CN100478453C - 添加焦磷酸酶的实时pcr - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于扩增和检测靶核酸的方法和试剂盒，其中包含进行和监控实时核酸扩增的试剂的组合物至少包括用第一荧光实体标记的第一杂交探针和焦磷酸酶。

Description

添加焦磷酸酶的实时PCR
本发明涉及核酸扩增和实时监控所述扩增的领域。更准确地说，本发明提供用于进行实时PCR测定的解决方案，其特征在于存在于这种测定中的荧光化合物是足够稳定的。
现有技术背景
通过聚合酶链反应(PCR)的DNA扩增是分子生物学的基本技术。通过PCR的核酸分析需要样品制备、扩增和产物分析。尽管通常顺序进行这些步骤，但扩增和分析也可同时发生。可在扩增前向PCR混合物中加入DNA染料或荧光探针，并将其用于在扩增期间分析PCR产物。在相同的设备内，在相同的试管中样品分析与扩增同时发生。这种组合的方法减少了样品处理，节约了时间，并且极大地降低了顺序反应对产物污染的风险，因为其中不需要从闭合的容器中取出样品来用于进一步的分析。组合扩增和产物分析的概念已被称为“实时”PCR。参见例如，美国专利号6,174,670。
实时PCR检测形式
在动力学的实时PCR中，在PCR的每个循坏中监控PCR产物的形成。通常在热循环仪中测量扩增，其具有用于在扩增反应期间测量荧光信号的附加装置。
a)DNA结合染料形式
由于双链扩增产物的量通常超过最初存在于待分析样品中的核酸的量，所以可使用双链DNA特异的染料，只有当所述染料结合双链DNA时，它才在用适当的波长激发时显示增强的荧光。优选地，只使用类似于SybrGreen I的染料，例如不会影响PCR反应的效率的染料。
本领域已知的所有其他形式需要设计荧光标记的杂交探针，其只有在结合其靶核酸时才发射荧光。
b)TaqMan探针
用两种成分标记单链杂交探针。当用合适波长的光激发第一成分时，根据荧光共振能量转移原理将吸收的能量转移到第二成分，即所谓的猝灭剂。在PCR反应的退火步骤期间，杂交探针结合靶DNA，并在随后的延伸阶段通过Taq聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性进行降解。结果激发的荧光成分和猝灭剂相互之间是空间隔离的，并且因此可测量第一成分的荧光发射。在US 5,210,015、US 5,538,848和US5,487,972中详细公开了TaqMan探针测定。在US 5,804,375中公开了TaqMan杂交探针和试剂的混合物。
c)分子信标(Beacon)
也用第一成分和猝灭剂标记这些杂交探针，该标记优选位于探针的两个末端。由于探针的二级结构，溶液中这两种成分是空间邻近的。与靶核酸杂交后，两种成分相互分离，以致于用合适波长的光激发后可测量第一成分的荧光发射(US 5,118,801)。
d)单标记探针(SLP)形式
这种检测形式由在5’-或3’-末端用单个荧光染料标记的单个寡核苷酸组成(WO 02/14555)。可将两种不同的设计用于寡核苷酸(oligo)标记：G-猝灭探针和硝基吲哚-去猝灭(Nitroindole-Dequenching)探针。在G-猝灭的实施方案中，荧光染料附着于寡核苷酸5’-或3’-末端的C上。当探针与靶杂交时，倘若2个G位于与C相对的靶链上并且在互补的寡核苷酸探针旁边的位置1，荧光就显著降低。在硝基吲哚-去猝灭的实施方案中，荧光染料附着于寡核苷酸的5’-或3’-末端的硝基吲哚上。硝基吲哚以某种方式降低游离探针的荧光信号。当探针与靶DNA杂交时由于去猝灭效应而使荧光增加。
e)FRET杂交探针
FRET杂交探针测试形式对于所有类型的同源杂交测定是特别有用的(Matthews，J.A.和Kricka，L.J.，Anal.Biochem.169(1988)1-25)。其特征在于同时使用两个单链杂交探针，并且其与扩增的靶核酸的相同链的邻近位点是互补的。两个探针都用不同的荧光成分进行标记。当用合适波长的光激发时，根据荧光共振能量转移原理，第一成分将吸收的能量转移至第二成分，从而当两个杂交探针都结合待检测靶分子的邻近位置时，可测量第二成分的荧光发射。作为监控FRET受体成分荧光的增加的替代，也可监控FRET供体成分的荧光降低作为杂交事件的定量测量。
