ES2338662T3 - Pcr en tiempo real con adicion de pirofosfatasa. - Google Patents

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Abstract

Composición para amplificar y detectar un ácido nucleico diana, que consta de - una ADN polimerasa termoestable - una mezcla de desoxinucleósido-trifosfatos - un tampón - múltiples pares de cebadores de amplificación - múltiples sondas de hibridación, cada una marcada con un distinto colorante fluorescente detectable, que solo emite fluorescencia cuando la sonda se une a su ácido nucleico diana, y dicha composición comprende adicionalmente una pirofosfatasa.

Description

PCR en tiempo real con adición de pirofosfatasa.
Ámbito de la presente invención
La presente invención se refiere al campo de la amplificación de ácidos nucleicos y al control de dicha amplificación en tiempo real. De modo más exacto la presente invención aporta una solución para realizar ensayos PCR en tiempo real, caracterizados porque los compuestos fluorescentes presentes en dichos ensayos están estabilizados apropiadamente.
Antecedentes
La amplificación de ADN mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica fundamental de la biología molecular. El análisis de ácidos nucleicos por PCR requiere la preparación de la muestra, su amplificación y el análisis del producto. Aunque estas etapas suelen efectuarse sucesivamente, la amplificación y el análisis pueden tener lugar de forma simultánea. Se pueden añadir colorantes de ADN o sondas fluorescentes a la mezcla de PCR antes de la amplificación y usarlos para analizar productos de PCR durante la amplificación. El análisis de la muestra tiene lugar al mismo tiempo que la amplificación, en el mismo tubo dentro del mismo aparato. Este método combinado disminuye la manipulación de la muestra, ahorra tiempo y reduce en gran medida el peligro de contaminación del producto para las siguientes reacciones, ya que no es necesario extraer las muestras de sus recipientes cerrados para análisis posteriores. El concepto de la amplificación combinada con el análisis del producto ha llegado a conocerse como PCR "en tiempo real". Véase, por ejemplo, la patente U.S. nº 6,174,670.
Formatos de detección para la PCR en tiempo real
En la PCR en tiempo real, la formación de los productos de PCR se controla cinéticamente en cada ciclo de la misma. La amplificación suele medirse en termocicladores dotados de dispositivos adicionales para medir señales de fluorescencia durante la reacción de amplificación.
a) Formato de colorante unido a ADN
Como la cantidad de producto amplificado de cadena doble suele exceder la cantidad de ácido nucleico presente inicialmente en la muestra objeto de análisis, se pueden usar colorantes específicos para ADN de cadena doble que al excitarse con una longitud de onda apropiada emiten una fluorescencia elevada solo si están unidos a un ADN de cadena doble. Preferiblemente solo deben utilizarse aquellos colorantes que no menoscaben la eficiencia de la reacción PCR, como por ejemplo SybrGreen I.
Todos los demás formatos conocidos del estado técnico requieren el diseño de una sonda de hibridación con marcador fluorescente que solo emita fluorescencia después de unirse a su ácido nucleico diana.
b) Sonda TaqMan
Se marca una sonda de hibridación de cadena doble con dos componentes. Cuando el primer componente se excita con luz de una longitud de onda apropiada la energía absorbida se transfiere al segundo componente, el llamado extintor, según el principio de transferencia de energía resonante fluorescente. Durante la etapa de apareamiento de la reacción de PCR la sonda de hibridación se une al ADN diana y es degradada por la actividad exonucleasa 5'-3' de la Taq polimerasa en la etapa siguiente de extensión. Como resultado, el componente fluorescente excitado y el extintor se distancian entre sí, con lo cual se puede medir la emisión de fluorescencia del primer componente. Los ensayos con sonda TaqMan se describen detalladamente en las patentes US 5,210,015, US 5,538,848, y US 5,487,972. Las sondas de hibridación TaqMan y las mezclas de reactivos se revelan en la patente US 5,804,375.
c) Balizas moleculares
Estas sondas de hibridación también van marcadas con un primer componente y un extintor, con los marcadores situados preferentemente a ambos extremos de la sonda. Como resultado de la estructura secundaria de la sonda, ambos componentes están espacialmente próximos en solución. Tras la hibridación a los ácidos nucleicos diana ambos componentes quedan separados entre sí, de modo que tras la excitación con luz de una longitud de onda adecuada se puede medir la fluorescencia del primer componente (patente US 5,118,801).
