｉ　０ｗ鋳型のみ取り除いた他の反応液成分あるいは遺伝子ＤＮＡのみ取 り除いた他の反応液成分を用いる。

各反応液に５０μｌのミネラルオイルを加え、遠心し、サーマルサイクラに設置 する。反応液は次の増幅反応を行なわれる。

１０１１５、あるいは２０サイクル ９６°Ｃ変性　１分 ６０°Ｃアニール／伸張　１．５分 最終サイクル　９６°Ｃ変性　１分 ６０°Ｃアニール／伸張　５，５分 サイクル終了後、ミネラルオイルは５０μｌのクロロフォルムで抽出され、４° Ｃに保存される。サンプルはつぎに４％アクリラミドゲル電気泳動およびホモク ロマトグラフィによる解析が行なわれる。

アククラミドゲルによる解析のために、増幅反応産物の４μ！を３μｌの５×ゲ ルローデイング液と混ぜ、４％アクリラミドゲルにのせ、ＩＸＴＢＥバッファ中 で２２０ボルト９０分間電気泳動を行なう。エチジウムブロマイド染色後、ＤＮ ＡをＵＶ蛍光で可視化する。

Ｍｌ　３ｍｐ　ｌ　０ｗ鋳型を含まない対照サンプルに相当するレーンでは、産 物のバンドが見えず、Ｍｌ　３ｍｐ　１０Ｗ鋳型のクロスオーバのコンタミネー ションがないことを示している。続くレーン全てには期待されるシーケンスに相 当する３５０塩基のバンドが認められる。

１０−”ｐｍｏｌのＭ１３ｍｐｌＯｗ鋳型が存在するときのバンドの強度は、遺 伝子ＤＮＡ　（分解あるいは未分解）か存在する、しないに関わらす１０−’ｐ ｍｏｌのＭｌ　３ｍｐ　ｌ　０ｗ鋳型のばあいにくらべ強い。産物のバンドの強 度は増幅サイクル数か増えるに従って強くなる。

２０サイクルの増幅は１０サイクルの時にみられる強度の２倍の強度を与え、１ ５サイクルの増幅はその中間となっている。ＰＣＲ産物の量は開始時のターゲッ トの鋳型量とサイクル数によって変わり、１８ｇのヒト遺伝子ＤＮＡの存在は、 それか分解されているか分解されていないかに関わらず、全く影響を与えない。

ホモクロマトグラフィの解析のため、各サンプルのｌμｌをＤＥＡＥ薄層プ薄層 プレートポットしＨｏｍｏ−ｍ１ｘＩ［の入ったガラスの展開層に７０″Ｃて置 く。９０分後、プレートを取り出し、乾燥させ、サランラップでおおってオート ラジオグラフィを行なう。−晩露光後を図３に示す。図３Ａて、レーン１−６は Ｍｌ　３ｍｐ　１０ｗ鋳型が存在しない条件で変わりに分解あるいは未分解のＨ Ｌ６０ＤＮＡを１Ｏ１１５，２０サイクルＰＣＲ反応サイクル行なったものであ る；レーン７−１２はＭｌ　３ｍｐ　１０Ｗ鋳型が存在する条件でヒト遺伝子Ｄ ＮＡが存在しないとき１０．１５．２０サイクルＰＣＲ反応サイクル行なったも のを二つずつロードしたものである。図３Ｂで反応はｌＯプサイルから始めて５ サイクルづつ増加して行なっている。Ｍｌ　３ｍｐ　１０ｗ鋳型ＤＮＡの濃度レ ーンＩ、２．５．６．９、ＩＯでは１０−”ｐｍｏｌで、レーン３．４．７．８ ．１１，１２では１０−”ｐｍｏｌである。レーン１−１１のうち奇数番号は分 解されたヒト遺伝子ＤＮＡを含み、偶数番号は未分解のヒト遺伝子ＤＮＡを含ん でいる。標識プローブ断片は薄層プレート上で約４．５塩基長にあたる位置に移 動している二つのあきらかなスポットとして認められる。サイクル数の増加と同 様に開始時の鋳型の増加に相関して、遊離される標識プローブ断片の量も増加し ている。ヒト遺伝子ＤＮＡが存在するか否かは、それか分解されているか分解さ れていないかに関わらず、プローブのハイブリダイゼーションあるいは分解を阻 害したり増強するものではない。

この結果は、遊離されるプローブの小断片の量の増加はＰＣＲ検定法が行なわれ る間に特異的に蓄積される産物に相関し連立した現象であることを示している。

大量の高次構造を持つヒト遺伝子ＤＮＡあるいは大量のランダムなりＮＡの”末 端”が存在するかしないかは、特異的な産物の蓄積あるいはプローブの遊離の程 度には影響しない。最後に、大量の高次構造を持つヒト遺伝子ＤＮＡの存在は、 特異的な産物の蓄積がない状態で、検出できるようなプローブの遊離を引き起こ すものではない。

例４ ３′標識プローブを使用したＰＣＲ ３′端放射性標識したプローブが鋳型量にアニールするとより小断片になって遊 離させるためにＰＣＲ増幅反応を行なう。ここで使用したプローブの塩基配列は 次のとおりである、 ５ＥＱＤＮＯ：１１　ＤＧ４６−５’５５４１−５５１２−３’５−ＣＧＣＴＧ ＣＧＣＧＴＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣ−３’Ａ、３２Ｐコルデ イセビンとターミナルトランスフェラーゼを用いたプローブの標識 ５ｐｍｏｌの各プローブ（ＤＧ４６、ＢＷ３２、ＢＷ３４）をそれぞれ１７．４ ユニツトのターミナルトランスフェラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と１０　ｐ ｍｏ　Ｉの（α−３２Ｐ）コルディセビン（コルディセビン＝３°　−デオキシ アデノシン−５′三リン酸、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　５０ ００キユーリ／　ｍ　ｍ　ｏ　１　、ｄｄＡＴＰ［Ｐｈａｒｍａｃｉａｌで３倍 に希釈）を１００ｍＭポタシウム力コヂレート、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ Ｈ７，６，１ｍＭ塩化コバルト、０．２ｍＭジチオスレイトールを含む１７．５ μｌの反応液に加え３７°Ｃで６０分反応させる。全量をフェノール／クロロホ ルム抽出しエタノール沈殿を行なう。前述のＳａｍｂｒｏｏｋら編に記載されて いるＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇの方法に往行、プローブを５０μｌの ＴＥバッファに再溶解しセファデックスＧ−５０スピンカラムにかける。プロー ブの最終濃度はＯ１ｌｐｍｏｌ／μｌであった。反応物のＴＣＡ沈殿により以下 の比活性であった。

変性濃度勾配ゲルによる３′放射性標識プローブとＢＷ３１１ＢＷ３３、ＢＷ３ ５の５′　リン酸化を比較した結果、３°放射性標識プローブと５′　リン酸化 プローブは同じような流れかたをした。

再び、増幅を行なった領域はプライマーＢＷ３６、ＢＷ４２ではさんだＭｌ　３ ｍｐ　１０ｗの３５０塩基の部分である。プライマーの塩基配列およびその位置 は例１に示しである。各増幅反応液は、１０−’ｐｍｏｌのターゲットシーケン スＭｌ　３ｍｐ　１０ｗを、５０ｍＭ　ＫＣＡ’、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ 、ｐＨ８，３，３ｍＭＭ　ｇ　Ｃｌ　ｘ、１０Ｐｍｏｌの各プライマーＢＷ３６ とＢＷ４２．２００μＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ｌ、２５ユニ ツトのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼと２、ＩＯｌあるいは２０　ｐｍｏ　１等の アイソトープ量となるように希釈したプローブＤＧ４６、ＢＷ３２、ＢＷ３４か ら構成されている５０μｌの反応液にくわえて調整した。

マスターとなる反応液には適当量の反応バッファ、ヌクレオシド三リン酸、鋳型 ＤＮＡ１酵素が含まれている。

等分にわけたものに適量のプライマーとプローブを加える。対照用の反応液には プライマーのみ取り除いた他の反応液成分あるいはプローブのみ取り除いた他の 反応液成分を用いる。

各反応液に５０μｌのミネラルオイルを加え、遠心し、サーマルサイクラに設置 する。反応液は次の増幅反応を行なわれる。

１５サイクル　９６°Ｃ変性　１分 ６０°Ｃアニール／伸張　１．５分 最終サイクル　９６°Ｃ変性　１分 ６０°Ｃアニール／伸張　５．５分 サイクル終了後、ミネラルオイルは５０μｌのクロロフォルムで抽出され、４℃ に保存される。

サンプルはつぎに４％アクリラミドゲル電気泳動、８％変性濃度勾配アクリラミ ドゲル電気泳動およびホモクロマトグラフィによる解析が行なわれる。三通りの 解析において反応液の取り扱いは前述したとおりである。

４％アクリラミドゲルによる解析の結果、プライマーを含まない対照反応を除き 全ての反応液で、期待される産物に一致する３５０塩基の位置に明瞭なバンドが 認められた。プライマー、プローブを共に含む反応液では、約３００塩基の位置 に第二のバンドが認められた。この第二のバンドはプローブ濃度を上げるに従っ て、強度が増強したので、十分３°端が放射性標識を受けなかったか３′端放射 性標識がはずれてしまい、プローブからの伸張、合成が起こってしまったものを 反映していると思われる。

８％変性濃度勾配アクリラミドゲル電気泳動の一晩の露光の結果、泳動を行なっ た３種のプローブ全てで、産物の大きさはプローブ全長から１５塩基以下まで広 かつていることかわかった。予想されたように、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５ ′→３゛　ヌクレアーゼ活性かプローブを分解し、分解されたプローブか鋳型績 より解離してきた。

