ES2202333T3 - Metodos de extincion de la fluorescencia de sondas de oligonucleotidos en solucion. - Google Patents

Metodos de extincion de la fluorescencia de sondas de oligonucleotidos en solucion.

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ES2202333T3 ES95113012T ES95113012T ES2202333T3 ES 2202333 T3 ES2202333 T3 ES 2202333T3 ES 95113012 T ES95113012 T ES 95113012T ES 95113012 T ES95113012 T ES 95113012T ES 2202333 T3 ES2202333 T3 ES 2202333T3
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Abstract

LA INVENCION SE DIRIGE A METODOS PARA CONTROLAR LA EMISION DE LUZ DE UN OLIGONUCLEOTIDO ETIQUETADO CON UNA ETIQUETA EMISORA DE LUZ QUE SON UTILES EN ENSAYOS DE DETECCION DE ACIDO NUCLEICO. UNA REACCION QUE DA COMO RESULTADO LA DIVISION DE SONDAS DE OLIGONUCLEOTIDOS DE RAMAL SIMPLE ETIQUETADOS CON UNA ETIQUETA EMISORA DE LUZ SE LLEVA A CABO EN LA PRESENCIA DE UN COMPUESTO DE UNION DE DNA QUE INTERACTUA CON LA ETIQUETA PARA MODIFICAR LA EMISION DE LUZ DE LA ETIQUETA. LOS METODOS UTILIZAN EL CAMBIO EN LA EMISION DE LUZ DE LA SONDA ETIQUETADA QUE RESULTA DE LA DEGRADACION DE LA SONDA. LOS METODOS SON APLICABLES EN GENERAL A ENSAYOS QUE UTILIZAN UNA REACCION QUE DA COMO RESULTADO LA DIVISION DE SONDAS DE OLIGONUCLEOTIDOS, Y EN PARTICULAR PARA ENSAYOS DE AMPLIFICACION/DETECCION HOMOGENEA EN DONDE LA SONDA HIBRIDIZADA SE DIVIDE CONCOMITANTEMENTE CON LA EXTENSION PRIMARIA. SE SUMINISTRA UN ENSAYO DE AMPLIFICACION/DETECCION HOMOGENEA QUE PERMITE LA DETECCION SIMULTANEA DE LA ACUMULACION DEL OBJETIVOAMPLIFICADO Y LA DETECCION ESPECIFICA PARA LA SECUENCIA DEL OBJETIVO.

Description

Métodos de extinción de la fluorescencia de sondas de oligonucleótidos en solución.
La presente invención se refiere a métodos para modificar la emisión luminosa de oligonucleótidos marcados con un marcador emisor de luz en solución empleando un cromóforo que fije el DNA. Se refiere además a métodos de detección de la degradación de oligonucleótidos de cadena simple, marcados con un marcador que emita luz en solución. La invención se refiere además a métodos de detección de secuencias de ácido nucleico por hibridación con una sonda oligonucleótida complementaria.
La detección de ácidos nucleicos empleando sondas de oligonucleótidos se ha convertido en un método estándar para la detección de dianas específicas. Se han descrito muchas modificaciones del método. En general se inmoviliza una muestra de DNA sobre un soporte sólido y después se hibrida para convertirse en una sonda marcada, específica de la diana a detectar (ver por ejemplo Falkow y col., patente US-4 358 535).
Se han descrito diversos métodos de detección de ácidos nucleicos que consisten en la segmentación selectiva de sondas de oligonucleótidos después de haberse formado dúplexes de hibridación de sonda-diana. La detección de sondas segmentadas indica la aparición de hibridación y, por tanto, la presencia de secuencias diana. Por ejemplo, Saiki y col., 1985, Biotechnology 3, 1008-1012, describen los métodos de detección de "restricción de oligómeros", en los que la hibridación de una sonda específica de la diana genera un sitio de restricción que seguidamente se segmenta con la correspondiente enzima de restricción. En la publicación de patente WO 89/09284 se describen métodos en los que se emplean sondas de RNA para detectar secuencias diana de DNA. Las sondas de RNA se hibridan con el DNA diana y se segmentan con RNasa H, que segmenta selectivamente el RNA en dúplexes híbridos de RNA-DNA. En la patente US-5 210 015 se describen métodos que aprovechan la actividad de 5'\rightarrow3'-exonucleasa de una polimerasa de ácidos nucleicos para segmentar sondas hibridadas con secuencias diana y de este modo desprenden fragmentos oligonucleótidos marcados, idóneos para la detección. Estos métodos requieren un oligonucleótido adicional, hibridado hacia la línea de entrada (upstream) del punto de hibridación de la sonda para que actúe como cebador de la reacción de extensión mediada por polimerasa. La segmentación de la sonda tiene lugar de modo concomitante con la extensión del cebador.
La invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un proceso de amplificación de ácidos nucleicos, permite la detección de ácidos nucleicos con una sensibilidad y una especificidad muy mejoradas. Utilizando la PCR pueden amplificarse selectivamente segmentos de un DNA genómico de copia simple antes de la detección, obteniéndose un nivel fácilmente detectable. Se publican métodos de PCR en la patente US-4 683 202. La PCR y los métodos de detección de los productos de la PCR empleando una sonda de oligonucleótido capaz de hibridarse con el ácido nucleico diana amplificado se describen en la patente US-4 683 195 y en la publicación de patente europea nº 237 362.
De modo similar a los métodos de detección de ácidos nucleicos sin amplificar que se han descrito anteriormente se han descrito también métodos de detección de productos amplificados que consisten en la segmentación selectiva de sondas de hibridación después de haberse formado dúplexes hibridados de sonda-diana. Saiki y col., Science 1985, 230, 1350-1353, describen la aplicación de la "restricción de oligómeros" a la detección de productos amplificados. En la patente US-5 210 015 se describe también el análisis de los productos amplificados por PCR empleando la actividad de 5'\rightarrow3'-exonucleasa de una polimerasa de ácido nucleico para segmentar sondas marcadas, hibridadas con secuencias diana (ver también Holland y col., Proc. Acad. Sci. USA 1991, 88, 7276-7280). Las sondas que se hibridan con una región del ácido nucleico diana se segmentan por la actividad de 5'\rightarrow3'-nucleasa de la polimerasa durante la extensión del cebador. La detección de los fragmentos marcados indica la aparición tanto de la extensión del cebador como de la hibridación de la muestra y, por tanto, la amplificación de una secuencia diana específica.
Se ha descrito un gran número de agentes para el marcado de ácidos nucleicos, ya sean sondas, ya sean dianas, para facilitar la detección de los ácidos nucleicos dianas. Se han descrito marcadores que proporcionan señales detectables por fluorescencia, radiactividad, colorimetría, difracción de rayos X o absorción, magnetismo y actividad enzimática, que incluyen por ejemplo fluoróforos, cromóforos, isótopos radiactivos (en especial el P^{32} y el I^{125}), reactivos 
\hbox{electrón-densos,}
enzimas y ligandos que tienen reactivos específicos de fijación. El marcado puede llevarse a cabo por muchos medios, por ejemplo la modificación química de un cebador o de una sonda para la incorporación de un marcador o bien la utilización de agentes de polimerización para incorporar un trifosfato de nucleósido modificado en un producto de extensión.
Se conoce un gran número de compuestos fluorescentes que fijan DNA. Comprenden los agentes de intercalado que fijan de modo no covalente las bases alineadas (stacked) de ácidos nucleicos y desvelan un cambio en la fluorescencia, cuyo resultado es un aumento o un desplazamiento a una longitud de onda diferente. En la patente US-4 582 789 se describen varias fracciones o restos intercalados, incluidos los psoralenos. El bromuro de etidio (EtBr) es un compuesto intercalado que despliega una fluorescencia mayor cuando se fija sobre un DNA de doble cadena que cuando se halla en solución libre (Sharp y col., Biochemistry 1973, 12, 3055). Aunque el EtBr puede utilizarse para detectar ácidos nucleicos tanto de cadena simple como de cadena doble, la afinidad del EtBr con los ácidos nucleicos de cadena simple es relativamente baja. El EtBr se emplea habitualmente para la detección no específica de ácidos nucleicos después de una electroforesis a través de gel. Después del fraccionamiento de tamaño sobre una matriz apropiada de gel, por ejemplo agarosa o acrilamida, se succiona el gel a una solución diluida de EtBr. Entonces se visualiza el DNA examinando el gel con luz UV (ver Maniatis y col, coord., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York 1982, editorial Cold Spring Harbor Laboratory).
Higuchi y col., Bio/Techniques 1992, 10, 413-417; Higuchi y col., Bio/Techniques 1993, 11, 1026-1030; y las publicaciones de patente europea nº 487 218 y 512 334 describen un ensayo homogéneo para la detección de productos de la PCR y productos competidores de PCR, basada en el aumento de fluorescencia que despliegan el EtBr y otros marcados fijados sobre el DNA, cuando se fijan sobre un DNA de doble cadena. Estos métodos permiten la detección directa del aumento del DNA de doble cadena durante una reacción de amplificación, de modo más significativo a partir del aumento de la diana amplificada. Sin embargo, estos métodos detectan solamente la cantidad total de DNA de doble cadena en la reacción y no distinguen las secuencias específicas de los ácidos nucleicos; la especificidad de ensayo depende de la especificidad de la reacción de amplificación.
El uso de sondas de oligonucleótidos marcadas con marcadores fluorescentes interactivos en ensayos de hibridación de ácidos nucleicos se ha descrito en Morrison, Nonisotopic DNA Probe Techniques, Kricka coord., Academic Press Inc., 1992, San Diego, CA, capítulo 13; y en Heller y Morrison, Rapid Detection and Identification of Infections Agents, Academic Press Inc., 1985, San Diego, CA, páginas 245-256. Los métodos se basan en el cambio de fluorescencia que surgen cuando se ponen marcadores fluorescentes idóneos en una proximidad inmediata, estos métodos se describen en la bibliografía técnica como transferencia de energía de fluorescencia (FET), transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, transferencia de energía no radiactiva, transferencia de energía de intervalo amplio, transferencia de energía acoplada a dipolos o transferencia de energía de Förster. En la técnica se conoce un gran número de marcadores fluorescentes idóneos que son productos comerciales, por ejemplo de la empresa Molecular Probes (Eugene, OR).