特别地，FRET杂交探针形式可用于实时PCR，以便检测扩增的靶DNA。在实时PCR的领域中已知的所有检测形式中，已经证实FRET杂交探针形式是高灵敏、准确和可靠的(WO 97/46707；WO 97/46712；WO 97/46714)。作为使用两个FRET杂交探针的替代，也可使用荧光标记的引物和只使用一个标记的寡核苷酸探针(Bernard，P.S.，等人，Anal.Biochem.255(1998)101-107)。在这方面，无论用FRET供体还是用FRET受体化合物标记引物，都可任意地进行选择。
除PCR和实时PCR外，将FRET杂交探针用于熔解曲线分析。在这种测定中，首先在具有合适扩增引物的一般PCR反应中扩增靶核酸。在扩增反应期间可已经存在杂交探针或顺序加入杂交探针。完成PCR反应后，组成型地增加样品的温度，只要杂交探针结合靶DNA就可检测到荧光。在熔解温度，从其靶释放杂交探针，并且荧光信号立即降低至背景水平。用适当的荧光对温度-时间的图来监控这种降低，以便确定第一导来值，由此可观察到荧光降低的最大值。
所有基于探针的检测形式可以是“多重的”。更准确地说，在一个反应容器中，可用多对扩增引物扩增多个靶，并用多个杂交探针进行检测。在这种情况下，用不同的可检测的荧光染料标记所述的多个探针，以便检测和区别被假设存在于样品中的多个靶。
对于用FRET杂交探针形式的多重检测，使用荧光素或荧光素衍生物作为与不同的FRET受体部分，例如Cy-5、LC-Red-640或LC-Red 705组合的FRET供体部分是可能的。
能够进行多重实时PCR的设备的一般实例是Roche DiagnosticsLightCycler(Cat.No.3 531 414 201)。它是能够进行动力学即时PCR定量以及随后分析PCR产物的熔解曲线的快速PCR系统。目前可商业购买的LightCycler版本2.0的光学系统包含一个光源，蓝色发光二极管(470nm LED)和6个检测通道。确定所有待分析的反应的限定信号阈值，且对于靶核酸以及参照核酸，例如标准或管家基因确定达到这个阈值需要的循环数Cp。可根据所获得的靶核酸和参照核酸的Cp值确定靶分子的绝对或相对拷贝数。
通过一组分色镜和滤色片将样品发射的荧光分开成为可在6个检测通道之一中记录的不同波长。由于荧光化合物是从市场上可获得的，这使得能够进行对双链DNA结合染料SybrGreen I的检测、使用TaqMan探针形式的双色检测和使用杂交探针(HybProbe)形式的4色检测。在WO 97/46707、WO 97/46712和WO 97/46714中公开了LightCycler系统的细节。
然而，已经观察到关于多重测定的主要缺陷。倘若利用多个引物对来扩增多个扩增子，经常观察到荧光的降低。
因此，本发明的技术问题是改善定量实时PCR扩增的性能并在后期扩增循环提供随后的熔解曲线分析。
发明概述
本发明基于焦磷酸酶的存在可在实时PCR实验期间甚至在后期循环稳定荧光信号的令人惊讶的观察。
因此，在第一个方面，本发明涉及使用焦磷酸酶稳定至少第一荧光实体的用途，其中该荧光实体存在于用于在热循环过程期间扩增和检测至少第一靶核酸的组合物中。
在第二个方面，本发明涉及用于扩增和检测靶核酸的组合物，其包括
-热稳定的DNA聚合酶
-脱氧核苷三磷酸的混合物
-缓冲液
-至少两种扩增引物
-至少一种用第一荧光实体标记的第一杂交探针，
其特征在于所述的组合物还包括焦磷酸酶。
优选地，焦磷酸酶是热稳定的焦磷酸酶。
在本文中，本发明也涵盖进一步包括被假设将得到扩增的各自靶核酸的组合物。
在具体的实施方案中，组合物包括至少一种用第二荧光实体标记的第二杂交探针，其中所述的第一和第二杂交探针一起构成FRET杂交探针对。
在第三个方面，本发明也涉及用于扩增和检测至少第一靶核酸的方法，其包括
-提供如上所述用于扩增和检测靶核酸的组合物
-将所述的组合物与被假设含有至少第一靶核酸的样品混合
-使产生的混合物经受热循环方案，以及
-通过监控杂交依赖性的荧光的方式来检测所述靶核酸的扩增产物。
在具体的实施方案中，根据本发明的方法能够进行多重实时PCR。如果这样，那么所述的组合物包括多个杂交探针，其能够与至少2种、优选3-4种以及最优选3-6种不同的扩增靶进行杂交。
在第四个方面，本发明涉及试剂盒，其包括
-热稳定的DNA聚合酶
-脱氧核苷三磷酸的混合物
-缓冲液
-至少两种扩增引物
-至少一种用第一荧光实体标记的第一杂交探针，和
-优选是热稳定的焦磷酸酶的焦磷酸酶。