産物の大きさの分布か広いということは、ＰＣＲサイクリング反応中に反応物の 濃度か連続して変化していることと温度か変化していることを指し示している。

このような変化はプローブおよび酵素のアニーリングの動力学を変え、サイクリ ング反応中のいろいろな時期でプローブかいろいろな大きさで解離することにな るのであろう。

ホモクロマトグラフィのプレートの解析の結果、プローブすべてについて最小の 産物の大きさは１０−１２塩基長であった。３種のプローブは５′端のテール領 域を除いて同一の塩基配列を有しているので、この結果はこのようなプローブの 塩基配列で６０°Ｃでアニール／伸張を行なった場合、プローブは約ＩＯ塩基長 まて分解されその後鋳型績より解離されてくることを示している。

例５ Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼのポリマー反応非依存性５°→３′　ヌクレアーゼ 活性 Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼは、プローブか上流のプライマーに近接していると き、ハイブリダイズしているプローブの３２Ｐで標識された５′端の遊離をおこ なうことかできる。リン酸化されたプローブＢＷ３３の０−２０塩基上流に位置 するような一連のプライマーを設計した。これらのプライマーを以下に示す。

約０．５ｐｍｏｌのプローブＢＷ３３と０．５ｐｍ。

１のプライマーの一つを０．５ｐｍｏｌのＭ１３ｍｐｌＯｗに、１０．　５μｌ ｌの５０ｍＭ　ＫＣＩ、ｌｏｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ！、ｐＨ８，３，３ｍ　Ｍ　 Ｍ　ｇ　Ｃｌ　を反応液中でアニールさせる。対照の反応液には２０ＰＭあるい は２００μＭの４種類の各デオキシヌクレオシド三リン酸か含まれている。更に プローブから５３０塩基上流に位置するプライマーＤＧ４７を使う。

反応液は９８°Ｃで１分加熱したのち、６０°Ｃで３０分アニールを行なう。チ ューブを遠心後、７０°Ｃの温浴中に置いておく。反応液が平衡温度に達した後 、１０．５．２．５．１．２５．０．３１２５ユニツトのＴａｑ　ＤＮＡポリメ ラーゼを加え、２．５．１００分反応後それぞれより４μｌずつ反応液を回収す る。各アリコツトに４μｌのＥＤＴＡを加えて酵素を失活させ、４°Ｃに置いて おく。反応液は続いてホモクロマトグラフィによる解析を行なう。

ホモクロマトグラフィの解析のため、各サンプルのｌμｌをＤＥＡＥ薄層プレー ト上にスポットしＨｏｍｏ−ｍ１ｘｌ［の入ったガラスの展開層に７０°Ｃで置 （Ｈｏｍｏ−ｍ１ｘが各プレートの上まで到達したのち、プレートを取り出し、 乾燥させ、サランラップでおおってオートラジオグラフィを行なう。図４この実 験の結果を示す。

図４て、レーン１−３は放射性標識したオリゴヌクレオチドの分子サイズマーカ ーで６．８．９．１０，１１１２．１３塩基を示している。レーン４−１０はｄ ＮＴＰが存在しない条件においての、プライマーＢＷ３７、ＢＷ３８、ＢＷ３９ 、ＢＷ４０、ＢＷ４１ＳＢＷ４２、ＤＧ４７に対する反応を示したものである。

レーン１１−２４は２０℃Ｍあるいは２００μＭのｄＮＴＰ存在下での各プライ マーに対する対照の反応を示している。

ｄＮＴＰが存在しない条件において、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼは全てのプラ イマーで標識プローブの断片を生成していたが、プライマーとプローブの間隔か 広がるにつれて標識物の放出は低下していた。この効果は調べた酵素濃度全て（ ０，３１２５−１０ユニット／１反応）と反応時間すべてで認められた。遊離さ れて（る断片の大きさは、同等２−３塩基長であった：しかしながら主要な産物 の大きさは加えたプライマーに依存していた。デルタ０とデルタ２のプライマー から遊離される主要な産物の大きさは、デルタ１，５．１Ｏ１２０のプライマー からのそれより１塩基小さかった。このヌクレアーゼ活性はポリマー化反応には 依存していなく、距離に依存していた。

ヌクレオシド三リン酸が存在する場合、遊離される標識プローブ断片の大きさと 相対的な割合は全てのプライマーで同じであった。またｄＮＴＰが存在する場合 、産物の大きさも１−２塩基大きかった。このことは、酵素がポリマー反応を行 なっているとき、酵素はすてに″ランニングスタート”の状態にありハイブリダ イズしたプローブに遭遇するとただちに１−２塩基の解離を行ないそれから切断 をおこなうので、その分長い断片を産み出すものと思われる。

２０℃Ｍあるいは２００μＭのｄＮＴＰか存在するとき、遊離される産物の量に 検出量きるほとの差は認められず、またｄＮＴＰか存在するとき伸張反応時間あ るいは酵素濃度による明らかな差も認められなかった。

例６ ５′端のプローブの塩基配列に基ずく遊離される産物の性質について例示したも の プローブの５端相補的領域の塩基対形成力の強弱か遊離される産物の大きさにど のような影響かあるかを調べた。ＧＣあるいはＡＴに富む５°端の相補的領域を 含むような２種のプローブＢＷ５０、ＢＷ５１を設計した。

ＢＷ５０、ＢＷ５１は例５て使用した。プローブＢＷ３３を参照した。

５ＥＱＩＤＮＯ：　１８　ＢＷ５０−５’５５２１−５４９６３゜５’−ｕｃｃ ｃｃＡ工：０ＣＧＣ’ｒｒＡＡ負ｘ℃ＣαｘゴＡＣＡ−３’５ＥＱＩＤＮＯ：　 １９　ＢＷ５１＝５°５５１１−５４８１３゜Ｔｇａ’ｒ’ｒｋＡＴ＜にＧαｎ ｃＴＡｃＡＧαにα工１ＴＡＣｒ＾π℃、３゜ａ、ｔ、ｇ、ｃ、＝鋳型績に非相 補的な塩基ＢＷ５０．ＢＷ５１．ＢＷ３３はポリヌクレオタイドキナーゼを使っ て３２ＰＡＴＰで標識し以下の比活性を得た。

ＢＷ５０：　１．７０　ｘ　Ｄ　ｅｐｍ／ｐｍｏ１３種のプローブの最終濃度は ０．１０℃ｍｏｌ／μｌてあった。

約０．５ｐｍｏｌのプローブＢＷ５０、ＢＷ５１あるいはＢＷ３３と０．５ｐｍ ｏｌのブライｖ−ＢＷ４２を０．５ｐｍｏｌのＭｌ　３ｍｐ　１０ｗに、ＩＯ， ５μｆの５０ｍＭ　ＫＣＩ、ｌ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ８，３，３ｍＭ 　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２各２００μＭの４種のデオキシヌクレオシド三リン酸からな る反応液中でアニールさせる。対照の反応液には鋳型ＤＮＡを除いた全ての成分 か含まれている。アニーリングの反応のために、反応液は９８°Ｃて１分加熱し たのち、６０°Ｃで３０分アニールを行なう。チューブを遠心後、５０°Ｃ１６ ０℃、７０°Ｃの温浴中に置いておく。反応液か平衡温度に達した時、０、　３ １２５．：ＬニットのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを加え、■、２．５分反応の 後それぞれより４μｌずつ反応液を回収する。各アリコツトに４μｍのＥＤＴＡ を加えて酵素を失活させ、４℃に置いておく。反応液は続いてホモクロマトグラ フィによる解析を行なわれその結果は図５．６に示す。

図５はＧＣに富んだプローブＢＷ５０を含んだ反応である。レーン１−３はオリ ゴヌクレオチドの分子サイズマーカーで６．８．９、ｌ０１ｌｌ、１２．１３塩 基を示している。レーン４−６は伸張反応を５０℃で１．２．５分行なったもの である。レーン７−９は伸張反応を６０℃で１，２．５分行なったものである。

レーン１０−ｌ２は伸張反応を７０°Ｃで１．２．５分行なったものである。レ ーン１３−１５は鋳型ＤＮＡのみを除いた対照反応で７０″Ｃて１．２．５分行 なったものである。

図６はＡＴに富んだプローブＢＷ５１を含んだ反応である。図５と同様に、レー ン１−３はオリゴヌクレオチドの分子サイズマーカーて６．８．９．１０，１１ ．１２．１３塩基を示している。レーン４−６は伸張反応を５０°Ｃて１．２． ５分行なったものである。レーン７−９は伸張反応を６０“Ｃで１．２．５分行 なったものである。レーン１０−１２は伸張反応を７０°Ｃで１．２．５分行な ったものである。レーン１３−１５は鋳型ＤＮＡのみを除いた対照反応で７０℃ で１．２．５分行なったものである。

これらの結果から、標識プローブの温度と５′端の塩基構成に依存していること が示された。より安定であるＧＣに富んだプローブＢＷ５０では、５０°Ｃでは ほとんど標識物の放出が見られず（図５、レーン４−６）、６０°Ｃ（図５、レ ーン７−９）、７０°Ｃ（図５、レーン１Ｏ−１２）で増加してくる。遊離され る主要な産物の大きさは３−５塩基である。ＢＷ５１は５°端でＡＴに富むが、 ５０°Ｃでも（図６、レーン４−６）より高い温度と同様の標識物の遊離が見ら れた。更にＡＴに富んだプローブてはＧＣに富んだプローブより作られる産物の 大きさか大きかった。ＡＴに富んだプローブ構成はよりおおきい”プレッシング 能力をあげるようになり、従ってＧＣに富んだプローブに比べてプローブの解離 か切断より早く、低い温度で起きるようになるからであろう。

