CN102770556B - 靶区分性探针及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶区分性探针(TD探针)及其用途或者应用。上述靶区分性探针均通过5’‑第二次杂交部位及3’‑第一次杂交部位与靶核酸序列杂交。靶区分性探针(TD探针)与非‑靶核酸序列进行杂交时，5’‑第二次杂交部位及分离部位均不与非‑靶核酸序列杂交，因此这两个部位形成单链，这起因于低的Tm值。如上所述，上述靶区分性探针(TD探针)分别对于靶核酸序列及非‑靶核酸序列明确表示相互不同的杂交模式，由此通过更加高的特异性来区分靶核酸序列与非‑靶核酸序列。

Description

靶区分性探针及其用途
【技术领域】
本发明涉及一种靶区分性探针(TD探针)及其用途。
【背景技术】
DNA杂交(hybridization)是分子生物学的基本的过程。利用DNA杂交的许多技术将会成为非常有用于特定靶序列检测的用具，将会明确有助于临床诊断、基因研究及法医学上的实验分析。
由于DNA杂交受到如盐浓度、温度、有机溶剂、碱基结构、互补的链的长度及杂交的核酸之间的核苷酸碱基(nucleotide base)错配(mismatch)个数等许多条件的影响，因此，最近为了提高寡核苷酸(oligonucleotide)杂交的特异性付出许多努力(Maniatis etal.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Laboratory，1982and Sambrook et al.，1989)。过去10年间提出了许多方法；使DNA碱基实现化学变形来进行高敏感度的杂交的方法(Azhikina et al.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，90：11460-11462)以及杂交后长时间在低温下实施清洗来强化错配区分能力的方法(Drmanacet al.，(1990)DNA and Cell Biology，9：527-534)。最近，为了提高基于DNA杂交的单核苷酸多态性(SNPs：single nucleotide polymorphisms)的析像能力，介绍了利用人为性错配的其他方法(Guo et al.，(1997)Nature Biotechnology，15：331-5)。并且，包括美国专利第6,077,668号、第6,329,144号、第6,140,054号、第6,350,580号，第6,309,824号，第6,342,355号以及6,268,128号的许多专利公开了用于杂交的探针及其应用。
为了检测利用探针的靶序列，提出了许多方法。在这种类型的方法中，有很多是利用杂交探针和核酸分解酶(nucleolytic enzymes)的方法。TaqManTM探针方法是利用这种原理的典型的例子之一。TaqManTM探针一般是包含位于5’-末端的荧光染料(fluorescentdye)、位于3’-末端的猝灭染料(quenching dye)的寡核苷酸(oligonucleotide)。如果进行照射(irradiation)，激发(excitation)的荧光染料则将能量转移到邻近的猝灭染料上，因此不显示荧光。TaqManTM探针制备为在聚合酶链式反应(PCR)产物的内部部位进行杂交。PCR期间，如果结合有TaqManTM探针的模板复制到聚合酶，聚合酶的5’→3’外切核酸酶(exonuclease)活性则会切割探针。这将会分离荧光染料及猝灭染料，并且不再发生荧光共振能量转移((FRET：fluorescence resonance energy transfer)。荧光在每个循环与探针切割比率成正比例地增加(Parashar et al，Indian J Med Res124：385-398(2006))。即，TaqManTM探针方法的特征在于利用基于杂交及聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的切割反应。但是，这技术自身具有固有的界限。由于TaqManTM探针方法是探针和靶序列之间的杂交必然伴随的过程，因此该方法的最重大的问题是探针的非特异性杂交(non-specifichybridization)。尤其，该方法出现假阳性(false positive)信号(结果)的可能性很高，，特别是在多个靶序列的多重检测(multiplex detection)出现假阳性信号的可能性很高。
对于靶序列的检测的再一个接近法是利用探针连接(ligation)的接近法(D.Y.Wu，et al.，Genomics 4：560(1989)，U.Landegren，et al.，Science 241：1077(1988)，and E.Winn-Deen，et al.，Clin.Chem.37：1522(1991))。连接反应视为用于检测点突变(point mutation)的有用的用具。在寡核苷酸连接分析(OLA：oligonucleotideligation assay)中，生成(spanning)所关注的靶部位的两个探针与靶部位进行杂交。探针与邻近的靶碱基进行杂交时，探针的对置的末端可以通过连接，例如连接酶(ligase)处理进行连接。连接的探针表示靶序列的存在。据报告，DNA连接酶在连接位点用作DNA基质和错配核苷酸的键合(Luo J，et al.，Nucleic acid res 24：3071(1996))。在基于连接的靶检测方法(ligation-based target detection)中，防止与靶序列结合的探针的非特异性结合的DNA连接酶也成了需要解决的问题。并且，连接反应需要发生成更高的特异性，例如，连接反应需要发生成连接部位分别单一错配核苷酸的程度的特异性。
对于同时检测对于多个基因或者多个基因族群(population)的各自的存在、水准或者表达模式的有用的方法的必要性逐渐增大。用于这种目的的最有用的方法之一是基于微阵列的技术(Schena et al.，1995.Quantitative Monitoring of Gene ExpressionPatterns with a Complementary DNA Microarray，Science，270：467-470；DeRisi etal.，1996，Use of a cDNA Microarray to Analyse Gene Expression Patterns inHuman Cancer，Nature Genetics 14：457-460)。到现在为止公开的基于微阵列的技术(Microarray-based technologies)是关于检测基因或者核苷酸变异及其表达模式分析的技术。
