JPH0870876A - 発光性標識で標識されたオリゴヌクレオチドの分解検出方法 - Google Patents
発光性標識で標識されたオリゴヌクレオチドの分解検出方法Info
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- JPH0870876A JPH0870876A JP7219026A JP21902695A JPH0870876A JP H0870876 A JPH0870876 A JP H0870876A JP 7219026 A JP7219026 A JP 7219026A JP 21902695 A JP21902695 A JP 21902695A JP H0870876 A JPH0870876 A JP H0870876A
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- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は核酸検出アッセイにおいて有用であ
る発光性標識で標識されたオリゴヌクレオチドの発光を
制御する方法に向けられる。 【解決手段】 発光性標識で標識された一本鎖オリゴヌ
クレオチドの開裂をもたらす反応を、該標識と相互作用
して該標識の発光を変化させるＤＮＡ結合化合物の存在
下で実施する。該方法はプローブの分解に起因する標識
プローブの発光の変化を利用する。本発明の方法はオリ
ゴヌクレオチドプローブの開裂をもたらす反応を使用す
るアッセイ、特にハイブリダイズしたプローブがプライ
マー伸長に付随して開裂される均一増幅／検出アッセイ
に適用可能である。増幅された標的の蓄積の同時検出と
標的配列の配列特異的検出を可能にする均一増幅／検出
アッセイが提供される。
る発光性標識で標識されたオリゴヌクレオチドの発光を
制御する方法に向けられる。 【解決手段】 発光性標識で標識された一本鎖オリゴヌ
クレオチドの開裂をもたらす反応を、該標識と相互作用
して該標識の発光を変化させるＤＮＡ結合化合物の存在
下で実施する。該方法はプローブの分解に起因する標識
プローブの発光の変化を利用する。本発明の方法はオリ
ゴヌクレオチドプローブの開裂をもたらす反応を使用す
るアッセイ、特にハイブリダイズしたプローブがプライ
マー伸長に付随して開裂される均一増幅／検出アッセイ
に適用可能である。増幅された標的の蓄積の同時検出と
標的配列の配列特異的検出を可能にする均一増幅／検出
アッセイが提供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ結合化合物
を使って溶液中の発光性標識で標識されたオリゴヌクレ
オチドの発光を制御する方法に関する。更に、本発明
は、溶液中の発光性標識で標識された一本鎖オリゴヌク
レオチドの分解を検出する方法に関する。また、本発明
は、相補的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダ
イゼーションにより核酸配列を検出する方法にも関す
る。
を使って溶液中の発光性標識で標識されたオリゴヌクレ
オチドの発光を制御する方法に関する。更に、本発明
は、溶液中の発光性標識で標識された一本鎖オリゴヌク
レオチドの分解を検出する方法に関する。また、本発明
は、相補的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダ
イゼーションにより核酸配列を検出する方法にも関す
る。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】オリ
ゴヌクレオチドプローブを使った核酸検出は特異的標的
検出のための標準法になりつつある。この方法の無数の
変形が記載されている。一般的には、ＤＮＡ試料を固体
支持体上に固定化し、次いで標識された標的特異的プロ
ーブにハイブリダイズさせる（例えば、Falkow他、米国
特許第4,358,535 号）。
ゴヌクレオチドプローブを使った核酸検出は特異的標的
検出のための標準法になりつつある。この方法の無数の
変形が記載されている。一般的には、ＤＮＡ試料を固体
支持体上に固定化し、次いで標識された標的特異的プロ
ーブにハイブリダイズさせる（例えば、Falkow他、米国
特許第4,358,535 号）。
【０００３】プローブ−標的ハイブリダイゼーション二
重型の形成後にオリゴヌクレオチドプローブの選択的開
裂を含む幾つかの核酸検出方法が記載されている。開裂
されたプローブの検出はハイブリダイゼーションの発生
を示し、よって標的配列の存在を示す。例えば、Saiki
他, 1985, Biotechnology 3:1008-1012 は、標的特異的
プローブのハイブリダイゼーションが制限部位を生成さ
せ、次いで対応する制限酵素により該制限部位が開裂さ
れるという「オリゴマー制限」検出方法を記載してい
る。
重型の形成後にオリゴヌクレオチドプローブの選択的開
裂を含む幾つかの核酸検出方法が記載されている。開裂
されたプローブの検出はハイブリダイゼーションの発生
を示し、よって標的配列の存在を示す。例えば、Saiki
他, 1985, Biotechnology 3:1008-1012 は、標的特異的
プローブのハイブリダイゼーションが制限部位を生成さ
せ、次いで対応する制限酵素により該制限部位が開裂さ
れるという「オリゴマー制限」検出方法を記載してい
る。
【０００４】特許公報WO 89/09284 号は、ＲＮＡプロー
ブを使ってＤＮＡ標的配列を検出する方法を記載してい
る。ＤＮＡ標的にハイブリダイズしたＲＮＡプローブ
は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド二重型の中のＲＮＡを
選択的に開裂させるＲＮアーゼＨを使って開裂される。
米国特許第5,210,015 号は、核酸ポリメラーゼの５′→
３′エキソヌクレアーゼ活性を使って標的配列にハイブ
リダイズしたプローブを開裂させ、それによって検出用
の標識オリゴヌクレオチド断片を遊離させる方法を記載
している。これらの方法は、ポリメラーゼ媒介伸長反応
用のプライマーとして作用するためにプローブハイブリ
ダイゼーション部位の上流にハイブリダイズする追加の
オリゴヌクレオチドを必要とする。
ブを使ってＤＮＡ標的配列を検出する方法を記載してい
る。ＤＮＡ標的にハイブリダイズしたＲＮＡプローブ
は、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド二重型の中のＲＮＡを
選択的に開裂させるＲＮアーゼＨを使って開裂される。
米国特許第5,210,015 号は、核酸ポリメラーゼの５′→
３′エキソヌクレアーゼ活性を使って標的配列にハイブ
リダイズしたプローブを開裂させ、それによって検出用
の標識オリゴヌクレオチド断片を遊離させる方法を記載
している。これらの方法は、ポリメラーゼ媒介伸長反応
用のプライマーとして作用するためにプローブハイブリ
ダイゼーション部位の上流にハイブリダイズする追加の
オリゴヌクレオチドを必要とする。
【０００５】核酸を増幅させる方法であるポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）の発明は、感度と特異性が大きく増
大された核酸検出を可能にした。ＰＣＲを使って、単一
コピーゲノムＤＮＡのセグメントを、検出前に容易に検
出可能なレベルにまで選択的に増幅させることができ
る。ＰＣＲ法は米国特許第4,683,202 号に開示されてい
る。ＰＣＲおよび増幅された標的核酸とハイブリダイズ
することができるオリゴヌクレオチドプローブを使った
ＰＣＲ生成物の検出方法は、米国特許第4,683,195 号お
よび欧州特許公報第237,362 号に記載されている。
連鎖反応（ＰＣＲ）の発明は、感度と特異性が大きく増
大された核酸検出を可能にした。ＰＣＲを使って、単一
コピーゲノムＤＮＡのセグメントを、検出前に容易に検
出可能なレベルにまで選択的に増幅させることができ
る。ＰＣＲ法は米国特許第4,683,202 号に開示されてい
る。ＰＣＲおよび増幅された標的核酸とハイブリダイズ
することができるオリゴヌクレオチドプローブを使った
ＰＣＲ生成物の検出方法は、米国特許第4,683,195 号お
よび欧州特許公報第237,362 号に記載されている。
【０００６】上述した未増幅の核酸を検出する方法と同
様、プローブ−標的ハイブリダイゼーション二重型の形
成後のハイブリダイゼーションプローブの選択的開裂を
含む増幅生成物の検出方法も記載されている。Saiki
他, 1985, Science 230: 1350-1353は、増幅生成物の検
出への「オリゴマー制限」の応用を記載している。米国
特許第5,210,015 号も、標的配列にハイブリダイズした
標識プローブを開裂させるのに核酸ポリメラーゼの５′
→３′エキソヌクレアーゼ活性を使ったＰＣＲ増幅生成
物の分析を記載している（Holland 他, 1991, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280も参照のこと）。
様、プローブ−標的ハイブリダイゼーション二重型の形
成後のハイブリダイゼーションプローブの選択的開裂を
含む増幅生成物の検出方法も記載されている。Saiki
他, 1985, Science 230: 1350-1353は、増幅生成物の検
出への「オリゴマー制限」の応用を記載している。米国
特許第5,210,015 号も、標的配列にハイブリダイズした
標識プローブを開裂させるのに核酸ポリメラーゼの５′
→３′エキソヌクレアーゼ活性を使ったＰＣＲ増幅生成
物の分析を記載している（Holland 他, 1991, Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280も参照のこと）。
【０００７】増幅反応混合物中に、増幅プライマーによ
り結合された標的核酸の領域にハイブリダイズするプロ
ーブが含まれる。ハイブリダイズしたプローブは、プラ
イマー伸長中にポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ
活性により開裂される。標識された断片の検出はプライ
マー伸長とプローブハイブリダイゼーションの両方の発
生を示し、従って特定の標的配列の増幅を示す。
り結合された標的核酸の領域にハイブリダイズするプロ
ーブが含まれる。ハイブリダイズしたプローブは、プラ
イマー伸長中にポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ
活性により開裂される。標識された断片の検出はプライ
マー伸長とプローブハイブリダイゼーションの両方の発
生を示し、従って特定の標的配列の増幅を示す。
【０００８】標的核酸の検出を容易にする目的で、プロ
ーブまたは標的のいずれかの核酸を標識するための多数
の剤が記載されている。蛍光、放射能、比色、Ｘ線回析
または吸光、磁性および酵素活性により検出可能なシグ
ナルを提供する標識が記載されており、そのような標識
としては、例えば、蛍光団、発色団、放射性同位体（特
に32Ｐと 125Ｉ）、高電子密度試薬、酵素、および特異
的結合相手を有するリガンドが挙げられる。標識は、多
数の手段、例えば標識を組み込むためのプライマーもし
くはプローブの化学的修飾、または伸長生成物中に変更
ヌクレオシド三リン酸を組み込むための重合剤の使用に
よって達成することができる。
ーブまたは標的のいずれかの核酸を標識するための多数
の剤が記載されている。蛍光、放射能、比色、Ｘ線回析
または吸光、磁性および酵素活性により検出可能なシグ
ナルを提供する標識が記載されており、そのような標識
としては、例えば、蛍光団、発色団、放射性同位体（特
に32Ｐと 125Ｉ）、高電子密度試薬、酵素、および特異
的結合相手を有するリガンドが挙げられる。標識は、多
数の手段、例えば標識を組み込むためのプライマーもし
くはプローブの化学的修飾、または伸長生成物中に変更
ヌクレオシド三リン酸を組み込むための重合剤の使用に
よって達成することができる。
【０００９】様々な蛍光性ＤＮＡ結合化合物が知られて
いる。それらとしては、積み重ねられた核酸塩基に非共
有結合的に結合しそして結果として異なる波長へのシフ
トまたは増大のいずれかの蛍光変化をもたらす挿入剤が
挙げられる。米国特許第4,582,789 号は、ソラレンを含
む幾つかの挿入成分を記載している。臭化エチジウム
（EtBr）は、遊離溶液中に存在する時よりも二本鎖ＤＮ
Ａに結合した時の方が増大した蛍光を示す挿入化合物で
ある（Sharp 他, 1973, Biochemistry 12:3055）。
いる。それらとしては、積み重ねられた核酸塩基に非共
有結合的に結合しそして結果として異なる波長へのシフ
トまたは増大のいずれかの蛍光変化をもたらす挿入剤が
挙げられる。米国特許第4,582,789 号は、ソラレンを含
む幾つかの挿入成分を記載している。臭化エチジウム
（EtBr）は、遊離溶液中に存在する時よりも二本鎖ＤＮ
Ａに結合した時の方が増大した蛍光を示す挿入化合物で
ある（Sharp 他, 1973, Biochemistry 12:3055）。
【００１０】EtBrは一本鎖核酸と二本鎖核酸の両方を検
出するのに用いることができるけれども、一本鎖核酸に
対するEtBrの親和性は比較的低い。EtBrはゲル電気泳動
後に核酸を非特異的に検出するのに常用されている。適
当なゲル母材、例えばアガロースまたはアクリルアミド
上でのサイズ分画後、EtBrの希薄溶液中にゲルを浸漬さ
せる。次いでＵＶ光下でゲルを検査することにより、Ｄ
ＮＡが可視化される（Maniatis他、1982編、Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Sprin
g Harbor Laboratory を参照のこと）。
出するのに用いることができるけれども、一本鎖核酸に
対するEtBrの親和性は比較的低い。EtBrはゲル電気泳動
後に核酸を非特異的に検出するのに常用されている。適
当なゲル母材、例えばアガロースまたはアクリルアミド
上でのサイズ分画後、EtBrの希薄溶液中にゲルを浸漬さ
せる。次いでＵＶ光下でゲルを検査することにより、Ｄ
ＮＡが可視化される（Maniatis他、1982編、Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, New York, Cold Sprin
g Harbor Laboratory を参照のこと）。
【００１１】二本鎖ＤＮＡに結合した時にEtBrまたは他
のＤＮＡ結合標識が示す蛍光の増加に基づいたＰＣＲお
よび同時ＰＣＲ生成物検出のための均一アッセイは、Hi
guchi 他, 1992, Bio/Techniques 10:413-417 ; Higuc
hi他, 1993, Bio/Techniques11:1026-1030 ;並びに欧州
特許公報第487,218 号および512,334 号中に記載されて
いる。この方法は、最も有意には増幅された標的の増加
から、増幅反応中の二本鎖ＤＮＡの増加の直接検出を可
能にする。しかしながら、それらの方法は反応液中の二
本鎖ＤＮＡの全量のみを検出し、特定の核酸配列を識別
しない。アッセイの特異性は増幅反応の特異性に依存す
る。
のＤＮＡ結合標識が示す蛍光の増加に基づいたＰＣＲお
よび同時ＰＣＲ生成物検出のための均一アッセイは、Hi
guchi 他, 1992, Bio/Techniques 10:413-417 ; Higuc
hi他, 1993, Bio/Techniques11:1026-1030 ;並びに欧州
特許公報第487,218 号および512,334 号中に記載されて
いる。この方法は、最も有意には増幅された標的の増加
から、増幅反応中の二本鎖ＤＮＡの増加の直接検出を可
能にする。しかしながら、それらの方法は反応液中の二
本鎖ＤＮＡの全量のみを検出し、特定の核酸配列を識別
しない。アッセイの特異性は増幅反応の特異性に依存す
る。
【００１２】核酸ハイブリダイゼーションアッセイにお
ける相互作用性蛍光標識で標識されたオリゴヌクレオチ
ドの使用は、Morrison, 1992, Nonisotopic DNA Probe
Techniques, Kricka編, Academic Press, Inc., San D
iego, CA, 第13章；HellerおよびMorrison, 1985, Rapi
d Detection and Identification of Infections Agent
s, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 第245-256
頁中に記載されている。この方法は、蛍光エネルギー転
移（ＦＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー転移、非放射性エネ
ルギー転移、長域エネルギー転移、双極子共役エネルギ
ー転移、またはフェルスターエネルギー転移として文献
中に記載されている、適当な蛍光標識が極めて接近した
時に起こる蛍光の変化に頼っている。多数の適当な蛍光
標識が当業界において公知であり、そして例えばMolecu
lar Probes社（Eugene, OR）から市販されている。
ける相互作用性蛍光標識で標識されたオリゴヌクレオチ
ドの使用は、Morrison, 1992, Nonisotopic DNA Probe
Techniques, Kricka編, Academic Press, Inc., San D
iego, CA, 第13章；HellerおよびMorrison, 1985, Rapi
d Detection and Identification of Infections Agent
s, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 第245-256
頁中に記載されている。この方法は、蛍光エネルギー転
移（ＦＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー転移、非放射性エネ
ルギー転移、長域エネルギー転移、双極子共役エネルギ
ー転移、またはフェルスターエネルギー転移として文献
中に記載されている、適当な蛍光標識が極めて接近した
時に起こる蛍光の変化に頼っている。多数の適当な蛍光
標識が当業界において公知であり、そして例えばMolecu
lar Probes社（Eugene, OR）から市販されている。
【００１３】Morrison, 1992, 前掲は、一緒に合わせら
れるかまたはプローブハイブリダイゼーションまで分け
られる別個のオリゴヌクレオチドに挿入性蛍光標識を結
合させるＦＥＴ型アッセイ形式を記載している。２つの
プローブを必要とするそれらのアッセイ方式は、プロー
ブ−プローブハイブリダイゼーションがプローブ−標的
ハイブリダイゼーションと競合するかどうかによって、
非競合または競合アッセイとして記載されている。別の
アッセイ形式では、第一の蛍光標識をハイブリダイゼー
ションプローブに結合させ、そして第二の蛍光標識を二
本鎖ハイブリダイゼーション二重型中に挿入することに
よってごく接近した状態にする。溶液中の挿入標識とハ
イブリダイズしてないプローブとの間には有意な相互作
用は全く起こらない。挿入標識はどんな二本鎖核酸中に
も挿入することができるので、この形式は一本鎖標的核
酸の検出にのみ実用的である。
れるかまたはプローブハイブリダイゼーションまで分け
られる別個のオリゴヌクレオチドに挿入性蛍光標識を結
合させるＦＥＴ型アッセイ形式を記載している。２つの
プローブを必要とするそれらのアッセイ方式は、プロー
ブ−プローブハイブリダイゼーションがプローブ−標的
ハイブリダイゼーションと競合するかどうかによって、
非競合または競合アッセイとして記載されている。別の
アッセイ形式では、第一の蛍光標識をハイブリダイゼー
ションプローブに結合させ、そして第二の蛍光標識を二
本鎖ハイブリダイゼーション二重型中に挿入することに
よってごく接近した状態にする。溶液中の挿入標識とハ
イブリダイズしてないプローブとの間には有意な相互作
用は全く起こらない。挿入標識はどんな二本鎖核酸中に
も挿入することができるので、この形式は一本鎖標的核
酸の検出にのみ実用的である。
【００１４】上述の米国特許第5,210,015 号に記載され
た核酸検出方法の一態様では、ごく近位において挿入性
蛍光標識で標識されているプローブを使用する。増幅中
のプローブ分解が標識を分離させ、それによって検出可
能な蛍光変化をもたらすように、１または複数のヌクレ
オチドにより隔てられたプローブに複数の標識が取り付
けられる。そのような多重標識プローブは合成が困難で
あり費用がかかる。
た核酸検出方法の一態様では、ごく近位において挿入性
蛍光標識で標識されているプローブを使用する。増幅中
のプローブ分解が標識を分離させ、それによって検出可
能な蛍光変化をもたらすように、１または複数のヌクレ
オチドにより隔てられたプローブに複数の標識が取り付
けられる。そのような多重標識プローブは合成が困難で
あり費用がかかる。
【００１５】当業者の技術の範囲内である分子生物学お
よび核酸化学の従来技術は、文献中に十分に説明されて
おり、例えば、Sambrook他, 1985, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator
y, Cold Spring Harbor, NewYork ; Oligonucleotide S
ynthesis (M.J. Gait編, 1984) ; Nucleic Acid Hybrid
ization (B.D. HamesおよびS.J. Higgins編, 1984) ;
並びにMethods in Enzymology (Academic Press, Inc.)