例７ ＨＩＶを捕捉する検定 以下はビオチンを含んだ二重標識プローブをＰＣＲに用いてターゲットシーケン スの検出を行なった一例である。ＨＩＶの遺伝子の一部のそれぞれの相補鎖であ る、２種のオリゴヌクレオチドＢＷ７３、ＢＷ７４をオリゴヌクレオチドの３゛ 端にビオチン分子を結合させて合成した。各オリゴヌクレオチドの５端には更に ポリヌクレオタイドキナーゼとガンマ−”Ｐ−ＡＴＰを使って３２Ｐで標識した 。２種のオリゴヌクレオチドｐＨ７、ｐＨ８もＨＩＶ遺伝子と相補的で、２種類 のオリゴヌクレオチドプローブに相同な領域をはさみ、ＰＣＲ反応用のプライマ ーとして働き、１４２塩基対の産物を作る。これらオリゴヌクレオチドの塩基配 列を以下に示す。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＱ：　２３　Ｆ’Ｈ８−ＴＯＣＴＡＴＯＴＣＡシーケンス中の ”Ｙ”はビオチンを示し、小文字は鋳型のＤＮＡに対し非相補的な塩基であるこ とを示す。

５０μｌのポリメラーゼチェーン反応液が、二重標識されたＢＷ７３あるいはＢ Ｗ７４をプローブとして２ｎＭ加えられて作成される。ＨＩＶか鋳型としてプラ スミドクローンの形で１反応当たり１０２あるいは１０’コピー数加えられ、プ ライマーオリゴヌクレオチドｐＨ７とｐＨ８がそれぞれ０．４μＭ加えられる。

Ｔａｑポリメラーゼか１反応当たり１．２５ＵとｄＮＴＰ２００μＭ加えられる 。各反応液に５０μ！のオイルかのせられ、軽く遠心して水溶液をチューブの底 に集め、９５°Ｃと６０°Ｃの間て、各温度で６０秒休止を入れなから、３０． ３５．４０サイクルの熱循環反応を行なう。熱循環反応終了後、５０μｌのクロ ロホルムで抽出し、水相を回収する。

各反応液は、３μＥを５％アクリラミド電気泳動ゲルにのせ、期待される１４２ 塩基対の産物を調べて増幅反応を解析する。また、各反応液のｌμｌをＤＥＡＥ セルロースプレートにのせＴＬＣホムクロマトグラフィで解析する。最後に、の こりの反応液を、ｌＯ■／−濃度に溶解した２５μｌのストレプトアビジンで標 識したＤＹＮＡＢＥＡＤＳ　Ｍ−２８０超常磁性ポリスチレンビーズと接触させ て解析を行なった。ビーズとの反応後混合液はコースタ−スピンＸ遠心フィルタ ーで濾過し、濾過物を回収し遊離された放射性標識物の存在を調べた。

図７は２種のゲルのイメージを示してあり、プローブの存在、非存在に関わらず 全ての反応に１４２塩基対長の産物が見られることが示され、またその量は反応 開始時のテンプレートが１０”から１０’コピーに増加するに従い、あるいは熱 サイクリングが３０，３５．４ｏへと続くに従って増加していることを示してい る。

図８は、ＰＣＲ反応のＴＬＣ解析の２つのオートラジオグラフィを組み合わせた もので、放射性標識物の遊離が起こっていて、かつその量は反応開始時のテンプ レートが増加するに従い、あるいは熱サイクリングが増えるに従って増加してい ることを示している。最初のＢＷ７３を使ったＰＣＲ反応のＴＬＣでは、レーン ｌと３に見られる放射性標識オリゴヌクレオチドかサイズスタンダードと比較し て２．３塩基長であることが示されている。

レーン４．５．６は開始時のテンプレートが１０’コピーのＰＣＲ反応で、レー ン７．８．９は開始時のテンプレートが１０”コピーのＰＣＲ反応である。レー ン４．７のサンプルは３０サイクル数の熱循環反応を行なったもの：レーン５． ８のサンプルは３５サイクル数の熱循環反応を行なったもの：レーン６．９のサ ンプルは４゜サイクル数の熱循環反応を行なったものである。２番目のＢＷ７４ を使ったＰＣＲ反応のＴＬＣでは、レーン１１２は放射性標識した２塩基、３塩 基（のサイズマーカー）、レーン４．５．６は開始時のテンプレートが１０’コ ピーでそれぞれ３０．３５．４ｏサイクルの熱循環反応を行なったＰＣＲ反応、 レーン７．８．９は開始時のテンプレート力＜ｔ　ｏ３コピーでそれぞれ３ｏ、 ３５．４０サイクルの熱循環反応を行なったＰＣＲ反応である。遊離されてきた 標識物の大きさは、５°端非相補性塩基を持たないＢＷ７３では小さく、５′端 に３塩基余分な非相補性塩基をもっＢＷ７４では長かった。

各タロマドグラムはさらにアンビスカウンターを使った二次元ラジオアイソトー プ画像装置により解析した。

アンビスの計数とビーズに捕捉された計数を表１に示す。

標識物の遊離に対する２種の計測法が良く一致を示していることは、ＰＣＲ産物 が合成されることを調へるのにビオチン標識をプローブとアビジン化ビーズを使 用することか有用であることを示している。

ＢＷ７３　３０　６−９　１０．８ １０２：２ビー数　３５　２９−０　３２．７４０　４７−２　４７．２ １０３：ｆｆヒー数　３０　１１．８　１６．８４０　５３．４　５２．５ ＢＷ７４　３０　Ｂ、３　７．９ １０２　コＩ：’−数３５　２０−７　２５−２４３．２　ａｇ−３ １Ｑ３コピー数　３０　１５−７　１４．７３５　３２　３７．７ ４０　４６　４７．９ 例８ プローブ標識と固相抽出方法について 本発明の具現化の一つに、切り出されたプローブを切り出されないプローブから 分離するステップが、プローブの切り出し後、切り出されたプローブの量を決め る前に行なわれている。２通りの分離する方法が行なわれている：　（１）アビ ジン化あるいはストレプトアビジン化した磁性粒子を使って、３′端にビオチン ５′端に蛍光団を標識したプローブを結合させ：磁性体粒子は切り出されないプ ローブと切り出されたプローブの３°側断片の両方を結合する方法と；　（２） ５’端が蛍光団あるいは！！ｐで標識されているものでオリゴヌクレオチドには 結合するがモノヌクレオタイドあるいはダイヌクレオタイドには結合しない、磁 性体粒子をつけたイオン交換樹脂を使う方法がある。これら別々のストラテジー の種々の特長について以下で論議する。

Ａ、アビジン化磁性体粒子 ３゛端ビオチン標識プローブとアビジン化（またはストレプトアビジン化）磁性 体ビーズから構成される分離システムはＤｙｎａ１社からのＤｙｂａｂｅａｄ” のようなビーズを用いて行なうのがよく；この種のビーズは５０μｌのビーズ溶 液で約１００１００ｐのビオチンを結合できる。

非特異的な吸着は、最初にビーズをデンハルト溶液およびキャリアＤＮＡで処理 することにより最小に抑えられる。

ストレプトアビジン−ビオチンによる分離方法に使うプローブは、３′端にビオ チン分子５′端に蛍光団が標識されている必要がある。３°端のビオチンはスト レプトアビジン化（あるいはアビジン化）による分離のリガンドとしての役目と 、増幅反応中の伸張を阻止する役目がある。合成後の修飾はプローブの各末端に 異なった核団を付加させることで容易に行なえる；すなわちビオチンを付けるた めに３“端にアミンを加え、のちに蛍光団を加えるために５′端の千オールをブ ロックする。

３′端ビオチン標識プローブは種々の方法で行なえるか、いくつかを以下に示す 。

ビオチンの誘導体てＮＨＳ活性を有するエステルはプローブ３′端のアミンに図 ９で示すような機構で付加させることかできる。連結の結果、三位のガンマハイ ドロキシル基かアミドカルボニル基となるが、これは典型的なＰＣＲ熱循環反応 の繰り返して不安定となる。例えば、４０サイクルの熱循環で、最初のプローブ のうち約６％がアビジン化磁性粒子に結合しなくなる。プローブと付加されたビ オチン間の結合が熱循環反応により壊れると、プローブはもはや切断された産物 から分離することができず、バックグラウンドの原因となる。この問題はプロー ブに一つ以上のビオチンを付加させることで克服することかできるが、別のいく つかの、プローブにビオチンを付加させる方法でより安定な産物を作り出すこと ができる。

ビオチンヒドラサイドをアルデヒドと共にプローブの３′　リボース糖より反応 させてビオチン化オリゴヌクレオチドを合成することができる。この戦略のため 、プローブの３′　ヌクレオチドはデオキシリボース糖の代わりにリポース糖を 含んでいる。合成において、３′　リボースはその２“あるいは３’　ＯＨ基を 固相支持体に結合させておく。合成後、オリゴヌクレオチドは固相支持体よりは ずされ、リボースの近位のディオール基がソディウＬぺ’）ｔデー　ト（Ｎａ　 ＩＯ４）により酸化されてアルデヒドとなり、次いて図１０に示されるようにビ オチンヒドラサイドと反応し、産物がソディウムボロハイドライド（ＮａＢＨ＜ ）により還元される。しかしなからできたビオチン化プローブはアビジン化磁性 体粒子とは可動に結合しない。図１Ｏにも示しであるビオチン長鎖ヒドラザイド がこの問題を解決する。

図１１に示されているように、プローブ合成において可溶性のビオチンフォスフ オルアミダイトを使用してプローブにビオチンを付加させることができる。合成 は最初塩基をｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｐｏｒｏｕｓ　ｇｌａｓｓ（ＣＥ　Ｇ）に 付加させることから開始されるが、このＣＥＧは最終的には廃棄される。フォス フオルアミダイトが加えられて、合成オリゴヌクレオチドの脱保護剤である水酸 化アンモニウムに作用して３′　リン酸基をつくりだす。次にビオチンフォスフ オルアミダイトが加えられ、図１１に示されるようなオリゴヌクレオチドが合成 され最終産物ができる。