Morrison, 1992, ver antes, describe formatos de ensayo basados en la FET, en los que los marcadores fluorescentes interactivos se fijan sobre nucleótidos separados que se colocan juntos o separados mediante una hibridación de sondas. Estos formatos de ensayo, que requieren dos sondas, se describen como competitivos o no competitivos, en función de si la hibridación sonda-sonda compite con la hibridación sonda-diana. En un formato alternativo de ensayo se fija un marcador fluorescente sobre la sonda de hibridación y el segundo marcador fluorescente se coloca en la proximidad inmediata intercalando en el dúplex de hibridación de doble cadena (= doble hebra). No se observa una interacción significativa entre el marcador intercalado y la sonda no hibridada en solución. Dado que el marcador intercalado puede intercalarse en cualquier ácido nucleico de doble cadena, este formato es práctico solamente para detectar ácidos nucleicos dianas de cadena simple (= hebra simple).
En una forma de ejecución de los métodos de detección de ácidos nucleicos, descritos en la patente 
\hbox{US-5 210 015,}
mencionada anteriormente, se utiliza una sonda que está marcada con marcados fluorescentes interactivos en una proximidad inmediata. Estos marcadores se pegan a la sonda separada por uno o varios nucleótidos, de modo que la degradación de la sonda durante la amplificación separa los marcadores, con lo cual se produce un cambio detectable de fluorescencia. Tales sondas de marcadores múltiples son difíciles y laboriosas de sintetizar.
Las técnicas convencionales de la biología molecular y de la química de los ácidos nucleicos, que ya son conocidas por los expertos en la materia, se han descrito exhaustivamente en la bibliografía técnica, ver por ejemplo Sambrook y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York 1985; Oligonucleotide Synthesis, coord. M.J. Gait, 1984; Nucleic Acid Hybridation, coord. B.D. Hames y S.J. Higgins, 1984; y la serie Methods in Enzymology, Academic Press Inc.
La presente invención proporciona métodos para modificar la emisión luminosa de una sonda de oligonucleótido marcada con un marcado emisor de lugar en solución, empleando un cromóforo que fije el DNA, capaz de interaccionar con el marcador para modificar la emisión de luz del marcador y dicho oligonucleótido de cadena simple no está hibridado con su cadena (hebra) complementaria.
La presente invención proporciona además métodos de detección de la degradación de oligonucleótidos en solución. Los oligonucleótidos se marcan con un marcador que emite luz. La segmentación de los oligonucleótidos se lleva a cabo en presencia de un cromóforo que fije el DNA, capaz de interaccionar con el marcador para modificar la emisión de luz del marcador. La degradación de oligonucleótidos se detecta midiendo el cambio resultante en la emisión de luz del marcador.
La presente invención proporciona las condiciones en las que tiene lugar una extinción significativa en solución por acción de un cromóforo que fije el DNA y que forma una unión emisora de luz con un oligonucleótido. Esta extinción tiene lugar sin hibridación del oligonucleótido marcado con su secuencia complementaria. Los métodos de la presente invención utilizan la dependencia de esta extinción con respecto a la longitud del nucleótido marcado. La extinción del marcador emisor de luz, fijado sobre un oligonucleótido corto (unos 6 nucleótidos o menos), es menos detectable que la extinción de un marcador emisor de luz que se haya fijado sobre un oligonucleótido más largo.
Tanto la aparición de la extinción en solución de un cromóforo que fije DNA y forme una unión emisora de luz con un oligonucleótido de cadena simple como la dependencia de la longitud del oligonucleótido son sorprendentes desde el punto de vista de la técnica anterior. Los ensayos descritos anteriormente (ver antes, Morrison, 1992), basados en la extinción de un compuesto intercalado de un marcador fluorescente unido a una sonda, recurren a intercalar del elemento de extinción en un dúplex de hibridación de doble cadena con el fin de color en una proximidad inmediata el elemento de extinción y el marcador. La técnica anterior enseña que la extinción en solución de un marcador unido a sondas monohebra (de cadena simple) sin hibridar es insignificante. Ya es bien conocido que la extinción por transferencia de energía fluorescente requiere que las sondas que interaccionan se hallen en una proximidad inmediata y que dos moléculas en solución no se mantienen en una proximidad suficiente para producir una extinción significativa. Además, los elementos de extinción intercalados, descritos en la técnica anterior, no se fijan de modo significativo sobre DNA de cadena simple y, por ello, no cabe esperar una extinción apreciable de un marcador unido a un DNA de cadena simple en solución. A diferencia de ello, la presente invención se basa en la extinción de un marcador fluorescente unido a un ácido nucleico de cadena simple mediante un cromóforo que fija sobre el DNA, que tiene lugar en solución.
La presente invención proporciona además métodos mejorados de detección de un ácido nucleico diana en una muestra por hibridación con una sonda oligonucleótida. Los métodos se basan en la segmentación selectiva de sondas hibridadas con el ácido nucleico diana. La detección de las sondas segmentadas empleando los métodos de la presente invención indica la presencia del ácido nucleico diana.
La presente invención proporciona, pues, un método de detección de un ácido nucleico diana en una muestra, dicho método consiste en:
(a) proporcionar una mezcla reaccionante que consta de una muestra, un cromóforo que fije el DNA y una sonda oligonucleótida marcada con un marcador emisor de luz, dicha sonda contiene una secuencia capaz de hibridarse con el ácido nucleico diana; y el compuesto que fija el DNA es capaz de modificar la emisión luminosa del marcador;
(b) medir la emisión de luz del marcador;
(c) tratar dicha mezcla en condiciones en las que dicha sonda oligonucleótida se hibrida con dicha secuencia diana y se segmenta;
(d) medir la emisión de luz del marcador; y
(e) determinar si la secuencia diana está presente a través de la diferencia entre la emisión de luz en la etapa (b) y la etapa (d).
La segmentación selectiva de sondas hibridadas con el ácido nucleico diana puede conseguirse por uno cualquiera de los muchos métodos conocidos. En Saiki y col., 1985, ver antes, en la publicación de patente WO 89/09284 y en la patente US-5 210 015 se describen ejemplos de reacciones idóneas para la segmentación selectiva de sondas hibridadas con secuencias diana.
Los métodos de la presente invención para detectar ácidos nucleicos son particularmente indicados para el uso en combinación con procesos de amplificación. De este modo, un una forma de ejecución de la invención, se amplifica la secuencia diana antes de la etapa (c).
En una forma preferida de ejecución, la presente invención proporciona mejoras a la amplificación PCR homogénea y al ensayo de detección de productos de PCR descrito en la patente US-5 210 015, que utiliza una sola polimerasa de ácido nucleico tanto para la extensión del cebador como para la segmentación de las sondas marcadas hibridadas. Las mejoras que aporta la presente invención permiten utilizar una sonda marcada con un solo marcador emisor de luz, sin requerir manipulaciones posteriores a la reacción para separar las sondas segmentadas de las no segmentadas.
Por tanto, la presente invención proporciona un método para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra empleando la PCR, dicho método consiste en:
(a) proporcionar una mezcla reaccionante de PCR que contenga dicha muestra, un par de cebadores oligonucleótidos, una polimerasa de ácido nucleico que tengan actividad de 5'\rightarrow3'-nucleasa, un cromóforo que fije el DNA y una sonda oligonucleótida capaz de hibridarse con una región del ácido nucleico diana fijado por los cebadores oligonucleótidos y en donde la sonda está marcada con un marcador emisor de luz, y en donde el compuesto que fija el DNA es capaz de modificar la emisión de luz del marcador;
(b) medir la emisión de luz del marcador;
(c) tratar la mezcla reaccionante de PCR en condiciones de la PCR, en la que la actividad de 5'\rightarrow3'-nucleasa de la polimerasa de ácido nucleico segmenta las sondas hibridadas con la secuencia diana;
(d) medir la emisión de luz del marcador;
(e) determinar si la secuencia diana está presente basándose en la diferencia en la emisión de luz entre la etapa (b) y la etapa (d).
En otra forma de ejecución del ensayo de amplificación PCR homogénea/detección, el cromóforo que fija el DNA proporcionado a la mezcla reaccionante se caracteriza porque proporcionar una señal detectable cuando se une a un DNA de cadena doble, dicha señal es más intensa que la cantidad de dicha señal proporcionada por dicho compuesto cuando está sin fijar, y la señal del cromóforo que fija el DNA se sigue con el fin de medir el aumento total en el DNA de cadena doble resultante del proceso de amplificación. En esta forma de ejecución, el cromóforo que fija el DNA actúa como elemento de extinción de la emisión de luz de la sonda sin fijar y también como compuesto generador de señal que se emplea en los métodos descritos por Higuchi y col., 1992, ver antes. En esta forma de ejecución de la presente invención, el cambio de señal generado por el compuesto que fija el DNA indica que la amplificación ha tenido lugar y el cambio en la emisión de luz del marcador de la sonda indica la amplificación de la secuencia diana específica. Por consiguiente, los métodos proporcionan mediciones separadas del éxito de la amplificación en un ensayo homogéneo, sin necesidad de reactivos adicionales.
La figura 1 presenta la dependencia entre la extinción fluorescente en solución y la longitud del oligonucleótido al que está unido el fluoróforo.
La figura 2 presenta la dependencia entre la extinción fluorescente en solución y la temperatura.
La figura 3 presenta la dependencia de la extinción fluorescente en solución y la temperatura y el aumento de la extinción observado por la presencia de una estructura secundaria tipo horquilla dentro del oligonucleótido de cadena simple marcado.
Para facilitar la comprensión de la invención se definen seguidamente algunos términos.