のシリーズを参照のこと。
よび核酸化学の従来技術は、文献中に十分に説明されて
おり、例えば、Sambrook他, 1985, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator
y, Cold Spring Harbor, NewYork ; Oligonucleotide S
ynthesis (M.J. Gait編, 1984) ; Nucleic Acid Hybrid
ization (B.D. HamesおよびS.J. Higgins編, 1984) ;
並びにMethods in Enzymology (Academic Press, Inc.)
のシリーズを参照のこと。
【００１６】
【課題を解決するための手段】本発明は、標識と相互作
用して該標識の発光を変化させることができるＤＮＡ結
合化合物を使って、溶液中の発光性標識で標識されたオ
リゴヌクレオチドプローブの発光を制御する方法を提供
する。本発明は、溶液中のオリゴヌクレオチドの分解を
検出する方法も提供する。オリゴヌクレオチドは発光性
標識で標識される。標識と相互作用して該標識の発光を
変化させることができるＤＮＡ結合化合物の存在下でオ
リゴヌクレオチド開裂が行われる。生成する標識の発光
の変化を測定することにより、オリゴヌクレオチド分解
が検出される。
用して該標識の発光を変化させることができるＤＮＡ結
合化合物を使って、溶液中の発光性標識で標識されたオ
リゴヌクレオチドプローブの発光を制御する方法を提供
する。本発明は、溶液中のオリゴヌクレオチドの分解を
検出する方法も提供する。オリゴヌクレオチドは発光性
標識で標識される。標識と相互作用して該標識の発光を
変化させることができるＤＮＡ結合化合物の存在下でオ
リゴヌクレオチド開裂が行われる。生成する標識の発光
の変化を測定することにより、オリゴヌクレオチド分解
が検出される。
【００１７】本発明は、オリゴヌクレオチドに結合した
発光性標識のＤＮＡ結合化合物による有意な溶液中消光
が起こる条件を提供する。この消光は、相補的配列への
標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを使
わずに起こる。本発明の方法は、標識オリゴヌクレオチ
ドの長さに対するこの消光の依存性を利用する。短鎖オ
リゴヌクレオチド（約６ヌクレオチド以下）に結合した
発光性標識の消光は、長鎖オリゴヌクレオチドに結合し
た発光性標識の消光よりも検出可能な位少ない。
発光性標識のＤＮＡ結合化合物による有意な溶液中消光
が起こる条件を提供する。この消光は、相補的配列への
標識オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを使
わずに起こる。本発明の方法は、標識オリゴヌクレオチ
ドの長さに対するこの消光の依存性を利用する。短鎖オ
リゴヌクレオチド（約６ヌクレオチド以下）に結合した
発光性標識の消光は、長鎖オリゴヌクレオチドに結合し
た発光性標識の消光よりも検出可能な位少ない。
【００１８】一本鎖オリゴヌクレオチドに結合した発光
性標識のＤＮＡ結合化合物による溶液中消光の発生と、
オリゴヌクレオチドの長さに対する依存性は、共に従来
技術から見れば驚くべきことである。プローブに結合し
た蛍光標識の挿入化合物による消光に基づいた従来のア
ッセイ（Morrison, 1992, 前掲を参照のこと）は、消光
剤と標識を極めて近位状態にする二本鎖ハイブリダイゼ
ーション二重型中への消光剤の挿入を頼みにしている。
従来技術は、ハイブリダイズしていない一本鎖プローブ
に結合した標識の溶液中消光は無視できると教示してい
る。
性標識のＤＮＡ結合化合物による溶液中消光の発生と、
オリゴヌクレオチドの長さに対する依存性は、共に従来
技術から見れば驚くべきことである。プローブに結合し
た蛍光標識の挿入化合物による消光に基づいた従来のア
ッセイ（Morrison, 1992, 前掲を参照のこと）は、消光
剤と標識を極めて近位状態にする二本鎖ハイブリダイゼ
ーション二重型中への消光剤の挿入を頼みにしている。
従来技術は、ハイブリダイズしていない一本鎖プローブ
に結合した標識の溶液中消光は無視できると教示してい
る。
【００１９】蛍光エネルギー転移による消光は、挿入標
識が極めて近位にあり、且つ溶液中の２つの分子が有意
な消光を引き起こすのに十分な位近位には維持されない
ことを必要とする。更に、従来技術に記載された挿入性
消光剤は一本鎖ＤＮＡには有意に結合しないので、従っ
て溶液中の一本鎖ＤＮＡに結合した標識の感知できるほ
どの消光は予想されなかった。対照的に、本発明は、溶
液中で生じるＤＮＡ結合化合物による一本鎖核酸に結合
した蛍光標識の消光に基づいている。
識が極めて近位にあり、且つ溶液中の２つの分子が有意
な消光を引き起こすのに十分な位近位には維持されない
ことを必要とする。更に、従来技術に記載された挿入性
消光剤は一本鎖ＤＮＡには有意に結合しないので、従っ
て溶液中の一本鎖ＤＮＡに結合した標識の感知できるほ
どの消光は予想されなかった。対照的に、本発明は、溶
液中で生じるＤＮＡ結合化合物による一本鎖核酸に結合
した蛍光標識の消光に基づいている。
【００２０】本発明は更に、オリゴヌクレオチドプロー
ブへのハイブリダイゼーションにより試料中の標的核酸
を検出する改良方法を提供する。この方法は、標的核酸
にハイブリダイズしたプローブの選択的開裂を当てにし
ている。本発明の方法を使った開裂プローブの検出は標
的核酸の存在を示す。
ブへのハイブリダイゼーションにより試料中の標的核酸
を検出する改良方法を提供する。この方法は、標的核酸
にハイブリダイズしたプローブの選択的開裂を当てにし
ている。本発明の方法を使った開裂プローブの検出は標
的核酸の存在を示す。
【００２１】よって、本発明は、試料中の標的核酸を検
出する方法であって、 (a) 前記試料、ＤＮＡ結合化合物および発光性標識で標
識されたオリゴヌクレオチドプローブを含んで成る反応
混合物を用意し、ここで前記プローブは前記標的核酸に
ハイブリダイズすることができる配列を含み、そして前
記ＤＮＡ結合化合物は前記標識の発光を変化させること
ができ； (b) 前記標識の発光を測定し； (c) 前記オリゴヌクレオチドプローブが前記標的配列に
ハイブリダイズしそして開裂される条件下で前記混合物
を処理し； (d) 前記標識の発光を測定し；そして (e) 段階(b) と段階(d) の発光の差により、前記標的配
列が存在するかどうかを決定することを含んで成る方法
を提供する。
出する方法であって、 (a) 前記試料、ＤＮＡ結合化合物および発光性標識で標
識されたオリゴヌクレオチドプローブを含んで成る反応
混合物を用意し、ここで前記プローブは前記標的核酸に
ハイブリダイズすることができる配列を含み、そして前
記ＤＮＡ結合化合物は前記標識の発光を変化させること
ができ； (b) 前記標識の発光を測定し； (c) 前記オリゴヌクレオチドプローブが前記標的配列に
ハイブリダイズしそして開裂される条件下で前記混合物
を処理し； (d) 前記標識の発光を測定し；そして (e) 段階(b) と段階(d) の発光の差により、前記標的配
列が存在するかどうかを決定することを含んで成る方法
を提供する。
【００２２】標的核酸にハイブリダイズしたプローブの
選択的開裂は多数の既知の方法のいずれによっても達成
することができる。標的配列にハイブリダイズしたプロ
ーブを選択的に開裂させる適当な反応の例は、Saiki
他, 1985, 前掲；特許公報第WO89/09284 号および米国
特許第5,210,015 号において記載されている。核酸を検
出するための本発明の方法は、増幅工程と共同した利用
に特に適する。よって、本発明の一態様では、段階(c)
の前に標的配列が増幅される。
選択的開裂は多数の既知の方法のいずれによっても達成
することができる。標的配列にハイブリダイズしたプロ
ーブを選択的に開裂させる適当な反応の例は、Saiki
他, 1985, 前掲；特許公報第WO89/09284 号および米国
特許第5,210,015 号において記載されている。核酸を検
出するための本発明の方法は、増幅工程と共同した利用
に特に適する。よって、本発明の一態様では、段階(c)
の前に標的配列が増幅される。
【００２３】好ましい態様では、本発明は、プライマー
伸長とハイブリダイズした標識プローブの開裂の両方に
単一の核酸ポリメラーゼを使用する、米国特許第5,210,
015号に記載の均一ＰＣＲ増幅／ＰＣＲ生成物検出アッ
セイの改良を提供する。本発明により提供される改良
は、開裂されたプローブと未開裂のプローブを分離する
ための反応後操作を必要とせずに単一の発光性標識で標
識されたプローブの使用を可能にする。
伸長とハイブリダイズした標識プローブの開裂の両方に
単一の核酸ポリメラーゼを使用する、米国特許第5,210,
015号に記載の均一ＰＣＲ増幅／ＰＣＲ生成物検出アッ
セイの改良を提供する。本発明により提供される改良
は、開裂されたプローブと未開裂のプローブを分離する
ための反応後操作を必要とせずに単一の発光性標識で標
識されたプローブの使用を可能にする。
【００２４】よって、本発明は、ＰＣＲを使って試料中
の標的核酸配列を検出する方法であって、 (a) 前記試料、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、
５′→３′ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラー
ゼ、ＤＮＡ結合化合物、および前記標的核酸の一領域に
ハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプ
ローブを含んで成るＰＣＲ反応混合物を用意し、ここで
前記オリゴヌクレオチドプローブは前記オリゴヌクレオ
チドプライマーにより結合された前記標的核酸配列中に
ハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドプローブは
発光性標識で標識されており、そして前記ＤＮＡ結合化
合物は前記標識の発光を変化させることができ； (b) 前記標識の発光を測定し； (c) ＰＣＲ条件下でＰＣＲ反応混合物を処理し、ここで
前記核酸ポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性が
前記標的配列にハイブリダイズしたプローブを開裂し； (d) 前記標識の発光を測定し；そして (e) 段階(b) と段階(d) の発光の差により、前記標的配
列が存在するかどうかを決定することを含んで成る方法
を提供する。
の標的核酸配列を検出する方法であって、 (a) 前記試料、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、
５′→３′ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラー
ゼ、ＤＮＡ結合化合物、および前記標的核酸の一領域に
ハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプ
ローブを含んで成るＰＣＲ反応混合物を用意し、ここで
前記オリゴヌクレオチドプローブは前記オリゴヌクレオ
チドプライマーにより結合された前記標的核酸配列中に
ハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドプローブは
発光性標識で標識されており、そして前記ＤＮＡ結合化
合物は前記標識の発光を変化させることができ； (b) 前記標識の発光を測定し； (c) ＰＣＲ条件下でＰＣＲ反応混合物を処理し、ここで
前記核酸ポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性が
前記標的配列にハイブリダイズしたプローブを開裂し； (d) 前記標識の発光を測定し；そして (e) 段階(b) と段階(d) の発光の差により、前記標的配
列が存在するかどうかを決定することを含んで成る方法
を提供する。
【００２５】均一ＰＣＲ増幅／検出アッセイの別の態様
によれば、反応混合物中に提供されるＤＮＡ結合化合物
は二本鎖ＤＮＡに結合すると検出可能なシグナルを提供
することを特徴とし、ここで該シグナルは前記化合物が
未結合の時に提供される前記シグナルの量よりも大き
く、そして増幅工程から生じる二本鎖ＤＮＡの全増加量
を測定するためにＤＮＡ結合化合物のシグナルが監視さ
れる。この態様では、ＤＮＡ結合化合物は未結合プロー
ブの発光の消光剤としておよびHiguchi 他, 1992, 前掲
に記載の方法で使用されたようなシグナル生成化合物と
しての両方で働く。本発明のこの態様では、ＤＮＡ結合
化合物により生じるシグナルの変化が特定の標的配列の
増幅を表す。よって、該方法は、追加の試薬を必要とせ
ずに均一アッセイにおける増幅の成功の独自の尺度を提
供する。
によれば、反応混合物中に提供されるＤＮＡ結合化合物
は二本鎖ＤＮＡに結合すると検出可能なシグナルを提供
することを特徴とし、ここで該シグナルは前記化合物が
未結合の時に提供される前記シグナルの量よりも大き
く、そして増幅工程から生じる二本鎖ＤＮＡの全増加量
を測定するためにＤＮＡ結合化合物のシグナルが監視さ
れる。この態様では、ＤＮＡ結合化合物は未結合プロー
ブの発光の消光剤としておよびHiguchi 他, 1992, 前掲
に記載の方法で使用されたようなシグナル生成化合物と
しての両方で働く。本発明のこの態様では、ＤＮＡ結合
化合物により生じるシグナルの変化が特定の標的配列の
増幅を表す。よって、該方法は、追加の試薬を必要とせ
ずに均一アッセイにおける増幅の成功の独自の尺度を提
供する。
【００２６】本発明の理解を手助けするために、幾つか
の用語を下記に定義する。「核酸」および「オリゴヌク
レオチド」なる用語は、検出しようとするプローブおよ
びオリゴマー断片を指し、ポリデオキシリボヌクレオチ
ド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリ
ボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、およびプ
リンもしくはピリミジン塩基または修飾されたプリンも
しくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである他の型の
ポリヌクレオチドに対する総称であろう。「核酸」と
「オリゴヌクレオチド」の用語の間に長さの区別をする
意図は全くなく、それらの用語は相互に交換可能に用い
られるだろう。それらの語は分子の一次構造のみに言及
する。よって、それらの用語は二本鎖および一本鎖ＤＮ
Ａ、並びに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを包含する。
の用語を下記に定義する。「核酸」および「オリゴヌク
レオチド」なる用語は、検出しようとするプローブおよ
びオリゴマー断片を指し、ポリデオキシリボヌクレオチ
ド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、ポリリ
ボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、およびプ
リンもしくはピリミジン塩基または修飾されたプリンも
しくはピリミジン塩基のＮ−グリコシドである他の型の
ポリヌクレオチドに対する総称であろう。「核酸」と
「オリゴヌクレオチド」の用語の間に長さの区別をする
意図は全くなく、それらの用語は相互に交換可能に用い
られるだろう。それらの語は分子の一次構造のみに言及
する。よって、それらの用語は二本鎖および一本鎖ＤＮ
Ａ、並びに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを包含する。
【００２７】「標的領域」、「標的配列」および「標的
核酸配列」なる用語は、検出しようとする核酸の領域を
指す。「プローブ」という用語は、相補的塩基対合によ
って標的核酸の配列と二重型構造を形成する、典型的に
は標識されたオリゴヌレオチドを意味する。プローブ
は、標的配列の一領域に対応する、好ましくは10〜50ヌ
クレオチド、より好ましくは20〜30ヌクレオチドから成
る「ハイブリダイズ領域」を含んで成るだろう。「対応
する」とは、指摘する核酸と同一であるかまたは相補的
であるという意味である。本発明では、プローブオリゴ
ヌクレオチドは、検出を可能にするために蛍光標識で標
識され、即ち蛍光標識に結合される。
核酸配列」なる用語は、検出しようとする核酸の領域を
指す。「プローブ」という用語は、相補的塩基対合によ
って標的核酸の配列と二重型構造を形成する、典型的に