在具体的实施方案中，这种试剂盒进一步包括至少一种用第二荧光实体标记的第二杂交探针，其中所述的第一和第二杂交探针一起构成FRET杂交探针对。
发明详述
在多重测定中，实时定量的荧光值可能在后期循环下降到低于最初的背景荧光。发生这种效应可能是由于影响缓冲液条件的高DNA/扩增子浓度，其由在荧光素通道530的荧光降低反映出来。
对于在多重实验中作为FRET供体部分的荧光素的发射，经常观察到2个阶段的降低。这依次削弱了荧光素在荧光共振能量转移过程中作为FRET供体起作用的能力，结果任何FRET受体部分的荧光发射受到影响。
在存在焦磷酸酶时，荧光素发射的降低是1个阶段的，表明在后期扩增循环，信号降低效应至少部分地得到了补偿。可通过下列理由来解释这种补偿：
在扩增反应期间，当核苷三磷酸整合到产生的扩增子上时，释放焦磷酸(PPi)：
Figure C20051009991100081
然而PPi浓度增加，导致反应混合物的pH降低，已知这反过来一般将影响荧光染料，特别是荧光素的稳定性(“spectrophotometricdetermination of pKa values for fluorescein using activity coefficientcorrections”，Smith，S.A.，Pretorius，W.A.，Water SA 28(2002)395-402；“Studies on Fluorescein-VII：The Fluorescence of Fluorescein as afunction of pH”；Diehl，H.和Markuszewski，R.，Talanta 36(1989)416-418)。
当加入热稳定的焦磷酸酶(PPase)时，焦磷酸将被转化为正磷酸(Pi)。
PPi                    Pi
在液体溶液中，释放的正磷酸形成平衡：
Figure C20051009991100092
(80％)            (20％)
由于这种平衡，特别是在酸性液体中，pH增加并且例如荧光素的荧光化合物可保持稳定。
因此，在第一个方面，本发明涉及使用焦磷酸酶稳定组合物中的至少第一荧光实体，其中该组合物用于在热循环过程期间扩增至少第一靶核酸。
优选焦磷酸酶是具有高于37℃的最适活性的热稳定焦磷酸酶，其能抗热循环过程并且在超过40个的扩增循环中稳定地保持其活性。在EP 763599中公开了合适的热稳定焦磷酸酶的一个实例。
可向组合物加入焦磷酸酶，产生至少0.005U/μl，但不超过0.5U/μl的终浓度。优选地，加入终浓度为大约0.01U/μl至0.1U/μl的焦磷酸酶。已经确定终浓度为大约0.04U/μl的焦磷酸酶是最适的。
如上文理论解释的，在扩增反应期间添加焦磷酸酶，导致在扩增步骤期间减弱或甚至完全防止pH降低，特别是在多重实验中扩增不同的靶时。这种效应稳定了存在于扩增反应混合物内的基本上任何类型的荧光探针的荧光实体，包括但不限于TaqMan探针、分子信标、单标记探针和FRET杂交探针对。特别的，添加焦磷酸酶对于可起FRET供体部分作用的荧光素或其它荧光化合物的稳定化是极为有利的。
此外，在包含至少两种或更多种不同杂交探针的多重组织的情况中，添加焦磷酸酶是极为有利的。这特别的适用于多重FRET杂交探针，其特征在于使用荧光素作为多对FRET杂交探针的一个且唯一的供体成分。
在这个方面，需要注意的是为了其他的目的，本领域中先前已经使用焦磷酸酶进行模板依赖性的核酸扩增：
EP 763 599公开了使用热稳定的焦磷酸酶作为PCR中的添加剂来改善整体的扩增效率。相似地，DE 19612779公开了使用焦磷酸酶来扩增特别长的DNA模板序列。US 6,225,092公开了在直接的扩增测序反应中加入焦磷酸酶的好处。最后US 2003/0049655公开了使用焦磷酸盐作为PCR反应混合物的添加剂来防止室温下非特异的引物延伸，以及随后添加焦磷酸酶来除去相应的盐。然而这些参考文献和根据本发明人的最佳认识的其他现有技术的参考文献中都没有预期或暗示可使用焦磷酸酶作为实时PCR的添加剂。
在第二个方面，本发明涉及用于扩增和检测靶核酸的组合物，其包括
-热稳定的DNA聚合酶
-脱氧核苷三磷酸的混合物
-缓冲液
-至少一对的两种扩增引物
-至少一种用第一荧光实体标记的第一杂交探针，
其特征在于所述的组合物还包括焦磷酸酶。