基于微阵列的技术一般利用与靶核酸的特异性的核酸序列互补的单链寡核苷酸(核酸探针)。但是，以往的DNA微阵列大部分为了检测靶核苷酸序列依赖于杂交，因此高比率的假阳性是极其严重的缺点。特别是，利用许多数量的探针时，不能除外交叉杂交(crosshybridization)的发生。该交叉杂交对数据质量(data quality)有极端的影响，并且引起假阳性/假阴性(false positive/false negative)结果。此外，微阵列需要许多液相制备步骤，且为了单一核苷酸错配的分别应该谨慎地调节反应温度及清洗。证明出了由于多个探针序列间的相互不同的适当杂交条件，基于此接近法的多路复用(multiplexing)十分难以实现(William E.Bunney，et al.2003.Microarray Technology：A Review of NewStrategies to Discover Candidate Vulnerability Genes in PsychiatricDisorders，Am.J.Psychiatry 160：4，657-666)。
虽然对于各方法不断介绍改善的接近法，但是包括这样的寡核苷酸杂交过程的所有方法及技术由于受到寡核苷酸杂交的非特异性带来的限制及问题的影响，因此还不能完全而顺畅地实现。
在本说明书全文中参照多个专利及文献，其引用由括号来表示。这样的专利及文献，作为参照全部包括在本说明书中，因此能够更加明确地说明本发明所属的技术领域的水准及本发明的内容。
【发明概述】
在这种情况下，本发明者认识到了为了克服现有技术的问题，应该提供能够以与现有探针不同的杂交方式与靶序列进行特异的杂交的新颖的探针。特别是，本发明者判断出上述新颖的探针尽管在基于核酸酶的核酸切割反应，还是在连接反应中都应具有独特的靶-区分能力。
本发明者为了开发能够使靶核酸序列的检测或者识别变得更加简便且能够没有假阳性及假阴性结果地检测的技术而锐意研究努力。其结果，由于靶核酸序列与非-靶核酸序列的相互不同的杂交模式，本发明者制备了具有用于区分靶核酸序列与非-靶核酸序列的固有的能力的新颖的靶区分性探针。并且，通过上述新颖的靶区分性探针，本发明者提出了在液相(liquid phase)及固相(solid phase)的反应系统中都能够应用的靶核酸序列检测方案。
因此，本发明的目的在于，提供一种区分靶核酸序列与非-靶核酸序列的靶区分性探针(target discriminative probe，TD probe)。
本发明的再一目的在于，提供一种在液相或者固相中，从基于利用靶区分性探针的5’→3’外切核酸反应的DNA或者从核酸混合物检测靶核酸序列的方法。
本发明的另一目的在于，提供一种利用靶区分性探针及聚合酶链式反应(PCR：polymerase chain reaction)，从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法。
本发明的还有一个目的在于，提供一种从基于利用靶区分性探针的连接反应的DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的方法。
本发明的又一目的在于，提供一种用于从DNA或者核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒。
本发明的其他目的及优点通过所附的权利要求书及附图，将会变得更加明确。
【附图说明】
图1表示利用双重-标记靶区分性探针及具有5’→3’外切核酸酶活性的酶的靶核酸序列与非-靶核酸序列的区分。上述靶区分性探针在其5’-第二次杂交部位具有荧光报道分子，在其3’-第一次杂交部位具有猝灭分子。
图2表示利用双重-标记靶区分性探针及具有5’→3’外切核酸酶活性的酶的靶核酸序列与非-靶核酸序列的区分。上述靶区分性探针在其5’-第二次杂交部位均具有报道分子及猝灭分子。
图3表示在5’-第二次杂交部位均具有报道分子及猝灭分子的双重-标记靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，利用具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶的实时聚合酶链式反应(PCR：Polymerase Chain Reaction)中不产生信号。
图4表示在固相中利用单一标记固定化靶区分性探针及具有5’→3’外切核酸酶活性的酶的靶核酸序列与非-靶核酸序列的区分。图4A表示在固定化靶区分性探针的靶-特意杂交中荧光信号强度的变化。图4B表示在固定化靶区分性探针的非-靶杂交中没有荧光信号强度的变化。
图5表示在固相中利用双重-标记固定化靶区分性探针及具有5’→3’外切核酸酶活性的酶的靶核酸序列与非-靶核酸序列的区分。图5A表示在固定化靶区分性探针的靶-特异性杂交中的信号的产生。图5B表示在固定化靶区分性探针的非-靶杂交中没有信号的产生。
图6表示在固相中作为单一标记第一次探针利用非-固定化寡核苷酸、作为单一标记第二次探针利用固定化靶区分性探针及连接酶来区分靶核酸序列与非-靶核酸序列。图6A表示在靶-特异性杂交中的第一次探针及第二次探针之间的连接。图6B表示在非-靶杂交中没有发生探针的连接。
图7表示在作为单一标记第一次探针利用非-固定化寡核苷酸、作为非-标记第二次探针利用固定化靶区分性探针及连接酶的固相中的靶-特异性杂交中的连接。
图8表示对5’-末端错配探针的具有5’→3’外切核酸酶活性的酶的切割活性的结果。符号1)模板为对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因的合成寡核苷酸；2)探针在其5’-末端具有报道分子，在其3’-末端部位具有猝灭分子；3)SA_P0在其5’-末端部位具有匹配序列；4)SA_P1在其5’-末端具有单一错配核苷酸；5)SA_P3在其5’-末端部位具有三个错配核苷酸；6)SA_P6在其5’-末端部位具有六个错配核苷酸；7)SA_P9在其5’-末端部位具有九个错配核苷酸。
图9表示根据双重-标记靶区分性探针的5’-第二次杂交部位的杂交的靶核酸序列与非-靶核酸序列的区分的结果。图9A及图9B分别表示金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)基因及淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)基因的检测。在图9A中，符号1)模板为对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因的合成寡核苷酸；2)靶区分性探针在其5’-末端具有报道分子，在其3’-第一次杂交部位具有猝灭分子；3)SA_TD_M在其5’-第二次杂交部位具有匹配序列；4)SA_TD_m在其5’-第二次杂交部位具有错配序列。图9B中，符号：1)模板为对淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)基因的合成寡核苷酸；2)靶区分性探针在其5’-末端具有报道分子，在其3’-第一次杂交部位具有猝灭分子；3)NG_TD_M在其5’-第二次杂交部位具有匹配序列；4)NG_TD_m在其5’-第二次杂交部位具有错配序列。
图10表示对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因的检测的靶区分性探针及现有探针间的比较结果。符号，1)模板为对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因的合成寡核苷酸；2)探针在其5’-末端具有报道分子，在其3’-末端部位具有猝灭分子；3)SA_TD_M为靶区分性探针，在其5’-第二次杂交部位具有匹配序列；4)SA_TD_m1为靶区分性探针，在其5’-第二次杂交部位具有三个错配核苷酸；5)SA_Con_M为现有探针，在其5’-末端部位具有匹配序列；6)SA_Con_m1为现有探针，在其5’-末端部位具有三个错配核苷酸。