d) Formato de sonda simple (SLP)
Este formato de detección consiste en un oligonucleótido simple marcado con un solo colorante fluorescente en el extremo 5' o 3' (patente WO 02/14555) . Para marcar los oligos se pueden usar dos modelos diferentes: sondas de inhibición por G y sondas de desinhibición por nitroindol. En la forma de inhibición por G el colorante fluorescente está unido a una C en el extremo 5' o 3' del oligo. La fluorescencia disminuye notablemente cuando la sonda se hibrida a la diana, en el caso de que haya dos G situadas en la cadena diana opuesta a C y en posición 1 aparte de la sonda oligonucleótida complementaria. En la forma de desinhibición por nitroindol el colorante fluorescente va unido a un nitroindol en el extremo 5' o 3' del oligonucleótido. El nitroindol reduce de algún modo la señal fluorescente de la sonda libre. La fluorescencia aumenta cuando la sonda se hibrida al ADN diana, debido a un efecto desinhibidor.
e) Sondas de hibridación FRET
El formato de ensayo con sondas de hibridación FRET es especialmente útil para todo tipo de ensayos de hibridación homogénea (Matthews, J.A., y Kricka, L.J., Anal. Biochem. 169 (1988) 1-25). Está caracterizado por dos sondas de hibridación monocatenarias que se emplean simultáneamente y que son complementarias de sitios adyacentes de la misma cadena del ácido nucleico diana amplificado. Ambas sondas están marcadas con componentes fluorescentes distintos. Al excitarse con luz de una longitud de onda adecuada, un primer componente transfiere la energía absorbida al segundo componente conforme al principio de transferencia de energía resonante fluorescente, lo que permite medir una emisión de fluorescencia del segundo componente cuando ambas sondas de hibridación se unen a posiciones adyacentes de la molécula diana objeto de detección. Como alternativa al control del aumento de fluorescencia del componente aceptor de FRET también se puede controlar el descenso de fluorescencia del componente donante de FRET como medición cuantitativa de un proceso de hibridación.
El formato de sondas de hibridación FRET puede usarse concretamente en PCR a tiempo real para detectar el ADN diana amplificado. Entre todos los formatos de detección conocidos en el estado técnico de la PCR a tiempo real se ha demostrado que el formato de sondas de hibridación FRET es muy sensible, exacto y fidedigno (véanse patentes WO 97/46707; WO 97/46712; WO 97/46714). Como alternativa al uso de dos sondas de hibridación FRET también puede usarse un cebador marcado con fluorescente y solo una sonda oligonucleótida marcada (Bernard, P.S., y otros, Anal. Biochem. 255 (1998) 101-107). A este respecto puede escogerse libremente entre marcar el cebador con el compuesto donante de FRET o con el compuesto aceptor de FRET.
Aparte de la PCR y de la PCR en tiempo real, las sondas de hibridación FRET se utilizan para el análisis de curvas de fusión. En este ensayo el ácido nucleico diana se amplifica primero en una reacción de PCR típica con cebadores de amplificación adecuados. Las sondas de hibridación pueden estar presentes durante la reacción de amplificación o pueden agregarse a continuación. Una vez completada la reacción de PCR, la temperatura de la muestra aumenta constitutivamente y se detecta fluorescencia mientras la sonda de hibridación está unida al ADN diana. A la temperatura de fusión las sondas de hibridación se desprenden de su diana y la señal fluorescente decrece inmediatamente hasta su nivel de fondo. Este descenso se controla mediante un gráfico apropiado de fluorescencia frente a temperatura, de modo que pueda determinarse un valor de la primera derivada al cual se observa el máximo descenso de fluorescencia.
Todos los formatos de detección a base de sondas se pueden "multiplexar". De manera más precisa, en un recipiente de reacción se pueden amplificar múltiples dianas con múltiples pares de cebadores de amplificación y se pueden detectar con múltiples sondas de hibridación. En este caso dichas sondas múltiples van marcadas con distintos colorantes fluorescentes detectables para descubrir y discriminar las múltiples dianas que supuestamente deben encontrarse en la muestra.
Para la detección multiplex con el formato de sondas de hibridación FRET se puede emplear fluoresceína o derivados de la misma como fragmento donante de FRET en combinación con diversos fragmentos aceptores de FRET, como Cy-5, LCRed-640 o LC-red 705.
Un ejemplo típico de instrumento capaz de realizar la PCR multiplex en tiempo real es el LightCycler de Roche Diagnostics (nº de cat. 3 531 414 201) . Es un sistema rápido de PCR que permite la cuantificación directa por PCR cinética y el subsiguiente análisis de las curvas de fusión de los productos de PCR. El sistema óptico de la actual versión 2.0 del LightCycler disponible comercialmente contiene una fuente de luz, un diodo emisor de luz azul (470 nm LED) y seis canales de detección. Se determina un umbral de señal definido para todas las reacciones objeto de análisis y el número de ciclos Cp que requiere la consecución de este valor umbral para el ácido nucleico diana y también para ácidos nucleicos de referencia, tales como el gen estándar o de mantenimiento. El número absoluto o relativo de copias de la molécula diana se puede determinar en base a los valores Cp obtenidos para el ácido nucleico diana y el ácido nucleico de referencia.