は標識されたオリゴヌレオチドを意味する。プローブ
は、標的配列の一領域に対応する、好ましくは10〜50ヌ
クレオチド、より好ましくは20〜30ヌクレオチドから成
る「ハイブリダイズ領域」を含んで成るだろう。「対応
する」とは、指摘する核酸と同一であるかまたは相補的
であるという意味である。本発明では、プローブオリゴ
ヌクレオチドは、検出を可能にするために蛍光標識で標
識され、即ち蛍光標識に結合される。
【００２８】「ハイブリダイゼーション」なる用語は、
相補的塩基対合によって起こる２つの一本鎖核酸による
二重型構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、
完全に相補的な核酸鎖の間でも小範囲のミスマッチを含
む核酸鎖の間でも起こり得る。完全に相補的な核酸鎖の
みがハイブリダイズするであろう条件は「緊縮ハイブリ
ダイゼーション条件」と呼称される。小範囲のミスマッ
チを除いて相補的である２つの一本鎖核酸は「実質上相
補的」と呼ばれる。実質上相補的な配列の安定な二重型
は、低緊縮ハイブリダイゼーション条件下で達成するこ
とができる。核酸技術の当業者は、例えばオリゴヌクレ
オチドの長さおよび塩基対濃度、イオン強度並びに不適
正塩基対の発生率を含む多数の変数を経験的に考慮し
て、二重型安定性を決定することができる。
相補的塩基対合によって起こる２つの一本鎖核酸による
二重型構造の形成を指す。ハイブリダイゼーションは、
完全に相補的な核酸鎖の間でも小範囲のミスマッチを含
む核酸鎖の間でも起こり得る。完全に相補的な核酸鎖の
みがハイブリダイズするであろう条件は「緊縮ハイブリ
ダイゼーション条件」と呼称される。小範囲のミスマッ
チを除いて相補的である２つの一本鎖核酸は「実質上相
補的」と呼ばれる。実質上相補的な配列の安定な二重型
は、低緊縮ハイブリダイゼーション条件下で達成するこ
とができる。核酸技術の当業者は、例えばオリゴヌクレ
オチドの長さおよび塩基対濃度、イオン強度並びに不適
正塩基対の発生率を含む多数の変数を経験的に考慮し
て、二重型安定性を決定することができる。
【００２９】「配列特異的オリゴヌクレオチド」および
「ＳＳＯ」なる用語は、ハイブリダイズ領域が検出しよ
うとする配列に正確に相補的であるオリゴヌクレオチド
プローブを指す。プローブが正確に相補的な標的配列に
のみハイブリダイズするであろう緊縮（stringent)ハイ
ブリダイゼーション条件の使用により、特異的標的配列
の検出が可能になる。緊縮ハイブリダイゼーション条件
は当業界において周知である（例えば、Sambrook他, 19
85, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New
Yorkを参照のこと）。
「ＳＳＯ」なる用語は、ハイブリダイズ領域が検出しよ
うとする配列に正確に相補的であるオリゴヌクレオチド
プローブを指す。プローブが正確に相補的な標的配列に
のみハイブリダイズするであろう緊縮（stringent)ハイ
ブリダイゼーション条件の使用により、特異的標的配列
の検出が可能になる。緊縮ハイブリダイゼーション条件
は当業界において周知である（例えば、Sambrook他, 19
85, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New
Yorkを参照のこと）。
【００３０】緊縮条件は配列依存性であり、異なる環境
中では異なるだろう。一般的には、緊縮条件は、限定さ
れたイオン強度とｐＨにおいて特定配列の融解温度（Ｔ
ｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、塩
基対の50％が解離されている温度（限定されたイオン強
度とｐＨの下で）である。ハイブリダイズ条件の緊縮性
を緩めると、配列ミスマッチが許容されるようになるだ
ろう。許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼ
ーション条件の適当な調整により制御することができ
る。
中では異なるだろう。一般的には、緊縮条件は、限定さ
れたイオン強度とｐＨにおいて特定配列の融解温度（Ｔ
ｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、塩
基対の50％が解離されている温度（限定されたイオン強
度とｐＨの下で）である。ハイブリダイズ条件の緊縮性
を緩めると、配列ミスマッチが許容されるようになるだ
ろう。許容されるミスマッチの程度は、ハイブリダイゼ
ーション条件の適当な調整により制御することができ
る。
【００３１】「部分配列」という用語は、別の配列の中
に含まれるヌクレオチド配列を指す。本明細書中で使用
する「標識」という用語は、核酸に取り付けることがで
き、そして検出可能なシグナルを提供するためかまたは
第二の標識と相互作用して第二の標識により提供される
検出可能なシグナルを変化させるためのいずれかに使う
ことができる、任意の原子または分子を指す。好ましい
標識は、蛍光、化学発光または生物発光により検出可能
なシグナルを生じる発光性化合物である。
に含まれるヌクレオチド配列を指す。本明細書中で使用
する「標識」という用語は、核酸に取り付けることがで
き、そして検出可能なシグナルを提供するためかまたは
第二の標識と相互作用して第二の標識により提供される
検出可能なシグナルを変化させるためのいずれかに使う
ことができる、任意の原子または分子を指す。好ましい
標識は、蛍光、化学発光または生物発光により検出可能
なシグナルを生じる発光性化合物である。
【００３２】「発色団」なる用語は、光の形でエネルギ
ーを吸収する非放射性化合物を指す。或る発色団は、化
学発光をもたらす化学反応により、または蛍光をもたら
す光の吸収により、励起して光を放出することができ
る。「蛍光団」なる用語は、蛍光を生じることのできる
化合物、即ち、或る周波数で光を吸収しそして別の（通
常はより低い）周波数で光を放出する化合物を指す。
「生物発光」なる用語は、発光性化合物が生物体中に見
つかるものである化学発光の形を言う。生物発光化合物
の例としては細菌のルシフェラーゼおよび蛍のルシフェ
ラーゼが挙げられる。
ーを吸収する非放射性化合物を指す。或る発色団は、化
学発光をもたらす化学反応により、または蛍光をもたら
す光の吸収により、励起して光を放出することができ
る。「蛍光団」なる用語は、蛍光を生じることのできる
化合物、即ち、或る周波数で光を吸収しそして別の（通
常はより低い）周波数で光を放出する化合物を指す。
「生物発光」なる用語は、発光性化合物が生物体中に見
つかるものである化学発光の形を言う。生物発光化合物
の例としては細菌のルシフェラーゼおよび蛍のルシフェ
ラーゼが挙げられる。
【００３３】「消光」という用語は、機構にかかわら
ず、第二の化合物により引き起こされる第一の化合物の
蛍光の減少を意味する。消光は典型的にはそれらの化合
物が極めて近位にあることを必要とする。本明細書中で
使用する時、化合物または化合物の蛍光が消光されると
言い、両用法とも同じ現象を指すと解釈される。「挿入
剤」という用語は、核酸二重らせん中の重ねられた塩基
対の間に非共有結合的に挿入することができる剤または
成分を指す。
ず、第二の化合物により引き起こされる第一の化合物の
蛍光の減少を意味する。消光は典型的にはそれらの化合
物が極めて近位にあることを必要とする。本明細書中で
使用する時、化合物または化合物の蛍光が消光されると
言い、両用法とも同じ現象を指すと解釈される。「挿入
剤」という用語は、核酸二重らせん中の重ねられた塩基
対の間に非共有結合的に挿入することができる剤または
成分を指す。
【００３４】多段階法に適用される「均一」なる用語
は、本明細書中で使用する時、段階と段階の間の試料処
理または操作の必要性が最小化されるかまたは排除され
る、該方法の段階を実施する方法を指す。例えば、「均
一」増幅／検出アッセイとは、増幅と検出の間の試料処
理と操作の必要性が最小化されるかまたは排除される増
幅および検出合同アッセイを言う。
は、本明細書中で使用する時、段階と段階の間の試料処
理または操作の必要性が最小化されるかまたは排除され
る、該方法の段階を実施する方法を指す。例えば、「均
一」増幅／検出アッセイとは、増幅と検出の間の試料処
理と操作の必要性が最小化されるかまたは排除される増
幅および検出合同アッセイを言う。
【００３５】「反応混合物」なる用語は、反応を実施す
るのに必要な試薬を含有する溶液を指す。増幅反応を実
施するのに必要な試薬を含有する溶液を意味する「増幅
反応混合物」は、典型的には、適当な緩衝液中にオリゴ
ヌクレオチドプライマーとＤＮＡポリメラーゼを含有す
る。特定反応のための反応混合物は文献から周知であ
る。
るのに必要な試薬を含有する溶液を指す。増幅反応を実
施するのに必要な試薬を含有する溶液を意味する「増幅
反応混合物」は、典型的には、適当な緩衝液中にオリゴ
ヌクレオチドプライマーとＤＮＡポリメラーゼを含有す
る。特定反応のための反応混合物は文献から周知であ
る。
【００３６】本発明は、溶液中の発光性標識で標識され
たオリゴヌクレオチドの発光を制御する方法を提供す
る。本発明の方法は、単一の発光性標識で標識された一
本鎖オリゴヌクレオチドの開裂の検出に適用できる。開
裂されたオリゴヌクレオチドの検出は、標識と相互作用
して該標識の発光を減少させることのできるＤＮＡ結合
化合物を含有する溶液中で実施される。開裂からくる標
識オリゴヌクレオチドの長さの変化が、取り付けられた
標識の発光の検出可能な減少をもたらす。適当な発光性
標識および標識と相互作用して該標識の発光を変化させ
ることができるＤＮＡ結合化合物を下記に記載する。
たオリゴヌクレオチドの発光を制御する方法を提供す
る。本発明の方法は、単一の発光性標識で標識された一
本鎖オリゴヌクレオチドの開裂の検出に適用できる。開
裂されたオリゴヌクレオチドの検出は、標識と相互作用
して該標識の発光を減少させることのできるＤＮＡ結合
化合物を含有する溶液中で実施される。開裂からくる標
識オリゴヌクレオチドの長さの変化が、取り付けられた
標識の発光の検出可能な減少をもたらす。適当な発光性
標識および標識と相互作用して該標識の発光を変化させ
ることができるＤＮＡ結合化合物を下記に記載する。
【００３７】第二の化合物によって或る化合物の発光を
消光させることができる機構は、Morrison, 1992, Noni
sotopic DNA Probe Techniques (Kricka編, Academic P
ress, Inc., San Diego, CA), 第13章の中に記載されて
いる。１つの周知の機構は蛍光エネルギー転移（ＦＥ
Ｔ）であり、これは文献中、蛍光共鳴エネルギー転移、
非放射性エネルギー転移、長域エネルギー転移、双極子
共役エネルギー転移およびフェルスターエネルギー転移
とも呼ばれる。ＦＥＴの主な必要条件は、化合物のうち
の１つ（エネルギー供与体）の発光スペクトルが別の化
合物（エネルギー受容体）の吸収スペクトルと重複しな
ければならないということである。
消光させることができる機構は、Morrison, 1992, Noni
sotopic DNA Probe Techniques (Kricka編, Academic P
ress, Inc., San Diego, CA), 第13章の中に記載されて
いる。１つの周知の機構は蛍光エネルギー転移（ＦＥ
Ｔ）であり、これは文献中、蛍光共鳴エネルギー転移、
非放射性エネルギー転移、長域エネルギー転移、双極子
共役エネルギー転移およびフェルスターエネルギー転移
とも呼ばれる。ＦＥＴの主な必要条件は、化合物のうち
の１つ（エネルギー供与体）の発光スペクトルが別の化
合物（エネルギー受容体）の吸収スペクトルと重複しな
ければならないということである。
【００３８】Styer およびHaugland, 1967, Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 98:719は、その距離が10オングス
トローム未満である時、幾つかの一般的発光体−消光剤
ペアのエネルギー転移効率が100 ％に近づき得ることを
示している。エネルギー転移率はエネルギー供与体分子
とエネルギー受容体分子の間の距離の６乗に比例して減
少する。従って、距離のわずかな増加がエネルギー転移
率を大きく減少させ、エネルギー供与体の蛍光の増加を
引き起こし、そして消光剤発色団が蛍光団でもある場
合、エネルギー受容体の蛍光の減少を引き起こす。
l. Acad. Sci. USA 98:719は、その距離が10オングス
トローム未満である時、幾つかの一般的発光体−消光剤
ペアのエネルギー転移効率が100 ％に近づき得ることを
示している。エネルギー転移率はエネルギー供与体分子
とエネルギー受容体分子の間の距離の６乗に比例して減
少する。従って、距離のわずかな増加がエネルギー転移
率を大きく減少させ、エネルギー供与体の蛍光の増加を
引き起こし、そして消光剤発色団が蛍光団でもある場
合、エネルギー受容体の蛍光の減少を引き起こす。
【００３９】本発明の代表的方法では、一本鎖オリゴヌ
クレオチドに結合した蛍光標識の発光が検出される。Ｄ
ＮＡ結合化合物は、結合したオリゴヌクレオチドの長さ
に依存する程度に標識の蛍光を消光する。ＦＥＴ消光は
周知であるけれども、一本鎖オリゴヌクレオチドに結合
した蛍光標識のＤＮＡ結合化合物による溶液中消光の発
生および該オリゴヌクレオチドの長さに対する消光の依
存性は、両方とも従来技術からは予想できない。距離を
増加させると蛍光標識の相互作用が非常に急速に減少す
るため、溶液中の標識は有意に相互作用しないと思われ
ていた。
クレオチドに結合した蛍光標識の発光が検出される。Ｄ
ＮＡ結合化合物は、結合したオリゴヌクレオチドの長さ
に依存する程度に標識の蛍光を消光する。ＦＥＴ消光は
周知であるけれども、一本鎖オリゴヌクレオチドに結合
した蛍光標識のＤＮＡ結合化合物による溶液中消光の発
生および該オリゴヌクレオチドの長さに対する消光の依
存性は、両方とも従来技術からは予想できない。距離を
増加させると蛍光標識の相互作用が非常に急速に減少す
るため、溶液中の標識は有意に相互作用しないと思われ
ていた。
【００４０】一般的な溶液中の相互作用の欠如は、プロ
ーブに結合された蛍光標識の挿入化合物による消光を基
にしたアッセイ（Morrison, 1992, 前掲）から明らかで
ある。それらの以前に記載されたアッセイは、消光剤と
標識を極めて接近した状態にし、それによってバックグ
ラウンドの未消光状態（挿入消光剤を含む溶液中ハイブ
リダイズしていない標識一本鎖プローブから成る）に対
して消光を増大させるための、二本鎖ハイブリダイゼー
ション二重型中への消光剤の挿入に頼っている。
ーブに結合された蛍光標識の挿入化合物による消光を基
にしたアッセイ（Morrison, 1992, 前掲）から明らかで
ある。それらの以前に記載されたアッセイは、消光剤と
標識を極めて接近した状態にし、それによってバックグ
ラウンドの未消光状態（挿入消光剤を含む溶液中ハイブ
リダイズしていない標識一本鎖プローブから成る）に対
して消光を増大させるための、二本鎖ハイブリダイゼー
ション二重型中への消光剤の挿入に頼っている。
【００４１】記載の挿入消光剤は一本鎖ＤＮＡ、即ちハ
イブリダイズしていないプローブを有意に結合しない。
ＦＥＴの距離依存性から予想される通り、従来技術はハ
イブリダイズしていないプローブの有意な溶液中消光を
報告していない。従来技術の教示とは対照的に、本発明
は、一本鎖核酸に結合された蛍光標識のＤＮＡ結合化合
物による有意な消光が溶液中で起こる条件を提供する。
イブリダイズしていないプローブを有意に結合しない。
ＦＥＴの距離依存性から予想される通り、従来技術はハ
イブリダイズしていないプローブの有意な溶液中消光を
報告していない。従来技術の教示とは対照的に、本発明
は、一本鎖核酸に結合された蛍光標識のＤＮＡ結合化合
物による有意な消光が溶液中で起こる条件を提供する。
【００４２】文献中に記載された多数の蛍光団およびＤ
ＮＡ結合発色団が、本発明の方法への使用に適当であ
る。蛍光団の発光スペクトルが発色団の吸収スペクトル
と重複するような適当な蛍光団とＤＮＡ結合発色団のペ
アが選択される。理論上、散乱された励起光による干渉
を最少にするために、蛍光団は高いストークスシフト
（最大吸収波長と最大発光波長とが大きな差）を有する
べきである。
ＮＡ結合発色団が、本発明の方法への使用に適当であ
る。蛍光団の発光スペクトルが発色団の吸収スペクトル
と重複するような適当な蛍光団とＤＮＡ結合発色団のペ
アが選択される。理論上、散乱された励起光による干渉