Los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se refieren a sondas y a fragmentos oligómeros que se van a detectar y deben tomarse en sentido genérico por polidesoxirribonucleótidos (que contiene 2-desoxi-D-ribosa), por polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa) y por cualquier otro tipo de polinucleótidos que sean N-glicósidos de una base purina o pirimidina o de una base purina o pirimidina modificadas. No se efectúa una distinción intencionada en cuanto a longitud entre los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido", por tanto, dichos términos pueden utilizarse de forma equivalente. Estos términos se refieren solamente a la estructura primaria de la molécula. Por tanto, estos términos incluyen tanto el DNA de cadena doble y de cadena simple como el RNA de cadena doble y de cadena simple.
Los términos "región diana", "secuencia diana" y "secuencia de ácido nucleico diana" se refieren a una región de un ácido nucleico que se pretende detectar.
El término "sonda" se refiere a un oligonucleótido, por ejemplo marcado, que forma una estructura dúplex con una secuencia de un ácido nucleico diana, resultante del apareamiento con la base complementaria. La sonda consta de una "región de hibridación" que tiene con preferencia de 10 a 50 nucleótidos, con mayor preferencia de 20 a 30 nucleótidos, correspondiente a una región de la secuencia diana. "Correspondiente" significa idéntico a o complementario con el ácido nucleico designado. En la presente invención, los oligonucleótidos de sonda están marcados con, es decir, están fijados sobre un marcador fluorescente que permite la detección.
El término "hibridación" se refiere a la formación de una estructura dúplex por parte de dos ácidos nucleicos de cadena simple, resultante del apareamiento con la base complementaria. La hibridación puede tener lugar entre cadenas (hebras) de ácido nucleico totalmente complementarias o entre cadenas de ácido nucleico que contienen regiones menores de desapareamiento. Las condiciones en las que solamente se hibridarán las cadenas de ácido nucleico totalmente complementarias se denominan "condiciones de hibridación restrictiva". Dos ácidos nucleicos de cadena simple que sean complementarios excepto en regiones menores de desapareamiento se denominan "sustancialmente complementarios". Los dúplexes estables de secuencias sustancialmente complementarias pueden lograrse en condiciones de hibridación menos restrictivas. Los expertos en la tecnología de los ácidos nucleicos podrán determinar empíricamente la estabilidad de los dúplexes considerando un cierto número de variables que incluyen, por ejemplo, la longitud y la concentración de pares de bases de oligonucleótidos, la concentración iónica y la incidencia de los pares de bases desapareadas.
Los términos "oligonucleótido específico de secuencia" y "SSO" se refieren a sondas oligonucleótidas en las que la región de hibridación es exactamente complementaria de la secuencia a detectar. El uso de condiciones de hibridación retrictivas, en las que la sonda se hibridará únicamente con la secuencia diana exactamente complementaria, permite la detección de una secuencia diana específica. Las condiciones restrictivas de hibridación son bien conocidas en la técnica (ver, p.ej. Sambrook y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York 1985). Las condiciones restrictivas son dependientes de secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Por lo general, las condiciones restrictivas se eligen en torno a 5ºC por debajo del punto de fusión térmico (Tm) de la secuencia específica para una determinada concentración iónica y pH. La Tm es la temperatura (para una concentración iónica y un pH definidos) en la que se disocia el 50 % de los pares de bases. Si se relaja el sentido restrictivo de las condiciones de hibridación se permitirá tolerar desapareamientos de secuencias; el grado de desapareamiento tolerado puede controlarse con el oportuno ajuste de las condiciones de hibridación.
El término "subsecuencia" se refiere a una secuencia de nucleótido contenida dentro de otra secuencia.
El término "marcador", en el marco de esta descripción, se refiere a cualquier átomo o molécula que pueda fijarse sobre un ácido nucleico y que pueda utilizarse ya sea para proporcionar una señal detectable, ya sea para interaccionar con un segundo marcador para modificar la señal detectable proporcionada por el segundo marcador. Los marcadores preferidos son compuestos emisores de luz que generan una señal detectable por fluorescencia, quimioluminiscencia o bioluminiscencia.
El término "cromóforo" se refiere a un compuesto no radiactivo que absorbe energía en forma de luz. Algunos cromóforos pueden excitarse para emitir luz ya sea mediante una reacción química, produciendo quimioluminiscencia, ya sea por absorción de luz, produciendo fluorescencia.
El término "fluoróforo" se refiere a un compuesto que es capaz de fluorescer, es decir, de absorber luz de una frecuencia y de emitir luz de otra frecuencia, por lo general inferior.
El término "bioluminiscencia" se refiere a una forma de quimioluminiscencia en la que el compuesto emisor de luz es un compuesto hallado en organismos vivos. Son ejemplos de compuestos bioluminiscentes la luciferasa bacteria y la luciferasa de luciérnaga.
El término "extinción" se refiere a la disminución de la fluorescencia de un primer compuesto, provocada por un segundo compuesto, prescindiendo del mecanismo. La extinción requiere por ejemplo que los compuestos se hallen en proximidad inmediata. En esta descripción se dice que se extingue el compuesto o la fluorescencia del compuesto, pero en ambos casos se entiende el mismo fenómeno.
El término "intercalador" se refiere a un agente o resto capaz de una inserción no covalente entre pares de bases alineados en una doble hélice de ácido nucleico.
El término "homogéneo" utilizado en la descripción para procesos multietapa se refiere a métodos de ejecución de etapas de proceso, en las que se reduce al mínimo o se elimina la necesidad de manipulación de la muestra o de manipulación entre etapas. Por ejemplo, un ensayo "homogéneo" de amplificación/detección se refiere a un ensayo combinado de amplificación y detección en el que se reduce al mínimo o se elimina la necesidad de manipulación de la muestra y de manipulación entre la amplificación y la detección.
El término "mezcla reaccionante" se refiere a una solución que contiene los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción. Una "mezcla reaccionante de amplificación", que se refiere a una solución que contiene los reactivos necesarios para realizar una reacción de amplificación, contiene por ejemplo cebadores oligonucleótidos y una DNA polimerasa en un tampón apropiado. Las mezclas de reacción para las reacciones específicas son bien conocidas en la bibliografía técnica.
La presente invención proporciona métodos para la modificación de la emisión de luz de un marcador oligonucleótido con un marcador emisor de luz en solución. Los métodos de la invención pueden aplicarse a la detección de la segmentación de oligonucleótidos de cadena simple con un solo marcador emisor de luz. La detección del oligonucleótido segmentado se lleva a cabo en una solución que contenga un cromóforo que fija el DNA y que puede interaccionar con el marcador para disminuir la emisión luminosa de dicho marcador. El cambio de longitud del oligonucleótido marcado después de la segmentación se traduce en un aumento detectable de emisión luminosa por parte del marcador fijado. Los marcadores emisores de luz idóneos y los compuestos que fijan el DNA que pueden interaccionar para modificar la emisión luminosa del marcador se describen seguidamente.
Los mecanismos, por los que se puede extinguir la emisión de luz de un compuesto con la intervención de un segundo compuesto, se describen en Morrison, Nonisotopic DNA Probe Techniques, coord. Kricka, Academic Press Inc., 1992, San Diego, CA, capítulo 13. Un mecanismo bien conocido es la transferencia de energía de fluorescencia (FET), también conocida en la bibliografía técnica como transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, transferencia de energía no radiactiva, transferencia de energía de intervalo amplio, transferencia de energía acoplada a dipolo y transferencia de energía de Förster. El requisito primario de la FET es que el espectro de transmisión de uno de los compuestos, el dador de energía, tiene que solaparse con el espectro de absorción del otro compuesto, el aceptor de energía. Styer y Haugland, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1967, 98, 719, indican que la eficiencia en la transferencia energética de algunas parejas habituales de emisores-extintores puede aproximarse al 100% cuando la distancia que los separa es inferior a 10 \ring{A}ngstrom. El grado de transferencia energética disminuye proporcionalmente a la sexta potencia de la distancia entre las moléculas del dador de energía y las del aceptor de energía. Por consiguiente, un pequeño aumento en la distancia que las separa puede traducirse en una fuerte disminución del grado de energía transferida, resultando de ello un incremento de fluorescencia en el dador de energía y, si el cromóforo extintor es también un fluoróforo, una disminución de fluorescencia en el aceptor de energía.
En los métodos ejemplificados de la presente invención se detecta la emisión del marcador fluorescente unido al oligonucleótido de cadena simple. Un cromóforo unido al DNA reduce la fluorescencia del marcador en un grado que depende de la longitud del oligonucleótido unido. Aunque sea bien conocida la extinción de la FET, desde el punto de vista de la técnica anterior son inesperadas tanto la aparición de una extinción en solución, causada por un cromóforo fijado al DNA de un marcador fluorescente unido a un oligonucleótido de cadena simple, como la dependencia de la extinción de la longitud del oligonucleótido. Dada la disminución extraordinariamente rápida de la interacción de marcadores fluorescentes a medida que aumenta la distancia, se creía que los marcadores en solución no interaccionan de modo significativo. La falta general de interacción en solución es evidente en los ensayos descritos previamente, basados en la extinción provocada por un compuesto intercalado de un marcador fluorescente fijado sobre una sonda (ver antes, Morrison 1992). Los ensayos descritos previamente se basan en intercalar el extintor en un dúplex de hibridación de doble cadena para acercar el extintor y el marcador hasta una distancia mínima y de este modo aumentar la extinción con respecto al estado de base sin extinguir, que consiste en sonda de cadena simple marcadas y no hibridadas en solución con un extintor a intercalar. Los extintores intercalados descritos no se fijan de modo significativo sobre DNA de cadena simple (monohebra), es decir, sobre la sonda sin hibridar. Tal como cabe esperar de la dependencia de la distancia en la FET, la técnica anterior no aprecia una extinción significativa en solución en la sonda sin hibridar. A diferencia de las teorías de la técnica anterior, la presente invención proporciona condiciones en las que tiene lugar una extinción significativa en solución de un marcador fluorescente unido a un ácido nucleico de cadena simple mediante un cromóforo que se une al DNA.