优选地，焦磷酸酶是热稳定的焦磷酸酶。同样优选的，所述焦磷酸酶存在的终浓度为至少0.005U/μl，但不超过0.5U/μl。更优选地，终浓度为大约0.01U/μl至0.1U/μl，以及终浓度为大约0.04U/μl是最适的。
热稳定的DNA聚合酶可以是任何种类的本领域已知的天然的、重组的和/或化学修饰的DNA聚合酶，其能够进行PCR扩增反应。这包括例如Taq聚合酶或能够扩增任何种类的双链靶DNA的任何其他聚合酶。此外，这包括具有相当大程度的逆转录酶活性的热稳定DNA聚合酶，例如来自US 5,618,711所公开的嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)的DNA聚合酶。
特别的，DNA聚合酶可包括如US 5,677,152和US 5,773,258中所公开的化学修饰。在这些参考文献中公开的酶包含共价的、但热不稳定的修饰，其使酶在扩增的第一循环之前失活，由此导致所谓的热启动(Hot Start)效应。
核苷酸的混合物通常包括大约等摩尔量的dATP、dGTP、dCTP和dTTP，其足以提供足够的单体离析物来用于扩增反应。也可使用dUTP来代替dTTP。此外，该混合物可另外包括任何种类的碱基类似物d-NTPs或非核苷的碱基类似物dNTPs。
除了适当的缓冲液外，组合物可进一步包括用于最优化热稳定聚合酶的酶活性的无机离子、盐或化合物，或优选的热稳定的焦磷酸。此外，这些化合物可增加引物退火的特异性。优选的，组合物包括MgCl2，其浓度范围为1至5mM MgCl2。
至少一对扩增引物是寡核苷酸对，其中的两个成员以相反的方向与靶核酸序列结合。可利用本领域公知的常规的亚磷酰胺化学反应来制备这种寡核苷酸。此外这种技术容许整合修饰或标记的核苷酸，只要可得到适当的亚磷酰胺。
在特定的实施方案中，本发明的组合物可包括多对扩增引物，优选的是2、3、4或5-6对扩增引物，其能够扩增被假设存在于待分析的样品中的不同靶序列。
根据本发明的组合物包含至少一种用第一荧光实体标记的第一杂交探针。这种杂交探针可以是用于实时PCR的任何种类的杂交探针，例如TaqMan探针、分子信标、单标记探针。在具体的实施方案中，组合物包括至少一种用第二荧光实体标记的第二杂交探针，其中所述的第一和第二杂交探针一起构成FRET杂交探针对。换言之，根据本发明的组合物也可包括至少一对FRET杂交探针。
根据本发明的组合物也可包括2、3、4、5-6或甚至更多与不同的靶核酸序列杂交的不同标记的杂交探针。同样在本发明的范围内，组合物可包括2、3、4或5-6对FRET杂交探针，其特征在于每对FRET杂交探针与不同的核酸序列杂交。优选的，所述的多对杂交探针的所有FRET供体部分都是相同的。最优选的，所有的供体部分都是荧光素。
当与待分析的样品混合时，可使用上文公开的所有发明的组合物来扩增和检测一种或多种被假设存在于所述样品中的靶核酸序列。在本文中，本发明也涵盖了包括除存在于上文公开的组合物中的成分外，进一步包括各自的靶核酸序列或被假设将得到扩增的靶核酸序列的组合物。
在另一个方面，本发明也涉及用于制备根据本发明的组合物的试剂盒。
更准确地说，这种试剂盒至少包括
(i)热稳定的DNA聚合酶
(ii)脱氧核苷三磷酸的混合物
(iii)缓冲液
(iv)至少两种扩增引物
(v)至少一种用第一荧光实体标记的第一杂交探针，和
(vi)优选是热稳定的焦磷酸酶的焦磷酸酶。
可在不同的容器中分别单独贮藏不同的成分。备选地，可将不同的成分一起储藏在一个贮藏容器中。同样备选地，可只将成分(i)至(vi)的亚群的任意选择的组合贮藏在一起。在优选的实施方案中，将成分(ii)、(iii)、(iv)和(v)贮藏在一起，而将成分(i)和(vi)各自分开贮藏。在另一个优选的实施方案中，将(i)、(ii)、(iii)和(iv)和(v)贮藏在一起。
在另一个实施方案中，这种试剂盒包括多对扩增引物，优选的为2、3、4或5-6对扩增引物，以及各自2、3、4或5-6种不同标记的杂交探针，其不局限于而选自TaqMan探针、分子信标和单标记探针。
在另一个具体的实施方案中，这种试剂盒进一步包括至少一种用第二荧光实体标记的第二杂交探针，其中所述的第一和第二杂交探针一起构成FRET杂交探针对。此外，这种试剂盒可包括与2、3、4或5-6对FRET杂交探针一起的2、3、4或5-6对扩增引物，其特征在于每对FRET杂交探针与由不同对的扩增引物扩增的不同核酸序列杂交。优选的，所述的多对杂交探针的所有FRET供体部分都是相同的。最优选的，(至少一个、几个或所有)供体部分都是荧光素。