を最少にするために、蛍光団は高いストークスシフト
（最大吸収波長と最大発光波長とが大きな差）を有する
べきである。
【００４３】当業界において周知である適当な標識とし
ては、フルオレセインおよびその誘導体、例えば FA
MTM、 HEXTM、 TETTMおよび JOETM；ローダミンおよび
その誘導体、例えばテキサスレッド、 ROXTMおよび TAM
RATM；ルシファーイエロー、並びにクマリン誘導体、例
えば７−Me2N−クマリン−４−酢酸、７−OH−４−CH3
−クマリン−３−酢酸および７−NH2 −４−CH3 −クマ
リン−３−酢酸（AMCA）が挙げられるがそれらに限定さ
れない。
ては、フルオレセインおよびその誘導体、例えば FA
MTM、 HEXTM、 TETTMおよび JOETM；ローダミンおよび
その誘導体、例えばテキサスレッド、 ROXTMおよび TAM
RATM；ルシファーイエロー、並びにクマリン誘導体、例
えば７−Me2N−クマリン−４−酢酸、７−OH−４−CH3
−クマリン−３−酢酸および７−NH2 −４−CH3 −クマ
リン−３−酢酸（AMCA）が挙げられるがそれらに限定さ
れない。
【００４４】FAMTM、 HEXTM、 TETTM、 JOETM、 ROXTM
および TAMRATMはPerkin Elmer, Applied Biosystems D
ivision (Foster City, CA) から販売されている。テキ
サスレッドと多数の他の適当な化合物はMolecular Prob
es (Eugene, OR) から販売されている。エネルギー供与
体としての利用に適当である化学発光化合物および生物
発光化合物の例としては、ルミノール（アミノフタルヒ
ドラジド）および誘導体、並びにルシフェラーゼが挙げ
られる。
および TAMRATMはPerkin Elmer, Applied Biosystems D
ivision (Foster City, CA) から販売されている。テキ
サスレッドと多数の他の適当な化合物はMolecular Prob
es (Eugene, OR) から販売されている。エネルギー供与
体としての利用に適当である化学発光化合物および生物
発光化合物の例としては、ルミノール（アミノフタルヒ
ドラジド）および誘導体、並びにルシフェラーゼが挙げ
られる。
【００４５】好ましい態様では、ＤＮＡ結合剤は挿入剤
である。適当な公知の挿入剤としては臭化エチジウムお
よびアクリジンオレンジが挙げられる。非挿入性ＤＮＡ
結合剤も適当である。例えば、一般に「グローブ結合
剤」と呼ばれるＤＮＡ結合化合物のクラスのメンバーが
適当である。それらの化合物は二重鎖ＤＮＡの小さなグ
ローブを認識しそして結合する。マラカイトグリーンは
本方法において機能することが証明されたこのクラスの
化合物の一例である。
である。適当な公知の挿入剤としては臭化エチジウムお
よびアクリジンオレンジが挙げられる。非挿入性ＤＮＡ
結合剤も適当である。例えば、一般に「グローブ結合
剤」と呼ばれるＤＮＡ結合化合物のクラスのメンバーが
適当である。それらの化合物は二重鎖ＤＮＡの小さなグ
ローブを認識しそして結合する。マラカイトグリーンは
本方法において機能することが証明されたこのクラスの
化合物の一例である。
【００４６】本発明の一態様によれば、ＤＮＡ結合化合
物は二本鎖ＤＮＡ中に挿入されると検出可能なほど変更
されるシグナルを提供する。臭化エチジウムは、他のＤ
ＮＡ結合剤、例えばアクリジン、プロフラビン、アクリ
ジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマリン、エ
リチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジタマイシン
Ｄ、クロロマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ル
テニウムポリピリジルおよびアントラマイシンと同様、
二本鎖ＤＮＡに結合すると変更された蛍光発光を示す。
好ましくは、増幅反応を阻害しないＤＮＡ結合化合物を
使って、増幅された配列の蓄積のモニタリングが行われ
る。
物は二本鎖ＤＮＡ中に挿入されると検出可能なほど変更
されるシグナルを提供する。臭化エチジウムは、他のＤ
ＮＡ結合剤、例えばアクリジン、プロフラビン、アクリ
ジンオレンジ、アクリフラビン、フルオロクマリン、エ
リチシン、ダウノマイシン、クロロキン、ジタマイシン
Ｄ、クロロマイシン、ホミジウム、ミトラマイシン、ル
テニウムポリピリジルおよびアントラマイシンと同様、
二本鎖ＤＮＡに結合すると変更された蛍光発光を示す。
好ましくは、増幅反応を阻害しないＤＮＡ結合化合物を
使って、増幅された配列の蓄積のモニタリングが行われ
る。
【００４７】オリゴヌクレオチドは、任意の適当な方
法、例えば制限酵素を使った適当な配列のクローニング
および単離、並びにNarang他, 1979, Meth. Enzymol.
68:90-99のホスホトリエステル法；Brown 他, 1979, Me
th. Enzymol. 68:109-151のホスホジエステル法；Beau
cage他, 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862のジエ
チルホスホルアミダイト法；および米国特許第4,458,06
6 号の固体支持体法のような方法による直接化学合成に
より、調製することができる。
法、例えば制限酵素を使った適当な配列のクローニング
および単離、並びにNarang他, 1979, Meth. Enzymol.
68:90-99のホスホトリエステル法；Brown 他, 1979, Me
th. Enzymol. 68:109-151のホスホジエステル法；Beau
cage他, 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862のジエ
チルホスホルアミダイト法；および米国特許第4,458,06
6 号の固体支持体法のような方法による直接化学合成に
より、調製することができる。
【００４８】標識オリゴヌクレオチドを合成する方法
は、Agrawal およびZamecnik, 1990,Nucl. Acids Res.
18(18):5419-5423 ; MacMillanおよび Verdine, 1990,
J. Org. Chem. 55:5931-5933 ; Pieles 他, 1989, Nuc
l. Acids Res. 17(22):8967-8978 ; Roget他, 1989, N
ucl. Acids Res. 17(19):7643-7651 ;並びにTesler他,
1989, J. Am. Chem. Soc. 111:6966-6976 中に記載さ
れている。合成方法の概説はGoodchild, 1990, Bioconj
ugate Chemistry 1 (3):165-187 に与えられている。
は、Agrawal およびZamecnik, 1990,Nucl. Acids Res.
18(18):5419-5423 ; MacMillanおよび Verdine, 1990,
J. Org. Chem. 55:5931-5933 ; Pieles 他, 1989, Nuc
l. Acids Res. 17(22):8967-8978 ; Roget他, 1989, N
ucl. Acids Res. 17(19):7643-7651 ;並びにTesler他,
1989, J. Am. Chem. Soc. 111:6966-6976 中に記載さ
れている。合成方法の概説はGoodchild, 1990, Bioconj
ugate Chemistry 1 (3):165-187 に与えられている。
【００４９】本発明の方法は、特に増幅された核酸（Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の検出に適当である。適
当な増幅方法としては、ＰＣＲ（米国特許第4,683,195
号；同第4,683,202 号および同第4,965,188 号）に加え
て、次のものが挙げられるがそれらに限定されない：リ
ガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ，WuおよびWallace, 1989, Gen
omics 4:560-569 並びにBarany, 1991, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 88:189-193）；ポリメラーゼ−リガーゼ
連鎖反応（Barany, 1991, PCR Methods and Applic. 1:
5-16）； Gap−ＬＣＲ（特許公報第WO 90/01069 号）；
ＮＡまたはＲＮＡのいずれか）の検出に適当である。適
当な増幅方法としては、ＰＣＲ（米国特許第4,683,195
号；同第4,683,202 号および同第4,965,188 号）に加え
て、次のものが挙げられるがそれらに限定されない：リ
ガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ，WuおよびWallace, 1989, Gen
omics 4:560-569 並びにBarany, 1991, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 88:189-193）；ポリメラーゼ−リガーゼ
連鎖反応（Barany, 1991, PCR Methods and Applic. 1:
5-16）； Gap−ＬＣＲ（特許公報第WO 90/01069 号）；
【００５０】修復連鎖反応( 欧州特許公報第439,182 A2
号）；３ＳＲ（Kwoh他, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:1173-1177；Guatelli他, 1990, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87:1874-1878；特許公報第WO 92/0880
A 号）並びにＮＡＳＢＡ（米国特許第5,130,238 号）。
本発明はいずれかの特定の増幅系に限定されない。別の
系が開発されたら、それらの系は本発明の実施により利
益を得るかもしれない。増幅系の最近の概観はAbramson
およびMyers, 1993, Current Opinion in Biotechnolog
y 4:41-47 中に発表された。
号）；３ＳＲ（Kwoh他, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:1173-1177；Guatelli他, 1990, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87:1874-1878；特許公報第WO 92/0880
A 号）並びにＮＡＳＢＡ（米国特許第5,130,238 号）。
本発明はいずれかの特定の増幅系に限定されない。別の
系が開発されたら、それらの系は本発明の実施により利
益を得るかもしれない。増幅系の最近の概観はAbramson
およびMyers, 1993, Current Opinion in Biotechnolog
y 4:41-47 中に発表された。
【００５１】本発明の好ましい態様は、米国特許第5,21
0,015 号およびHolland 他, 1991,Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 88:7276-7280中に記載の方法の改良法を提供
する。該方法は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′
エキソヌクレアーゼ活性を使ってアニールした標識オリ
ゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション二重型から開
裂させ、そして検出用の標識断片を遊離させる。
0,015 号およびHolland 他, 1991,Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 88:7276-7280中に記載の方法の改良法を提供
する。該方法は耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′
エキソヌクレアーゼ活性を使ってアニールした標識オリ
ゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション二重型から開
裂させ、そして検出用の標識断片を遊離させる。
【００５２】該ＤＮＡポリメラーゼの５′→３′エキソ
ヌクレアーゼ活性による本発明の標識プローブの開裂
は、反応混合物中に標識を遊離させる。ＤＮＡ結合化合
物による溶液中シグナルの消光は、蛍光団が短縮された
開裂断片に結合した時よりも未開裂の全長オリゴヌクレ
オチドプローブに結合した時の方が有意に大きい。結果
として観察される蛍光の増加はプローブの開裂を示し、
これは必然的に標的配列の存在とプローブ／標的ハイブ
リダイゼーションの発生の両方を示唆する。
ヌクレアーゼ活性による本発明の標識プローブの開裂
は、反応混合物中に標識を遊離させる。ＤＮＡ結合化合
物による溶液中シグナルの消光は、蛍光団が短縮された
開裂断片に結合した時よりも未開裂の全長オリゴヌクレ
オチドプローブに結合した時の方が有意に大きい。結果
として観察される蛍光の増加はプローブの開裂を示し、
これは必然的に標的配列の存在とプローブ／標的ハイブ
リダイゼーションの発生の両方を示唆する。
【００５３】本発明の均一ＰＣＲ／検出アッセイは、Hi
guchi 他, 1992, 前掲に記載の方法と共同した使用に適
する。この態様では、ＤＮＡ結合化合物の蛍光も測定さ
れる。よって、ＤＮＡ結合剤の蛍光は増幅が起こったと
いう検出を可能にし、そして開裂されたハイブリダイズ
したプローブの蛍光は標的特異的増幅を示す。
guchi 他, 1992, 前掲に記載の方法と共同した使用に適
する。この態様では、ＤＮＡ結合化合物の蛍光も測定さ
れる。よって、ＤＮＡ結合剤の蛍光は増幅が起こったと
いう検出を可能にし、そして開裂されたハイブリダイズ
したプローブの蛍光は標的特異的増幅を示す。
【００５４】本発明の検出方法は多数のアッセイに適用
可能である。各アッセイはアッセイ試薬と適合できる緩
衝液中の標的試料を必要とする。プローブ開裂の検出の
前または同時のいずれかに標的が増幅されるならば、標
的核酸は該標的を増幅させるのに使う酵素と適合できる
緩衝液中に存在しなければならない。標的核酸は、組
織、体液、便、痰、唾液、植物細胞、細菌培養物等を含
む様々な生物学的材料から単離することができる。各ア
ッセイに適する試料調製方法は技術の現状において記載
されている。
可能である。各アッセイはアッセイ試薬と適合できる緩
衝液中の標的試料を必要とする。プローブ開裂の検出の
前または同時のいずれかに標的が増幅されるならば、標
的核酸は該標的を増幅させるのに使う酵素と適合できる
緩衝液中に存在しなければならない。標的核酸は、組
織、体液、便、痰、唾液、植物細胞、細菌培養物等を含
む様々な生物学的材料から単離することができる。各ア
ッセイに適する試料調製方法は技術の現状において記載
されている。
【００５５】一般に、試料中の核酸はＤＮＡの配列、最
も普通にはゲノムＤＮＡの配列であろう。しかしなが
ら、本発明は他の核酸、例えば伝令ＲＮＡ、リボソーム
ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはクローン化ＤＮＡを使っ
て実施することもできる。本発明における使用に適当な
核酸試料としては、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲ
ＮＡが挙げられる。当業者は、標識オリゴヌクレオチド
プローブを開裂させるのに用いる反応に応じて、どんな
核酸の性質でも、使用する方法に適切で且つ十分認識さ
れた変更を行うことにより、核酸を検出することができ
るということを認識するだろう。
も普通にはゲノムＤＮＡの配列であろう。しかしなが
ら、本発明は他の核酸、例えば伝令ＲＮＡ、リボソーム
ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡまたはクローン化ＤＮＡを使っ
て実施することもできる。本発明における使用に適当な
核酸試料としては、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲ
ＮＡが挙げられる。当業者は、標識オリゴヌクレオチド