La fluorescencia emitida por una muestra es separada por una serie de espejos y filtros dicroicos en diferentes longitudes de onda que pueden registrarse en uno de los seis canales de detección. La disponibilidad de compuestos fluorescentes en el mercado permite detectar el colorante SybrGreen I unido al ADN bicatenario, la detección de color dual con el formato de sonda TaqMan y la detección cuatricolor con el formato de sonda de hibridación (HybProbe). En las patentes WO 97/46707, WO 97/46712 y WO 97/46714 se revelan detalles del LightCycler.
Sin embargo se ha observado una desventaja importante respecto a los ensayos multiplex. Cuando se amplifican múltiples amplicones mediante el uso de múltiples pares de cebadores a menudo se observa un descenso de la fluorescencia.
Por tanto el problema subyacente a la presente invención es el de proporcionar un mejor rendimiento de la amplificación cuantitativa por PCR en tiempo real y del subsiguiente análisis de las curvas de fusión en los últimos ciclos.
Descripción breve de la presente invención
La presente invención se basa en la sorprendente observación de que la presencia de pirofosfatasa puede estabilizar la señal fluorescente durante un experimento de PCR en tiempo real, incluso en los últimos ciclos.
Así, en un primer aspecto, la presente revelación se refiere al uso de una pirofosfatasa para estabilizar al menos una primera entidad fluorescente presente en una composición destinada a la amplificación y detección de al menos un primer ácido nucleico diana durante un proceso de termociclado.
En un segundo aspecto la presente invención se refiere a una composición para amplificar y detectar un primer ácido nucleico diana, la cual consta de
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una ADN polimerasa termoestable
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una mezcla de desoxinucleósido-trifosfatos
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un tampón
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múltiples pares de cebadores de amplificación
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múltiples sondas de hibridación, cada una marcada con un distinto colorante fluorescente detectable, que solo emite fluorescencia cuando la sonda se une a su ácido nucleico diana, y dicha composición comprende adicionalmente una pirofosfatasa.
La pirofosfatasa es preferiblemente termoestable.
En este contexto la presente invención también comprende dichas composiciones con un contenido adicional de un respectivo ácido nucleico diana, el cual se supone que es amplificado.
En una forma de ejecución específica la composición comprende al menos una segunda sonda de hibridación marcada con una segunda entidad fluorescente, de modo que dicha primera y segunda sondas constituyen juntas un par de sondas de hibridación FRET.
En un tercer aspecto la presente invención también se refiere a un método para amplificar y detectar al menos un primer ácido nucleico diana, que comprende
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proporcionar una composición como la revelada arriba, para amplificar y detectar un ácido nucleico diana
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mezclar dicha composición con una muestra que contiene supuestamente, al menos, un primer ácido nucleico diana
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someter la mezcla resultante a un protocolo de termociclado, y
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detectar el producto de amplificación de dicho ácido nucleico diana, controlando la fluorescencia dependiente de la hibridación.
En una forma de ejecución específica el método según la presente invención es capaz de realizar la PCR multiplex en tiempo real. En este caso la composición comprende múltiples sondas de hibridación, que son capaces de hibridar al menos dos, preferiblemente 3-4 y sobre todo 3-6 dianas de amplificación diferentes.
En un cuarto aspecto la presente invención se refiere a un kit que consta de
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una ADN polimerasa termoestable
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una mezcla de desoxinucleósido-trifosfatos
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un tampón
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múltiples pares de cebadores de amplificación
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múltiples sondas de hibridación, cada una marcada con un distinto colorante fluorescente detectable, que solo emite fluorescencia cuando la sonda se une a su ácido nucleico diana, y dicho kit comprende además una pirofosfatasa que es preferentemente termoestable.
En una forma de ejecución específica dicho kit lleva al menos una segunda sonda de hibridación marcada con una segunda entidad fluorescente, de modo que dicha primera y segunda sondas constituyen juntas un par de sondas de hibridación FRET.
Descripción detallada de la presente invención
En los últimos ciclos de los ensayos multiplex los valores de fluorescencia de cuantificación en tiempo real pueden caer por debajo de la fluorescencia de fondo. Este efecto se debe probablemente a que las elevadas concentraciones de ADN/amplicón influyen en las condiciones del tampón, lo cual se refleja en un descenso de la fluorescencia en el canal 530 de fluoresceína.
En experimentos multiplex se observa frecuentemente un descenso en dos fases de la emisión de la fluoresceína como fragmento donante de FRET, lo cual a su vez reduce la capacidad de la fluoresceína para actuar como donante de FRET en el proceso de transferencia de energía resonante fluorescente y por tanto afecta a la emisión de fluorescencia de cualquier fragmento aceptor de FRET.