在非常具体的实施方案中，根据本发明的试剂盒可进一步包括计算机可读的存储介质，其包括“色彩补偿文件(color compensationfile)”。这种色彩补偿文件是用于补偿可能在多重实验中发生的不同检测通道之间的色彩亮度干扰的方式。换言之，使在每个实验中得到的数据经过特殊的数学处理，以便于记录不同检测通道之间的色彩亮度干扰。
在进一步的方面，本发明也涉及用于扩增和检测至少第一靶核酸的方法，其包括
-提供用于扩增和检测靶核酸的组合物，其包括
-热稳定的DNA聚合酶
-脱氧核苷三磷酸的混合物
-缓冲液
-至少两种扩增引物
-至少一种用第一荧光实体标记的第一杂交探针，
-优选是热稳定的焦磷酸酶的焦磷酸酶
-将所述的组合物与被假设含有至少第一靶核酸的样品混合
-使产生的混合物在实时热循环仪设备中经受热循环方案，以及
-通过监控杂交依赖性的荧光的方式来检测所述靶核酸的扩增产物。
为了进行根据本发明的方法，可使用上文公开的所有组合物和试剂盒。特别的，根据本发明的方法能够进行多重实时PCR。如果是这种情况，那么所述的组合物包括多个杂交探针，其能够与至少2种、优选3-4种以及最优选3-6种不同的扩增靶杂交。
该新方法特别适用于利用多对FRET杂交探针的多重PCR实验，特别是如果所有的FRET供体化合物都是相同的话，例如如果所有的FRET供体化合物都是荧光素的话。
附图简述
图1-5：4重PCR管家基因：β2M(通道610)、PBGD(通道640)、HPRT(通道670)、G6PDH(通道705)，虚线：没有焦磷酸酶；实线：具有0.8U的焦磷酸酶
图1：通道530：荧光素发射
图2：通道610：LC-Red 610发射
图3：通道640：LC-Red 640发射
图4：通道670：Cy-5发射
图5：通道705：LC-Red 705发射
提供下列实施例、参考文献、序列表和附图以帮助理解本发明，在所附的权利要求书中阐明本发明的真实范围。可以理解可在所阐明的步骤中进行改变而不背离本发明的精神。
实施例
实施例1：
在LightCycler 2.0设备中使用FRET杂交探针形式的4-重PCR
对于在Light Cycler2.0设备(Roche Applied Science Cat.No.3531 414 201)中扩增和检测4种不同的管家基因h-PBGD、h-β2-M、h-G6PDH和hHPRT，使用具有根据Roche Applied Science Cat.No.3146 073、3 146 081、3 261 883和3 261 891的序列的引物和探针。在存在或不存在0.8单位的热稳定焦磷酸酶(Calbiochem Cat.No.：405822)时进行扩增。
首先，制备10×检测混合物：
β2M(β2微球蛋白)
  终浓度
  H<sub>2</sub>O
  β2M正向引物   5μmol
  β2M反向引物   5μmol
  β2M荧光素探针   2μmol
  β2M LC Red610探针   2μmol
HPRT(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶)
  终浓度
  H<sub>2</sub>O
  HPRT正向引物   3μmol
  HPRT反向引物   3μmol
  HPRT荧光素探针   2μmol
  HPRT Cy-5探针   2μmol
G6PDH(葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶)
  终浓度
  H<sub>2</sub>O
  G6PDH正向引物   5μmol
  G6PDH反向引物   5μmol
  G6PDH荧光素探针   2μmol
  G6PDH LC Red705探针   2μmol
PBGD(胆色素原脱氨基酶)
  终浓度
  H<sub>2</sub>O
  PBGD正向引物   3μmol
  PBGD反向引物   5μmol
  PBGD荧光素探针   2μmol
  PBGD LightCycler Red 640探针   2μmol