プローブを開裂させるのに用いる反応に応じて、どんな
核酸の性質でも、使用する方法に適切で且つ十分認識さ
れた変更を行うことにより、核酸を検出することができ
るということを認識するだろう。
【００５６】試料調製は、試料の入手源、検出しようと
する標的、および使用する反応に依存して異なるだろ
う。適当な試料調製プロトコールは当業界において既知
であり、上記に引用した文献（例えばSambrook他、前掲
を参照のこと）中に記載されている。標的配列のＰＣＲ
増幅のための単純で且つ迅速な試料調製方法は、Higuch
i, 1989, PCR Technology (Erlich 編, Stockton Pres
s, New York) と PCR Protocols, 第18〜20章 (Innis
他編, Academic Press, 1990) の中に記載されている。
これらは共に参考として本明細書中に組み込まれる。当
業者は、適当なプロトコールを選択しそして経験的に最
適化することができるだろう。
する標的、および使用する反応に依存して異なるだろ
う。適当な試料調製プロトコールは当業界において既知
であり、上記に引用した文献（例えばSambrook他、前掲
を参照のこと）中に記載されている。標的配列のＰＣＲ
増幅のための単純で且つ迅速な試料調製方法は、Higuch
i, 1989, PCR Technology (Erlich 編, Stockton Pres
s, New York) と PCR Protocols, 第18〜20章 (Innis
他編, Academic Press, 1990) の中に記載されている。
これらは共に参考として本明細書中に組み込まれる。当
業者は、適当なプロトコールを選択しそして経験的に最
適化することができるだろう。
【００５７】溶液中の標識の蛍光は、分光蛍光計、例え
ばHitachi/Perkin Elmer Model 650-40 (Perkin Elmer,
Norwalk, CT) またはPTI LS-100発光分光光度計（Phot
on Technology International, London, Ontario, Cana
da）において測定される。分光蛍光計は、使用する特定
の機器の特徴に依存して、励起波長と発光波長並びにバ
ンド幅を設定する機会を提供する。特定の蛍光標識から
の蛍光を検出するために波長およびバンド幅設定値を決
定する方法は当業者にとって明らかであろう。一般的な
手引き書は例えばThe Merck Index (Bydavari 他, 198
9, Merck Co. Inc. Rahway, NJ)およびHauglandによる1
990年版のMolecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon)
カタログの中に見つかる。各標識は別々の蛍光スペクト
ルを有するけれども、本発明を実施するには広域の検出
波長が適当である。
ばHitachi/Perkin Elmer Model 650-40 (Perkin Elmer,
Norwalk, CT) またはPTI LS-100発光分光光度計（Phot
on Technology International, London, Ontario, Cana
da）において測定される。分光蛍光計は、使用する特定
の機器の特徴に依存して、励起波長と発光波長並びにバ
ンド幅を設定する機会を提供する。特定の蛍光標識から
の蛍光を検出するために波長およびバンド幅設定値を決
定する方法は当業者にとって明らかであろう。一般的な
手引き書は例えばThe Merck Index (Bydavari 他, 198
9, Merck Co. Inc. Rahway, NJ)およびHauglandによる1
990年版のMolecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon)
カタログの中に見つかる。各標識は別々の蛍光スペクト
ルを有するけれども、本発明を実施するには広域の検出
波長が適当である。
【００５８】プローブ開裂をもたらす反応の前と後に蛍
光測定を行い、反応前の値に比較した蛍光の変化を算出
する。同等に、反応混合物の一部を反応条件にかけない
でおく。こうして、反応前の蛍光を反応後の蛍光と一緒
に、反応の終了後に測定することができる。蛍光の測定
用にも適当である反応容器の使用は、反応容器を開けた
りまたは別の反応後処理を行ったりせずに反応前の蛍光
と反応後の蛍光の両方の直接測定を可能にする。
光測定を行い、反応前の値に比較した蛍光の変化を算出
する。同等に、反応混合物の一部を反応条件にかけない
でおく。こうして、反応前の蛍光を反応後の蛍光と一緒
に、反応の終了後に測定することができる。蛍光の測定
用にも適当である反応容器の使用は、反応容器を開けた
りまたは別の反応後処理を行ったりせずに反応前の蛍光
と反応後の蛍光の両方の直接測定を可能にする。
【００５９】上述したような核酸検出方法がＰＣＲ増幅
と組み合わされる好ましい方法では、増幅反応は自動化
法として実施される。48または96本までの反応管を入れ
ることができるヒートブロックを使用する熱循環器がPe
rkin Elmer (Norwalk, CT)から現在入手可能である。従
って96までの増幅反応を同時に実施することができる。
と組み合わされる好ましい方法では、増幅反応は自動化
法として実施される。48または96本までの反応管を入れ
ることができるヒートブロックを使用する熱循環器がPe
rkin Elmer (Norwalk, CT)から現在入手可能である。従
って96までの増幅反応を同時に実施することができる。
【００６０】本発明は、試料を処理したり、管を開けた
り、循環反応を中断したりする必要を伴わずに、全ての
試料中のＰＣＲ生成物の自動検出を可能にする。適当な
光学系は、例えば、Higuchi 他, 前掲、Higuchi 他, 19
93, 前掲、および欧州特許公開第 512,334号の中に記載
されている。１つのそのような光学系では、複数のファ
イバーオプチクスリードを使って励起光を光源から反応
管に伝達させ、そして各管からの発光を測定する。各フ
ァイバーオプチクスは一度で蛍光を迅速に読むことがで
きるため、反応管からの蛍光を読むのにただ１つの蛍光
計が必要である。別の光学系は、複数の反応容器の蛍光
を同時に測定するのにビデオカメラを使用する。透明な
反応容器蓋の使用により、容器を開封しない状態での蛍
光測定が可能になる。
り、循環反応を中断したりする必要を伴わずに、全ての
試料中のＰＣＲ生成物の自動検出を可能にする。適当な
光学系は、例えば、Higuchi 他, 前掲、Higuchi 他, 19
93, 前掲、および欧州特許公開第 512,334号の中に記載
されている。１つのそのような光学系では、複数のファ
イバーオプチクスリードを使って励起光を光源から反応
管に伝達させ、そして各管からの発光を測定する。各フ
ァイバーオプチクスは一度で蛍光を迅速に読むことがで
きるため、反応管からの蛍光を読むのにただ１つの蛍光
計が必要である。別の光学系は、複数の反応容器の蛍光
を同時に測定するのにビデオカメラを使用する。透明な
反応容器蓋の使用により、容器を開封しない状態での蛍
光測定が可能になる。
【００６１】96ウエルのミクロタイター方式を使用する
別の適当な検出方法が記載されている。この型の方式
は、例えばゲノム分析のための大規模試料スクリーニン
グ、例えば血液銀行スクリーニング手順におけるAIDSウ
イルスまたは鎌状赤血球貧血についてのスクリーニング
のために、臨床研究室においてしばしば望ましい。本発
明の方法はこの型の分析に適し、ELISA 方式のような既
知の「ウエル内」アッセイ方法または他の光学密度に基
づいた方法に要求される無数の洗浄および抽出操作の必
要性を排除する。（Kolber他, 1988, J. Immun. Meth.
108:255-264 、Huschtscha他, 1989, In Vitro Cell an
d Dev. Biol. 25(1):105-108 、およびVoller他, 197
9, The Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Dynatech
Labs, Alexandria, VAを参照のこと）。
別の適当な検出方法が記載されている。この型の方式
は、例えばゲノム分析のための大規模試料スクリーニン
グ、例えば血液銀行スクリーニング手順におけるAIDSウ
イルスまたは鎌状赤血球貧血についてのスクリーニング
のために、臨床研究室においてしばしば望ましい。本発
明の方法はこの型の分析に適し、ELISA 方式のような既
知の「ウエル内」アッセイ方法または他の光学密度に基
づいた方法に要求される無数の洗浄および抽出操作の必
要性を排除する。（Kolber他, 1988, J. Immun. Meth.
108:255-264 、Huschtscha他, 1989, In Vitro Cell an
d Dev. Biol. 25(1):105-108 、およびVoller他, 197
9, The Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Dynatech
Labs, Alexandria, VAを参照のこと）。
【００６２】本発明の検出方法は、ELISA プレートリー
ダーに類似しているが蛍光を励起・測定するために設計
された装置を使った直接蛍光測定も可能にすう。例え
ば、Millipore (Bedford, MA) により製造された CytoF
luorTM 2300 機がそのような方法に適当である。あるい
は、増幅反応の間のＰＣＲ生成物の増加をモニタリング
するのに蛍光の連続測定を提供する装置が有用である。
本発明の方法が特定の検出方法、熱循環器もしくはシグ
ナル測定器または反応容器の数に限定されないことは当
業者に明白であろう。
ダーに類似しているが蛍光を励起・測定するために設計
された装置を使った直接蛍光測定も可能にすう。例え
ば、Millipore (Bedford, MA) により製造された CytoF
luorTM 2300 機がそのような方法に適当である。あるい
は、増幅反応の間のＰＣＲ生成物の増加をモニタリング
するのに蛍光の連続測定を提供する装置が有用である。
本発明の方法が特定の検出方法、熱循環器もしくはシグ
ナル測定器または反応容器の数に限定されないことは当
業者に明白であろう。
【００６３】本発明の方法は複数の標的配列を同時に検
出するためにも利用することができる。各標的に特異的
なプローブが反応混合物中に存在する。試料中に存在す
る各標的核酸について、対応するプローブがハイブリダ
イズしそして開裂されるだろう。開裂されたプローブを
別々に検出するために、別の波長で蛍光を発する標識に
より各種のプローブが標識される。次いで測定波長の適
当な選択により、各種のプローブが別々に検出される。
出するためにも利用することができる。各標的に特異的
なプローブが反応混合物中に存在する。試料中に存在す
る各標的核酸について、対応するプローブがハイブリダ
イズしそして開裂されるだろう。開裂されたプローブを
別々に検出するために、別の波長で蛍光を発する標識に
より各種のプローブが標識される。次いで測定波長の適
当な選択により、各種のプローブが別々に検出される。
【００６４】よって、本発明の方法は、増幅反応を一度
開始したら反応容器を開けずに一試料の中の数個の標的
を検出するためのＰＣＲ同時増幅方法において増幅生成
物を検出するのに有用である。本発明は、同一試料中の
２つの異なる核酸標的の定量的比較に特に有用である。
核酸を定量する方法は米国特許第5,219,727 号に記載さ
れている。記載された定量方法は、標的の相対量を決定
するかまたは増幅前に存在する標的の量をそれぞれ正確
に定量するために内部標準を使用するＰＣＲを基にした
方法である。
開始したら反応容器を開けずに一試料の中の数個の標的
を検出するためのＰＣＲ同時増幅方法において増幅生成
物を検出するのに有用である。本発明は、同一試料中の
２つの異なる核酸標的の定量的比較に特に有用である。
核酸を定量する方法は米国特許第5,219,727 号に記載さ
れている。記載された定量方法は、標的の相対量を決定
するかまたは増幅前に存在する標的の量をそれぞれ正確
に定量するために内部標準を使用するＰＣＲを基にした
方法である。
【００６５】一本鎖オリゴヌクレオチドプローブのヌク
レオチド配列は、該プローブを標的にハイブリダイズさ
せるために標的配列に相補的である。オリゴヌクレオチ
ドプローブはヌクレオチド配列に依存して低温で二次構
造を形成し、二本鎖ＤＮＡの領域を生成することができ
る。ＤＮＡ結合化合物は、蛍光標識に対してごく近位状
態で二本鎖領域中に挿入することができ、それによって
エネルギー転移の効率を増大させることができる。本発
明の方法は二次構造によるプローブ内の二本鎖領域の形
成を要求しないけれども、そのような領域は標識の消光
を向上させることができる。
レオチド配列は、該プローブを標的にハイブリダイズさ
せるために標的配列に相補的である。オリゴヌクレオチ
ドプローブはヌクレオチド配列に依存して低温で二次構
造を形成し、二本鎖ＤＮＡの領域を生成することができ
る。ＤＮＡ結合化合物は、蛍光標識に対してごく近位状
態で二本鎖領域中に挿入することができ、それによって
エネルギー転移の効率を増大させることができる。本発
明の方法は二次構造によるプローブ内の二本鎖領域の形
成を要求しないけれども、そのような領域は標識の消光
を向上させることができる。
【００６６】他方の末端に相補的な末端配列を付加する
ことにより、二次構造を形成しない一本鎖プローブ中に
二次構造を導入することができる。形成される二次構造
は、「ヘアピン」構造を形成する５′末端と３′末端の
ハイブリダイゼーションを含む。プローブの各末端の相
補的配列の長さは、アッセイ温度および条件（典型的に
は室温）において安定なヘアピン二次構造を形成するの
に十分であるが、プローブの自己ハイブリダイゼーショ
ンがプローブ−標的ハイブリダイゼーションよりも多く
生じるようにヘアピン二次構造を安定化して該プローブ
を標的配列にハイブリダイズできなくするほどには長く
ない。
ことにより、二次構造を形成しない一本鎖プローブ中に
二次構造を導入することができる。形成される二次構造
は、「ヘアピン」構造を形成する５′末端と３′末端の
ハイブリダイゼーションを含む。プローブの各末端の相
補的配列の長さは、アッセイ温度および条件（典型的に
は室温）において安定なヘアピン二次構造を形成するの
に十分であるが、プローブの自己ハイブリダイゼーショ
ンがプローブ−標的ハイブリダイゼーションよりも多く
生じるようにヘアピン二次構造を安定化して該プローブ
を標的配列にハイブリダイズできなくするほどには長く
ない。
【００６７】プローブの正確な長さは検出しようとする
標的配列の長さとアッセイ条件に依存するだろう。好ま
しくは、安定なヘアピン構造の形成を引き起こすのに長
さ約６〜９ヌクレオチドの相補的末端領域が十分である
が、反応条件に応じてそれ以上またはそれ以下の長さが
所望されるかもしれない。プローブのヘアピン二次構造
の安定性とプローブ−標的ハイブリダイゼーション二重
型の安定性は経験的に決定することができる。
標的配列の長さとアッセイ条件に依存するだろう。好ま
しくは、安定なヘアピン構造の形成を引き起こすのに長
さ約６〜９ヌクレオチドの相補的末端領域が十分である
が、反応条件に応じてそれ以上またはそれ以下の長さが
所望されるかもしれない。プローブのヘアピン二次構造
の安定性とプローブ−標的ハイブリダイゼーション二重
型の安定性は経験的に決定することができる。
【００６８】
【実施例】実施例１：標識オリゴヌクレオチドプローブの合成 一端が蛍光団で標識されたオリゴヌクレオチドプローブ
をABI 394 ＤＮＡ合成装置（Perkin Elmer ABD, Foster
City, CA ）上で１マイクロモルスケールで合成した。
５′標識オリゴヌクレオチドを直接提供するためにオリ
ゴヌクレオチド合成の間蛍光標識のアミダイトを使用し
た。これはオリゴヌクレオチドのいずれの合成後修飾の
必要性も除去した。
をABI 394 ＤＮＡ合成装置（Perkin Elmer ABD, Foster
City, CA ）上で１マイクロモルスケールで合成した。
５′標識オリゴヌクレオチドを直接提供するためにオリ
ゴヌクレオチド合成の間蛍光標識のアミダイトを使用し
た。これはオリゴヌクレオチドのいずれの合成後修飾の
必要性も除去した。
【００６９】フルオレセインのホスホルアミダイト誘導