この付加反応は５゛がアミンで終わっているオリゴヌクレオチドを使用すること により蛍光団の付加反応に用いることもできる。ビオチンの付加のために３′ア ミンを使用することにより５°チオール基に蛍光団を付加する化学反応には制限 がつくことになる。ビオチンの一つの窒素原子がブロックされているビオチンフ ォスフオルアミダイトを使用することにより、ビオチン標識プローブの合成の効 率か改善する。

ビオチンが直接有孔のガラスの結合されている市販の試薬を使うことも可能で、 図１２に示しであるようにこの試薬はプローブ合成反応の開始物として使われる 。この付加法は５゛端がアミンで終わっているオリゴヌクレオチドを使用するこ とによって蛍光団の付加にも応用できる。ビオチンの付加のために３′アミンを 使用することにより５′チオール基に蛍光団を付加する化学反応には制限かつく ことになる。オリゴヌクレオチドの５′端に修飾塩基を酵素的手法で付加するこ とも可能であるが、−殺性と実用性において限界が見られる。

Ｂ、磁性によるイオン交換物質 市販されているポリエチレンイミン（ＰＥＩ）マトリックス（セルロース−、シ リカ−１あるいはポリオールポリマーをベースとした）粒子を使って未切断プロ ーブより切断されたプローブを分離することができる。たとえば、Ｈｙｄｒｏｐ ｈａｓｅ、　ＰＥＴ、　ＳｅｌｅｃｔａｃｅｌＴＭＰＥＩ　Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＴＭＰＨＩ、　Ａｍ１ｃｏｎ　ＰＥｌ００．１０００．１００孔なとは全て市販 のＰＥＩマトリックスで切断プローブ産物より未切断のプローブを分けることが できる。

市販されている活性化セルロースの磁性体粒子で、Ｃｏｒｔｅｘ　ＭａｇａＣｅ ｌｌ”のような粒子はＰＥｌ６００．　ＰＥ１１８００゜ＰＥｌｌ０．０００の ような種々の大きさのＰＥＴと１グラムのマトリックスあたり種々のモル比のＰ ＥＩと誘導体を作ることができる。しかしなから、任意の大きさのオリゴヌクレ オチドあるいはクマリン標識したオリゴヌクレオチドはＰＥＩ（市販のＰＥＴマ トリックスのオリゴヌクレオチドに対する特異性は、オリゴヌクレオチドをクマ リンで標識すると失われてしまう）との誘導体であるか否かに関わらず磁性体セ ルロース及びアガロースビーズに結合してしまう。高濃度の塩（２，ＯＭ　Ｎａ Ｃ１’）あるいはＮ−メチルピロリントン（１０−２０％）を加えることにより 、部分的に特異性をあげることが可能であるし、他の共溶媒剤、ＳＤＳ、Ｂｒ１ ｊ３５、グアニジン、尿素も特異性をあげるのに使われる。しかしながら、８Ｍ 尿素はクマリン標識したダイヌクレオチド、トリヌクレオチドがＢａｋｅｒｂｏ ｎｄ”　ＰＥＩ、ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｃｏｒｔｅｘ”ｉｉ４　Ｐ　Ｅ■誘導体粒 子に非特異的に結合するのを効率良くブロックする。しかしＮ置換尿素使用がよ り好ましいが。

前述したように、Ｃｏｒｔｅｘ　Ｂｔｏｃｈｅｍ社はＰＥＩ＋：結合することの できる種々の活性化セルロースでコートした磁性体粒子を販売している。これら のうちで最も便利なものはべりオデートで活性化したマトリックスである。

しかしながら、製造元で推奨するぺりオデートで活性化したマトリックスにアミ ンを付加するプロトコルにはいくつかの問題がある：アミンとアルデヒドとの反 応でイミンが生じ、これは不安定で加水分解されあるいはさらにアミンと反応を 起こし；残存するアルデヒドをブロックするために過剰のエタノラミンを加える ステップではＰＥＴがエタノ−ラミンに置換されマトリックスよりＰＥｌが取り 除かれることとなり：アルカリ性の条件で結合反応を行なうときはアルドールの 濃縮によりアルデヒド間て反応か起こり粒子の凝集が起こり；またアリカル性の 条件でアルデヒドの反応を行なう結果フリーラジカルが生じ、セルロースに作用 して種々の反応が起こる。

イミンを安定化させるため、還元（Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈ４とＮ　ａ　Ｂ　Ｈ３ＣＮに よる）反応を加えることも可能だが、このステップはガスの発生を伴い粒子の体 積を減少させ、粒子の凝集をおこす。このような不要な効果はフリーラジカルの 発生によるものである。活性化したアルデヒドへの結合による合併症を防ぐには エポキシド化学を利用して防ぐことができる。生じるベーターハイドロキシアミ ンは安定で還元剤を必要としない。更に、酸素はフリーラジカルの生成に関係し ているので、反応系から酸素を取り除くことはフリーラジカルの生成を最小に抑 え、特に還元のステップで顕著である。ＰＥＩ誘導セルロースによってコーティ ングした磁性体粒子の合成で、エタノラミンによるブロッキングのステップをな くすことが可能で、調整物はソディウムシアノボロハイドライド（ＮａＢＨ，Ｃ Ｎ）で還元する一晩前あるいは還元の間ヘリウムによってパージされる。この最 終の調整においてほとんと凝集は起こらない。

ポリアクロレイン磁性体粒子もＰＥｌ６００、エチレンジアミンによって誘導体 が行なえ、クマリン標識したダイヌクレオチド、トリヌクレオチドによる非特異 的結合は高濃度のＮＭＰにより阻止することがてきる。長鎖のＰＥＩポリマーの 使用により、小分子のクマリン標識オリゴヌクレオチドとの非特異的相互作用を マスクすることもできる。

本方法で使用する磁性体マトリックスを選定する最も重要な要因はマトリックス に寄与するバックグラウンドの蛍光の量である。このバックグラウンドの蛍光を 最小に抑える方法は、使用する蛍光団の励起、および最大放出波長が、バッファ ー、マトリックス、臨床サンプルからのバックグラウンドの蛍光スペクトルと重 なり合いが最小になるようなものを選定するということである。更に、バックグ ラウンドの蛍光はマトリックス内の汚染物からも由来するので、結合させる前に 十分前処置をして取り除いておく必要がある。

Ｃ，プローブに蛍光団を付加させる化学反応前述したように、プローブを標識の 標識物で望ましいのは、分離の方法を無視すれば、蛍光団である。オリゴヌクレ オチドと結合した蛍光団との間には何らかの相互作用が認められる。この相互作 用は蛍光団がオリゴヌクレオチドに結合した時に観察される減光現象として報告 されているものに関与しているかもしれない。核酸の５′に結合したときＤＮＡ との相互作用が最小であるような蛍光団を選定する必要がある。・ ３種の推奨できる蛍光団として、７−ｄｉｅｔｙｌａｍｉｎｏ−３−（４−ｍａ ｌｅｉｍｉｄｙｌｐｈｅｎｙｌ）−４−ｍｅｔｈｙｌ　ｃｏｕｍａｒｉｎ（ＣＰ Ｍ）。

６−（ｂｒｏｍｏｍｅｔｈｙｌ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＢＭＦ）、Ｌｕｃｉ ｆｅｒ　Ｙｅｌｌｏｗｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ（ＬＹ［Ａ）、と５−（およ び６−）ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈＯｄａｌｌｌｉｎｅ！　ｓｕｃｃｉｎｉｍｉ ｄｙｌ　ｅｓｔｅｒで、なかでもＣＰＭか：減衰係数か大きいこと、発光量が多 いこと、褪色が少ないこと、ストークスシフトが大きいことなとの性質をもち好 ましい。蛍光団はプローブの５″端に結合しているチオール基を介して結合する こともできるか、ＣＰＭの場合アリルマレイミドが生じ、これは熱循環反応の条 件化で不安定である。

蛍光標識された物質の解析のための機械か多く市販されている。例えば、ＡＢ１ 社のＧｅｎｅ　ＡｎａｌｙｓｅｒはＲＯＸ（６−ｃａｒｂｏｘｙ−Ｘ−ｒｈｏｄ ａｍｉｎｅ）　、　ｒｈｏｄａｍｉｎ　１−ＮＨＳ。

ＴＡＭＲＡ（５／６−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ　ｒｈｏｄａｍｉ ｎ　ＮＨＳ）、ＦＡＭ（５’ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　ＮＨＳ） などの蛍光団で標識されたＤＮＡをアットモルのレベルで解析することが可能で ある。

これらの物質はプローブの５′アルキラミンを介してアミド結合でプローブに結 合している。

ＣＮＨＳ　（７−ａｍ　ｉｎ　ｏ−４−ｍｅ　ｔ　ｈｙ　ｌ　−ｃｏｕｍａｒ　 １ｎ−３−ａｃｅ　ｔ　ｉｃ、　ａｃ　ｉｄ、　サクシニミヂルエステル）を含 むその他の存用な蛍光団もアミド結合を介し結合させられる。

標識反応において、特定のオリゴヌクレオチドに与えられた蛍光団を効率良く結 合させるには修飾も要求される。例えば、５′端がアミンで終わっていプローブ と７−ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｃｏｕｍａｒｉｎ−３−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔ ｅ　ＮＨＳ　ｅａｔｅｒ間の初期反応は非常に効率が悪い。３′端かリン酸化さ れていて増幅反応中の伸張反応を阻害するプローブは、高度な二次構造を持ち、 ５′アミンと３゛燐酸基が接近して塩の架橋を作りつる。この構造は５′アミン とＮＨＳエステルが反応するのを妨げ、従って産物の収量か低下することになる 。２５％のＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）を加えることによりこの反応の効 率を著明に改善することができる。