图11表示为了检测靶核酸序列而利用在5’-第二次杂交部位均具有报道分子及猝灭分子的靶区分性探针的实时聚合酶链式反应(PCR)的结果。图11A及图11B分别表示金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因及淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)基因的检测。在图11A中，符号：1)模板为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的基因组DNA；2)靶区分性探针在其5’-第二次杂交部位均具有报道分子及猝灭分子；3)SA_TD2_M在其5’-第二次杂交部位具有匹配序列；4)SA_TD2_m在其5’-第二次杂交部位具有错配序列。在图11B中，符号：1)模板为淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)基因组DNA；2)靶区分性探针在其5’-第二次杂交部位均具有报道分子及猝灭分子；3)NG_TD2_M在其5’-第二次杂交部位具有匹配序列；4)NG_TD2_m在其5’-第二次杂交部位具有错配序列。
图12表示为了区分单一核苷酸错配而利用在5’-第二次杂交部位均具有报道分子及猝灭分子的靶区分性探针的实时聚合酶链式反应(PCR)的结果。符号，1)模板为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的基因组DNA；2)靶区分性探针在其5’-第二次杂交部位均具有报道分子及猝灭分子；3)SA_TD_S_M在其5’-第二次杂交部位具有匹配序列；4)SA_TD_S_m在其5’-第二次杂交部位具有单一错配核苷酸。
图13表示根据在固体基质的表面上实现固定化的双重-标记靶区分性探针的5’-第二次杂交部位的杂交的靶核酸序列与非-靶核酸序列的区分结果。为了调查各点的再现性进行了两次反复实验。将荧光强度以反复的点的平均值来表示。符号：SA_TD1_Chip_M为在其5’-第二次杂交部位具有匹配序列的靶区分性探针；SA_TD1_Chip_m为在其5’-第二次杂交部位具有错配序列的靶区分性探针。
图14表示在固相中对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)基因的检测的靶区分性探针及现有探针间的比较结果。符号：SA_TD1_Chip_M为在其5’-第二次杂交部位具有匹配序列的靶区分性探针；SA_TD1_Chip_m1为在其5’-第二次杂交部位具有三个错配核苷酸的靶区分性探针；SA_Con_Chip_M为在其5’-末端部位具有匹配序列的现有探针；SA_Con_Chip_m1为在其5’-末端部位具有三个错配核苷酸的现有探针。
【发明详述】
本发明涉及一种靶区分性探针(TD probe)及其用途或应用。
【靶区分性探针(TD探针)】
根据本发明的一实施方式，本发明提供一种靶区分性探针(targetdiscriminative probe)，其具有下述通式I的变性双重特异性寡核苷酸(modified dualspecificity oligonucleotide)结构，用于区分靶核酸序列与非-靶核酸序列：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在上述通式中，X’p是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次杂交部位(5’-second hybridization portion)；Y’q是包含至少三个通用(universal)碱基的分离部位(separation portion)；Z’r是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次杂交部位(3’-first hybridization portion)；p、q及r表示核苷酸的个数；并且，X’、Y’及Z’是脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；上述5’-第二次杂交部位的Tm低于上述3’-第一次杂交部位的Tm，上述分离部位在上述三个部位中具有最低的Tm；上述分离部位在对于上述靶核酸序列的杂交方面，使上述5’-第二次杂交部位从上述3’-第一次杂交部位分离，由此上述靶区分性探针的杂交特异性借助上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位来双重性地决定，其结果，提高上述靶区分性探针的整体杂交特异性；上述靶区分性探针与上述靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位均与靶核酸序列杂交；上述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位均形成单链，由此上述靶区分性探针区分靶核酸序列与非-靶核酸序列。
本发明者为了开发能够使靶核酸序列的检测或者识别变得更加简便且能够没有假阳性及假阴性结果地检测的技术而锐意研究努力。其结果，由于靶核酸序列与非-靶核酸序列的相互不同的杂交模式，本发明者制备了具有用于区分靶核酸序列与非-靶核酸序列的固有的能力的新颖的靶区分性探针。并且，通过上述新颖的靶区分性探针，本发明者提出了在液相(liquid phase)及固相(solid phase)的反应系统中都能够应用的靶核酸序列检测实验方案。
因此，利用于本发明的上述探针被称为“靶区分性探针(Target DiscriminativeProbe)”(TD探针)，利用上述靶区分性探针的本发明的技术被称为“靶区分性探针靶检测试验”。
本发明的上述靶区分性探针具有在一个寡核苷酸分子内包含三个固有的不同部位的变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：5’-第二次杂交部位、3’-第一次杂交部位及分离部位。这样的结构使靶区分性探针成为显示更高的特异性的探针，这相对于现有技术，使本发明成为具有新颖性及创造性的发明。
变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构是双重特异性寡核苷酸(DSO：dualspecificity oligonucleotide)变形的新结构，本发明者第一次提出了该结果(WO 2006/095981)。并且，上述双重特异性寡核苷酸(DSO)结构起到引物作用时，命名为双重引发寡核苷酸(DPO：dual priming oligonucleotide)(Chun et al.，Dual primingoligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses andSNP genotyping of CYP2C19 gene，Nucleic Acid Research，35：6e40(2007))。