体（FAM TM, Perkin Elmer ABD, Foster City, CA)の付
加によりオリゴヌクレオチドの５′末端を合成した。該
ホスホルアミダイトは、ヌクレオチドから標識を分離す
るリンカーを含有する。制御細孔ガラス（ＣＰＧ）を水
酸化アンモニウムで55℃で４時間処理してＣＰＧから標
識オリゴヌクレオチドを分離した後、オリゴヌクレオチ
ドを濾別し、空気流の中で乾燥し、再懸濁し、濾過し、
そして逆相HPLCにより精製した。次いで、純粋な５′標
識オリゴヌクレオチドを含有する画分を蒸発乾固せしめ
た。
体（FAM TM, Perkin Elmer ABD, Foster City, CA)の付
加によりオリゴヌクレオチドの５′末端を合成した。該
ホスホルアミダイトは、ヌクレオチドから標識を分離す
るリンカーを含有する。制御細孔ガラス（ＣＰＧ）を水
酸化アンモニウムで55℃で４時間処理してＣＰＧから標
識オリゴヌクレオチドを分離した後、オリゴヌクレオチ
ドを濾別し、空気流の中で乾燥し、再懸濁し、濾過し、
そして逆相HPLCにより精製した。次いで、純粋な５′標
識オリゴヌクレオチドを含有する画分を蒸発乾固せしめ
た。
【００７０】実施例２：蛍光の消光に対するオリゴヌク
レオチドの長さの影響 長さ２〜34ヌクレオチドの標識オリゴヌクレオチドの蛍
光を、EtBrを含む溶液とEtBrを含まない溶液中で測定し
た。更に、比較のため遊離標識の蛍光の測定も行った。
５′末端がFAM TMで標識された一連のプローブを実施例
１に記載の通りに合成した。それらのプローブの核酸配
列を５′→３′方向で下記に与える。
レオチドの長さの影響 長さ２〜34ヌクレオチドの標識オリゴヌクレオチドの蛍
光を、EtBrを含む溶液とEtBrを含まない溶液中で測定し
た。更に、比較のため遊離標識の蛍光の測定も行った。
５′末端がFAM TMで標識された一連のプローブを実施例
１に記載の通りに合成した。それらのプローブの核酸配
列を５′→３′方向で下記に与える。
【００７１】
【表１】
【００７２】ＰＣＲ反応緩衝液（50mM KCl, 10mM Tris
pH 8.3および 3mM MgCl2）と０，２または４μg/ml
（０，５または10μＭ）の濃度のEtBrを含有する400 μ
l の溶液中でオリゴヌクレオチドを測定した。オリゴヌ
クレオチドは１μＭの濃度で存在した。ＦＡＭ標識の蛍
光を検出するために、励起光の波長を495 nmになるよう
に選択しそして蛍光を518 nmの波長で測定した。読みは
20℃で行った。４μg/mlのEtBr濃度で行った測定を翌日
に繰り返し、該測定の再現性を評価した。
pH 8.3および 3mM MgCl2）と０，２または４μg/ml
（０，５または10μＭ）の濃度のEtBrを含有する400 μ
l の溶液中でオリゴヌクレオチドを測定した。オリゴヌ
クレオチドは１μＭの濃度で存在した。ＦＡＭ標識の蛍
光を検出するために、励起光の波長を495 nmになるよう
に選択しそして蛍光を518 nmの波長で測定した。読みは
20℃で行った。４μg/mlのEtBr濃度で行った測定を翌日
に繰り返し、該測定の再現性を評価した。
【００７３】結果を図１に与える。EtBrの存在下でのプ
ローブ蛍光の測定値を、EtBr無しでの蛍光に比較して示
す。EtBrの存在下での遊離標識の蛍光に約６％の減少が
観察された。長さ６塩基未満のオリゴヌクレオチドに結
合した標識の蛍光の減少は遊離標識のものと感知できる
ほど異なっていなかった。有意な消光は、長さが少なく
とも10ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに観察され
た。
ローブ蛍光の測定値を、EtBr無しでの蛍光に比較して示
す。EtBrの存在下での遊離標識の蛍光に約６％の減少が
観察された。長さ６塩基未満のオリゴヌクレオチドに結
合した標識の蛍光の減少は遊離標識のものと感知できる
ほど異なっていなかった。有意な消光は、長さが少なく
とも10ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドに観察され
た。
【００７４】実施例３：消光の温度依存性 フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドプローブのEtBr
による消光の温度依存性を決定づけるために実験を行っ
た。EtBrを含むプローブ溶液と含まないプローブ溶液の
蛍光を、該溶液を加熱および冷却しながら測定した。
による消光の温度依存性を決定づけるために実験を行っ
た。EtBrを含むプローブ溶液と含まないプローブ溶液の
蛍光を、該溶液を加熱および冷却しながら測定した。
【００７５】４μg/mlのEtBrを含むかまたは含まない、
上記実施例２に記載の緩衝液中に0.5 μＭのBW118 （配
列番号４）またはSGW128（配列番号６）のいずれかを含
有する溶液を調製した。未結合のフルオレセイン標識を
含有する同様な溶液も調製した。すぐに使用しない溶液
は必要になるまで遮光下で冷蔵庫の中に保存した。蛍光
を測定しながら溶液の温度を制御するために、水浴に接
続されたジャケット付キュベットを使った。溶液温度
は、水浴からジャケット付キュベットを通して溶液の周
りに水を循環させることにより維持された。ジャケット
付キュベットの近くで循環水の温度を測定し、溶液の温
度が実際に維持されていることを確かめた。蒸発を防ぐ
ために試料の上に鉱油を重層させた。光漂白を防ぐため
に、測定を行っている間だけ溶液を励起光に暴露した。
励起波長と発光波長は上述の通りに選択した。
上記実施例２に記載の緩衝液中に0.5 μＭのBW118 （配
列番号４）またはSGW128（配列番号６）のいずれかを含
有する溶液を調製した。未結合のフルオレセイン標識を
含有する同様な溶液も調製した。すぐに使用しない溶液
は必要になるまで遮光下で冷蔵庫の中に保存した。蛍光
を測定しながら溶液の温度を制御するために、水浴に接
続されたジャケット付キュベットを使った。溶液温度
は、水浴からジャケット付キュベットを通して溶液の周
りに水を循環させることにより維持された。ジャケット
付キュベットの近くで循環水の温度を測定し、溶液の温
度が実際に維持されていることを確かめた。蒸発を防ぐ
ために試料の上に鉱油を重層させた。光漂白を防ぐため
に、測定を行っている間だけ溶液を励起光に暴露した。
励起波長と発光波長は上述の通りに選択した。
【００７６】溶液を加熱および冷却しながら測定を実施
した。２つの測定を単一温度で、１つは加熱しながらも
う１つは冷却しながら行い、得られた値を平均した。そ
のデータを図２に与える。各測定値は、未消光（EtBr不
含有の）溶液から得られた対応する値に関して標準化さ
れている。標識オリゴヌクレオチドプローブの有意な消
光は全ての温度で観察された。消光の量の有意な増加は
40℃以下で観察され、観察した温度範囲全体を通して、
温度を下げると消光の量が増加した。室温以下でかなり
大きな消光が観察されたけれども、便宜上20℃で蛍光を
測定することが望ましいかもしれない。
した。２つの測定を単一温度で、１つは加熱しながらも
う１つは冷却しながら行い、得られた値を平均した。そ
のデータを図２に与える。各測定値は、未消光（EtBr不
含有の）溶液から得られた対応する値に関して標準化さ
れている。標識オリゴヌクレオチドプローブの有意な消
光は全ての温度で観察された。消光の量の有意な増加は
40℃以下で観察され、観察した温度範囲全体を通して、
温度を下げると消光の量が増加した。室温以下でかなり
大きな消光が観察されたけれども、便宜上20℃で蛍光を
測定することが望ましいかもしれない。
【００７７】実施例４：ＰＣＲプローブ標識の遊離 この実施例は、ＰＣＲ反応混合物中の未開裂の標識プロ
ーブを消光するためのEtBrの使用を記載する。伸長生成
物の合成を防ぐために３′末端が修飾されているＦＡＭ
標識プローブの存在下で、ＰＣＲ増幅を実施した。ＤＮ
Ａポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、プライマ
ーの下流の標的配列にハイブリダイズしたプローブを開
裂させ、それによって該プローブの標識オリゴヌクレオ
チド小断片を遊離させる。開裂された断片に結合した標
識の蛍光の増加（これは標的配列の増幅を示す）が検出
された。
ーブを消光するためのEtBrの使用を記載する。伸長生成
物の合成を防ぐために３′末端が修飾されているＦＡＭ
標識プローブの存在下で、ＰＣＲ増幅を実施した。ＤＮ
Ａポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、プライマ
ーの下流の標的配列にハイブリダイズしたプローブを開
裂させ、それによって該プローブの標識オリゴヌクレオ
チド小断片を遊離させる。開裂された断片に結合した標
識の蛍光の増加（これは標的配列の増幅を示す）が検出
された。
【００７８】下記に示す２つのＦＡＭ標識プローブのう
ちの１つの存在下で増幅を実施した。該プローブの核酸
配列を５′→３′方向で示す。上述した通りに５′末端
にＦＡＭが結合されたこれらのプローブを合成した。各
プローブは、Taq ポリメラーゼによる伸長を阻止するた
めに３′−ＯＨの代わりに３′−ＰＯ4 を有するように
合成した。
ちの１つの存在下で増幅を実施した。該プローブの核酸
配列を５′→３′方向で示す。上述した通りに５′末端
にＦＡＭが結合されたこれらのプローブを合成した。各
プローブは、Taq ポリメラーゼによる伸長を阻止するた
めに３′−ＯＨの代わりに３′−ＰＯ4 を有するように
合成した。
【００７９】プローブ 配列番号 配列 SGW127 ７ CCATCAATGAGGAAGCTGCAAGAATGGGATAGAG SGW128 ８ GACCATCAATGAGGAAGCTGCAAGAATGGGATAG
【００８０】増幅 増幅領域は、Hoffmann-La Roche により開発・製造され
そしてPerkin Elmer (Norwalk, CT)により販売されてい
るプライマー SK431とSK145 により指令されたHIV gag
領域からの142 塩基対生成物であった。HIV gag 遺伝子
のクローン化断片を含有するプラスミドから増幅を行っ
た。２つのプローブのそれぞれについて２つの複製増幅
を実施した。増幅は次の試薬を含有する150 μl 反応液
中で実施した：
そしてPerkin Elmer (Norwalk, CT)により販売されてい
るプライマー SK431とSK145 により指令されたHIV gag
領域からの142 塩基対生成物であった。HIV gag 遺伝子
のクローン化断片を含有するプラスミドから増幅を行っ
た。２つのプローブのそれぞれについて２つの複製増幅
を実施した。増幅は次の試薬を含有する150 μl 反応液
中で実施した：
【００８１】３×108 コピーの標的配列 50mM KCl 10mM Tris-HCl, pH 8.3 3mM MgCl2 75ピコモルの各プライマー 各々50μＭの４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸
* 3.75単位のTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Hoffmann-La Roch
e により開発・製造されそしてPerkin Elmer, Norwalk,
CT により販売されている） 0.5 μＭのプローブ ４μg/mlのEtBr（10μＭ）
* 3.75単位のTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Hoffmann-La Roch
e により開発・製造されそしてPerkin Elmer, Norwalk,
CT により販売されている） 0.5 μＭのプローブ ４μg/mlのEtBr（10μＭ）
【００８２】* 一般に、長い標的領域の増幅には各々20
0 μＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸が好まし
い。ＰＣＲ熱循環条件にかけられる各反応混合物につい
て、１つはEtBrを含みもう１つはEtBrを含まない２つの
追加の反応混合物を測定対照用として調製し保存した
（温度循環なし）。反応混合物をGeneAmp 900 熱循環器
（Perkin Elmer, Norwalk, CT ）中で次の増幅スキーム
にかけた：各々変性段階（95℃、15秒）、アニーリング
／伸長段階（55℃、30秒）および生成物の完全な伸長を
保証するための最終インキュベーション（72℃、10分）
から成る35サイクル。増幅後、反応液を分析まで４℃に
維持した。
0 μＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸が好まし
い。ＰＣＲ熱循環条件にかけられる各反応混合物につい
て、１つはEtBrを含みもう１つはEtBrを含まない２つの
追加の反応混合物を測定対照用として調製し保存した
（温度循環なし）。反応混合物をGeneAmp 900 熱循環器
（Perkin Elmer, Norwalk, CT ）中で次の増幅スキーム
にかけた：各々変性段階（95℃、15秒）、アニーリング
／伸長段階（55℃、30秒）および生成物の完全な伸長を
保証するための最終インキュベーション（72℃、10分）
から成る35サイクル。増幅後、反応液を分析まで４℃に
維持した。
【００８３】分析 増幅が起こったことを確かめるために、増幅生成物をア
ガロースゲル電気泳動により分析した。プローブ分解を
後述の通り分析した。
ガロースゲル電気泳動により分析した。プローブ分解を
後述の通り分析した。
【００８４】Ａ．ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
るプローブ分解の分析 増幅後、５μの増幅反応液を10ピコモル／μl のプロー
ブ濃度になるようにホルムアミド中に希釈した。次いで
５μl の希釈増幅反応液（レーンあたり50ピコモルのプ
ローブ）を７Ｍ尿素、10％ポリアクリルアミドゲルの厚
さ0.4 mmの長方形ウエル上に負荷し、そして1500Ｖ，20
Ｗ，20mAにおいて ABI 373A ＤＮＡシーケンサー（Perk
in Elmer, Norwalk, CT ）上で６時間電気泳動した（フ
ルスキャンシーケンシング）。 373A ＤＮＡシーケンサ
ーデータ収集プログラム（PerkinElmer, Norwalk, CT
）を使ってデータを収集した。
るプローブ分解の分析 増幅後、５μの増幅反応液を10ピコモル／μl のプロー
ブ濃度になるようにホルムアミド中に希釈した。次いで
５μl の希釈増幅反応液（レーンあたり50ピコモルのプ
ローブ）を７Ｍ尿素、10％ポリアクリルアミドゲルの厚
さ0.4 mmの長方形ウエル上に負荷し、そして1500Ｖ，20
Ｗ，20mAにおいて ABI 373A ＤＮＡシーケンサー（Perk
in Elmer, Norwalk, CT ）上で６時間電気泳動した（フ
ルスキャンシーケンシング）。 373A ＤＮＡシーケンサ
ーデータ収集プログラム（PerkinElmer, Norwalk, CT
）を使ってデータを収集した。
【００８５】収集したデータを362 Gene ScannerTMデー
タ解析プロブラム(v.1.2d1) (Perkin Elmer, Norwalk,
CT) を使って解析した。遊離されたプローブに相当する
ピーク面積の和と完全体レーンのピーク面積の和を比較
することにより、開裂されたプローブの比率を推定し
た。遊離されたプローブの全量は、反応混合物中に含ま
れるプローブの全量の推定比率として算出した。ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により測定されたプローブ分
解の量を下記に示す。２つの複製反応の各々について算
出された値を示す。
タ解析プロブラム(v.1.2d1) (Perkin Elmer, Norwalk,
CT) を使って解析した。遊離されたプローブに相当する
ピーク面積の和と完全体レーンのピーク面積の和を比較
することにより、開裂されたプローブの比率を推定し
た。遊離されたプローブの全量は、反応混合物中に含ま
れるプローブの全量の推定比率として算出した。ポリア
クリルアミドゲル電気泳動により測定されたプローブ分
解の量を下記に示す。２つの複製反応の各々について算
出された値を示す。
【００８６】
【表２】
【００８７】Ｂ．分光蛍光計を使って蛍光を測定するこ
とによる分析 各ＰＣＲとＰＣＲ対照（未循環の反応混合物）の50μl
を 350μl のＴＥ（10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH 8.