Muchos fluoróforos y cromóforos que se fijan sobre el DNA se han descrito en la técnica y son idóneos para utilizarse en los métodos de la presente invención. Los pares de fluoróforos y cromóforos fijados sobre DNA idóneos se eligen de modo que el espectro de emisión del fluoróforo se solape con el espectro de absorción del cromóforo. En el caso ideal, el fluoróforo debería tener un desplazamiento de Stokes alto (una gran diferencia entre la longitud de onda del máximo de absorción y la longitud de onda del máximo de emisión) para reducir al mínimo la interferencia provocada por la luz de excitación dispersa.
Los marcadores idóneos bien conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a la fluoresceína y sus derivados, por ejemplo FAM™, HEX™, TET™ y JOE™; la rodamina y sus derivados, por ejemplo el rojo Texas, ROX™ y 
\hbox{TAMRA™;}
el amarillo lucifer y los derivados de cumarina, por ejemplo el 7-Me_{2}N-cumarina-4-acetato, el 
\hbox{7-OH-4-CH _{3} -cumarina-
3-acetato}
y el 7-NH_{2}-4-CH_{3}-cumarina-3-acetato (AMCA). La empresa Perkin Elmer, Applied Biosystems Division (Foster City, CA), comercializa los marcadores FAM™, HEX™, TET™, JOE™, ROX™ y TAMRA™. El rojo Texas y muchos otros compuestos idóneos se comercializan por la empresa Molecular Probes (Eugene, OR). Son ejemplos de compuestos quimioluminiscentes y bioluminiscentes que pueden ser idóneos para actuar como dadores de energía el luminol (aminoftalhidrazida) y sus derivados y las luciferasas.
En una forma preferida, el agente que se fija sobre el DNA es un agente intercalado. Los agentes intercalados idóneos bien conocidos incluyen el bromuro de etidio y el anaranjado de acridina.
Son también idóneos los agentes que se fijan sobre el DNA pero no se intercalan. Son idóneos, por ejemplo, los componentes del grupo de compuestos que se fijan sobre el DNA conocidos normalmente con el nombre de compuestos que se "fijan sobre surco" (groove binders). Estos compuestos reconocen y se fijan sobre el surco menor del DNA dúplex. El verde malaquita es un ejemplo de este grupo de compuestos que se ha demostrado que funciona bien en los métodos presentes.
En una forma de ejecución de la invención, el cromóforo que se fija sobre el DNA proporciona además una señal que se puede detectar que está alterada si se intercala en una DNA de doble cadena. El bromuro de etidio, al igual que otros marcadores que se fijan sobre el DNA, por ejemplo las acridinas, la proflavina, el anaranjado de acridina, la acriflavina, la fluorcumarina, la elipticina, la daunomicina, la cloroquina, la distamicina D, la cromomicina, el homidio, la mitramicina, los polipiridilos de rutenio y la antramicina, presenta emisiones alteradas de fluorescencia cuando se fija sobre un DNA de doble cadena (doble hebra). Se utiliza con preferencia un compuesto que se fije sobre el DNA, que no inhiba la reacción de amplificación, con el fin de permitir el seguimiento de la acumulación de secuencias amplificadas.
Un oligonucleótido puede obtenerse por cualquier método idóneo, incluida por ejemplo la clonación y el aislamiento de las secuencias idóneas empleando enzimas de restricción y la síntesis química directa por un método tal como el método de los fosfotriésteres de Narang y col., Meth. Enzymol. 1979, 68, 90-99; el método de los fosfodiésteres de Brown y col., Meth. Enzymol. 1979, 68, 109-151; el método de las dietilfosforamiditas de Beaucage y col., Tetrahedron Lett. 1981, 22, 1859-1862; y el método del soporte sólido de la patente US-4 458 066. Los métodos de síntesis de oligonucleótidos marcados se describen en Agrawal y Zamecnik, Nucl. Acids Res. 1990, 18 (18), 
\hbox{5419-5423;}
MacMillan y Verdine, J. Org. Chem., 1990, 55,5931- 5933; Pieles y col., Nucl. Acids Res. 1989, 17 (22), 8967-8978; Roget y col., Nucl. Acids Res. 1989, 17 (19), 7643-7651; y Tesler y col., J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6966-6976. Goodchild en Bioconjugate Chemistry 1990, 1(3), 165-187, publica una reseña de los métodos de síntesis.
Los métodos de la presente invención son muy indicados para la detección de ácidos nucleicos amplificados, ya sean DNA o RNA. Además de la PCR (ver patente US-4 683 195; 4 683 202 y 4 965 188), los métodos de amplificación idóneos incluyen, pero no se limitan a los siguientes: la reacción en cadena de la ligasa (ligase chain reaction, LCR, Wu y Wallace, Genomics, 1989, 4, 560-569; y Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 189-193); reacción en cadena de la ligasa polimerasa (polymerase ligase chain reaction) (Barany, PCR Methods and Applic., 1991, 1, 
\hbox{5-16);}
Gap-LCR (publicación de patente nº WO 90/01069); reacción en cadena de reparación (repair chain reaction) (publicación de patente europa nº 439 182 A2); 3SR (Kwoh y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 1173-1177; Guatelli y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 1874-1878; publicación de patente nº WO 92/0880A) y NASBA (patente USA-5 130 238). Esta invención no se limita a un sistema de amplificación concreto. A medida que se vayan desarrollando nuevos sistemas, estos sistemas podrán beneficiarse de la práctica de esta invención. Abramson y Myers, Current Opinion in Biotechnology 1993, 4, 41-47, ha publicado una reseña reciente de sistemas de amplificación.
Una forma preferida de ejecución de la invención proporciona mejoras del proceso descrito en la patente US-5 210 015 y Holland y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 7276-7280. Este procedimiento aprovecha la actividad de la 5'\rightarrow3'-exonucleasa de una DNA polimerasa termoestable para segmentar las sondas de oligonucleótido marcadas apareadas a partir de dúplexes de hibridación y liberar fragmentos marcados para la detección. La segmentación de las sondas marcadas de la presente invención mediante la actividad de 5'\rightarrow3'-exonucleasa de la DNA polimerasa libera los marcados y los entrega a la mezcla reaccionante. La extinción de señal en solución del cromóforo ligado al DNA es significativamente mayor cuando el fluoróforo está unido a la sonda de oligonucleótido de longitud plena, sin segmentar, que cuando está unido a un fragmento segmentado de menor longitud. El consiguiente aumento de la fluorescencia observada indica la segmentación de la sonda que necesariamente indica tanto la presencia de secuencias diana como la realización de la hibridación entre sonda y diana.
El presente ensayo homogéneo de PCR/detección es idóneo para utilizarse combinado con los métodos descritos por Higuchi y col., 1992, ver antes. En esta forma de ejecución se mide también la fluorescencia del cromóforo que se fija sobre el DNA. Por consiguiente, la fluorescencia del agente que se fija sobre el DNA permite detectar que ha tenido lugar una amplificación y la fluorescencia de la sonda hibridada segmentada indica una amplificación específica de la diana.
Los métodos de detección de la presente invención se pueden aplicar a un gran número de ensayos. Cada ensayo requiere una muestra diana en un tampón que sea compatible con los reactivos del ensayo. Si la diana se ha amplificado previamente o durante la detección de la segmentación de la sonda, el ácido nucleico diana tendrá que estar en un tampón compatible con las enzimas empleadas para amplificar la diana. El ácido nucleico diana puede aislarse de un gran número de materiales biológicos, incluidos tejidos, líquidos corporales, heces, esputo, saliva, células vegetales, cultivos bacterianos, etcétera. Los métodos idóneos de preparación de muestras para cada uno de los ensayos se han descrito ya en la técnica anterior.
En general, el ácido nucleico de la muestra deberá ser una secuencia de DNA, más habitualmente un DNA genómico. Sin embargo, en la presente invención puede practicarse también con otros ácidos nucleicos, por ejemplo un RNA mensajero, un RNA ribosómico, un RNA vírico o un DNA clonado. Las muestras idóneas de ácidos nucleicos incluyen a los DNA o RNA de cadena simple o de cadena doble que se utilicen en la presente invención. Los expertos en la materia observarán que, en función de la reacción que se aplique para segmentar las sondas de oligonucleótidos marcados, sea cual sea la naturaleza del ácido nucleico, el ácido nucleico puede detectarse simplemente efectuando modificaciones idóneas y bien reconocidas de los métodos empleados.
La preparación de las muestras puede variar en función del origen de la muestra, de la diana a detectar y de la reacción a efectuar. Los protocolos idóneos de preparación de muestras ya son conocidos en la técnica y se describen en la bibliografía técnica mencionada anteriormente (p.ej. ver Sambrook y col.). Higuchi, en PCR Technology (coord. Erlich, Stockton Press, Nueva York 1989) y en PCR Protocols, capítulos 18-20 (Innis y col., coord., Academic Press 1990), describe métodos sencillos y rápidos de preparación de muestras para la amplificación PCR de secuencias diana, ambas citas se incorporan a la presente como referencias. El experto en la materia podrá seleccionar y mejorar mediante ensayos el protocolo idóneo.
La fluorescencia de marcadores en solución se mide con un espectrofluorómetro, por ejemplo el modelo 650-40 de Hitachi/Perkin Elmer (Perkin Elmer, Norwalk, CT) o el espectrofotómetro de luminiscencia PTI LS-100 (Photon Technology International, Londres, Ontario, Canadá). En función de las características de la máquina concreta que se utilice, un espectrofluorómetro brinda la posibilidad de ajustar la longitud de onda de excitación y de emisión, así como el ancho de banda. El experto en la materia apreciará como obvia la manera de fijar los ajustes de la longitud de onda y del ancho de banda para detectar la fluorescencia de un marcador fluorescente concreto. Una orientación general puede encontrarse por ejemplo en The Merck Index (coord. Budavari y col., Merck Co. Inc., Rahway, NJ, 1989) y en el catálogo de 1990 (autor: Haugland) de la empresa Molecular Probes Inc. (Eugene, Oregon). Aunque cada marcador tenga un espectro discreto de fluorescencia, para la práctica de la invención puede ser conveniente un amplio intervalo de longitudes de onda de detección.