双重特异性寡核苷酸(DSO)体现杂交或者退火借助由分离区域相互分离的5’-高Tm特异性部位(或者5’-第一次杂交部位、5’-第一次引发部位)及3’-低Tm特异性部位(或者3’-第二次杂交部位，3’-第二次引发部位)双重性地决定的新颖的概念，显示出非常惊人的特异性(参照WO 2006/095981；Kim et al.，Direct detection of lamivudine-resistanthepatitis B virus mutants by multiplex PCR using dual-priming oligonucleotideprimers，Journal of Virological Methods，149：76-84(2008)；Kim，et.al.，Rapiddetection and identification of 12 respiratory viruses using a dual primingoligonucleotide system-based multiplex PCR assay，Journal of VirologicalMethods，doi：10.1016/j.jviromet.2008.11.007(2008)；Horiiet.al.，Use of dualpriming oligonucleotide system to detect multiplex sexually transmittedpathogens in clinical specimens，Letters in Applied Microbiology，doi：10.111/j.1472-765X2009.02618x(2009)))。如上所述，双重特异性寡核苷酸(DSO)最终获得具有相互不同的退火特性的两个部位：造成初期的稳定的杂交的5’-第一次杂交部位及决定靶特异性的3’-第二次杂交部位。
变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构是上述双重特异性寡核苷酸(DSO)结构逆转而成的：即，决定靶特异性的5’-第二次杂交部位及造成初期的稳定的杂交的3’-第一次杂交部位。
具有变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构的靶区分性探针与非-靶核酸进行杂交时，5’-末端部位不干涉于杂交，这与本发明者所提出的之前的双重特异性寡核苷酸(DSO)结构明显不同。
特别是，为了完全克服与探针相关的假阳性信号问题，本发明者为了提出更能信赖且正确的接近法而锐意努力，在本发明的方法中表示靶序列的信号的产生借助不仅是探针杂交反应，而且是追加的酶反应，例如5’→3’外切核酸酶反应或者2个探针的连接反应而达成。考虑到本发明的新颖的接近法很大地依存于探针5’-末端部位的杂交，本发明者将探针设计成能够最大限度地体现5’-末端的特异性，通过使公知的双重特异性寡核苷酸(DSO)变形来提出靶区分性探针。
具有独特的5’-末端杂交模式的靶区分性探针没有假阳性信号地检测靶序列，这不借助现有探针及双重特异性寡核苷酸(DSO)探针而达成。
基于变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构的靶区分性探针的杂交特异性(或者靶特异性)在本发明中没有假阳性地检测靶。
令人关注的是，具有变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构的靶区分性探针分别对于靶与非-靶核酸序列，明确地表现出不同的杂交行为(behavior)。如图1至图3所示，靶区分性探针与靶核酸序列进行杂交时，靶区分性探针的5’-第二次杂交部位及3’-第一次杂交部位与靶核酸序列形成双链。靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时(即，非-靶杂交或者结合)，其3’-第一次杂交部位优势地与非-靶核酸序列结合，但是5’-第二次杂交部位及分离部位均不与非-靶核酸杂交，而形成单链。
3’-第一次杂交部位与非-靶序列进行退火，但是在靶区分性探针的靶-特异性杂交条件下具有较短序列(低的Tm值)的5’-第二次杂交部位不与非-靶序列杂交。之所以如此，是因为在杂交特异性方面，3’-第一次杂交部位及5’-第二次杂交部位借助分离部位来进行分离。即，在杂交特异性方面，5’-第二次杂交部位从3’-第一次杂交部位以相对独立的方式进行杂交，5’-第二次杂交部位的杂交少受3’-第一次杂交部位的杂交带来的影响。因此，对于非-靶序列的5’-第二次杂交部位的杂交可能性将会降得很低。
靶区分性探针的3’-第一次杂交部位及5’-第二次杂交部位具有与模板互补的序列时，在靶-特异性杂交条件下，靶区分性探针能够特异性地与模板的靶核酸序列进行杂交。但是，只有靶区分性探针的5’-第二次杂交部位具有与模板互补的序列时，在靶-特异性杂交条件下，靶区分性探针不与模板进行杂交。
上述的靶区分性探针的特征在于，通过如下两种靶-监控事件(target-surveillance event)能够以极致地改善的靶-特异性检测靶序列。第一，如上所述，对于靶及非-靶核酸序列具有分别不同的杂交模式的靶区分性探针能够以非常高的特异性从非-靶核酸序列区分靶核酸序列。第二，连续的酶反应(5’→3’外切核酸反应或者连接)的产生根据靶区分性探针的杂交模式而决定，这在靶检测过程中提高靶-特异性。
靶区分性探针与靶核酸序列杂交，且形成双链。如上所述，具有如此巧妙的设计的变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构的靶区分性探针能够完全区分靶核酸序列与非-靶核酸序列。
根据本发明的优选实例，位于分离部位的通用碱基选自包含脱氧肌苷(deoxyinosine)、肌苷(inosine)、7-去氮-2’-脱氧肌苷(7-deaza-2’-deoxyinosine)、2-氮杂-2’-脱氧肌苷(2-aza-2’-deoxyinosine)、2’-甲氧基肌苷(2’-OMe inosine)、2’-F肌苷(2’-F inosine)、脱氧3-硝基吡咯(deoxy 3-nitropyrrole)、3-硝基吡咯(3-nitropyrrole)、2’-甲氧基3-硝基吡咯(2’-OMe3-nitropyrrole)、2’-F3-硝基吡咯(2’-F3-nitropyrrole)、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯(1-(2’-deoxybeta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole)、脱氧5-硝基吡咯(deoxy 5-nitroindole)、5-硝基吲哚(5-nitroindole)、2’-甲氧基5-硝基吲哚(2’-OMe 5-nitroindole)、2’-F5-硝基吲哚(2’-F5-nitroindole)、脱氧4-硝基苯并咪唑(deoxy4-nitrobenzimidazole)、4-硝基苯并咪唑(4-nitrobenzimidazole)、脱氧4-氨基苯并咪唑(deoxy 