0 ）中に希釈した。各試料の蛍光をHitachi/Perkin Elm
er Model 650-40 蛍光分光蛍光計（実施例２参照）の中
で494 nmの励起波長と522 nmの発光波長において20℃で
測定した。485 nmの励起フィルター（20nm バンド通過
幅）を取り付けた CytoFluorTM 2300 （前掲）を使って
読みを行った。
とによる分析 各ＰＣＲとＰＣＲ対照（未循環の反応混合物）の50μl
を 350μl のＴＥ（10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH 8.
0 ）中に希釈した。各試料の蛍光をHitachi/Perkin Elm
er Model 650-40 蛍光分光蛍光計（実施例２参照）の中
で494 nmの励起波長と522 nmの発光波長において20℃で
測定した。485 nmの励起フィルター（20nm バンド通過
幅）を取り付けた CytoFluorTM 2300 （前掲）を使って
読みを行った。
【００８８】分解したプローブの比率は、反応中に起こ
る蛍光の変化量を蛍光の最大可能変化量、即ちプローブ
が全部分解された時に起こったであろう蛍光の変化量で
割ることにより算出することができる。反応中に起こる
蛍光の変化量は、共にEtBrの存在下での循環試料と未循
環試料の間の蛍光の差として測定される。これはＰＣＲ
熱循環の前と後の反応混合物を測定することと同等であ
る。蛍光の最大可能変化量の直接測定は行わなかった。
代わりに、EtBrの存在下での完全に分解されたプローブ
の蛍光の推定値とEtBrを含む未循環試料の蛍光との差と
して蛍光の最大可能変化量を推定した。EtBrの存在下で
の完全に分解されたプローブの蛍光の推定値は下記に記
載の通り得られた。
る蛍光の変化量を蛍光の最大可能変化量、即ちプローブ
が全部分解された時に起こったであろう蛍光の変化量で
割ることにより算出することができる。反応中に起こる
蛍光の変化量は、共にEtBrの存在下での循環試料と未循
環試料の間の蛍光の差として測定される。これはＰＣＲ
熱循環の前と後の反応混合物を測定することと同等であ
る。蛍光の最大可能変化量の直接測定は行わなかった。
代わりに、EtBrの存在下での完全に分解されたプローブ
の蛍光の推定値とEtBrを含む未循環試料の蛍光との差と
して蛍光の最大可能変化量を推定した。EtBrの存在下で
の完全に分解されたプローブの蛍光の推定値は下記に記
載の通り得られた。
【００８９】EtBrを含まない未循環試料の蛍光に0.94を
掛けた値を、プローブが全部分解された時のEtBrの存在
下での試料の蛍光を概算するのに使った。EtBr無しで
は、プローブの蛍光はオリゴヌクレオチドの長さにより
ほとんど影響を受けない。よって、未分解の（全長）プ
ローブを含有する試料の蛍光は、完全に分解された（短
鎖）プローブを含有する試料のものとほぼ同じである。
EtBrを含まない未循環試料の蛍光は、EtBrを含まない完
全に分解された断片を含有する試料の蛍光とほぼ同じで
ある。
掛けた値を、プローブが全部分解された時のEtBrの存在
下での試料の蛍光を概算するのに使った。EtBr無しで
は、プローブの蛍光はオリゴヌクレオチドの長さにより
ほとんど影響を受けない。よって、未分解の（全長）プ
ローブを含有する試料の蛍光は、完全に分解された（短
鎖）プローブを含有する試料のものとほぼ同じである。
EtBrを含まない未循環試料の蛍光は、EtBrを含まない完
全に分解された断片を含有する試料の蛍光とほぼ同じで
ある。
【００９０】EtBrを含む完全に分解された断片を含有す
る試料の蛍光は、EtBrによる完全に分解されたプローブ
の残留消光を考慮に入れた後に得られる。図１に示され
るように、完全に分解されたプローブ断片のEtBrによる
残留消光は約６％である。従って、EtBrを含まない未循
環試料の蛍光に0.94の係数を掛けることにより、EtBrの
存在下での完全に分解されたプローブを含有する試料の
蛍光の推定値が提供される。EtBrを含む未循環試料の蛍
光を差し引くことにより、所望の蛍光の最大可能変化量
の推定値が提供される。
る試料の蛍光は、EtBrによる完全に分解されたプローブ
の残留消光を考慮に入れた後に得られる。図１に示され
るように、完全に分解されたプローブ断片のEtBrによる
残留消光は約６％である。従って、EtBrを含まない未循
環試料の蛍光に0.94の係数を掛けることにより、EtBrの
存在下での完全に分解されたプローブを含有する試料の
蛍光の推定値が提供される。EtBrを含む未循環試料の蛍
光を差し引くことにより、所望の蛍光の最大可能変化量
の推定値が提供される。
【００９１】上記近似から、EtBrを含まない溶液中での
長鎖プローブと短鎖プローブの間の蛍光の差が無視でき
ると思われる。実際の実施では、EtBrの不在下であって
も、標識の蛍光は取り付けられるオリゴヌクレオチドの
長さと配列の両方に或る程度依存する。この依存性は予
測できないので、蛍光の最大可能変化量を直接測定する
ことが望ましい。これは、追加の反応混合物を調製し、
その反応混合物に該プローブを完全に分解するＤＮＡヌ
クレアーゼを加えることによって達成される。蛍光の最
大変化量は、プローブ分解の前後の反応混合物の蛍光の
差として算出される。
長鎖プローブと短鎖プローブの間の蛍光の差が無視でき
ると思われる。実際の実施では、EtBrの不在下であって
も、標識の蛍光は取り付けられるオリゴヌクレオチドの
長さと配列の両方に或る程度依存する。この依存性は予
測できないので、蛍光の最大可能変化量を直接測定する
ことが望ましい。これは、追加の反応混合物を調製し、
その反応混合物に該プローブを完全に分解するＤＮＡヌ
クレアーゼを加えることによって達成される。蛍光の最
大変化量は、プローブ分解の前後の反応混合物の蛍光の
差として算出される。
【００９２】分光光度計を使って測定された蛍光の変化
量から算出した時のプローブ分解の量を下記に示す。２
つの複製反応の各々について算出された値を示す。その
値は、上述の蛍光の最大変化量の近似値を使って算出さ
れる。
量から算出した時のプローブ分解の量を下記に示す。２
つの複製反応の各々について算出された値を示す。その
値は、上述の蛍光の最大変化量の近似値を使って算出さ
れる。
【００９３】
【表３】 CytoFluor TM 2300 マイクロウエルプレートリーダー中
で測定された蛍光の変化量から算出されたプローブ分解
の量を下記に示す。２つの複製反応の各々について算出
された値を示す。その値は、上述の蛍光の最大変化量の
近似値を使って算出される。
で測定された蛍光の変化量から算出されたプローブ分解
の量を下記に示す。２つの複製反応の各々について算出
された値を示す。その値は、上述の蛍光の最大変化量の
近似値を使って算出される。
【００９４】
【表４】 これらの結果は、蛍光の変化がプローブ分解の検出を可
能にするのに十分であったことを証明する。
能にするのに十分であったことを証明する。
【００９５】実施例５：プローブの二次構造による消光
の増大 一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの中の二次構造の存
在は、消光剤が挿入できる二本鎖ＤＮＡの領域を提供す
ることにより、挿入性ＤＮＡ結合消光剤による消光を増
大させることができる。これは、１つのプローブが標的
配列にハイブリダイズしなかった時にヘアピン構造を形
成すると予想される点で異なっているプローブの消光を
比較することにより証明された。
の増大 一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの中の二次構造の存
在は、消光剤が挿入できる二本鎖ＤＮＡの領域を提供す
ることにより、挿入性ＤＮＡ結合消光剤による消光を増
大させることができる。これは、１つのプローブが標的
配列にハイブリダイズしなかった時にヘアピン構造を形
成すると予想される点で異なっているプローブの消光を
比較することにより証明された。
【００９６】実験は本質的には実施例３に記載の通りに
実施した。ただし、温度と蛍光を連続的に測定した。２
つがヘアピン二次構造を形成する３種のオリゴヌクレオ
チドを、本質的には上記実施例１に記載の通りに合成し
た。それらの配列と標識部位を下記に示す。 SGW140（配列番号９）（ヘアピン） FAMTM−CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGACTATG SGW146（配列番号10）（ヘアピン） FAMTM−CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGACTANG ST50FLC （配列番号11） FAMTM−CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT ここでＮはTAMRA が結合される修飾チミジンを表す。
実施した。ただし、温度と蛍光を連続的に測定した。２
つがヘアピン二次構造を形成する３種のオリゴヌクレオ
チドを、本質的には上記実施例１に記載の通りに合成し
た。それらの配列と標識部位を下記に示す。 SGW140（配列番号９）（ヘアピン） FAMTM−CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGACTATG SGW146（配列番号10）（ヘアピン） FAMTM−CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGACTANG ST50FLC （配列番号11） FAMTM−CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT ここでＮはTAMRA が結合される修飾チミジンを表す。
【００９７】SGW140（配列番号９）とSGW146（配列番号
10）は、ハイブリダイズしてヘアピン二次構造を形成す
ることができる自己相補的末端領域を有する。SGW146
（配列番号10）はその上３′末端付近に結合した第二の
消光性化合物（TAMRA TM）を含有する。ヘアピン構造の
形成は FAMTMとTAMRA TMをごく近位状態にし、それによ
って蛍光を消光する。このオリゴヌクレオチドの場合に
は、 TAMRATMとEtBrの両方による FAMTMの合同消光が測
定された。
10）は、ハイブリダイズしてヘアピン二次構造を形成す
ることができる自己相補的末端領域を有する。SGW146
（配列番号10）はその上３′末端付近に結合した第二の
消光性化合物（TAMRA TM）を含有する。ヘアピン構造の
形成は FAMTMとTAMRA TMをごく近位状態にし、それによ
って蛍光を消光する。このオリゴヌクレオチドの場合に
は、 TAMRATMとEtBrの両方による FAMTMの合同消光が測
定された。
【００９８】測定はジャケット付クオーツキュベットを
使ってHitachi/Perkin Elmer Model650-40 蛍光分光蛍
光計の中で実施した。励起および発光単色計をそれぞれ
495nmと522 nmに設定した。それらの単色計のスリット
幅をそれぞれ3 nmと7 nmに設定した。ＰＣＲ緩衝液（50
mM KCl, 10mM Tris pH 8.3, 3mM MgCl2 ）中に４μg/ml
のEtBrと共にまたは伴わずに 0.5μＭ標識オリゴヌクレ
オチドを含有する400μl 溶液を使って測定を行った。
溶液は必要になるまで遮光下で冷蔵庫の中に保存した。
使ってHitachi/Perkin Elmer Model650-40 蛍光分光蛍
光計の中で実施した。励起および発光単色計をそれぞれ
495nmと522 nmに設定した。それらの単色計のスリット
幅をそれぞれ3 nmと7 nmに設定した。ＰＣＲ緩衝液（50
mM KCl, 10mM Tris pH 8.3, 3mM MgCl2 ）中に４μg/ml
のEtBrと共にまたは伴わずに 0.5μＭ標識オリゴヌクレ
オチドを含有する400μl 溶液を使って測定を行った。
溶液は必要になるまで遮光下で冷蔵庫の中に保存した。
【００９９】各試料を分光蛍光計内のジャケット付キュ
ベット中に入れ、そして蒸発を防ぐために試料の上に鉱
油を重層させた。溶液の温度を20〜95℃の間で約１℃／
分の速度で上昇および低下させた。EtBrを含まない直鎖
状プローブの蛍光に関して標準化した蛍光測定値を図３
に与える。温度を上昇および低下させながら記録した測
定値が示される。蛍光の最大変化量が観察された温度に
相当する融解中点値も示される。
ベット中に入れ、そして蒸発を防ぐために試料の上に鉱
油を重層させた。溶液の温度を20〜95℃の間で約１℃／
分の速度で上昇および低下させた。EtBrを含まない直鎖
状プローブの蛍光に関して標準化した蛍光測定値を図３
に与える。温度を上昇および低下させながら記録した測
定値が示される。蛍光の最大変化量が観察された温度に
相当する融解中点値も示される。
【０１００】EtBrはヘアピンプローブの二本鎖領域を安
定化し、それによって融解温度を上昇させることが観察
された。これは、EtBrの添加によって生じた融解中点値
のシフトを比較する図３から理解することができる。ヘ
アピン二次構造の存在がEtBrによる蛍光消光を増大させ
ることが観察された。
定化し、それによって融解温度を上昇させることが観察
された。これは、EtBrの添加によって生じた融解中点値
のシフトを比較する図３から理解することができる。ヘ
アピン二次構造の存在がEtBrによる蛍光消光を増大させ
ることが観察された。
【０１０１】実施例６：多重標識プローブの消光の増大 上記実施例４に記載の方法で使用される別のプローブ
は、消光剤として作用しそして５′末端蛍光標識の数塩
基以内のところでプローブオリゴヌクレオチドに結合さ
れている第二の標識を含有する。未開裂のプローブ上の
蛍光標識は、蛍光エネルギー転移によって第二の結合標
識により消光される。プライマー伸長中に起こるプロー
ブ分解が標識と消光剤を分離し、それによって検出可能
なシグナルを増大させる。そのようなプローブの利用は
米国特許第5,210,015 号に記載されている。未開裂のプ
ローブを消光させる本発明の方法は、未開裂のプローブ
を更に消光させるために二重標識プローブと共に使用
し、それによってプローブ分解により生成するシグナル
の変化量を増加させることができる。
は、消光剤として作用しそして５′末端蛍光標識の数塩
基以内のところでプローブオリゴヌクレオチドに結合さ
れている第二の標識を含有する。未開裂のプローブ上の
蛍光標識は、蛍光エネルギー転移によって第二の結合標
識により消光される。プライマー伸長中に起こるプロー
ブ分解が標識と消光剤を分離し、それによって検出可能
なシグナルを増大させる。そのようなプローブの利用は
米国特許第5,210,015 号に記載されている。未開裂のプ
ローブを消光させる本発明の方法は、未開裂のプローブ
を更に消光させるために二重標識プローブと共に使用
し、それによってプローブ分解により生成するシグナル
の変化量を増加させることができる。
【０１０２】消光剤を組み合わせることにより提供され
る追加の消光を証明するために、５′末端で FAMTM標識
されたプローブのEtBrによる蛍光消光を、 FAMTMとマラ
カイトクリーン（MG）の両方で標識されたプローブのEt
Brによる蛍光消光と比較した。５′末端に単一の FAMTM
標識が取り付けられているかまたは FAMTM標識から３塩
基離れて追加のMG標識が取り付けられているプローブを
合成した。両プローブは下記に示す配列を使って合成し
た：
る追加の消光を証明するために、５′末端で FAMTM標識
されたプローブのEtBrによる蛍光消光を、 FAMTMとマラ
カイトクリーン（MG）の両方で標識されたプローブのEt
Brによる蛍光消光と比較した。５′末端に単一の FAMTM
標識が取り付けられているかまたは FAMTM標識から３塩
基離れて追加のMG標識が取り付けられているプローブを
合成した。両プローブは下記に示す配列を使って合成し
た：
【０１０３】 SGW55 （配列番号12） FAMTM−CCANCAATGAGGAAGCTGCAAGAATGGGATAGAG。 ここでＮはマラカイトグリーンを結合させることができ
る修飾チミジンを表す。蛍光の測定は、本質的には上記
実施例２に記載の通りに行った。結果を下記に示す。
る修飾チミジンを表す。蛍光の測定は、本質的には上記
実施例２に記載の通りに行った。結果を下記に示す。
【０１０４】
【表５】
【０１０５】ＰＣＲ試薬混合物中のEtBrによるかまたは
追加の標識による消光は、検出可能なシグナルの変化を
生じるのに十分である。消光方法の組合せは消光効率の
有意な増加を提供し、開裂されたプローブと未開裂のプ
ローブの一層高感度な識別を可能にする。上記実施例４
に記載の方法においてここに記載のような多重標識プロ
ーブを使用することは、開裂されたプローブと未開裂の
プローブとを識別する能力を更に増大させるだろう。
追加の標識による消光は、検出可能なシグナルの変化を
生じるのに十分である。消光方法の組合せは消光効率の
有意な増加を提供し、開裂されたプローブと未開裂のプ
ローブの一層高感度な識別を可能にする。上記実施例４
に記載の方法においてここに記載のような多重標識プロ
ーブを使用することは、開裂されたプローブと未開裂の