Las mediciones de fluorescencia se llevan a cabo antes y después de la reacción de segmentación de la sonda y se calcula el cambio de fluorescencia, refiriéndolo al valor existente antes de la reacción. Una porción de la mezcla reaccionante no se somete a las condiciones de reacción. De este modo puede medirse la fluorescencia previa a la reacción y la fluorescencia existente después de la reacción, una vez haya finalizado esta. El uso de tubos de reacción que son también idóneos para efectuar la medición de fluorescencia permite realizar mediciones directas tanto de la fluorescencia previa como de la posterior a la reacción sin tener que abrir los tubos de reacción ni realizar manipulaciones después de la reacción.
En los métodos preferidos, en los que la detección del ácido nucleico se combina con una amplificación PCR, ya descritos anteriormente, la reacción de amplificación se efectúa en un proceso automatizado. Las máquinas que efectúan ciclos térmicos (thermal cyclers) pueden adquirirse de Perkin Elmer (Norwalk, CT), estas máquinas utilizan un bloque calefactor capaz de contener de 48 a 96 tubos de reacción. Por consiguiente, pueden realizarse simultáneamente un máximo de 96 reacciones de amplificación.
La presente invención permite la detección automática de productos PCR en todas las muestras, sin necesidad de manipular las muestras, abrir los tubos o interrumpir la reacción por ciclos térmicos. Los sistemas ópticos idóneos se describen por ejemplo en Higuchi y col., 1992, ver antes, Higuchi y col., 1993, ver antes, y en la publicación de patente europea nº 512 334. En un sistema óptico de este tipo se emplean conductos múltiples de fibras ópticas para transmitir la luz de excitación desde el foco al tubo de reacción y se mide la emisión de luz de cada tubo. Solo se requiere un fluorómetro para leer la fluorescencia de los tubos de reacción, ya que cada fibra óptica puede leerse rápidamente al mismo tiempo. Un sistema óptico alternativo consiste en una cámara de video para medir la fluorescencia de múltiples tubos de reacción simultáneamente. El uso de tapones transparentes para los tubos de reacción permite efectuar la medición de la fluorescencia sin abrir los tubos.
Se ha descrito un esquema alternativo idóneo de detección que emplea un formato de microvaloración de 96 hoyos. Este tipo de formato es deseable a menudo en laboratorios clínicos para la exploración de muestras a gran escala, por ejemplo para análisis genéticos, tales como la exploración de la anemia de células falciformes o el virus del SIDA en procesos de exploración de bancos de sangre. La presente invención es idónea para este tipo de análisis y elimina la necesidad de numerosos procesos de lavado y extracción que se requieren en los procedimientos de ensayo "en hoyo" ya conocidos, por ejemplo los formatos de tipo ELISA u otros métodos ópticos basados en la densidad (ver Kolber y col., J. Immun. Meth. 1988, 108, 255-264; Huschtscha y col., In Vitro Cell and Dev. Biol., 1989, 25(1), 105-108; y Voller y col., The Enzyme Linked Immunosorbent Assay, 1979, Dynatech Labs, Alexandria, VA).
Los métodos presentes de detección permiten además la medición directa de la fluorescencia empleando un aparato similar al lector de placas ELISA, pero diseñado para excitar y medir la fluorescencia. Por ejemplo, la máquina CytoFluor™ 2300, fabricada por Millipore (Bedford, MA), es idónea para este método. Como alternativa puede ser útil un aparato que proporcione una determinación continua de la fluorescencia para el seguimiento del aumento de la cantidad de producto PCR durante la reacción de amplificación.
Para el experto en la materia resultará obvio que los métodos de la presente invención no se limitan a un método concreto de detección, máquina de ciclos térmicos (thermal cycler) o máquina de medición de señales ni a un número concreto de tubos de reacción.
Los métodos de la presente invención pueden utilizarse simultáneamente para detectar secuencias diana múltiples. En la mezcla reaccionante se hallan sondas específicas de cada diana. Para cada ácido nucleico diana presente en la muestra se hibrida y se segmenta la sonda correspondiente. Con el fin de detectar por separado las sondas segmentadas, cada especie de sonda se marca con un marcador que emite fluorescencia en una longitud de onda distinta. Seguidamente se detecta por separado cada especie de muestra mediante la oportuna selección de la longitud de onda a medir.
De este modo, los métodos de la presente invención son útiles para detectar los productos de amplificación en métodos de co-amplificación PCR para detectar diversas dianas de una muestra sin tener que abrir nunca el tubo de reacción después de que se haya iniciado la reacción de amplificación. La invención es útil en particular para efectuar comparaciones cuantitativas de dos ácidos nucleicos diana distintos dentro de una misma muestra. Los métodos para cuantificar ácidos nucleicos se describen en la patente US-5 219 727. Los métodos de cuantificación descritos son métodos basados en la PCR empleando un patrón interno ya sea para determinar la cantidad relativa de una diana, ya sea para cuantificar cuidadosamente la cantidad de diana presente antes de la amplificación, respectivamente.
La secuencia de nucleótido de las sondas de oligonucleótidos de cadena simple es complementaria de la secuencia diana, con el fin de que la sonda se hibride con la diana. Una sonda de oligonucleótido puede formar una estructura secundaria a temperaturas bajas, en función de la secuencia de oligonucleótido que produce regiones de DNA de cadena doble. Un compuesto intercalado, que se fije sobre el DNA, puede intercalarse dentro de la región de doble cadena en proximidad inmediata del marcador fluorescente, de este modo aumenta la eficacia de la transferencia energética. Aunque los métodos de la presente invención no requieren la formación de regiones de cadena doble dentro de la sonda mediante una estructura secundaria, la realidad es que dichas regiones pueden mejorar la extinción del marcador.
La estructura secundaria puede introducirse en una sonda de hebra (cadena) simple que no forme estructuras secundarias mediante la adición de una secuencia terminal complementaria del otro extremo. La estructura secundaria formada implica la hibridación de los extremos 5' y 3' de las sondas para formar una estructura de "horquilla". La longitud de las secuencias complementarias en cada extremo de la sonda tiene que ser suficiente para formar una estructura secundaria de horquilla estable en la temperatura y condiciones del ensayo, por ejemplo a temperatura ambiente, pero no lo suficientemente larga para estabilizar la estructura secundaria de horquilla de modo que la autohibridación de la sonda predomine sobre la hibridación entre sonda y diana, incapacitando a la sonda para hibridarse con la secuencia diana. La secuencia exacta de la sonda puede depender de la secuencia diana que se pretende detectar y de las condiciones de ensayo. Las regiones terminales complementarias provistas con preferencia de 6-9 nucleótidos son suficientes para provocar la formación de una estructura estable de horquilla, aunque puedan ser más o menos deseables en función de las condiciones de reacción. La estabilidad de la estructura secundaria de tipo horquilla de la sonda y la estabilidad del dúplex de hibridación sonda-diana pueden determinarse empíricamente.
Ejemplo 1 Síntesis de sondas de oligonucleótido marcadas
Las sondas de oligonucleótidos marcadas con un fluoróforo en un extremo se sintetizan en un sintetizador de DNA del tipo ABI 394 (Perkin Elmer ABD, Foster City, CA) a escala de 1 micromol. Durante la síntesis del oligonucleótido se emplean amiditas del marcador fluorescente para proporcionar directamente un oligonucleótido marcado en 5'. Así se puede obviar la necesidad de cualquier modificación del oligonucleótido posterior a la síntesis.
Se sintetiza el extremo 5' del oligonucleótido por adición de un derivado fosforamidita de fluoresceína (FAM™, Perkin Elmer ABD, Foster City, CA). La fosforamidita contiene un engarce (enlace) que separa el marcador y el nucleótido. Después de tratar el vidrio de poro controlado (CPG) con hidróxido amónico a 55ºC durante 4 horas para separar el oligonucleótido del CPG, se filtra el oligonucleótido y se seca en una corriente de aire, se suspende de nuevo, se filtra y se purifica por cromatografía HPLC en fase inversa. A continuación se concentran a sequedad las fracciones que contienen el oligonucleótido puro marcado en 5'.
Ejemplo 2 Efecto de la longitud del oligonucleótido en la extinción de la fluorescencia
La fluorescencia de oligonucleótidos marcados, obtenidos a partir de una longitud de 2-34 nucleótidos, se mide en soluciones con y sin EtBr. Se efectúan además, a título comparativo, mediciones de la fluorescencia del marcador solo.
Se sintetiza una serie de sondas marcadas con FAM™ en el extremo 5' del modo descrito en el ejemplo 1. Las secuencias de ácido nucleico de las sondas se indica seguidamente, orientadas de 5' a 3'.
Oligo Seq.ID.No. Longitud Secuencia
SGW70 2 GA
SGW71 2 CC
SGW74 3 GAC
SGW75 4 GACC
SGW76 5 GACCA
SGW77 6 GACCAG
BW115 1 10 GAGACCATCA
BW116 2 15 GAGACCATCAATGAG
BW117 3 20 GAGACCATCAATGAGGAAGC
BW118 4 25 GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAG
BW119 5 30 GAGACCATCAATGAGGAAGCTGCAGAATGG
SGW128 6 34 GACCATCAATGAGGAAGCTGCAAGAATGGGATAG
Los oligonucleótidos se miden en soluciones de 400 \mul que contienen un tampón de la reacción PCR (KCl 50 mM, Tris 10 mM [pH 8,3] y MgCl_{2} 3 mM) y EtBr en una concentración de 0, 2 ó 4 \mug/ml (0, 5 ó 10 \muM). El oligonucleótido está presente en una concentración de 1 \muM. Para detectar la fluorescencia del marcador FAM se elige una longitud de onda de la luz de excitación de 495 nanometros y se mide la fluorescencia en una longitud de onda de 518 nanometros. Se toman las lecturas a 20ºC. Las mediciones realizadas con una concentración de EtBr de 4 \mug/ml se repiten al día siguiente para evaluar la reproducibilidad de las mediciones.