En presencia de pirofosfatasa el descenso de emisión de la fluoresceína ocurre en una sola fase, lo cual indica que el efecto de disminución de la señal en los últimos ciclos de amplificación está compensado, al menos parcialmente. Esta compensación puede explicarse teniendo en cuenta las consideraciones siguientes:
Durante la reacción de amplificación se libera pirofosfatasa (PPi) tras la incorporación de nucleótido trifosfatos al amplicón generado:
ADN_{x} + dNTP \leftrightarrow ADN_{x+1} + PPi
Sin embargo el incremento de la concentración de PPi produce un descenso de pH en la mezcla reactiva, que, como es sabido, afecta a la estabilidad de los colorantes fluorescentes en general y de la fluoresceína en particular ("Spectrophotometric determination of pKa values for fluorescein using activity coefficient corrections" [Determinación espectrofotométrica de valores pKa para correcciones del coeficiente de actividad en el uso de fluoresceína], Smith, S.A., Pretorius, W.A., Water SA 28 (2002) 395-402; "Studies on Fluorescein-VII: The Fluorescence of Fluorescein as a function of pH" [Estudios sobre fluoresceína-VII: La fluorescencia de la fluoresceína en función del pH], Diehl, H. y Markuszewski, R., Talanta 36 (1989) 416-418).
Al añadir pirofosfatasa termoestable (PPase) el pirofosfato se convierte en ortofosfato (Pi).
1
En soluciones líquidas el ortofosfato liberado forma un equilibrio:
2
Debido a este equilibrio, sobre todo en líquidos ácidos, aumenta el pH y los compuestos fluorescentes tales como la fluoresceína pueden permanecer estabilizados.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso de pirofosfatasa para estabilizar al menos una primera entidad fluorescente en una composición destinada a la amplificación de al menos un primer ácido nucleico diana durante un proceso de termociclado.
La pirofosfatasa es preferiblemente una pirofosfatasa termoestable, con una actividad óptima por encima de 37ºC, que es resistente a los procesos de termociclado y mantiene su actividad inalterada a lo largo de más de 40 ciclos de amplificación. En la patente EP 763 599 se revela un ejemplo de una pirofosfatasa termoestable adecuada.
La pirofosfatasa puede añadirse a la composición resultante a una concentración final de al menos 0,005 U/\mul pero no mayor de 0,5 U/\mul. Preferiblemente se añade pirofosfatasa a una concentración final de unas 0,01 U/\mul hasta 0,1 U/\mul. Se ha comprobado que las concentraciones óptimas de pirofosfatasa son de unas 0,04 U/\mul.
Como se ha explicado teóricamente arriba, la adición de pirofosfatasa durante una reacción de amplificación reduce o incluso evita completamente el descenso de pH durante el proceso de amplificación, sobre todo cuando se amplifican diferentes dianas en un ensayo multiplex. El resultado de este efecto es la estabilización de básicamente cualquier tipo de entidad fluorescente presente en una mezcla reactiva, incluyendo sin limitación las sondas TaqMan, balizas moleculares, sondas simples y pares de sondas de hibridación FRET. Concretamente la adición de pirofosfatasa es muy ventajosa para la estabilización de la fluoresceína o de otros compuestos fluorescentes que pueden servir como fragmentos donantes de FRET.
Además la adición de pirofosfatasa es muy ventajosa en el caso de equipos multiplex que contienen al menos dos o más sondas de hibridación distintas. Esto es especialmente cierto para sondas de hibridación FRET multiplex caracterizadas porque la fluoresceína se usa como el único componente donante de múltiples pares de sondas de hibridación FRET.
A este respecto hay que remarcar que, para otros fines, las pirofosfatasas se han usado anteriormente en la técnica de realizar amplificaciones de ácido nucleico dependientes de molde:
La patente EP 763 599 revela el uso de pirofosfatasa termoestable en la PCR como aditivo para mejorar la eficiencia global de la amplificación. De manera similar la patente DE 19612779 revela el uso de pirofosfatasa para la amplificación de secuencias extraordinariamente largas de ADN molde. La patente US 6,225,092 revela la utilidad de añadir pirofosfatasa en reacciones de secuenciación directa de la amplificación. Por último la patente US 2003/0049655 revela el uso de sales de pirofosfatasa como aditivo en mezclas reactivas de PCR, para impedir extensiones inespecíficas del cebador a temperatura ambiente, así como la adición de pirofosfatasa para eliminar luego las sales correspondientes. Sin embargo, ninguna de estas referencias, y según el mejor conocimiento de los inventores ni otras del estado técnico previo, anticipan o sugieren el uso de pirofosfatasa como aditivo para la PCR en tiempo
real.