蛍光団と褪色物質を同時にプローブに標識することも可能である。プローブが壊 れていない状態の場合、蛍光団よりの蛍光は褪色物質により褪色させられる。本 発明の方法によって、プローブが蛍光団と褪色物質の間で切断されると、蛍光団 より完全な蛍光量が放出される。褪色現象には蛍光団と褪色物質の間でのエネル ギー移動も含まれるので、蛍光団の発光スペクトルと褪色物質の吸収スペクトル は重なり合っている必要がある。本発明の性質より好ましい組み合わせは蛍光団 がローダミン５９０で褪色物質はクリスタルバイオレットである。

このようなプローブのひとつが図１３に示しである。

このような構造を合成するには、ローダミンの誘導体を５′チオール基を介して 結合させ、クリスタルバイオレットを２塩基離れたサイミジンから延びているア ミンを介して結合させる。２つの分子を２つのフオスフオダイエステル結合の分 、離すことによって、それらの間をＤＮＡポリメラーゼが切断する機会を増やし ている。

最初クリスタルバイオレットをラクトンとアミン間の反応で行なおうとしたか成 功しなかった。クリスタルバイオレットは図１４に示すように修飾し活性型のア シルアサイドにした。この型のクリスタルバイオレットはアミンで修飾されたＤ ＮＡと反応することかでき、望む産物か逆相ＨＰＬＣによって精製できた。

ローダミン−Ｘ−マレイミド群と５゛チオール基との反応は成功しなかった。こ れはクリスタルバイオレットを加える前にローダミン−Ｘ−マレイミドを反応さ せても同様であった。これは脱ブロツク化された５′チオール基がサイミジンの スペーサー内のアククラミドの二重結合（図１３参照）と反応したためと思われ る。アミンをサイミジンに付加する別の方法を図１５に示しである。

この例ではオリゴヌクレオチドプローブの３゛端にビオチンを５゛端に蛍光団を 結合する一般的な方法の案内を示した。このような付加方法は数多くあるもので あり、本発明はプローブの標識について特定の方式を選定しているわけてはない 。

例９ Ａｍｐｌｉ　Ｗａｘ　”を用いＵＮＧ、ｄＵＴＰを使用したＰＣＲ反応法のプロ トコール ＰＣＲ反応は増幅の特異性ということに関して、以下に詳しく記述されている方 法あるいは試薬なとの改善が行われてきた、ＰＣＴ出願第９１１０１０３９号、 ■９９１年２月１５日登録；米国特許出願第４８１．５０１号１９９１年２月１ ６日登録、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９１１０５２１０号１９９１年６月２３日 登録；米国特許出願第６０９．１５７号１９９０年１１月２日登録：米国特許出 願第５５７，５１７号１９９０年７月２４日登録。これら出願特許の内容は参考 文献として添付されているが、以下のプロトコルはこれらの改良されたＰＣＲ法 が優れた結果をえるために本発明とどのようにして組み合わされているかを示し ている。使われている全ての試薬はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ社よ り購入した。（ＰＥＣＩ、Ｎｏ　ｒｗａ　１　ｋ、ＣＴ）このプロトコルは基本 的にはつぎの３部からなっている：ワックスでカバーされたｄＮＴＰ、プライマ ー、マグネシウムおよびトリスを含むＭｉｃｒｏＡｍｐ”、’チューブ；Ａ＋ｎ ｐｌｉＴａｑＤ　Ｎ　ＡポリメラーゼとＵＮＧが加えられたプレミックスＢ（酵 素混合液ともよばれる）；試料とプローブの入ったプレミックスＣ０酵素混合液 とプローブの入った試料か作成されワックス層の上に載せられる。チューブをサ ーモサイクラ−ＴＣ９６００に置き熱循環反応を開始する。下のプロトコルは５ ０μ！反応用で、試料は２７μｌ以下でターゲットはＨＩＶである。

試薬は以下のようにして用意されるのが望ましい。

ＭｉｃｒｏＡｍｐ”チューブは一本当たり１２．５μｌのプレミックスＡと１２ ｍｇのＡｍｐｌｉＷａｘＴＭベレットが入っている。

プレミックスＡにはｌμＭのプライマー５Ｋ１４５と５Ｋ４３１（どちらもビオ チン化されていない）、８００μＭ　ｄＡＴＰｌ　８００μＭ　ｄＧＴＰ、８０ ０μＭｄＣＴＰ、８００μＭ　ｄＴＴＰｌ　１５ｍＭＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８，３が入っている。ＡｍｐｌｉＷａｘ”ペレットは融点 ５５°Ｃのパラフィンで（アルドリッチケミカル社）０．１５％のＴｗｅｅｎ　 ６５を含み、ワックスベレットとプレミックスＡの底の層が共にＤＮＡを含まな い部分に加えられる。ワックスペレットは溶けて上層に蒸発を防止するバリヤー を形成する。このバリヤーはチューブを４−２５°Ｃにおくと硬度が回復して、 ４°Ｃに保存した場合この下のＰＣＲ反応物を敷部月間安定に保つ役割がある。

バリアーの上に加えた材料は熱循環反応の開始においてワックスが溶は出すまで 混ぜる必要はない。対照としてのチューブにはプライマーが含まれていない以外 同じである。

プレミックスＢのバッファには１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｌ、ｐＨ８，３と５ ０ｍＭ　ＫＣＪが入っていて酵素ＡｍｐｌｉＴａｑ”Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼと ＵＮＧの希釈に用いられる。１反応当たり約２．６μｌのプレミックスＣバッフ ァが使われる。

プレミックスＣバッファはｌＯ倍濃度として調整され、１０５ｍＭ　Ｔｒｉｓ− ＨＣＩ、ｐＨ８，３と７１５ｍＭ　ＫＣＩか入っていて、最終反応濃度がそれぞ れ１０ｍＭと５０ｍＭになるように試料ＤＮＡに加えられる。

キャリアＤＮＡと同様にプローブもこの層に加えられる。

もしプラスミドの対照反応が行なわれるなら、１反応当たり約ｌμｇのヒト胎盤 ＤＮＡ　（１ｕｇ／μｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（１’、ｐ）（ｓ、ＩｍＭ　 ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＮａＣｆ、シェアかけフェノール／クロロホルム抽出し、 エタノール沈殿して調整）をキャリアＤＮＡとして加える。１反応当たり約３． ３μｌの１０倍濃度のプレミックスＣ保存液をしようする。

プローブは５μＭ濃度の保存溶液として調整し、ＬｏｌｏｌＣと名付けた。プロ ーブＬＧＩＯＩＣは３°端に燐酸基を持っているので、プローブの伸張と７−シ エチルアミノクマリンー３−カルボキシレートがオリゴヌクレオチドの５′端の アミノアリファティックス基にアミド結合を介して結合するのを妨げている。プ ローブの塩基配列は以、下に示すとおりである。

Ｓ　Ｅ　Ｑ　Ｉ　Ｄ　Ｎｏ　’、　２４　Ｌ　Ｇ　１０１　ｆｆ４ＡＧＡＣＣＡ ＴＣＡＡＴＧＡＯＧＡＡＧＣｍＣＡＧＡＡＴＯＧＧＡＴこのプローブは遮光して 一２０℃で保存する。

ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼはＰＥＣ１社より貯蔵濃度５Ｕ／μ ｌて供給され、ＵＮＧは同社より貯蔵濃度ＩＵ／μｌで供給されている。プラス ミドの補正用試料を同時に反応させることも可能であるし、この目的のため、３ ００．１．０００；３．０００；１０，０００；３０．０００．１００，０００ ．１，０００，０００倍に希釈ものをＧｅｎｅ　ＡｍｐｌｉｆｉｅｒＴＭのポジ ティブコントロールＤＮＡと共に用意しておくと有用である。このＤＮＡはＨＩ ＶＺ６の遺伝子がｐｏｌ遺伝子の領域が中断するようなかたちに組み替えられて いて、感染性が阻止されたかたちでプラスミドｐＢＲ３２２内に挿入されている 。

それぞれの反応液の最終濃度は、１２．５μｌのプレミックスＡ、２．６μｌの プレミックスＢ、３．３μｌのプレミックスＣ；２μｌのプローブＬＧＩＯＩＣ ；２７μｌの検体試料；　０．　４ｐｌＣＤＡｍｐ１ｉＴａｑ　ＤＮＡポリメラ ーゼ；２μｌのＵＮＧで最終的な容量は４９．８μｌとなる。この反応液は、２ ５０ｎＭの各プライマｍ；２００μＭの各ｄＮＴＰ；３．７５ｍＭのＭｇＣ１ｚ ；５０ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！、ｐＨ８，３；２００ｎＭ プローブ；２ユニットのＵＮＧと２ユニツトのポリメラーゼからなっている。

反応をするために、−反応当たり２．６μｌのプレミックスＢ；０．４ｕｌ！の ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ：２μｌのＵＮＧを、ＤＮＡの存在 しないフード内あるいは室内で混合して酵素混合液を調整する。１６反応分を行 なうには、材料が十分なように１８反応分の酵素混合液を用意しておくべきであ る。ＤＮＡの存在しないフード内あるいは室内で、ワックスでカバーされたプレ ミックスＡが入っているＭｉｃｒｏＡｍｐ７Ｍのチューブ内に酵素混合液をワッ クスの上に置くようにして加える。

サンプルを調整する場所で、サンプル混合液を３．３μｌの１０倍のプレミック スＣバッファと２７μｌの試料と（定量のための対照反応用として、１０μｌの 希釈液と１７μｌの水を加える）２μｌのプローブを加えて調整する（キャリア ーＤＮＡは加えるとすれば検体と混ぜておく）。次に、それぞれ別々のサンプラ ーチップを用いて、３２．３μｌのサンプル混合液を各チューブに加え、酵素混 合液とサンプル混合液の容量のアンバランスは完全にかき混ぜて解消する。同時 にプライマーを含まない二つの対照反応用のチューブを熱循環反応中のプローブ の切断を測定するために用意する。この対照反応には通常１，０００コピーの対 照テンプレートを使われる。更にこの検定を補正するためにプラスミドの希釈系 を用いる。この補正として通常−反応当たり３から１０゜０００コピー数のＨＩ Ｖ遺伝子のターゲットが使われる。