已经利用荧光素-CPG(Roche Applied Science Cat.No.3 138187)、LC-Red-610(Roche Applied Science Cat.No.3 561 488)、LC-Red-640(Roche Applied Science Cat.No.2 015 161)、LC-Red-705(Roche Applied Science Cat.No.2 157 594)和Cy-5-NHS-酯(Amersham Cat.No.27179901)或Cy-5亚磷酰胺(Amersham Cat.No.PA 15100)，根据亚磷酰胺化学反应的标准方案合成引物和探针。
对于每个毛细管，在20μl的总体积中，将4μl5×主混合物(MasterMix)(Multiplex Master Roche Applied Science Cat.No.04 340 019001)与0.8μl 25mM MgCl2和各2μl的10×检测混合物、4μl含有逆转录自Roche Applied Science Cat.No.为3 146 073、3 146 081、3261883和3 261 891的RNA标准的各自DNA的大约105个拷贝的人cDNA混合。在每个第二等分试样中，加入0.8μl热稳定的焦磷酸酶(1U/μl，Calbiochem Cat.No.：405822)产生0.04U/μl的终浓度。
各自的移液方案如下：
  没有焦磷酸酶的每个毛细管   有焦磷酸酶的每个毛细管
  5×LightCycler Multiplex DNA MasterHybProbe(Cat.No.04 340 019 001)   4μl   4μl
  MgCl<sub>2</sub>(25mM)   0.8μl   0.8μl
  10×检测混合物β2M   2μl   2μl
  10×检测混合物HPRT   2μl   2μl
  10×检测混合物G6PDH   2μl   2μl
  10×检测混合物PBGD   2μl   2μl
  cDNA，逆转录自Roche Applied ScienceCat.No.为3 146 073、3 146 081、3 261883和3 261 891的RNA标准的各自DNA的10<sup>5</sup>个拷贝   4μl   4μl
  焦磷酸酶(1U/μl，Calbiochem  Cat.No.：405822) -   0.8μl
  H<sub>2</sub>O   3.2μl   2.4μl
  总计   20μl   20μl
根据下列方案进行实时的热循环和检测：
  变性   1×   95℃   600s   20℃/s   -
  扩增   45×   95℃   10s   20℃/s   -
  55℃   10s   20℃/s   单个
  72℃   10s   20℃/s   -
  冷却   1×   40℃   30s   20℃/s   -
图1-5中显示了来自不同检测通道的荧光发射，其特征在于其中的实线表示含有焦磷酸酶的样品，而虚线表示不含有焦磷酸酶的样品。
图1中显示了所有4对不同的FRET杂交探针的FRET供体部分的荧光素发射。如在该图中所看到的，可测量到2个阶段的降低，而在存在0.8U的焦磷酸酶时，只有1个降低阶段。因此在后期扩增循环，焦磷酸酶至少能够部分地稳定荧光素。
在图2-5超过45个循环的扩增中，显示在存在或不存在焦磷酸酶时，不同FRET受体部分的发射，其指示了4种不同管家基因的扩增和检测(图2，通道610(h-β2-M)、图3，通道640(PBGD)、图4，通道670(HPRT)和图5，通道705(G6PDH))。
从图中可以看出，在没有焦磷酸酶的样品中，所有4个通道中荧光信号在大约35个扩增循环达到顶峰，随后下降。这种效应在包括对于用LC-Red 610(图2)、LC-Red 640(图3)和LC-Red 705(图5)标记的FRET供体探针的额外0.8U焦磷酸酶的样品中得到完全补偿，而对于用Cy-5标记的探针(图4)基本上得到补偿。因此，添加焦磷酸酶能够在后期扩增循环稳定不同FRET受体部分的信号，这可能是由于稳定了FRET供体荧光素。
实施例2：
在LightCycler 2.0设备中使用FRET杂交探针形式的3-重PCR