En un segundo aspecto la presente invención se refiere a una composición para amplificar y detectar un ácido nucleico diana, que consta de
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una ADN polimerasa termoestable
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una mezcla de desoxinucleósido-trifosfatos
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un tampón
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múltiples pares de cebadores de amplificación
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múltiples sondas de hibridación, cada una marcada con un distinto colorante fluorescente detectable, que solo emite fluorescencia cuando la sonda se une a su ácido nucleico diana, y dicha composición comprende adicionalmente una pirofosfatasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La pirofosfatasa es preferiblemente termoestable. También preferiblemente, dicha pirofosfatasa está presente en una concentración final de al menos 0,005 U/\mul, pero no mayor de 0,5 U/\mul. Se prefiere sobre todo una concentración final de unas 0,01 U/\mul hasta 0,1 U/\mul, con una concentración final óptima de 0,0 4 U/\mul aproximadamente.
La ADN polimerasa termoestable puede ser cualquier tipo de ADN polimerasa natural, recombinante y/o modificada químicamente, conocida del estado técnico, capaz de efectuar una reacción de amplificación PCR, incluyendo por ejemplo la Taq polimerasa o cualquier otra polimerasa capaz de amplificar cualquier clase de ADN diana bicatenario. Además incluye las ADN polimerasas termoestables que poseen un grado importante de actividad de transcriptasa inversa, como, por ejemplo, la ADN polimerasa de thermus thermophilus revelada en la patente US 5,618,711.
La ADN polimerasa puede tener en particular una modificación química, como se revela en las patentes US 5,677,152 y US 5,773,258. Los enzimas revelados en estas referencias llevan modificaciones covalentes, pero termolábiles, que inactivan el enzima antes del primer ciclo de amplificación, dando como resultado un efecto llamado inicio caliente.
La mezcla de nucleósidos comprende habitualmente dATP, dGTP, dCTP y dTTP en proporciones aproximadamente equimolares, suficientes para proporcionar bastantes eductos monoméricos a la reacción de amplificación. En vez de dTTP se puede usar dUTP. Además la mezcla puede llevar dNTPs con análogos de base o bien dNTPs con análogos de base no nucleósidos de cualquier tipo.
Además de un tampón apropiado la composición puede llevar otros iones, sales o compuestos inorgánicos para optimizar las actividades enzimáticas de la polimerasa termoestable o preferiblemente de la pirofosfatasa termoestable. Asimismo estos compuestos pueden aumentar la especificidad del apareamiento de los cebadores. La composición comprende preferiblemente MgCl_{2} en un intervalo de concentración de 1 hasta 5 mM de MgCl_{2}.
El par, como mínimo, de cebadores de amplificación es un par de oligonucleótidos cuyos dos miembros se unen con orientación opuesta a la secuencia de ácido nucleico diana. Estos oligonucleótidos se pueden preparar según la química convencional de la fosforamidita, bien conocida del estado técnico. Esta tecnología también permite incorporar nucleótidos modificados o marcados, siempre que se disponga de la fosforamidita adecuada.
\newpage
La composición de la presente invención lleva múltiples pares de cebadores de amplificación, preferiblemente 2, 3, 4 o 5-6 pares de cebadores de amplificación, capaces de amplificar distintas secuencias diana supuestamente presentes en la muestra analizada.
La composición conforme a la presente invención contiene múltiples sondas de hibridación, cada una marcada con un distinto colorante fluorescente detectable. Puede ser cualquiera de las sondas de hibridación utilizadas en la PCR en tiempo real, por ejemplo una sonda TaqMan, una baliza molecular, una sonda simple. La composición conforme a la presente invención también puede contener, al menos, un par de sondas de hibridación FRET.
La composición conforme a la presente invención contiene 2, 3, 4, 5-6 o incluso más sondas de hibridación marcadas de modo diferente, que se hibridan a distintas secuencias diana de ácido nucleico. También dentro del ámbito de la presente invención la composición puede llevar 2, 3, 4 o 5-6 sondas de hibridación FRET, caracterizadas porque cada par sondas de hibridación FRET se hibrida a una distinta secuencia de ácido nucleico diana. Preferiblemente todos los fragmentos donantes de FRET de dichos múltiples pares de sondas de hibridación son idénticos. Con mayor preferencia, todos los fragmentos donantes son fluoresceína.
Cuando se mezclan con una muestra para analizar, todas las composiciones según la presente invención anteriormente reveladas pueden usarse para amplificar y detectar una o más secuencias de ácido nucleico diana supuestamente presentes en dicha muestra. En este contexto la presente invención también abarca composiciones que, junto a los ingredientes existentes en las composiciones arriba reveladas, incluyen la(s) respectiva(s) secuencia(s) de ácido nucleico diana que hipotéticamente se amplifican.