これら操作が終了した後、チューブにキャップをしてＴＣ９６００のトレイに配 置する。

サーマルサイクラ−の設定様式は以下の通りである；５０℃２分を１サイクル： ９５℃ｌＯ秒、５５℃ＩＯ秒、７２℃１０秒を５サイクル；９０℃１０秒、６０ ℃ｌＯ秒７２℃ＩＯ秒を３５サイクル行なう。サーマルサイククリング反応が終 了後、チューブをＴＣ９６００より取り出し、必要なら一２０°Ｃで保存する。

７０°Ｃ以上にチューブを長時間さらすのはすすめられない、またアルカリ変性 は行なってはならない。

いくつもの対照反応をおくのは有効で、テンプレートを含まない対照反応は反応 液に汚染がないかを決めるのにまたプローブの切断による非特異的な産物の増幅 と非特異的なシグナルが生じているかを決める目的にニプライマーを含まない対 照反応はバックグラウンドに影響する増幅とは関係していないプローブの切断を 測定する目的に（いくつかの臨床サンプルを加えてプローブの切断で生じた成分 か存在するかを検出することも可能である）；あるいは定量を目的とした対照反 応がある。

前述のプロトコルによる増幅反応後ワックス層の下に形成されているＰＣＲ産物 を回収するために、サンプラーチップをワックス層の中心に突きたてて、チップ をゆっくりと穏やかな力で反応液が飛び出して実験室を汚染することのないよう にすすめてサンプルを吸い出す。反応チューブを片手の一本の指で固定するとう まく行なうことが出きる。細いサンプラーチップ（ゲルにのせるための）を使う と特にワックスをうまく貫くことができる。

突き立てるより刻むような動きでもワックスを貫くことが可能でありワークスで 詰まることもない。もしチップにワックスの小片がついてきたら、それはのこり のワックスに軽くこすり付けて取り除ける。

あるいは反応チューブを凍らせて（ドライアイスエタノールバス、あるいはフリ ーザーで一晩凍らせて）、解凍し、小型遠心機で軽く遠心する（アングルロータ ーて）こともおこなえる。するとワックス層は粉々に砕け、サンプラーチップが 詰まることなくいれることができる。

ワックスの断片はサンプルチップをチューブの内壁にこすって取り除くことがで きる。この方法は特ににｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｓａｍ ｐｌｅｒｓの場合（？）、チップが厚くワックス層に直接貫通させるのか困難な 場合有効である。

前述した方法はいずれも取り出したサンプルからほぼ完全にワックスが取り除か れているのでクロロフォルム抽出は不要である。

前述の発明は説明のためやや詳しく述べているが、付属している特許請求の範囲 内での変更あるいは修飾がなされうることは容易に理解されるところである。

例１０ ＢａｋｅｒｂｏｎｄＴＭＰ　Ｅ　Ｉを用いた固相抽出法この例示では増幅反応を 本発明の方法に従って、蛍光物質標識（クマリン誘導体）プローブ存在下で行な ったＰＣＲ反応液の試料採取についてのプロトコルを示すものである。いくつか のストック用試薬を調整しておくとこのプロトコルの実行がより容易になる。こ れら試薬の一つは予め洗浄した５０ｍＭのＢａｋｅｒｂｏｎｄ”Ｐ　Ｅ　Ｉ　マ トリックスが入ったエッペンドルフチューブである。

Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　”Ｐ　Ｅ　ＩはＪ、　Ｔ、　Ｂａｋｅｒ社（製品番号７２ ６４−００）より入手でき、シリカベースで粒子サイズ４０μｍで２７５オング ストロームのポアサイズである。このマトリックスは最初水で洗いエタノールで 洗い、また水で洗い、次に１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８゜３．５０ｍＭ 　ＫＣｌ、、　１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ＭＮａＣ１，８Ｍ尿素で洗い、次にｌｏｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（ｌＳ　ｐＨ８，３，５０ｍＭ　ＫＣＩ、ＩｍＭＥＤＴＡ、５ ００ｍＭ　ＮａＣｆ、８Ｍ尿素で平衡化する。チューブに分けた後、１５μｌの 水を加えマトリックスの水分を保っておく。このチューブは４°Ｃに保存する。

パインディングバッファも同様にストック溶液として調整でき、その構成はｌｏ ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ、ｐＨ８，５００ｍＭ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　ＫＣｌ５ １ｍＭ　ＥＤＴＡ、８Ｍ尿素である。このバップアは４°Ｃに保存するが、この 温度で尿素は沈殿を形成する。パインディングバッファは使用前に軽（温めて尿 素を再溶解させる。

このプロトコルを行なうにはいくつかの器具が有用である。パインディングのス テップにおいて、マトリックスが浮遊状態に保たれるようにチューブをミックス し続ける必要があるが、このためにはＶｏｒｔｅｘ　Ｇｅｎ１ｅ２　ミキサーが 有用である（Ｆｉｃｃｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号１２−８ １２．６０マイクロチューブホルダー付き、カタログ番号１２−８１２−Ｂより 入手可能）。更にエッペンドルフ小型遠心機、日立モデル２０００分光光度計、 微量蛍光光度計用の内申２ｍｍ、光路長２．５ｍｍの石英性キュベツト（Ｓｔａ ｒｎａ　Ｃｅｌｌｓ社より入手可能、番号＋８ＦＱＩＯｍｍ５）もこのプロトコ ルを行なうのに有用である。

適当な対照反応は行なうへきであり、パインディングステップでは３種の対照反 応か必要とされる。バックグラウンドの蛍光の対照反応としては、プローブだけ を除いたＰＣＲ増幅反応用のサンプルを調整して行なう。対照のサンプルは実際 の検体サンプルと全く同様に処理を行なって、２０マイクロをマトリックスに加 え上清存在する蛍光量を測定する。この対照反応により、マトリックス、パイン ディングバッファ、およびＰＣＲ増幅反応液の成分にあるバックグラウンドの蛍 光量が測定でき、また臨床サンプル中に存在する蛍光量を測定することができる 。

二番目の対照反応は偶然のプローブの分解とパインディング反応を測定するため のもので、プローブを含むすべての成分を含むＰＣＲ増幅反応液だが熱循環反応 は行なわない模擬反応（モック）である。実際の検体サンプルと同様に処理した 後、上溝に存在する蛍光量を測定する。この対照反応は貯蔵中に起こるプローブ の分解を測定するもので同様にパインディングの効率も測定する。

もしプローブの分解が起きず、パインディング反応が完全に行なわれていればＢ ａｋｅｒｂｏｎｄ”Ｐ　Ｅ　Ｉに結合させた後の上清中の蛍光量は第一の対照反 応で測定されたバックグラウンドの蛍光量に等しくなるはずである。

第三の対照反応は加えたプローブの量を測定するためのものである。第二の対照 反応用に調整されたサンプルかこの測定にも使用できる。しかしながらこの場合 、２０μｌをマトリックスを含まない２９０μｌのパインディングバッファに加 えて行なう。この対照反応は加えたプローブの量を決めるためのものである。

このプロトコルを行なうためには、先ず必要なパインディング用のチューブの数 を決めなければならない；この数は検体サンプルと対照の合計である。対照は、 テンプレートをふくまない対照、プライマーを含まない対照、補正用の対照およ び前述した第一、第二の対照である。

対照は三重で行なってもよい。各チューブに２３５μｌのパインディングバッフ ァを加える。

また、インプットの量を測定するために、空のエッペンドルフチューブにマトリ ックスの入ったチューブに相当する（２３５μｌパインデイングバツフア、１５ μｌ水、マトリックスに相当する４０μｌ分）２９０μｌのパインディングバッ ファを加えたものを用意してもよい。

インプット量の測定は三重で行なってもよい。

マトリックスが入っているチューブに（検体サンプルと第一、第二の対照）２０ μｌのサンプルを加える。バッファの入っているチューブに（第三の対照）２０ μｌのモックＰＣＲ反応液を加える。チューブをＶｏｒｔｅｘ　Ｇｅｎ１ｅ２ミ キサーで４のレベルで室温で３０分間振蕩する。

チューブを次にエツペンドルフ小型遠心機で（１６，０００Ｇ）室温で５分間遠 心する。各々のチューブから上清の２００μｌを、チューブの壁にあるペレット あるいはマトリックスか崩れないようにして取り出し、新しいエッペンドルフチ ューブに移し変える。

上清の蛍光量を前述したキュベツトで日立モデル２０クマフン 菫汁加刊４で標識したプローブの場合、分光光度計は以下のように設定する；２ Ｍ管の電圧７００ｖ、励起波長４３２ｎｍ、吸収波長４８０ｎｍ、励起スリット 巾１０ｎｍ、吸収スリット巾２０ｎｍｏサンプルへの励起光の露光は最小限にな るようにし、サンプルが分光光度計内に長く置かれるような場合は、シャッタを 閉めるようにする。

切り出されたプローブのｐｍｏ　ｌ数での評価がシグナルの量の評価に最も便利 である。シグナルの量を評価するためには最初に、次式に従って第三の対照反応 よりインプットシグナルを決定する。

この式で、引き算は検体サンプル中の全てのバックグラウンド蛍光量を補正する ためのもので、３１０／２０は希釈係数である、また１０ｐｍｏｌはＰＣＲ増幅 反応に加えられたプローブの量である。