在与实施例1基本相同的条件下，进行3-重实时PCR实验以便于分别从1×106拷贝的质粒DNA扩增3种不同的序列。使用购自Roche Applied Science(Cat.No.1 721 992)的热稳定焦磷酸酶。用针对利用LC-Red 640作为荧光受体部分检测因子II DNA，以及针对2种hHFE同工型，即利用Cy-5作为荧光受体部分的HFE845和利用LC-Red 705作为荧光受体部分的HFE187的适当引物和探针进行PCR。用末端磷酸部分在其各自的3’末端封闭携带5’受体部分的探针。
对这3种靶，使用下列引物和探针：
凝血酶原(因子II)登录号AF478696
FII正向引物5`cca atc ccg tga aag aat tat 3`SEQ.ID.NO：1
FII反向引物5`agg tgg tgg att ctt aag tc 3`SEQ.ID.NO：2
FII荧光素探针5`gag cat tgt ggc tcg ctg ag-Fluos 3`SEQ.ID.NO：3
FII LC Red 640探针5`LC Red 640-cac ttt tat tgg gaa cca tag ttt tag aaa casc aa-Phos 3`SEQ.ID.NO：4
HFE 187登录号Z92910
  HFE 187正向引物5`gcc tca gag cag gac ctt gg 3`SEQ.ID.NO：5
  HFE 187反向引物5`cag ctg ttt cct tca aga tgc 3`SEQ.ID.NO：6
  HFE 187荧光素探针5`ctt gaa att cta ctg gaa acc cat gga gtt cgg ggc tcc-Fluos 3`SEQ.ID.NO：7
  HFE 187 LC Red 705探针5`LC Red 705-cac ggc gac tct cat cat cat aga aca cga aca-Phos 3`SEQ.ID.NO：8
HFE 845登录号Z92910
  HFE 845正向引物5`-tgg caa ggg taa aca gat cc-3`SEQ.ID.NO：9
  HFE 845反向引物5`-ctc agg cac tcc tct caa cc-3`SEQ.ID.NO：10
  HFE 845荧光素探针5`-aga tat acg tac cag gtg gag-Fluos 3`SEQ.ID.NO：11
  HFE 845Cy5探针5`Cy5-ccc agg cct gga tca gcc cct cat tgt gat ctg gg-Phos 3`SEQ.ID.NO：12
同样在这个实验中，可通过添加0.8单位的焦磷酸酶补偿后期扩增循环荧光信号的下降，其对于LC-Red 640和LC-Red 705发射是完全补偿的，而对于Cy-5发射是基本上补偿的。
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<160>12
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>FII正向引物
<400>1
ccaatcccgt gaaagaatta t                                    21
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>FII反向引物
<400>2
aggtggtgga ttcttaagtc                                      20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>FII荧光素探针
<400>3
gagcattgtg gctcgctgag                                      20
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>FII LC Red 640探针
<400>4
cacttttatt gggaaccata gttttagaaa cascaa                    36
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>HFE 187正向引物
<400>5
gcctcagagc aggacc ttgg                                     20