En otro aspecto la presente invención también se refiere a kits para preparar una composición conforme a la presente invención.
Más concretamente un kit de este tipo consta de
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una ADN polimerasa termoestable
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una mezcla de desoxinucleósido-trifosfatos
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un tampón
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múltiples pares de cebadores de amplificación
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múltiples sondas de hibridación, cada una marcada con un distinto colorante fluorescente detectable,
el cual solo emite fluorescencia cuando la sonda se une a su ácido nucleico diana, y dicho kit comprende adicionalmente una pirofosfatasa, que es preferiblemente termoestable.
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Los distintos componentes pueden conservarse individualmente en recipientes diferentes. Como alternativa los distintos componentes se pueden conservar todos juntos en un recipiente de almacenamiento. También como alternativa, se pueden conservar juntas combinaciones de solo un subconjunto de componentes (i) a (vi) elegidas arbitrariamente. En una forma de ejecución preferida los componentes (ii), (iii), (iv) y (v) se conservan juntos y los componentes (i) y (vi) se almacenan cada uno por separado. En otra forma de ejecución preferida (i), (ii), (iii) y (iv) y (v) se conservan juntos.
En otra forma de ejecución dicho kit incluye múltiples pares de cebadores de amplificación, preferiblemente 2, 3, 4 o 5-6 pares de cebadores de amplificación, y respectivamente 2, 3, 4 o 5-6 sondas de hibridación con marcadores distintos, seleccionadas, sin exclusividad, de un grupo constituido por sondas TaqMan, balizas moleculares y sondas simples.
En otra forma de ejecución específica dicho kit también incluye al menos una segunda sonda de hibridación marcada con una segunda entidad fluorescente, de modo que dichas primera y segunda sondas de hibridación constituyen conjuntamente un par de sondas de hibridación FRET. Asimismo dicho kit puede comprender 2, 3, 4 o 5-6 pares de cebadores de amplificación junto con 2, 3, 4 o 5-6 pares de sondas de hibridación FRET, y está caracterizado porque cada par de sondas de hibridación FRET se hibrida con una secuencia de ácido nucleico distinta, amplificada por un par diferente de cebadores de amplificación. Todos los fragmentos donantes de FRET de dichos múltiples pares de sondas de hibridación son idénticos. Con mayor preferencia, (al menos uno, varios o todos), los fragmentos donantes son fluoresceína.
En una forma de ejecución muy específica, un kit según la presente invención puede incluir además un medio de almacenamiento legible por ordenador que comprenda "archivos de compensación de color". Un archivo de compensación de color es un medio de compensar las interferencias entre diferentes canales de detección, que pueden darse en ensayos multiplex. En otras palabras, los datos obtenidos en cada experimento se someten a una operación matemática específica, a fin de tener en consideración las interferencias entre diferentes canales de detección.
En otro aspecto la presente invención también se refiere a un método, para amplificar y detectar como mínimo un primer ácido nucleico diana, que consiste en:
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proporcionar una composición para amplificar y detectar un ácido nucleico diana, que contiene
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una ADN polimerasa termoestable
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una mezcla de desoxinucleósido-trifosfatos
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un tampón
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múltiples pares de cebadores de amplificación
-
múltiples sondas de hibridación, cada una marcada con un distinto colorante fluorescente detectable, el cual solo emite fluorescencia cuando la sonda se une a su ácido nucleico diana, y dicha composición comprende adicionalmente una pirofosfatasa,
que es preferiblemente termoestable,
-
mezclar dicha composición con una muestra que supuestamente contiene al menos un primer ácido nucleico diana,
-
someter la mezcla resultante a un protocolo de termociclado en un aparato termociclador en tiempo real, y
-
detectar el producto amplificado de dicho ácido nucleico diana mediante control de la fluorescencia dependiente de la hibridación.
\vskip1.000000\baselineskip
Para realizar un método conforme a la presente invención se pueden usar todas las composiciones y kits revelados anteriormente. En concreto, el método según la presente invención puede efectuar PCR multiplex en tiempo real. En este caso, la composición incluye múltiples sondas de hibridación, capaces de hibridarse con al menos dos, preferiblemente 3-4 y sobre todo 3-6 dianas de amplificación distintas.
El nuevo método es especialmente útil para experimentos de PCR multiplex con empleo de múltiples pares de sondas de hibridación FRET, sobre todo si todos los compuestos donantes de FRET son idénticos, por ejemplo, si todos los compuestos donantes de FRET son fluoresceína.