4-aminobenzimidazole)、4-氨基苯并咪唑(4-aminobenzimidazole)、脱氧水粉蕈素(deoxy nebularine)、2’-F水粉蕈素(2’-F nebularine)、2’-F 4-硝基苯并咪唑(2’-F4-nitrobenzimidazole)、肽核酸-5-硝基吲哚(PNA-5-nitroindole)、肽核酸-水粉蕈素(PNA-nebularine)、肽核酸-肌苷(PNA-inosine)、肽核酸-4-硝基苯并咪唑(PNA-4-nitrobenzimidazole)、肽核酸-3-硝基吡咯(PNA-3-nitropyrrole)、吗啉基-5硝基吲哚(morpholino-5-nitroindole)、吗啉基-水粉蕈素(morpholino-nebularine)、吗啉基-肌苷(morpholino-inosine)、吗啉基-4-硝基苯并咪唑(morpholino-4-nitrobenzimidazole)、吗啉基-3-硝基吡咯(morpholino-3-nitropyrrole)、氨基磷酸酯-5-硝基吲哚(phosphoramidate-5-nitroindole)、氨基磷酸酯-水粉蕈素(phosphoramidate-nebularine)、氨基磷酸酯-肌苷(phosphoramidate-inosine)、氨基磷酸酯-4-硝基苯并咪唑(phosphoramidate-4-nitrobenzimidazole)、氨基磷酸酯-3-硝基吡咯(phosphoramidate-3-nitropyrrole)、2’-0-甲氧基乙基肌苷(2’-0-methoxyethyl inosine)、2’-0-甲氧基乙基水粉蕈素(2’0-methoxyethyl nebularine)、2’-0-甲氧基乙基5-硝基吲哚(2’-0-methoxyethyl 5-nitroindole)、2’-0-甲氧基乙基4-硝基-苯并咪唑(2’-0-methoxyethyl 4-nitro-benzimidazole)、2’-0-甲氧基乙基3-硝基吡咯(2’-0-methoxyethyl 3-nitropyrrole)及上述碱基的群。更优选地，通用碱基为脱氧肌苷(deoxyinosine)、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯(1-(2’-deoxybeta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole)或者5-硝基吲哚(5-nitroindole)，最优选为脱氧肌苷(deoxyinosine)。
上述分离部位包含如下核苷酸，该核苷酸优选地具有至少3个通用碱基，更优选地具有至少4个通用碱基、最优选地具有至少5个通用碱基。上述分离部位包含如下连续的核苷酸，该核苷酸优选地具有与至少3个通用碱基，更优选地具有至少4个通用碱基，最优选地具有至少5个通用碱基。上述分离部位选择性地包含3-10个、3-8个、4-7个或者4-5个连续的通用碱基。
优选地，上述3’-第一次杂交部位的长度比5’-第二次杂交部位的长度更长。上述3’-第一次杂交部位优选地具有15-60核苷酸的长度，更优选地具有15-40核苷酸的长度，进而优选地具有15-30核苷酸的长度。
上述5’-第二次杂交部位优选地具有至少3核苷酸的长度，更优选地具有至少5核苷酸的长度，进而优选地具有至少6核苷酸的长度。上述5’-第二次杂交部位具有优选为15以下的核苷酸长度，更优选地具有13以下的核苷酸的长度，进而优选地具有12核苷酸的长度。
就上述5’-第二次杂交部位而言，优选地具有3-15核苷酸的长度，更优选地具有3-13核苷酸的长度，进而优选地具有4-12核苷酸的长度，最优选地具有5-11核苷酸的长度。上述分离部位优选地具有3-10核苷酸的长度，更优选地具有3-8核苷酸的长度，进而优选地具有4-7核苷酸的长度，最优选地具有4-5核苷酸的长度。5’-第二次杂交部位及分离部位的整体长度优选为至少6核苷酸，更优选为至少9核苷酸，进而优选为至少12核苷酸，最优选为至少15核苷酸。
根据本发明的优选实例，上述3’-第一次杂交部位具有40℃-80℃的Tm，更优选地具有45℃-70℃的Tm。上述5’-第二次杂交部位优选地具有6℃-40℃的Tm，更优选地具有10℃-40℃的Tm。上述分离部位优选地具有2℃-15℃的Tm，更优选地具有3℃-15℃的Tm。
根据本发明的优选实例，上述靶区分性探针具有包含产生可检测信号的一个标记或者多个标记的相互作用性标记系统。
本发明中所利用的产生可检测信号的标记包含在本发明所属的技术领域中公知的任何标记。有些标记由单一分子或者单一原子标记组成；但是标记的大部分(例如，相互作用性标记系统)由至少两种或者其以上的标记分子或者原子所组成。
根据本发明的优选实例，靶区分性探针上的上述标记是化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、发光标记、化学发光标记或者金属标记(例如，金)。
上述化学标记包含生物素。链霉亲和素(或者抗生物素蛋白)与生物素的结合特异性产生表示靶核酸序列的间接性信号。
上述酶标记包含碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)、荧光素酶(luciferase)、细胞色素(cytochrome)P450及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)。利用对于上述酶标记的基质，从而能够得到表示靶核酸序列的信号。利用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)时，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP：bromochloroindolylphosphate)、氮蓝四唑(NBT：nitro blue tetrazolium)或者无元素氯(ECF：elemental chlorine free)可作为对于显色反应的基质而利用，利用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)时，氯萘酚(chloronaphtol)、氨基乙基咔唑(aminoethylcarbazol)、二氨基联苯胺(diaminobenzidine)、D-虫荧光素(D-luciferin)、光泽精(lucigenin)(双(N-甲基二吖啶)硝酸盐：bis-N-methylacridiniumnitrate)、苄氧基试卤灵(resorufin benzyl ether)、鲁米诺(luminol)、安普思红试剂(Amplex Red reagent)(10-乙酰基-3，7-二羟基吩恶嗪(10-acetyl-3，7-dihydroxyphenoxazine))、HYR(对苯二胺-氯化氢(p-phenylenediamine-HCl)及邻苯二酚(pyrocatechol))、TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺：3，3’，5，5’-TETRAMETHYLBENZIDINE)、ABTS(2，2-连氮-二(3-乙基苯并噻唑啉磺酸酯)：2，2-AZINE-DI[3-ETHYLBENZTHIAZOLINE SULFONATE])、邻苯二胺(OPD：o-phenylenediamine)或者萘酚/派洛宁(naphtol/pyronine)可作为基质而利用；并且利用葡糖氧化酶(glucose oxidase)时，t-NBT(氮蓝四唑)或者m-PMS(吩嗪硫酸甲酯：phenazine methosulfate)可作为基质而利用。