Los resultados se presentan en la figura 1. Las mediciones de la fluorescencia de la sonda en presencia de EtBr se presentan en relación a la fluorescencia sin EtBr. Se observa una disminución de la fluorescencia del marcador libre del orden del 6 % en presencia de EtBr. La disminución de la fluorescencia del marcador fijado a los nucleótidos de menos de 6 bases de longitud no es apreciablemente distinta de la del marcador solo. Una extinción significativa se aprecia en nucleótidos que tienen una longitud por lo menos de 10 nucleótidos
Ejemplo 3 Extinción en función de la temperatura
Se efectúan ensayos para determinar la dependencia de la extinción con respecto a la temperatura por acción de EtBr de sondas de oligonucleótidos marcadas con fluoresceína. Se mide la fluorescencia de soluciones de la sonda con y sin EtBr al tiempo que las soluciones se calentaban y se enfriaban.
Se preparan soluciones que contienen 0,5 \muM de BW118 (Seq ID No. 4) o de SGW128 (Seq ID No. 6) en el tampón descrito en el ejemplo 2 anterior, ambas con y sin 4 \mug/ml de EtBr. Se preparan soluciones similares que contienen el marcador fluoresceína sin fijar. Las soluciones que no se utilizan de inmediato se guardan en el frigorífico, en la oscuridad, hasta el momento de su utilización. Para controlar la temperatura de las soluciones mientras se mide la fluorescencia se emplean cubetas encamisadas conectadas a un baño de agua de calentamiento. Se mantiene la temperatura de la solución por circulación de agua desde el baño de agua alrededor de la solución a través de las cubetas encamisadas. Se mide la temperatura del agua en circulación junto a las cubetas encamisadas para determinar con exactitud la temperatura de la solución que se está midiendo. Se coloca aceite mineral sobre la muestra para evitar su evaporación. Se expone la solución a la luz de excitación únicamente durante la medición, con el fin de evitar un blanqueo por acción de la luz. Se eligen las longitudes de onda de excitación y de emisión del modo descrito anteriormente.
Se efectúan las mediciones mientras las soluciones se calientan o se enfrían. Si se realizan dos mediciones a una temperatura concreta, una durante el calentamiento y la otra durante el enfriamiento, se promedian los valores obtenidos. Los datos se presentan en la figura 2. Cada medición se normaliza con respecto al valor correspondiente obtenido con la solución sin extinguir (sin EtBr).
En todas las temperaturas se observa una extinción significativa de las sondas de oligonucleótidos marcados. Un aumento significativo del valor de la extinción se observa por debajo de 40ºC, con un valor de extinción en aumento a medida que disminuye la temperatura a lo largo del intervalo de temperaturas observado. Aunque todavía se observa una extinción mayor por debajo de la temperatura ambiente, por conveniencia puede ser deseable medir la fluorescencia a 20ºC.
Ejemplo 4 Liberación de marcador de sonda de PCR
En este ejemplo se describe el uso de EtBr para extinguir sondas marcadas no segmentadas en una mezcla de reacción de PCR. Se efectúa una amplificación por PCR en presencia de una sonda marcada con FAM que se ha modificado en el extremo 3' para impedir la síntesis de un producto de extensión. La actividad de exonucleasa de la DNA polimerasa segmenta la sonda hibridada con la secuencia diana en sentido hacia la línea de salida desde el cebador, liberando de este modo pequeños fragmentos de oligonucleótido marcados de la sonda. Se detecta el aumento de fluorescencia del marcador fijado a los fragmentos segmentados, lo cual indica la amplificación de la secuencia diana.
Las amplificaciones se realizan en presencia de una de las dos sondas marcadas con FAM que se indican a continuación. Las secuencias de ácido nucleico de las sondas se presentan en la orientación de 5' a 3'. Las sondas se sintetizan fijadas al FAM por el extremo 5', del modo descrito antes. Cada sonda se sintetiza para que tenga un 3'-PO_{4} en lugar de un 3'-OH con el fin de bloquear cualquier extensión provocada por la Taq polimerasa.
Sonda Seq ID No. Secuencia
SGW127 7 CCATCAATGAGGAAGCTGCAAGAATGGGATAGAG
SGW128 8 GACCATCAATGAGGAAGCTGCAAGAATGGGATAG
Amplificación
La región amplificada es un producto de 142 pares de bases de la región gag de HIV, dirigida por cebadores SK431 y SK145, desarrollado y fabricado por Hoffmann-La Roche y comercializado por Perkin Elmer (Norwalk, CT). Las amplificaciones se realizan partiendo de un plásmido que contiene un fragmento clonado del gen gag de HIV.
Se efectúan dos amplificaciones replicadas de cada una de las dos sondas. Las amplificaciones se llevan a cabo en mezclas reaccionantes de 150 \mul que contienen los reactivos siguientes:
3 x 10^{8} copias de la secuencia diana
KCl 50 mM
Tris-HCl 10 mM, pH 8,3
MgCl_{2} 3 mM
75 pmoles de cada cebador
50 \muM de cada uno de los cuatro trifosfatos de desoxirribonucleósido*
3,75 unidades de Taq polimerasa (desarrollada y fabricada por Hoffman-La Roche y comercializada por Perkin Elmer, Norwalk, CT)
muestra 0,5 \muM
4 \mug/ml de EtBr (10 \muM)
* En general se prefieren 200 \muM de cada trifosfato de desoxirribonucleótido para la amplificación de regiones diana más largas.
De cada mezcla reaccionante sometida a las condiciones de ciclos térmicos PCR se preparan y se almacenan (sin ciclos térmicos) dos mezclas reaccionantes adicionales, una con EtBr y la otra sin EtBr, que se utilizarán para los controles de medición. Las mezclas reaccionantes se someten al siguiente esquema de amplificación en una máquina de ciclos térmicos del tipo GeneAmp 9600 Thermal Cycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT): 35 ciclos, cada uno de ellos consiste en una etapa de desnaturalización (95ºC, 15 segundos) seguida de una etapa de apareamiento/extensión (55ºC durante 30 segundos) y después una incubación final para asegurar que se ha completado la extensión de los productos (72ºC, 10 minutos). Después de la amplificación se mantienen las mezclas reaccionantes a 4ºC hasta que se analizan.
Análisis
Para confirmar que se haya realizado la amplificación se analiza el producto de la amplificación por electroforesis en gel de agarosa. Se analiza la degradación de la sonda del modo que se describe a continuación.
A. Análisis de la degradación de la sonda por electroforesis en gel de poliacrilamida
Una vez finalizada la amplificación se diluyen 5 \mul de la solución reaccionante de amplificación en formamida hasta una concentración de sonda de 10 pmoles/\mul. A continuación se cargan 5 \mul (por 50 pmoles de sonda por calle) de la solución reaccionante de amplificación diluida en un hoyo rectangular de un gel de poliacrilamida al 10 %, urea 7M, 0,4 mm de grosor y se somete a electroforesis en una aparato ABI 373A DNA Sequencer (Perkin Elmer, Norwalk, CT) durante 6 horas con los parámetros siguientes: 1500 V, 20 W, 20 mA (funcionamiento de secuenciación con exploración completa). Los datos se recogen mediante un programa llamado 373A DNA Sequencer Data Collection Program (Perkin Elmer, Norwalk, CT).
Los datos recogidos se analizan con un programa llamado 362 Gene Scanner™ Data Analysis Program (versión 1.2d1) (Perkin Elmer, Norwalk, CT). Se estima la fracción de sonda segmentada comparando la suma de las áreas de los picos que corresponden a la sonda liberada y la suma de las áreas de los picos de la calle entera. La cantidad total de la sonda liberada se calcula en forma de fracción estimada de la cantidad total de la sonda incluida en la mezcla reaccionante.
La cantidad de degradación de sonda, medida por electroforesis en gel de poliacrilamida, se recoge a continuación. Los valores calculados para cada uno de las dos reacciones replicadas se incluyen también.
Sonda Fracción de sonda degradada Picomoles de sonda liberados
0,5 \muM de SGW127 0,20 15
0,21 15
0,5 \muM de SGW128 0,20 15
0,24 18
B. Análisis por medición de fluorescencia empleando un espectrofluorómetro
Cincuenta \mul de PCR y de control de PCR (mezcla reaccionante no sometida a ciclos térmicos) se diluyen en cada caso en 350 \mul de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,0). Se mide la fluorescencia de cada muestra a 20ºC en un espectrofluorómetro de fluorescencia del tipo Hitachi/Perkin Elmer modelo 650-40 (ver ejemplo 2) en una longitud de onda de excitación de 494 nm y una longitud de emisión de 522 nm. Las lecturas se efectúan empleando un aparato CytoFluor™ 2300 (descrito anteriormente) con un filtro de excitación a 485 nm (20 nm de ancho de paso de banda) y un filtro de emisión de 530 nm (25 nm de ancho de paso de banda).
Se calcula la fracción de sonda degradada dividiendo el cambio de fluorescencia que tiene lugar durante la reacción por el cambio máximo posible de fluorescencia, es decir, el cambio de fluorescencia que tendría lugar si se hubiera degradado la totalidad de la sonda. Se mide el cambio de fluorescencia ocurrido durante la reacción como diferencia de fluorescencia entre las muestras sometidas a ciclos térmicos y las no sometidas, en ambos casos en presencia de EtBr, lo cual equivale a medir la mezcla reaccionante antes y después de los ciclos térmicos de la PCR. No se realiza medición directa del cambio máximo posible de fluorescencia. En su lugar se estima el cambio máximo posible de fluorescencia en forma de diferencia entre la estimación de la fluorescencia de la sonda totalmente degradada en presencia de EtBr y la fluorescencia de la muestra no sometida a ciclos térmicos con EtBr. El valor estimado de la fluorescencia de la sonda totalmente degradada en presencia de EtBr se obtiene del modo indicado a continuación.