検体サンプルのシグナル量は次式に従って計算される。

（検体サンプルの蛍光シグナル−第一の対照反応の蛍光シグナル）Ｘ　（３１０ ／２０）インプットシグナル 上のプロトコルはプローブを標識する蛍光団によって修飾されるものであり、た だ本発明を説明するためのものである。

図１６は本発明のＢａｋｅｒｂｏｎｄ”Ｐ　Ｅ　Ｉを用いた固相抽出法によるシ グナルとインプットしたターゲットの数との結果とその関係を示したものである 。

配列の一覧 （１）　一般の情報 （ｉ）出願人：　Ｃｅｔｕｓ社　他 （ｉｉ）発明の名称：均質検定システム（ｉｉ）シーケンスの数：２４ （ｉｖ）連絡先住所： （Ａ）宛先：　ＣｅｔｕＳ社 （Ｂ）番地：１４００　５３番通り （Ｃ）都市：　Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ （Ｄ）州：カリフォルニア州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　９４６０８ （ｖ）コンピュータで読み取り可能な形式（Ａ）媒体のｍ類：ディスケット、３ ．５０インチ、８００Ｋｂ容量 （Ｂ）コンピュータ：アップルマッキントツシシュ （Ｃ）オペレーティングシステム：マツキントラシュ　６．０．５ （Ｄ）ソフトウェア：ワードパーフェクト（ｖｉ　）本出願に関するデータ （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願臼：１９９１年８月６日 （Ｃ）分類； （ｖｎ　）先行する特許出願のダーテ （Ａ）出願番号：５６３．７５８ （Ｂ）出願臼：］９９０年８月６日 （ｖｉ　）特許事務所に関するデータ （Ａ）名称：　Ｋｅｖｉｎ　Ｒ，Ｋａｓｔｅｒ（Ｂ）登録番号；３２．７０４ （Ｃ）　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ／Ｄｏｃｋｅｔ１号：２５２８．１（ｉｘ）　を話 番号 （Ａ）電話：　（４１５）４２０−３４４４（Ｂ）電話ファックス： （２）塩基配列　ＩＤナンバーｌに関する情報（ｉ）塩基配列の性質 （Ａ）長さ：２８塩基 （Ｂ）種Ｍ二Ｍ酸 （Ｃ）鎖の性質ニ一本鎖 （目状：直線 （ｉｉ）で　３の核酸 （ｘｉ）　ｉ　ｉ基配列　ＩＤナンバーＩＣＣＧ　’Ｃ丁フＣ丁　ＡＣＴＣＡＧ ＧＣ（２）塩基配列　ＩＤナンバー２に関する情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ＝３０塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバー２ＧＡＡＧＡＡＡＧＣＧ　ＡＡＡ ＧＧＡＧＣＧＧ　ＧＣＧＣτＡＧＧＧＣ（２）塩基配列　ＩＤナンバー３に関す る情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ＝３１塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＴＤナンバー３ＣＧＣＴＧＣＧＣＧＴ　ＡＡＣ ＣＡＣＣＡＣＡ　ＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＸ（２）塩基配列　ＩＤナンバー４に関 する情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ：３７塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバー４ＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧ　ＣＧＴ ＡＡＣＣＡＣ：ｌ：　ＡＣＡＣ：：ＣＧＣＣ：Ｇ　ＣＣＧＣＧＣＸ（２）塩基配 列　ＩＤナンバー５に関する情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ：４１塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｌ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバー５ＣＧＴＣＡＣＣＧＡＴ　ＣＧＣ フＧＣＧＣＧＴ　ＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡ　ＣＣＣＧＣＣＧＣＧＣＸ（２）塩基配 列　ＩＤナンバー６に関する情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ：２５塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状、直線 （ｎ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＴＤナンバー６ＧＡＴＧ局ττＣＧτＧτ口： ＧｒＡｃｘ　ｐｈ：τＧＧ２）塩基配列　ＩＤナンバー７に関する情報（ｉ）塩 基配列の性質： （Ａ）長さ＝２５塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｌ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバー７ＧＧＴ？ＡＴＣＧＡＡ　ＡＴＣ ＡＣｓ：ＣＡＣＡ　ＧＣＧＣＣ２）塩基配列　ＩＤナンバー８に関する情報（ｉ ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ：３０塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバー８ＣＧ：τ’Ｊ’：：−　Ｃ；　 ：ｌ：１．：τ　Ａ入；Ｃλ：；入二Ｉｓ　ＣＣ＋　Ｇｌ＋ＣＧ％＋ＧＣ２）塩 基配列　ＩＤナンバー９に関する情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ＝３３塩基 （Ｂ）種類、核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバー９ＧＡＴＣＧＣＴＧＣＧ　Ｃ５Ｔ ｋＡＣＣＡＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＣＧ　ＣＧＣ２）塩基配列　ＩＤナンバー１０ に関する情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ＝４０塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）ｌの性質、一本鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述・塩基配列　ＩＤナンバー１０ＣＧフＣＡＣＣＧＡＴ　Ｃに ＣＴＧＣＧＣＧＴ　ＡＡＣＣＡＣＣＡＣＡ　ＣＣ：ＣＧＣＣＧＣＧＣ２）塩基配 列　ＩＤナンバー１１に関する情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ：３０塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （Ｘり配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバーｌＩＧこ５ＣＴＡＧＧＧＣＧこτＧ ＧＣＡＡＧ？　Ｇτ八へＣＧＧＴＣＡ２）塩基配列　ＩＤナンバー１２に関する 情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さコ３０塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｌ）配列の記述；塩基配列　ＩＤナンバー１２Ｓ：ｌ；ｙＳ：ＴＡＧＧ；　 ＣＧごＴＧＧＣＡＡＧ　ＴＣ；ＴＡＧＣＧＧＴＣ２）塩基配列　ＩＤナンバー１ ３に関する情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ＝３０塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバー１３ＧＧＧＣＧＣＴＡＧＣ；　Ｇ ＣＧＣＴＧＧＣ入Ａ　ＧＴＧτＡＧＣＧＧＴ２）塩基配列　ＩＤナンバー１４に 関する情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ：３０塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状２直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＴＤナンバー１４ＡＧＣＧＧＧＣＧＣＴ　ＡＧ ＧＧＣＧＣＴＧＧ　ＣＡＡＧＴＧτ＾ＧＣ２）塩基配列　ＩＤナンバー１５に関 する情報（ｉ）塩基配列の性質。

（Ａ）長さ＝３０塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ｒＤナンバー１５ＡＡ入ＧＧＡＧＣＧＧ　ＧＣ ＧＣＴＡＧＧＧＣＧＣＴＧＧＣＡＡＧ？２）塩基配列　ＩＤナンバー１６に関す る情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ：３０塩基 （Ｂ）種類：核酸 （、Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバー１６ＧＡＡＧＡＡＡＧＣＧ　ＡＡ ＡＧＧＡＧＣＧＧ　ＧＣＧＣτλＱＧ：２）塩基配列　ＩＤナンバー１７に関す る情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ：３０塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：池の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバー１７ＣＧＧこＣＡＡＣＧＣＧＣＧ ＧＧＧＡＧＡＧ　ＧＣＧＧ費τ父Ｇ２）塩基配列　ＩＤナンバー１８に関する情 報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ＝２９塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状２直標 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバー１８τ入τＣＣＣＧＣＣＧ　ＣＧ Ｃττ入Ａτｃｃ　ｃｃｃｃｃτＡＣＡ２）塩基配列　ＩＤナンバー１９に関す る情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ＝３４塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類；他の核酸 （ｘｌ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバ−１９ＧＣＡ丁？ＡＡＴＧＣＧＣＣ ＧＣＴＡＣＡＧ　ＧＧＣＧＣＧ？ＡＣＴ　ＡＴＧＧ２）塩基配列　ＩＤナンバー ２０に関する情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ＝３３塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバー２０ＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡ　ＡＴ ＧＡＧＧＡＡＧ：　ＴＧＣＡＧＡＡ”ｒＧＧ　ＧＡＴ２）塩基配列　ＩＤナンバ ー２１に関する情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ＝３６塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述、塩基配列　ＩＤナンバー２１ＧフＧＧＡＧ＾ＣＣＡ　τＣ ＡＡ？ＧＡＧＧＡ　ＡＧＣτＧＣＡＧＡＡ　丁ＧＧＧＡτ２）塩基配列　ＩＤナ ンバー２２に関する情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ：３０塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバー２２ＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡ　ＣＡ ＴＣＡＡＧＣＡＧ　ＣＣＡτＧＣ＾λ＾丁２）塩基配列　ＩＤナンバー２３に関 する情報（ｉ）塩基配列の性質： （Ａ）長さ＝２７塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバー２３τＧＣＴＡＴＧＴＣＡ　Ｇ： τＣ−ロτＧＧττ＝Ｃ丁２）塩基配列　ＩＤナンバー２４に関する情報（ｉ） 塩基配列の性質： （Ａ）長さ：３３塩基 （Ｂ）種類：核酸 （Ｃ）鎖の性質ニー重鎖 （Ｄ）幾何学的性状：直線 （ｉｉ）分子の種類：他の核酸 （ｘｉ）配列の記述：塩基配列　ＩＤナンバー２４ＧＡＧＡＣＣ：ＡＴＣＡ　Ａ ＴＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧ　ＧＡＴレーン　＋　２３４５６７［ ３９１０１１１２ＦＩＧ、　１ ’ｖ−ン　ｌ　２３４５６　７　ａ９１０１１１２ＦＩＧ、　２ ＦＩＧ、　７Ａ ＦＩＧ、　７Ｂ ＦＩＧ、　８Ａ ＦＩＧ、ｔ。

日Ｇ、１４ 日Ｇ、１５ −−−−０コピー数のときの平均シグナル・−・・・・・−平均シグナル＋１標 準偏差ＦＩＧ、１６ １）ＦＢ　慣　喜　親　牛 特表千６−５０００２１　（３３） フロントページの続き （７２）発明者　サイキ、ランドール　ケイ。