上述放射性标记包含C14、I125、P32及S35。
根据本发明的优选实例，与靶区分性探针连接的标记为能够提供实时信号的单一标记。例如，上述单一标记为荧光铽(Tb)螯合物(terbium chelate)(Nurmi et al，NucleicAcids Research，2000，Vol.28No.8)。努米(Nurmi)等提出了上述标记在探针-连接的形态中放出低水准的荧光，但是借助5’→3’核酸切割活性而从探针-模板二聚物解离时，增加荧光信号。因此，单一标记与靶区分性探针连接时，上述荧光铽(Tb)螯合物在本发明中能够实现实时靶检测。
上述相互作用性标记系统为能量非-放射性地(non-radioacively)传达到供体分子及受体分子之间的信号产生系统。
作为相互作用性标记系统的代表性例子，荧光共振能量转移技术(FRET：fluorescence resonance energy transfer)标记系统包含荧光报道分子(供体分子)及猝灭分子(受体分子)。在荧光共振能量转移技术中，能量供体为荧光性，但是，能量受体可以是荧光性或者非-荧光性。
在相互作用性标记系统的再一形态中，能量供体为非-荧光性，例如，为发色团(chromophore)，能量受体为荧光性。在相互作用性标记系统的另一形态中，能量供体为发光性，例如，生物发光性、化学发光性或者电化学发光性，受体为荧光性。
更优选地，靶区分性探针上的标记为相互作用性标记系统，进而优选为荧光共振能量转移标记系统，最优选为一对的报道分子及猝灭分子。
优选地，利用荧光共振能量转移标记时，两种标记(位于靶区分性探针上的报道分子及猝灭分子)被靶区分性探针内的一个位点(产生核酸酶切割的部位)而分离，由此5’→3’外切核酸酶活性以在上述位点的切割反应从猝灭分子分离报道分子，这将会产生表示靶核酸系列的存在的信号。
上述标记可借助现有方法与靶区分性探针相连接。例如，上述标记可通过包含至少三个碳原子的间隔区(例如，3-碳间隔区、6-碳间隔区或者12碳间隔区)与靶区分性探针相连接。
根据本发明的优选实例，上述报道分子及猝灭分子均位于5’-第二次杂交部位，或者报道分子及猝灭分子分别位于5’-第二次杂交部位及分离部位的各自不同部位。例如，报道分子位于5’-第二次杂交部位，猝灭分子位于分离部位。
更优选地，报道分子及猝灭分子中的一个位于靶区分性探针的5’-末端，另一个位于5’-第二次杂交部位。
根据本发明的优选实例，上述靶区分性探针在其5’-第二次杂交部位上具有报道分子及猝灭分子中的一个，在3’-第一次杂交部位上具有另一个。
更优选地，报道分子及猝灭分子中的一个位于靶区分性探针的5’-末端，另一个位于3’-第一次杂交部位。
本发明的上述靶区分性探针在靶序列的检测上具有如下的非常多样的应用性：
【I.液相或者固相中借助5’→3’外切核酸反应的靶检测方法】
【1.液相中的靶检测方法】
本发明的靶区分性探针对靶序列检测体现卓越的能力。
根据本发明的其他实施方式，本发明提供一种利用靶区分性探针(TD probe)来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将上述靶核酸序列与上述靶区分性探针进行杂交的步骤，上述靶区分性探针包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，上述靶区分性探针具有以下通式I的变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在上述通式中，X’p是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次杂交部位(5’-second hybridization portion)；Y’q是包含至少三个通用碱基的分离部位(separation portion)，Z’r是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次杂交部位(3’-first hybridization portion)；上述靶区分性探针由荧光报道分子及猝灭报道分子的荧光的猝灭分子进行双重标记；上述荧光报道分子及上述猝灭分子中至少一个位于上述5’-第二次杂交部位；p、q及r表示核苷酸的个数；并且X’、Y’及Z’是脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；上述5’-第二次杂交部位的Tm低于上述3’-第一次杂交部位的Tm，上述分离部位在上述三个部位中具有最低的Tm；上述分离部位在对于上述靶核酸序列的杂交方面，使上述5’-第二次杂交部位从上述3’-第一次杂交部位分离，由此上述靶区分性探针的杂交特异性借助上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位来双重性地决定，其结果，提高上述靶区分性探针的整体杂交特异性；
上述靶区分性探针与上述靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位均与上述靶核酸序列进行杂交，上述5’-第二次杂交部位由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割；上述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位都形成单链，上述5’-第二次杂交部位不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，由此上述靶区分性探针区分上述靶核酸序列与非-靶核酸序列；
(b)将上述步骤(a)的结果物与具有5’→3’外切核酸酶活性的酶接触的步骤；上述靶区分性探针与上述靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位由具有上述5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，位于上述靶区分性探针上的上述荧光报道分子从上述猝灭分子分离，产生荧光信号；上述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位不被具有上述5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，因此从不产生荧光信号；以及
(c)检测上述荧光信号的步骤，通过切割上述5’-第二次杂交部位而产生的上述荧光信号表示靶核酸序列的存在。
根据本发明，将靶核酸序列与靶区分性探针进行杂交。