Se toma la fluorescencia de la muestra no sometida a ciclos térmicos sin EtBr y multiplicada por 0,94 como valor aproximado de la fluorescencia de una muestra en presencia de EtBr, en la que se haya degradado la totalidad de la sonda. Sin EtBr, la fluorescencia de la sonda se ve menos afectada por la longitud del oligonucleótido. Por consiguiente, la fluorescencia de una muestra que contenga sondas no degradadas (de longitud completa) es aproximadamente la misma que la de una muestra que contenga una sonda totalmente degradada (corta). Por ello, la fluorescencia de una muestra no sometida a ciclos térmicos sin EtBr es aproximadamente la misma que la fluorescencia de una muestra que contenga fragmentos totalmente degradados sin EtBr. La fluorescencia de una muestra que contiene fragmentos totalmente degradados con EtBr se obtiene teniendo en cuenta la extinción residual de la sonda totalmente degradada por el EtBr. Tal como se aprecia en la figura 1, la extinción residual causada por el EtBr de los fragmentos de sonda totalmente degradada es de aproximdamente el 6 %. Por lo tanto, multiplicando la fluorescencia de una muestra no sometida a ciclos térmicos sin EtBr por el factor 0,94 se obtiene un valor estimado de la fluorescencia de una muestra que contenga sondas totalmente degradadas en presencia de EtBr. Restando la fluorescencia de una muestra no sometida a ciclos térmicos con EtBr se obtiene el valor estimado deseado del cambio máximo posible de fluorescencia.
La aproximación anterior supone que se puede prescindir de la diferencia de fluorescencia entre sondas cortas y largas en solución sin EtBr. En la práctica actual, la fluorescencia de un marcador depende en cierto grado tanto de la longitud como de la secuencia del oligonucleótido fijado, incluso en ausencia de EtBr. Dado que la dependencia es imprevisible, es preferible medir directamente el cambio máximo posible de fluorescencia. Esto se consigue preparando una mezcla reaccionante adicional y añadiendo a esta mezcla reaccionante una DNA nucleasa que degrade la sonda por completo. Se calcula el cambio máximo de fluorescencia como diferencia entre la fluorescencia de la mezcla reaccionante antes y después de la degradación de la sonda.
A continuación se indica el grado o cantidad de degradación de la sonda se calcula a partir del cambio de fluorescencia medido empleando un espectrofotómetro. Se recogen los valores calculados para cada una de las dos mezclas reaccionantes replicadas. Se calculan los valores empleando la aproximación del cambio máximo de fluorescencia descrito anteriormente.
Sonda Fracción de sonda degradada Picomoles de sonda liberados
0,5 \muM de SGW127 0,69 52
0,72 54
0,5 \muM de SGW128 0,33 25
0,32 24
Se indica seguidamente la cantidad de degradación de sonda, calculada a partir del cambio de fluorescencia medido en un lector de placas de microhoyos del tipo CytoFluor™ 2300. Se recogen los valores calculados para cada una de las dos mezclas reaccionantes replicadas. Se calculan los valores empleando la aproximación del cambio máximo de fluorescencia descrito anteriormente.
Sonda Fracción de sonda degradada Picomoles de sonda liberados
0,5 \muM de SGW127 0,49 37
0,48 36
0,5 \muM de SGW128 0,25 19
0,24 18
Los resultados demuestran que el cambio de fluorescencia es suficiente para permitir la detección de la degradación de la sonda.
Ejemplo 5 Aumento de la extinción con la estructura secundaria de la sonda
La presencia de una estructura secundaria en una sonda de oligonucleótido de cadena (hebra) simple puede aumentar la extinción gracias a un elemento extintor intercalado que fije el DNA proporcionando regiones de DNA de cadena doble, en las que puede intercalarse el extintor. Esto se pone de manifiesto comparando la extinción de sondas que difieren en el hecho de que una sonda se espera que forme una estructura de horquilla cuando no se hibrida con una secuencia diana.
Los ensayos se llevan a cabo básicamente de igual modo que en el ejemplo 3, salvo que la temperatura y la fluorescencia se miden en continuo. Se sintetizan tres oligonucleótidos, dos de los cuales forman estructuras secundarias de horquilla, básicamente por el método descrito en el ejemplo 1. Estas secuencias y los sitios de marcado se indican seguidamente.
SGW140 (Seq ID No. 9) (horquilla)
FAM™-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGACTATG
SGW146 (Seq ID No. 10) (horquilla)
FAM™-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGACTANG
ST50FLC (Seq ID No. 11)
FAM™-CATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGT
En este caso, N significa una timidina modificada sobre la cual se ha fijado el TAMRA.
El SGW140 (Seq ID No. 9) y el SGW146 (Seq ID No. 10) tienen regiones terminales autocomplementarias, que pueden hibridarse para formar una estructura secundaria de horquilla. Además, el SGW146 (Seq ID No. 10) tiene un segundo compuesto extintor (TAMRA™) unido junto al extremo 3'. La formación de estructura de horquilla coloca al FAM™ y al TAMRA™ en una proximidad inmediata, con lo que se extingue la fluorescencia. Se mide para este nucleótido la extinción combinada del FAM™ causada tanto por el TAMRA™ como por el EtBr.
Las mediciones se llevan a cabo empleando una cubeta de cuarzo encamisada en un espectrofluorómetro de fluorescencia del tipo Hitachi/Perkin Elmer, modelo 650-40, ya descrito anteriormente. Los monocrómetros de excitación y de emisión se ajustan a 495 y 522 nm, respectivamente. Las anchuras de rendija de los monocrómetros se ajustan a 3 y 7 nm, respectivamente. Se efectúan las mediciones empleando soluciones de 400 \mul que contienen 0,5 \muM de oligonucleótido marcado con y sin 4 \mug/ml de EtBr en tampón de PCR (50 mM de KCl, 10 mM de Tris, pH 8,3; 3 mM de MgCl_{2}). Se almacenan las soluciones en un frigorífico hasta el momento de su utilización.
Cada muestra se coloca en una cubeta encamisada dentro del fluorómetro y se coloca aceite mineral en la parte superior de la muestra para evitar su evaporación. Se eleva la temperatura de la solución y se baja entre 20 y 95ºC con una velocidad de 1ºC por minuto.
En la figura 3 se presentan las mediciones de fluorescencia, normalizadas con respecto a la fluorescencia de una sonda lineal sin EtBr. Se presentan las mediciones grabadas tanto durante el aumento como la disminución de la temperatura. Se presentan también los puntos de fusión medios correspondientes a la temperatura en la que se observa un mayor grado de cambio de fluorescencia.
Se observa que el EtBr estabiliza la región de doble cadena de una sonda de tipo horquilla, elevando su temperatura de fusión. Esto se puede apreciar en la figura 3 comparando el desplazamiento de puntos de fusión medios que tiene lugar cuando se añade el EtBr. La presencia de una estructura secundaria de tipo horquilla se traduce en un aumento de la extinción de la fluorescencia provocada por el EtBr.
Ejemplo 6 Aumento de la extinción por una sonda marcada múltiple
Una sonda alternativa, que se puede utilizar en los métodos descritos en el ejemplo 4 anterior, contiene un segundo marcador que actúa como extintor y está unido al oligonucleótido de la sonda en un punto separado por unas pocas bases del marcador fluorescente del extremo 5'. El marcador fluorescente de la sonda no segmentada se extingue por el segundo marcador fijado mediante transferencia de energía fluorescencia. La degradación de la sonda, que tiene lugar durante la extensión del cebador, separa el marcador y el extintor, aumentando de este modo la señal detectable. El uso de una sonda de este tipo se describe en la patente US-5 210 015. Los métodos presentes de extinción de sondas no segmentadas pueden aplicarse en combinación con sondas marcadas dobles para la extinción ulterior de la sonda sin segmentar, aumentando el cambio de señal producido por la degradación de la sonda.
Para demostrar la extinción adicional proporcionada por extintores combinados, se compara la extinción de fluorescencia producida por el EtBr en sondas marcadas con FAM™ en el extremo 5' con la extinción de fluorescencia producida por el EtBr en sondas marcadas con el FAM™ y con verde malaquita (MG). Se sintetizan las sondas con un solo marcador FAM™ unido al extremo 5' o bien con un marcador MG unido a un punto situado a 3 bases de distancia del marcador FAM™. Ambas sondas se sintetizan con la secuencia indicada seguidamente:
SGW55 (Seq ID No. 12)
FAM™-CCANCAATGAGGAAGCTGCAAGAATGGGATAGAG
En este caso, N significa una timidina modificada sobre la que se une el verde malaquita. Se llevan a cabo las mediciones de fluorescencia fundamentalmente del modo descrito en el ejemplo 2 anterior. Los resultados se presentan a continuación.
\newpage
Marcadores de sonda EtBr Fluorescencia % del máx.
FAM 0 689 100%
FAM 4 \mug/ml 106 15%
FAM+MG 0 165 24%
FAM+MG 4 \mug/ml 46,1 7%
La extinción producida por el EtBr en la mezcla reaccionante de PCR o por el marcador adicional es suficiente para producir un cambio detectable de señal. La combinación de métodos de extinción proporciona un aumento significativo en la eficacia de la extinción, permitiendo una discriminación más eficaz de las muestras segmentada y sin segmentar. El uso de una sonda marcada múltiple, descrito aquí, en los métodos del ejemplo 4 anterior ampliaría todavía más la capacidad de distinguir entre sondas segmentadas y no segmentadas.
Ejemplo 7 Extinción causada por otros cromóforos unidos al DNA
La elección de otros cromóforos idóneos, unidos al DNA, para la extinción en solución de sondas marcadas con fluorescencia se ilustra con la siguiente serie de cromóforos fluorescentes, unidos al DNA: PO-PRO-1, BO-PRO-1, YO-PRO-1 y TO-PRO-1. Estos compuestos son tinturas monoméricas de cianina y ácido nucleico, comercializadas por la empresa Molecular Probes (Eugene, OR). Se recogen seguidamente los máximos de excitación y de emisión de cada uno de los compuestos, expresados en nanometros. A título comparativo se adjuntan los máximos de excitación y de emisión del marcador fluoresceína.