Descripción de las figuras
Figuras 1-5: PCR 4-plex, genes de mantenimiento: \beta2M (canal 610), PBGD (canal 640), HPRT (canal 670), G6PDH (canal 705); líneas de trazos: sin pirofosfatasa; línea continua: con 0,8 U de pirofosfatasa
Figura 1: canal 530, emisión de fluoresceína
Figura 2: canal 610, emisión de LC-Red 610
Figura 3: canal 640, emisión de LC-Red 640
Figura 4: canal 670, emisión de Cy-5
Figura 5: canal 705: emisión de LC-Red 705
Se aportan los siguientes ejemplos, referencias, listas de secuencias y figuras, para facilitar la comprensión de la presente invención, cuyo verdadero alcance se expone en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos Ejemplo 1 PCR 4-plex con el formato de sondas de hibridación FRET en un aparato LightCycler 2.0.
Para amplificar y detectar los 4 distintos genes constitutivos h-PBGD, h-\beta2-M, h-G6PDH y hHPRT en un aparato Light- Cycler 2.0 (Roche Applied Science nº de cat. 3 531 414 201) se usan cebadores y sondas con secuencias correspondientes a los nº de cat. 3 146 073, 3 146 081, 3 261 883 y 3 261 891 de Roche Applied Science. La amplificación se llevó a cabo en presencia o ausencia de 0,8 unidades de pirofosfatasa termoestable (Calbiochem nº de cat. 405822).
\newpage
Primero se prepararon mezclas detectoras 10x:
\vskip1.000000\baselineskip
\beta2M (\beta2 microglobulina)
3 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
HPRT (Hipoxantina Fosforribosil Transferasa)
4 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
G6PDH (Glucosa-6-Fosfato-Deshidrogenasa)
5 
\newpage
PBGD (Porfobilinógeno Desaminasa)
6
Los cebadores y sondas se habían sintetizado según protocolos estándar de la química de fosforamidato, usando fluoresceína-CPG (nº de cat. 3 138 187 de Roche Applied Science), LC-Red-610 (nº de cat. 3 561 488 de Roche Applied Science), LC-Red 640 (nº de cat. 2 015 161 de Roche Applied Science), LC-Red-705 (nº de cat. 2 157 594 de Roche Applied Science) y Cy-5-NHS-éster (nº de cat. 27179901 de Amersham) o Cy-5 fosforamidato (nº de cat. PA 15100 de Amersham).
Para cada capilar, en un volumen total de 20 \mul, se mezclaron 4 \mul de 5x Master Mix (Multiplex Master Roche Applied Science nº de cat. 04 340 019 001) con 0,8 \mul de MgCl_{2} 25 mM y 2 \mul de cada mezcla detectora 10x, 4 \mul de ADNc humano con aprox. 10 copias de un respectivo ADN transcripto inverso de ARN patrones de Roche Applied Science (nº de cat. 3 146 073, 3 146 081, 3 261883 y 3 261 891). A cada segundo alícuota se le añadieron 0,8 \mul de pirofos-
fatasa termoestable (1 U/\mul, nº de cat. 405822 de Calbiochem), obteniéndose una concentración final de 0,04 U/\mul.
El respectivo esquema de pipeteo fue el siguiente:
7
El termociclado y la detección en tiempo real se realizaron según el siguiente protocolo:
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
Las emisiones de fluorescencia de los distintos canales de detección están representadas en las figuras 1-5, donde las líneas continuas indican una muestra que contiene pirofosfatasa y las líneas de trazos una muestra que no contiene pirofosfatasa.
En la fig. 1 se representa la emisión de fluoresceína como fragmento donante de FRET - de los 4 pares distintos de sondas de hibridación. Como se ve en la figura, puede medirse un descenso bifásico, mientras que en presencia de 0,8 U de pirofosfatasa el descenso es monofásico. Por tanto la pirofosfatasa es capaz de estabilizar la fluoresceína, al menos parcialmente, durante los últimos ciclos de amplificación.
En las fig. 2-5 se representa la emisión de los distintos fragmentos aceptores de FRET - indicativa de la amplificación y detección de los 4 diferentes genes de mantenimiento (fig. 2 canal 610, h-b2-M), fig. 3, canal 640 (PBGD), fig. 4, canal 670 (HPRT) y fig. 5, canal 705 (G6PDH)) - en presencia o ausencia de pirofosfatasa, durante 45 ciclos de amplificación.