根据本发明，仅利用靶区分性探针及具有5’→3’外切核酸酶活性的酶，从而能够没有假阳性信号地检测靶核酸序列，这第一次被本发明者提出。
如图1所示，靶区分性探针对于靶及非-靶核酸序列分别体现明确不同的杂交动作。靶区分性探针与靶核酸序列进行杂交时，靶区分性探针的5’-第二次杂交部位及3’-第一次杂交部位与靶核酸形成双链。靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交(即，非-靶杂交或者结合)时，其3’-第一次杂交部位优势地与非-靶核酸序列相结合，但是5’-第二次杂交部位及分离部位都未能与非-靶核酸杂交，且形成单链。
因此，靶区分性探针与靶核酸序列进行杂交时，其5’-第二次杂交部位由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶(例如，具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶)所切割，荧光报道分子及猝灭分子相互分离，从而产生对于靶核酸序列的荧光信号。一般而言，靶区分性探针的切割开始从其5’-末端进行，随后朝向5’→3’方向进行。
与此相对地，靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，5’-第二次杂交部位及3’-第一次杂交部位均形成单链，从而不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割。最终，靶区分性探针不生成对于非-靶杂交的信号。
借助这样的靶区分性探针的独特的杂交动作，仅利用靶区分性探针及具有5’→3’外切核酸酶活性的酶，从而能够没有假阳性地检测靶核酸序列。
根据本发明的优选实例，具有上述5’→3’外切核酸酶活性的酶只作用于双链核酸的5’-末端，从而朝向5’→3’方向促进外切核酸反应，且不切割单链核酸。
根据本发明的优选实例，具有上述5’→3’外切核酸酶活性的酶为热稳定性酶。根据本发明的优选实例，具有5’→3’外切核酸酶活性的酶为模板-依赖性核酸聚合酶，更优选为热稳定性模板-依赖性核酸聚合酶。
根据本发明的优选实例，上述荧光报道分子及上述猝灭分子分别位于5’-第二次杂交部位及3’-第一次杂交部位的各自不同部位。例如，荧光报道分子位于5’-第二次杂交部位，猝灭分子可位于3’-第一次杂交部位。选择性地，猝灭分子位于5’-第二次杂交部位，荧光报道分子可位于3’-第一次杂交部位。
根据本发明的优选实例，荧光报道分子及猝灭分子均位于5’-第二次杂交部位，或者报道分子及猝灭分子分别位于上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位的各自不同部位。最优选地，荧光报道分子及猝灭分子均位于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位。
众所周知，对于具有5’→3’外切核酸酶活性的酶(包含模板-依赖性核酸聚合酶)中的一部分酶来说，其活性一般非常低但是还具有内切核酸酶(endonuclease)活性。内切核酸酶活性的程度受到如下的影响：(i)酶的种类，(ii)模板、反应时间及与反应组合物相同的反应条件，(iii)探针的长度、序列及5’错配序列长度，或者(iv)靶序列。根据本发明的优选实例，在本发明的方法中利用均具有5’→3’外切核酸酶活性及内切核酸酶活性的酶时，本发明在充分抑制内切核酸酶活性的条件下实施。优选地，在本发明中利用几乎没有内切核酸酶活性或者没有内切核酸酶活性的具有5’→3’外切核酸酶活性的酶来实施。
因此，利用具有5’→3’外切核酸酶活性及内切核酸酶活性的酶及靶区分性探针来检测靶时，内切核酸酶活性并不是具有考虑价值的重要因素。但是，为了实现更加确切的靶检测，在靶区分性探针的3’-第一次杂交部位包含阻断剂，这将抑制与非-靶核酸序列杂交的靶区分性探针的3’-第一次杂交部位的内切核酸酶-催化剂切割。特别是，靶区分性探针在液相中利用时，为了实现更加确切的靶检测，荧光报道分子及猝灭分子均位于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位上。
在本发明中，具有5’→3’外切核酸酶活性的酶一般包含具有5’→3’外切核酸酶活性的酶，一般包含不仅具有5’→3’外切核酸酶活性而且还具有内切核酸酶活性的酶。在本发明中，具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶一般包含具有5’→3’外切核酸酶活性的核酸聚合酶，一般包含不仅具有5’→3’外切核酸酶活性而且还具有内切核酸酶活性的核酸聚合酶。
根据本发明的优选实例，上述靶区分性探针在从其5’-末端包含1-10核苷酸的序列的任意位点(site)，更优选为在从5’-末端包含1-5核苷酸的序列的任意位点，进而优选为在从其5’-末端包含1-3核苷酸的序列的任意位点上包含至少一个标记。最优选地，靶区分性探针在其5’-末端包含至少一个标记。
根据本发明的优选实例，上述步骤(a)一同利用在杂交了靶区分性探针的位点的下游位点上杂交的上游引物及靶区分性探针来实施，具有5’→3’外切核酸酶活性的酶是具有5’-3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶，上游引物在上述步骤(b)中借助模板-依赖性核酸聚合酶来延长。
杂交之后，与靶核酸序列杂交的上游引物借助模板-依赖性核酸聚合酶的聚合酶活性而延长，靶区分性探针由5’→3’外切核酸酶活性所切割，由此荧光报道分子及猝灭分子发生分离，并产生荧光信号。
根据本发明的优选实例，上述步骤(a)一同利用靶区分性探针及反向引物而实施，具有5’→3’外切核酸酶活性的酶是模板-依赖性核酸聚合酶，步骤(b)通过基于模板-依赖性核酸聚合酶的反向引物的延长反应来生成与靶区分性探针杂交的靶核酸序列。
反向引物生成与靶区分性探针杂交的追加的靶核酸序列，将靶核酸序列体现为更加明确而又高的固形光信号。
用于本发明的荧光分子及猝灭分子为荧光物质。报道分子及猝灭分子可利用在本发明所属的技术领域中公知的任何物质，其例如下：Cy2TM(506)，YO-PROTM-1(509)，YOYOTM-1(509)，Calcein(517)，FITC(518)，FluorXTM(519)，AlexaTM(520)，Rhodamine 110(520)，Oregon GreenTM 500(522)，Oregon GreenTM488(524)，RiboGreenTM(525)，RhodamineGreenTM(527)，Rhodamine 123(529)，MagnesiumGreenTM(531)，Calcium GreenTM(533)，TO-PROTM-1(533)，TOTO1(533)，JOE(548)，BODIPY530/550(550)，Dil(565)，BODIPYTMR(568)，BODIPY558/568(568)，BODIPY564/570(570)，Cy3TM(570)，AlexaTM 546(570)，TRITC(572)，Magnesium OrangeTM(575)，Phycoerythrin