Máxlmos de excitación y de emisión
Compuesto Excitación Emisión
PO-PRO-1 435 455
BO-PRO-1 462 481
YO-PRO-1 491 509
TO-PRO-1 515 531
fluoresceína 494 516
La interacción máxima entre el marcador de fluoresceína y los compuestos unidos al DNA se espera para el momento en el que el máximo de emisión de la fluoresceína (516 nm) se sitúa en la proximidad inmediata del máximo de excitación del compuesto unido al DNA. Por ello se espera que el TO-PRO-1 genere la extinción máxima del marcador fluoresceína y además que el PO-PRO-1 genere la extinción mínima.
Los oligonucleótidos de longitudes 33 y 2 se sintetizan del modo descrito anteriormente. Las secuencias de los dos oligonucleótidos se indican seguidamente, orientadas de 5' a 3'. El oligonucleótido de longitud 2 corresponde a una forma degradada del oligonucleótido de longitud completa.
Oligo SEQ ID NO: Secuencia
ST535FS 13 FAM™-AGAAGGTGAGATGACCAGAGGACTGAGTCCAAT
ST4F FAM™-AG
Se mide básicamente igual que en el anterior ejemplo 2 la fluorescencia de los oligonucleótidos marcados en solución con y sin uno de los compuestos fijados sobre el DNA, empleando el espectrofotómetro de luminiscencia PTI LS-100 (Photon Technology International, Londres, Ontario, Canadá). Las mediciones se llevan a cabo en soluciones de 400 \mul que contienen 0,5 \muM de oligonucleótido, 1 x tampón de PCR (50 mM de KCl, 10 mM de Tris, pH 8,3; y 3 mM de MgCl_{2}), con o sin 5 \muM de uno de los compuestos fijados sobre el DNA. A continuación se presenta el grado o cantidad de extinción de cada oligonucleótido y de cada compuesto fijado sobre el DNA, expresado como porcentaje de la señal sin extinguir.
\newpage
Extinción
Compuesto extintor ST535FS ST4F
PO-PRO-1 6,0 1,1
BO-PRO-1 20,4 2,1
YO-PRO-1 20,7 19,0
TO-PRO-1 95,9 29,6
Los métodos presentes se basan en la extinción diferencial de oligonucleótidos largos y cortos. Tal como era de esperar de la comparación de máximos de emisión y de excitación, se observa que la extinción de fluorescencia de la fluoresceína causada por el TO-PRO-1 es la mayor, mientras que la extinción de la fluorescencia de la fluoresceína causada por el PO-PRO-1 es la menor. El TO-PRO-1 despliega además una extinción muy reducida del fragmento de nucleótido marcado en 2. La diferencia, superior al triple, en extinción (de \approx96% a \approx30%) es suficiente para permitir una detección sensible de la segmentación de oligonucleótidos en una reacción empleando los métodos presentes.
Los resultados sugieren que el mecanismo predominante de extinción puede ser la FET y que previsiblemente pueden elegirse otros pares idóneos de marcador/extintor por comparación de los máximos de emisión del marcador y de excitación del extintor. Una vez realizada la elección puede determinarse mediante exploración rutinaria la concentración óptima de extintor que convierta en máxima la diferencia entre la extinción de oligonucleótidos marcados largas y cortos, tal como se describe seguidamente.
La concentración óptima de TO-PRO-1 destinado al uso en los métodos presentes se determina del modo siguiente. Se mide la extinción de fluorescencia de cada una de las sondas anteriores en soluciones que contienen el 
\hbox{TO-PRO-1}
en concentraciones comprendidas entre 0 y 10 \muM. Las mediciones se llevan a cabo fundamentalmente del modo descrito anteriormente. Los resultados se presentan a continuación.
Fluorescencia residual
TO-PRO-1 (\muM) ST4F ST535FS
0,0 1,0 1,0
0,1 1,0 1,0
0,5 0,97 0,87
0,75 0,95 0,74
1,0 0,91 0,65
5,5 0,81 0,21
5,0 0,70 0,06
10,0 0,45 0,01
Los datos presentados no se han corregido con la absorción del TO-PRO-1 en las longitudes de onda de excitación y de emisión de la fluoresceína. La extinción significativa del oligonucleótido corto en concentraciones altas de 
\hbox{TO-PRO-1}
puede atribuirse a la densidad óptica del TO-PRO-1 y no se debe a la extinción de la fluoresceína. Una concentración de TO-PRO-1 de 5,0 \muM proporcionaría una diferencia máxima de extinción entre las sondas de longitud completa y las degradadas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: F. Hoffmann-La Roche AG
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Métodos para controlar, detectar o detectar la degradación de un oligonucleótido marcado con un marcado emisor de luz en solución
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 13
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: F. Hoffmann-La Roche AG
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: Grenzacherstrasse 124
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Basilea
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
CANTÓN: BS
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Suiza
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: CH-4002
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
INFORMACIÓN TELEMÁTICA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 061 688 7493
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 061 688 1395
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 1
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 10 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GAGACCATCA 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 2
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 15 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GAGACCATCA ATGAG 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 3
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GAGACCATCA ATGAGGAAGC 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 4
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAG 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 5
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAATGG 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 6
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GACCATCAAT GAGGAAGCTG CAAGAATGGG ATAG 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 7
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCATCAATGA GGAAGCTGCA AGAATGGGAT AGAG 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 8
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
GACCATCAAT GAGGAAGCTG CAAGAATGGG ATAG 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 9
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CATAGTGGTC TGCGGAACCG GTGAGTACAC CGACTATG 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 10
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 38 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CATAGTGGTC TGCGGAACCG GTGAGTACAC CGACTANG 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 11
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CATAGTGGTC TGCGGAACCG GTGAGT 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 12
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
CCANCAATGA GGAAGCTGCA AGAATGGGAT AGAG 
\hfill
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 13
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: simple
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SEQ ID NO: 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskip
AGAAGGTGAG ATGACCAGAG GACTGAGTCC AAT 
\hfill

Claims (7)

1. Un método para modificar la emisión luminosa de un oligonucleótido de cadena (= hebra) simple, marcado con un marcador emisor de luz en solución, que consiste en incorporar a dicha solución un cromóforo que se fija sobre el DNA; dicho cromóforo que se fija sobre el DNA interacciona con dicho marcador para modificar la emisión de luz de este último; y el oligonucleótido de cadena simple no se hibrida con su cadena complementaria.
2. Un método para detectar la degradación por segmentación de un oligonucleótido de cadena simple, marcado con un marcador emisor de luz, dicha segmentación se cataliza con una reacción; y dicho método consiste en:
(a) proporcionar una mezcla reaccionante, idónea para llevar a cabo dicha reacción; en ella dicha mezcla reaccionante consta de un oligonucleótido y de un cromóforo que se fije sobre el DNA; dicho cromóforo que se fija sobre el DNA es capaz de interaccionar con dicho marcador para modificar la emisión de luz de dicho marcador;
(b) medir la emisión de luz de dicho oligonucleótido en dicha mezcla reaccionante;
(c) efectuar dicha reacción en condiciones que produzcan la segmentación de dicho oligonucleótido;
(d) medir la emisión de luz de dicho oligonucleótido en dicha mezcla reaccionante; y
(e) detectar la segmentación de dicho oligonucleótido a través de la diferencia entre la emisión de luz medida en la etapa (b) y la etapa (d).
3. Un método para detectar un ácido nucleico diana en una muestra, dicho método consiste en:
(a) proporcionar una mezcla reaccionante que consta de dicha muestra, un cromóforo que se fije sobre el DNA y una sonda de oligonucleótido marcada con un marcador emisor de luz, dicha sonda contiene una secuencia capaz de hibridarse con el ácido nucleico diana; y el compuesto que se fija sobre el DNA es capaz de modificar la emisión luminosa del marcador; y dicha reacción cataliza la segmentación de dicho oligonucleótido únicamente si dicho oligonucleótido se hibrida con dicho ácido nucleico diana;
(b) medir la emisión de luz de dicho oligonucleótido en dicha mezcla reaccionante;
(c) tratar dicha mezcla en condiciones en las que dicha sonda de oligonucleótido se hibrida con dicha secuencia diana y se segmenta;
(d) medir la emisión de luz de dicho oligonucleótido en dicha mezcla reaccionante; y
(e) determinar si la secuencia diana está presente a través de la diferencia entre la emisión de luz medida en la etapa (b) y la etapa (d).
4. El método según la reivindicación 3, en el que dicha secuencia diana se amplifica antes de realizar la etapa (c).
5. Un método para detectar una secuencia de ácido nucleico diana en una muestra realizando una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), dicho proceso consiste en:
(a) proporcionar una mezcla reaccionante de PCR que contenga dicha muestra, un par de cebadores oligonucleótidos, una polimerasa de ácido nucleico que tengan actividad de 5'\rightarrow3'-nucleasa, un cromóforo que se fije sobre el DNA y una sonda de oligonucleótido capaz de hibridarse con una región del ácido nucleico diana fijado por los cebadores oligonucleótidos y en donde dicha sonda de oligonucleótido está marcada con un marcador emisor de luz, y en donde el compuesto que se fija sobre el DNA es capaz de modificar la emisión de luz de dicho marcador;
(b) medir la emisión de luz de dicho marcador en dicha mezcla reaccionante;
(c) tratar la mezcla reaccionante de PCR en condiciones de la PCR, en la que la actividad de 5'\rightarrow3'-nucleasa de la polimerasa de ácido nucleico segmenta las sondas hibridadas con la secuencia diana;
(d) medir la emisión de luz de dicho marcador en dicha mezcla reaccionante;
(e) determinar si la secuencia diana está presente basándose en la diferencia de emisión de luz medida en la etapa (b) y la etapa (d).
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, en el que dicho cromóforo que se fija sobre el DNA es un intercalador de DNA.
\newpage
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que dicho marcado es un derivado de fluoresceína y dicho cromóforo que se fija sobre el DNA es el bromuro de etidio.
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