Como puede apreciarse en la figuras, en una muestra sin pirofosfatasa la señal fluorescente alcanzó un máximo a unos 35 ciclos de amplificación en los 4 canales y luego decayó. En una muestra que llevaba adicionalmente 0,8 U de pirofosfatasa este efecto fue compensado completamente para las sondas donantes de FRET marcadas con LC-Red 610 (fig. 2), LC-Red 640 (fig. 3) y LC-Red 705 (fig. 5), y sustancialmente para las sondas marcadas con Cy-5 (fig. 4). Por lo tanto la adición de pirofosfatasa es capaz de estabilizar la señal de los diferentes fragmentos aceptores de FRET en los últimos ciclos de amplificación, debido probablemente a la estabilización de la fluoresceína como donante de FRET.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 PCR 3-plex con el formato de sondas de hibridación FRET en un aparato LightCycler 2.0
En condiciones básicamente idénticas a las del ejemplo 1 se realizó un ensayo PCR 3-plex en tiempo real para amplificar tres secuencias distintas, partiendo de 1 x 10^{6} copias de ADN plásmido para cada una. Se usó pirofosfatasa termoestable de Roche Applied Science (nº de cat. 1 721 992). La PCR se llevó a cabo con cebadores y sondas apropiadas para detectar Factor II-ADN, empleando LC-Red 640 como fragmento aceptor de fluorescencia, y las dos isoformas de hHFE: HFE 845, usando Cy-5 como fragmento aceptor de fluorescencia, y HFE 187, utilizando LC-Red 705 como fragmento aceptor de fluorescencia. Las sondas con un fragmento aceptor en 5' se bloquearon por sus respectivos extremos 3' con un fragmento terminal de fosfato. Para estas tres dianas se usaron los cebadores y sondas siguientes:
\newpage
Protrombina (Factor II) nº de acceso AF478696
9 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
HFE 187 nº de acceso Z92910
10 
\newpage
HFE 845 nº de acceso Z92910
11
En este ensayo el descenso de señal fluorescente en los últimos ciclos de amplificación también se pudo compensar con la adición de 0,8 unidades de pirofosfatasa, de modo completo respecto al LC-Red 640 y al LC-Red 705 y sustancialmente respecto al Cy-5.
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FII Cebador directo
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
ccaatcccgt gaaagaatta t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 20
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FII Cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aggtggtgga ttcttaagtc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FII Sonda con fluoresceína
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gagcattgtg gctcgctgag 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> FII Sonda con LC Red 640
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacttttatt gggaaccata gttttagaaa cascaa 
\hfill
36 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HFE 187 Cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcctcagagc aggaccttgg 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HFE 187 Cebador inverso
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<400> 6
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cagctgtttc cttcaagatg c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 39
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HFE 187 Sonda con fluoresceína
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cttgaaattc tactggaaac ccatggagtt cggggctcc 
\hfill
39 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> HFE 187 Sonda con LC Red 705
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cacggcgact ctcatcatca tagaacacga aca 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> HFE 845 Cebador directo
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskip
tggcaagggt aaacagatcc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> HFE 845 Cebador inverso
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<400> 10
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\hskip-.1em\dddseqskip
ctcaggcact cctctcaacc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 11
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> HFE 845 Sonda con fluoresceína
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<400> 11
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agatatacgt accaggtgga g 
\hfill
21 
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<210> 12
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
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<223> HFE 845 Sonda con Cy5
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<400> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cccaggcctg gatcagcccc tcattgtgat ctggg 
\hfill
35

Claims (7)

1. Composición para amplificar y detectar un ácido nucleico diana, que consta de
-
una ADN polimerasa termoestable
-
una mezcla de desoxinucleósido-trifosfatos
-
un tampón
-
múltiples pares de cebadores de amplificación
-
múltiples sondas de hibridación, cada una marcada con un distinto colorante fluorescente detectable, que solo emite fluorescencia cuando la sonda se une a su ácido nucleico diana, y dicha composición comprende adicionalmente una pirofosfatasa.
2. Composición según la reivindicación 1, en la cual dicha pirofosfatasa es termoestable.
3. Composición constituida por una composición según las reivindicaciones 1-2 y un ácido nucleico molde.
4. Un kit que consta de
-
una ADN polimerasa termoestable
-
una mezcla de desoxinucleósido-trifosfatos
-
un tampón
-
múltiples pares de cebadores de amplificación
-
múltiples sondas de hibridación, cada una marcada con un distinto colorante fluorescente detectable, que solo emite fluorescencia cuando la sonda se une a su ácido nucleico diana, y dicho kit comprende adicionalmente una pirofosfatasa.
5. Un kit formado por un kit según la reivindicación 4 y un medio de almacenamiento legible por ordenador que comprende un archivo de compensación de color.
6. Método para amplificar y detectar, al menos, un primer ácido nucleico diana, que consiste en
-
proporcionar una composición según las reivindicaciones 1-2,
-
mezclar dicha composición con una muestra que contiene supuestamente, al menos, un primer ácido nucleico diana
-
someter la mezcla resultante a un protocolo de termociclado, y
-
detectar el producto de amplificación de dicho ácido nucleico diana, controlando la fluorescencia dependiente de la hibridación en tiempo real.
7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque dichas múltiples sondas de hibridación son capaces de hibridarse con al menos dos, preferiblemente 3-6 y sobre todo 3-4 productos de amplificación diferentes.
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