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>HFE 187反向引物
<400>6
cagctgtttc cttcaagatg c                                    21
<210>7
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>HFE 187荧光素探针
<400>7
cttgaaattc tactggaaac ccatggagtt cggggctcc                 39
<210>8
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>HFE 187LC Red 705探针
<400>8
cacggcgact ctcatcatca tagaacacga aca                       33
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>HFE 845正向引物
<400>9
tggcaagggt aaacagatcc                                      20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>HFE 845反向引物
<400>10
ctcaggcact cctctcaacc                                    20
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<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>HFE 845荧光素探针
<400>11
agatatacgt accaggtgga g                                  21
<210>12
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>HFE 845 Cy5探针
<400>12
cccaggcctg gatcagcccc tcattgtgat ctggg                   35

Claims (12)

1.一种用于扩增和检测靶核酸的组合物，其包括
-热稳定的DNA聚合酶
-脱氧核苷三磷酸的混合物
-缓冲液
-至少两种扩增引物
-至少一种用第一荧光实体标记的第一杂交探针，
其中所述的组合物还包括焦磷酸酶。
2.根据权利要求1的组合物，其中所述的焦磷酸酶是热稳定的焦磷酸酶。
3.根据权利要求1-2中任一项的组合物，
进一步包括至少一种用第二荧光实体标记的第二杂交探针，其中所述的第一和第二杂交探针一起构成FRET杂交探针对。
4.根据权利要求1-2中任一项的组合物，进一步包括模板核酸。
5.一种试剂盒，其包括
-热稳定的DNA聚合酶
-脱氧核苷三磷酸的混合物
-缓冲液
-至少两种扩增引物
-至少一种用第一荧光实体标记的第一杂交探针，
其中所述的试剂盒还包括焦磷酸酶。
6.根据权利要求5的试剂盒，
进一步包括至少一种用第二荧光实体标记的第二杂交探针，其中所述的第一和第二杂交探针一起构成FRET杂交探针对。
7.根据权利要求5-6中任一项的试剂盒，
进一步包括包含色彩补偿文件的计算机可读的存储介质。
8.一种用于扩增和检测至少第一靶核酸的方法，其包括
-提供根据权利要求1-3中任一项的组合物，
-将所述的组合物与被假设含有至少第一靶核酸的样品混合
-使产生的混合物经受热循环方案
-通过监控杂交依赖性的荧光的方式来检测所述靶核酸的扩增产物。
9.根据权利要求8的方法，其特征在于，
所述的组合物包括多个杂交探针，其能够与至少2种不同的扩增产物杂交。
10.根据权利要求8的方法，其特征在于，
所述的组合物包括多个杂交探针，其能够与3-6种不同的扩增产物杂交。
11.根据权利要求8的方法，其特征在于，
所述的组合物包括多个杂交探针，其能够与3-4种不同的扩增产物杂交。
12.焦磷酸酶用于稳定至少第一荧光实体的用途，其中该荧光实体存在于用于在热循环过程期间扩增至少第一靶核酸的组合物中。
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