プローブとを識別する能力を更に増大させるだろう。
【０１０６】実施例７：他のＤＮＡ結合化合物による消
光 蛍光標識プローブの溶液中消光に別の適当なＤＮＡ結合
化合物を選択できることを次のような蛍光性ＤＮＡ結合
化合物を使って証明した：RO-PRO-1, BO-PRO-1, YO-PRO
-1およびTO-PRO-1。それらの化合物はMolecular Probes
(Eugene, OR)から市販されている関連する単量体シア
ニン核酸染料である。各化合物についてナノメートルで
測定された励起および発光極大を下記に与える。フルオ
レセイン標識の励起および発光極大を比較のため示す。
光 蛍光標識プローブの溶液中消光に別の適当なＤＮＡ結合
化合物を選択できることを次のような蛍光性ＤＮＡ結合
化合物を使って証明した：RO-PRO-1, BO-PRO-1, YO-PRO
-1およびTO-PRO-1。それらの化合物はMolecular Probes
(Eugene, OR)から市販されている関連する単量体シア
ニン核酸染料である。各化合物についてナノメートルで
測定された励起および発光極大を下記に与える。フルオ
レセイン標識の励起および発光極大を比較のため示す。
【０１０７】
【表６】 フルオレセイン標識とＤＮＡ結合化合物との最大相互作
用は、フルオレセイン（516 nm）の発光極大がＤＮＡ結
合化合物の励起極大と最も接近して合致した時に起こる
と予想される。よって、TO-PRO-1はフルオレセイン標識
の最大消光を示すと予想され、PO-PRO-1は最小消光を示
すと予想された。
用は、フルオレセイン（516 nm）の発光極大がＤＮＡ結
合化合物の励起極大と最も接近して合致した時に起こる
と予想される。よって、TO-PRO-1はフルオレセイン標識
の最大消光を示すと予想され、PO-PRO-1は最小消光を示
すと予想された。
【０１０８】長さ33および２のオリゴヌクレオチドを上
述と同様に合成した。これら２つのオリゴヌクレオチド
の配列を５′→３′方向で下記に示す。長さ２のオリゴ
ヌクレオチドは全長オリゴヌクレオチドの分解形に相当
する。オリゴ 配列番号 配列 ST535FS 13 FAMTM−AGAAGGTGAGATGACCAGAGGACTGAGTCCAAT ST4F FAMTM−AG
述と同様に合成した。これら２つのオリゴヌクレオチド
の配列を５′→３′方向で下記に示す。長さ２のオリゴ
ヌクレオチドは全長オリゴヌクレオチドの分解形に相当
する。オリゴ 配列番号 配列 ST535FS 13 FAMTM−AGAAGGTGAGATGACCAGAGGACTGAGTCCAAT ST4F FAMTM−AG
【０１０９】上記ＤＮＡ結合化合物のうちの１つを含有
するおよび含有しない溶液中の標識オリゴヌクレオチド
の蛍光を、本質的には実施例２と同様に、PTI LS-100発
光分光光度計（Photon Technology International, Lon
don, Ontario, Canada）を使って測定した。0.5 μＭオ
リゴヌクレオチド、１×ＰＣＲ緩衝液（50mM KCl, 10mM
Tris pH 8.3および 3mM MgCl2）を含みそして５μＭの
ＤＮＡ結合化合物の１つを含むかまたは含まない 400μ
l 溶液中で測定を行った。各オリゴヌクレオチドおよび
ＤＮＡ結合化合物について、未消光シグナルの％として
表した消光の量を下記に与える。
するおよび含有しない溶液中の標識オリゴヌクレオチド
の蛍光を、本質的には実施例２と同様に、PTI LS-100発
光分光光度計（Photon Technology International, Lon
don, Ontario, Canada）を使って測定した。0.5 μＭオ
リゴヌクレオチド、１×ＰＣＲ緩衝液（50mM KCl, 10mM
Tris pH 8.3および 3mM MgCl2）を含みそして５μＭの
ＤＮＡ結合化合物の１つを含むかまたは含まない 400μ
l 溶液中で測定を行った。各オリゴヌクレオチドおよび
ＤＮＡ結合化合物について、未消光シグナルの％として
表した消光の量を下記に与える。
【０１１０】
【表７】
【０１１１】本法は長鎖および短鎖オリゴヌクレオチド
の示差的消光を当てにしている。発光極大と励起極大の
比較から予想された通り、TO-PRO-1によるフルオレセイ
ンの蛍光消光が最大であると観察され、そしてPO-PRO-1
によるフルオレセインの蛍光消光が最小であると観察さ
れた。TO-PRO-1は、標識された２ヌクレオチド断片の大
きく減少した消光も示した。本法を使った反応液中のオ
リゴヌクレオチド開裂の選択的検出を可能にするには、
消光の３倍以上の差（〜96％から〜30％へ）が十分であ
る。
の示差的消光を当てにしている。発光極大と励起極大の
比較から予想された通り、TO-PRO-1によるフルオレセイ
ンの蛍光消光が最大であると観察され、そしてPO-PRO-1
によるフルオレセインの蛍光消光が最小であると観察さ
れた。TO-PRO-1は、標識された２ヌクレオチド断片の大
きく減少した消光も示した。本法を使った反応液中のオ
リゴヌクレオチド開裂の選択的検出を可能にするには、
消光の３倍以上の差（〜96％から〜30％へ）が十分であ
る。
【０１１２】上記結果は、優勢的な消光機構がＦＥＴで
あり得ることを示唆し、そして標識の発光極大と消光剤
の励起極大を比較することにより他の適当な標識／消光
剤ペアを予想通りに選択できることを示唆している。選
択の後、下記に記載するような常用のスクリーニングに
より、長鎖標識オリゴヌクレオチドの消光と短鎖標識オ
リゴヌクレオチドの消光の差を最大にする最適消光剤濃
度を決定することができる。本発明の方法における使用
のためのTO-PRO-1の最適濃度は次の通りに決定された。
０〜10μＭの濃度でTO-PRO-1を含有する溶液中で上記プ
ローブの各々の蛍光消光を測定した。本質的には上述し
た通りに測定を実施した。その結果を下記に与える。
あり得ることを示唆し、そして標識の発光極大と消光剤
の励起極大を比較することにより他の適当な標識／消光
剤ペアを予想通りに選択できることを示唆している。選
択の後、下記に記載するような常用のスクリーニングに
より、長鎖標識オリゴヌクレオチドの消光と短鎖標識オ
リゴヌクレオチドの消光の差を最大にする最適消光剤濃
度を決定することができる。本発明の方法における使用
のためのTO-PRO-1の最適濃度は次の通りに決定された。
０〜10μＭの濃度でTO-PRO-1を含有する溶液中で上記プ
ローブの各々の蛍光消光を測定した。本質的には上述し
た通りに測定を実施した。その結果を下記に与える。
【０１１３】
【表８】
【０１１４】示したデータは、フルオレセインの励起お
よび発光波長におけるTO-PRO-1による吸収について補正
しなかった。高濃度のTO-PRO-1による短鎖オリゴヌクレ
オチドの有意な消光は、TO-PRO-1の光学濃度からくるの
であって、フルオレセインの消光によるのではない。5.
0 μＭのTO-PRO-1濃度は全長プローブと分解したプロー
ブの間の消光に最大の差を提供するだろう。
よび発光波長におけるTO-PRO-1による吸収について補正
しなかった。高濃度のTO-PRO-1による短鎖オリゴヌクレ
オチドの有意な消光は、TO-PRO-1の光学濃度からくるの
であって、フルオレセインの消光によるのではない。5.
0 μＭのTO-PRO-1濃度は全長プローブと分解したプロー
ブの間の消光に最大の差を提供するだろう。
【０１１５】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：10 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GAGACCATCA 10
【０１１６】配列番号：２ 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GAGACCATCA ATGAG 15
【０１１７】配列番号：３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GAGACCATCA ATGAGGAAGC 20
【０１１８】配列番号：４ 配列の長さ：25 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAG 25
【０１１９】配列番号：５ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAATGG 30
【０１２０】配列番号：６ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GACCATCAAT GAGGAAGCTG CAAGAATGGG ATAG 34
【０１２１】配列番号：７ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CCATCAATGA GGAAGCTGCA AGAATGGGAT AGAG 34
【０１２２】配列番号：８ 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 GACCATCAAT GAGGAAGCTG CAAGAATGGG ATAG 34
【０１２３】配列番号：９ 配列の長さ：38 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CATAGTGGTC TGCGGAACCG GTGAGTACAC CGACTATG 38
【０１２４】配列番号：10 配列の長さ：38 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CATAGTGGTC TGCGGAACCG GTGAGTACAC CGACTANG 38
【０１２５】配列番号：11 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CATAGTGGTC TGCGGAACCG GTGAGT 26
【０１２６】配列番号：12 配列の長さ：34 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 CCANCAATGA GGAAGCTGCA AGAATGGGAT AGAG 34
【０１２７】配列番号：13 配列の長さ：33 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列 AGAAGGTGAG ATGACCAGAG GACTGAGTCC AAT 33
【図１】図１は、蛍光団が結合されるオリゴヌクレオチ
ドの長さに対する溶液中蛍光消光の依存性に関するグラ
フである。
ドの長さに対する溶液中蛍光消光の依存性に関するグラ
フである。
【図２】図２は、温度に対する溶液中蛍光消光の依存性
に関するグラフである。
に関するグラフである。
【図３】図３は、温度に対する溶液中蛍光消光の依存性
および標識された一本鎖オリゴヌクレオチド内部のヘア
ピン二次構造の存在に起因する観察される消光の増大に
関するグラフである。
および標識された一本鎖オリゴヌクレオチド内部のヘア
ピン二次構造の存在に起因する観察される消光の増大に
関するグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート マルコルム ワトソン アメリカ合衆国，カリフォルニア 94703, バークレー，バークレー ウェイ 1819
Claims (7)
- 【請求項１】 溶液中の発光性標識で標識された一本鎖
オリゴヌクレオチドの発光を制御する方法であって、前
記溶液中にＤＮＡ結合化合物を含めることを含んで成
り、前記ＤＮＡ結合化合物が前記標識と相互作用して前
記標識の発光を変化させることを特徴とする方法。 - 【請求項２】 発光性標識で標識された一本鎖オリゴヌ
クレオチドの開裂による分解を検出する方法であって、
前記開裂が反応により触媒され、そして前記方法が (a) 前記反応を実施するのに適当な反応混合物を用意
し、ここで前記反応混合物は前記オリゴヌクレオチドと
ＤＮＡ結合化合物を含んで成り、前記ＤＮＡ結合化合物
は前記標識と相互作用して前記標識の発光を変更するこ
とができ； (b) 前記反応混合物中の前記オリゴヌクレオチドの発光
を測定し； (c) 前記オリゴヌクレオチドの開裂を引き起こす条件下
で前記反応を実施し； (d) 前記反応混合物中の前記オリゴヌクレオチドの発光
を測定し；そして (e) 段階(b) と段階(d) で測定した発光の差により、前
記オリゴヌクレオチドの開裂を検出することを含んで成
る方法。 - 【請求項３】 試料中の標的核酸を検出する方法であっ
て、 (a) 反応に向けて反応混合物を用意し、ここで前記反応
混合物は前記試料、ＤＮＡ結合化合物、および発光性標
識で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを含
んで成り、前記プローブは前記標的核酸にハイブリダイ
ズすることができる配列を含み、前記ＤＮＡ結合化合物
は前記標識の発光を変化させることができ、そして前記
オリゴヌクレオチドが前記標的核酸にハイブリダイズし
た時にのみ前記反応が前記オリゴヌクレオチドの開裂を
触媒し； (b) 前記反応混合物中の前記オリゴヌクレオチドの発光
を測定し； (c) 前記オリゴヌクレオチドプローブが前記標的配列に
ハイブリダイズしそして開裂される条件下で前記混合物
を処理し； (d) 前記反応混合物中の前記オリゴヌクレオチドの発光
を測定し；そして (e) 段階(b) と段階(d) で測定された発光の差により標
的配列が存在するかどうかを決定することを含んで成る
方法。 - 【請求項４】 前記標的配列が段階(c) の前に増幅され
る、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使っ
て試料中の標的核酸配列を検出する方法であって、 (a) 前記試料、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、
５′→３′ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラー
ゼ、ＤＮＡ結合化合物、および前記標的核酸の一領域に
ハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプ
ローブを含んで成るＰＣＲ反応混合物を用意し、ここで
前記オリゴヌクレオチドプローブは前記オリゴヌクレオ
チドプライマーにより結合された前記標的核酸配列中に
ハイブリダイズし、前記オリゴヌクレオチドプローブは
発光性標識で標識されており、そして前記ＤＮＡ結合化
合物は前記標識の発光を変化させることができ； (b) 前記反応混合物中の前記標識の発光を測定し； (c) ＰＣＲ条件下でＰＣＲ反応混合物を処理し、ここで
前記核酸ポリメラーゼの５′→３′ヌクレアーゼ活性が
前記標的配列にハイブリダイズしたプローブを開裂し； (d) 前記反応混合物中の前記標識の発光を測定し；そし
て (e) 段階(b) で測定された発光と段階(d) で測定された
発光の差により、前記標的配列が存在するかどうかを決
定することを含んで成る方法。 - 【請求項６】 前記ＤＮＡ結合化合物がＤＮＡ挿入剤で
ある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 - 【請求項７】 前記標識がフルオレセイン誘導体であ
り、そして前記ＤＮＡ結合化合物が臭化エチジウムであ
る、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/299,682 US5491063A (en) | 1994-09-01 | 1994-09-01 | Methods for in-solution quenching of fluorescently labeled oligonucleotide probes |
| US299682 | 2002-11-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0870876A true JPH0870876A (ja) | 1996-03-19 |
| JP3795557B2 JP3795557B2 (ja) | 2006-07-12 |
Family
ID=23155803
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21902695A Expired - Lifetime JP3795557B2 (ja) | 1994-09-01 | 1995-08-28 | 発光性標識で標識されたオリゴヌクレオチドの分解検出方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5491063A (ja) |
| EP (1) | EP0699768B1 (ja) |
| JP (1) | JP3795557B2 (ja) |
| AT (1) | ATE243759T1 (ja) |
| CA (1) | CA2157200C (ja) |
| DE (1) | DE69531133T2 (ja) |
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