アメリカ合衆国９４８０５　カリフォルニア州すッチモンド、サーティーナイン ス　ストリート　３２０ （７２）発明者　ワトソン、ロバート　エム。

アメリカ合衆国９４７０３　カリフォルニア州バークレイ、バークレイ　ウェイ 　１８１９

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．サンプル中のターゲットの核酸配列を検出する方法において、 （ａ）一本鎖の核酸からなるサンプルを、ターゲットの核酸の領域に相補的な配 列をもつオリゴヌクレオチドと同じターゲットの核酸の配列領の第二の領域に相 補的な配列を含み、第一のオリゴヌクレオチドにより限定される核酸配列は含ま ないような標識オリゴヌクレオチドを接触させ、ハイブリダイゼションを生じさ せる条件で二本鎖複合体の混合物を形成し、ここで二本鎖複合体は、第一のオリ ゴヌクレオチドと標識オリゴヌクレオチドに第一のオリゴヌクレオチドの３′端 が標識オリゴヌクレオチドの５′端と隣接するような配置でアニールしたターゲ ットの核酸からなり； （ｂ）工程（ａ）の混合物を５′→３′ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型鎖依存性核 酸ポリメラーゼと、そのポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性が働いてア ニールした標識オリゴヌクレオチドを切断して標識断片を遊離するような条件に 保ち； （ｃ）その遊離されてきた標識断片を検出しおよび／あるいは測定する 方法。
2. ２．工程（ａ）でアニールした二本鎖の第一のオリゴヌクレオチドの３′端がア ニールした標識オリゴヌクレオチドの５′端に、核酸のポリマー化反応がなくて も標識断片の遊離が効率よく行なえるような間隔で近接している請求の範囲１の 方法。
3. ３．オリゴヌクレオチドがデオキスリボヌクレオチドからなる請求の範囲１の方 法。
4. ４．核酸ポリメラーゼが５′→３′ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラー ゼである請求の範囲１の方法。
5. ５．標識オリゴヌクレオチド内のヌクレオチドが、ヌクレアーゼの切断の特異性 をコントロールするように修飾を加えてある請求の範囲１の方法。
6. ６．標識オリゴヌクレオチドが少なくとも１種の標識物を含む請求の範囲１の方 法。
7. ７．標識オリゴヌクレオチドが第１、第２の標識物をふくみ、第一の標識物と第 二の標識物がヌクレアーゼにより切断を受けやすいサイトを隔てて離れている請 求の範囲１の方法。
8. ８．標識オリゴヌクレオチドが５′末端で標識されている請求の範囲６の方法。
9. ９．標識オリゴヌクレオチドがさらにそのテール部分が核酸でないものから構成 されているものあるいはターゲットの核酸配列とは非相補的なヌクレオチド配列 から構成されている請求の範囲７の方法。
10. １０．標識物がテールの部分あるいは非相補的な配列のヌクレオチドに結合して いる請求の範囲９の方法。
11. １１．標識物が５′末端に結合していて、テール部分あるいは非相補的な配列に よりターゲットの核酸配列に相補的な配列よりはなされている請求の範囲１０の 方法。
12. １２．核酸のポリマー化反応が十分促進されるような条件下で、標識断片の遊離 が第一のオリゴヌクレオチドが伸張している間に起こる請求の範囲１の方法。
13. １３．サンプル中のターゲットの核酸塩基配列を検出するポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）増幅方法において、（ａ）前記サンプルを含むＰＣＲアッセイに、タ ーゲットの核酸の領域に相補的な配列を含有する少なくとも一種の標識オリゴヌ クレオチドを供給し、この標識オリゴヌクレオチドはステップ（ｂ）のオリゴヌ クレオチドプライマーで決定されるターゲットの核酸の領域内にアニールし； （ｂ）オリゴヌクレオチドプライマーのセットを供給し、そこで第一のプライマ ーはターゲット核酸配列の一本の鎖の領域に相補的な配列を持ち、相補的なＤＮ Ａ鎖の合成のプライミングを行ない、第二のプライマーはターゲット核酸配列の もう一本の鎖の領域に相補的な配列を含有し、その相補的なＤＮＡ鎖の合成のプ ライミングを行ない；それぞれのオリゴヌクレオチドプライマーは同じ核酸鎖に アニールする標識オリゴヌクレオチドの上流でその相補的鋳型にアニールするよ うに選定されていて；（ｃ）ターゲットの核酸塩基配列の増幅を鋳型依存性ポリ メライジング剤として５′→３′ヌクレアーゼ活性をもつ核酸ポリメラーゼを用 いＰＣＲサイクリングステップで受け入れられるような条件で行なうもので、Ｐ ＣＲサイクリングステップとは（ｉ）ターゲット配列中の鋳型の核酸配列にプラ イマーと標識オリゴヌクレオチドをアニールさせ、（ｉｉ）プライマーを伸張さ せ、そこで核酸ポリメラーゼはプライマー伸張生成物を合成し、同時に核酸ポリ メラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性により標識オリゴヌクレオチドとそれに 相補的な薄型核酸配列から構成されるアニール形成下二本鎖複合体から標識断片 の遊離を行ない、それによって検出可能な標識断片を産生し、そして、 （ｄ）遊離された標識断片を検出および／あるいは測定しサンプル中のターゲッ トの核酸配列の存否を決定することからなる方法。
14. １４．核酸ポリメラーゼが耐熱性酵素である請求の範囲１３の方法。
15. １５．耐熱性酵素がＴｈｅｒｍｕｓ属種に由来するＤＮＡポリメラーゼである請 求の範囲１４の方法。
16. １６．アニールしているオリゴヌクレオチドプライマーの３′末端が同じ核酸鎖 にアニールしている標識オリゴヌクレオチドの５′末端に近接している請求の範 囲１３の方法。
17. １７．核酸ポリメラーゼによる伸張反応を阻止するために３′末端をブロックさ れた標識オリゴヌクレオチドによる請求の範囲１６の方法。
18. １８．標識オリゴヌクレオチドがさらに１−約１０塩基の、ターゲットの核酸配 列とは実質的に非相補的な配列を含有する請求の範囲１６の方法。
19. １９．標識オリゴヌクレオチドが第１、第２の標識物をふくみ、第一の標識物と 第二の標識物がヌクレアーゼにより切断を受けやすいサイトを隔てて離れている 請求の範囲１３の方法。
20. ２０．請求の範囲１３の工程（ａ）において標識オリゴヌクレオチドのプローブ の一対があたえられる請求の範囲１３の方法。
21. ２１．標識されたプローブの一対が同じ相補的核酸鎖の異なった重なり合わない 領域にアニールし、第二の標識プローブの５′末端が第一の標識プローブの３′ 末端と隣接する請求の範囲２０の方法。
22. ２２．標識物が非相補的配列内のヌクレオチドに結合している請求の範囲１８の 方法。
23. ２３．標識物が５′末端に結合していて、非相補的な配列により相補的なプロー ブ配列よりはなされている請求の範囲２２の方法。
24. ２４．オリゴヌクレオチドが５′末端で標識されている請求の範囲１３の方法。
25. ２５．オリゴヌクレオチドがブロックされた３′末端で標識されている請求の範 囲１７の方法。
26. ２６．標識物がオリゴヌクレオチドの内部の配列に結合している請求の範囲１３ の方法。
27. ２７．標識物が増幅されたターゲットの核酸配列の数に比例したシグナルを与え る請求の範囲１３の方法。
28. ２８．標識物がシグナルを与える性質をそなえたデオキシリポヌクレオシドアナ ログである請求の範囲１３の方法。
29. ２９．標識オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド上で相互作用し合う一対 のシグナル発生標識物で、検出しうるシグナルの発生を有効に減弱させるように 配置されている標識物からなり、その標識物はオリゴヌクレオチド内でヌクレア ーゼの切断を受けやすいサイトによって離されて配置され、それにより、プライ マー伸張反応において核酸ポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性により第 一の相互作用するシグナル発生標識物が第二の相互作用するシグナル発生標識物 よりその感受性サイトで切り離されて検出しうるシグナルを生成する請求の範囲 １３の方法。
30. ３０．第一の標識物が化学発光基質で、第二の標識物がそれと相互作用する蛍光 団である請求の範囲２９の方法。
31. ３１．オリゴヌクレオチドの標識物が核酸ポリメラーゼの５′→３′ヌクレアー ゼ活性が標識断片を遊離させることが可能なだけ十分な長さのスペーサーアーム を介して、結合している請求の範囲１３の方法。
32. ３２．標識オリゴヌクレオチドとそれに関連した上流のオリゴヌクレオチドプラ イマーのメルティング温度（Ｔｍ）の差が、ＰＣＲサイクル中のアニーリングの ステップで標識オリゴヌクレオチドがより結合しやすいような設定になっている 請求の範囲１３の方法。
33. ３３．標識オリゴヌクレオチドのＴｍが上流のオリゴヌクレオチドプライマーの Ｔｍより４０℃高い請求の範囲３２の方法。
34. ３４．標識オリゴヌクレオチドの断片がモノヌクレオチド、ジヌクレオチドおよ びより大きいヌクレオチド断な 片の混合物からなる請求の範囲１３の方法。
35. ３５．標識断片の検出の前に標識オリゴヌクレオチド断片をＰＣＲ混合物中の他 の成分より分離することからなる請求の範囲１３の方法。
36. ３６．分離のステップでサイズエクスクルージョンクロマトグラフを使用する請 求の範囲３５の方法。
37. ３７．ＰＣＲ混合物から標識断片を固相抽出法で分離する請求の範囲３５の方法 。
38. ３８．固相にアビジンあるいはストレプトアビジンを結合させ、標識オリゴヌク レオチドにさらに標識物とはヌクレアーゼの切断を受けやすいサイトで分離する ビオチン分子を結合させた請求の範囲３７の方法。