R&B(575)，Rhodamine Phalloidin(575)，Calcium OrangeTM(576)，Pyronin Y(580)，Rhodamine B(580)，TAMRA(582)，RhodamineRedTM(590)，Cy3.5TM(596)，ROX(608)，Calcium CrimsonTM(615)，AlexaTM 594(615)，TexasRed(615)，Nile Red(628)，YO-PROTM-3(631)，YOYOTM-3(631)，R-phycocyanin(642)，C-Phycocyanin(648)，TO-PROTM-3(660)，TOTO3(660)，DiD DilC(5)(665)，Cy5TM(670)，Thiadicarbocyanine(671)，Cy5.5(694)，HEX(556)，TET(536)，Biosearch Blue(447)，CALFluor Gold 540(544)，CAL Fluor Orange 560(559)，CAL Fluor Red 590(591)，CALFluor Red 610(610)，CAL Fluor Red 635(637)，FAM(520)，Fluorescein(520)，Fluorescein-C3(520)，Pulsar650(566)，Quasar 570(667)，Quasar 670(705)及Quasar705(610)。括号的数字为以纳米单位表示的最大发光波长。
适合的一对报道分子-猝灭分子公开在如下的许多文献中：Pesce等，editors，FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(Marcel Dekker，New York，1971)；White等，FLUORESCENCEANALYSIS：A PRACTICAL APPROACH(Marcel Dekker，New York，1970)；Berlman，HANDBOOKOF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES，2nd EDITION(Academic Press，NewYork，1971)；Griffiths，COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES(AcademicPress，New York，1976)；Bishop，editor，INDICATORS(Pergamon Press，Oxford，1972)；Haugland，HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS(MolecularProbes，Eugene，1992)；Pringsheim，FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE(IntersciencePublishers，New York，1949)；Haugland，R.P.，HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES ANDRESEARCH CHEMICALS，Sixth Edition，Molecular Probes，Eugene，Oreg.，1996；U.S.Pat.Nos.3,996,345以及4,351,760。
在本发明中，值得关注的是可以利用能够对广范围波长或者特定波长的荧光进行猝灭的非-荧光黑猝灭分子。非-荧光黑猝灭分子的例子为黑洞猝灭剂(BHQ：black holequencher)及4-[4-(二甲基氨基)苯偶氮]苯甲酸(DABCYL：4-[4-(Dimethylamino)phenylazo]benzoic acid)。
在应用于靶区分性探针的荧光共振能量转移标记中，报道分子包含荧光共振能量转移的供体，猝灭分子包含荧光共振能量转移的剩余伙伴(受体)。例如，荧光素染料(fluorescein dye)利用为报道分子，罗丹明染料(rhodamine dye)利用为猝灭分子。
在本说明书中使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或者“靶序列”意味着所要检测的核酸序列，在杂交、退火或者扩增(amplifying)条件下与引物及探针进行退火或者杂交。
在本说明书中使用的术语“探针(probe)”意味着与靶核酸序列实质上互补的部位或者包含这些部位的单链核酸分子。在本发明中利用的探针可包含自然(naturallyoccurring)脱氧单磷酸核苷(dNMP)(即，脱氧腺苷酸(dAMP)、dGMP(脱氧鸟苷酸)、dCMP(脱氧胞苷酸)及dTMP(脱氧胸苷酸))、变形的核苷酸或者非-自然核苷酸。并且，探针还可包含核糖核苷酸。
优选地，标记探针的3’-末端被阻断(blocking)，以便抑制延长。就上述阻断而言，可以利用非-互补的碱基或者在最后核苷酸的3’羟基添加如生物素或者磷酸盐基的化学部分(moiety)而达成。并且，阻断过程可利用去除3’-OH或者如双脱氧核糖核苷酸一样没有3’-OH的核苷酸来实现。
在本说明书中使用的术语“引物”意味着寡核苷酸，在诱导与核酸链(模板)互补的引物延长产物的合成的条件，即，如核苷酸与DNA聚合酶的聚合剂的存在，以及适合的温度与pH的条件下可作用为合成的起始点。优选地，为了扩增时获取最大效率，引物为单链。优选地，引物为脱氧核糖核苷酸。在本发明中利用的引物可包含自然(naturally occurring)脱氧单磷酸核苷(dNMP)(即，dAMP、dGMP、dCMP及dTMP)、变形核苷酸或者非-自然核苷酸。并且，引物还可包含核糖核苷酸。
就引物而言，应充分长，以便能够在聚合剂的存在下引发延长产物的合成。引物的适合的长度取决于多个因素，例如，温度、应用领域及引物的根源(source)。术语“退火”或者“引发”意味着在模板核酸并置(apposition)寡脱氧核苷酸或者核酸，就上述并置而言，通过聚合酶对核苷酸进行聚合而在模板核酸或者其一部分形成互补的核酸分子。
在本说明书中使用的术语“杂交(hybridization)”意味着互补的单链核酸形成双链核酸。在本说明书中使用的术语“退火”和“杂交”没有区分，在本说明书中混用。
靶区分性探针的退火或者杂交可借助在本发明所属的技术领域中公知的多个杂交方法来实施。在本发明中，适合的杂交条件借助最优化程序决定为一连串的过程。如温度、成分的浓度、杂交及清洗时间、缓冲液成分及它们的pH及离子强度等条件根据多种因子而变得多样，例如，如探针及靶核酸序列的寡核苷酸的长度及糖皮质激素(GC)含量。杂交的详细条件可以在Joseph Sambrook，等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor5，N.Y.(2001)；及M.L.M.Anderson，Nucleic Acid Hybridization，Springer-Verlag New York Inc.N.Y.(1999)确认。
根据本发明的优选实例，上述靶区分性探针的上述杂交温度为40℃至80℃，更优选为45℃至75℃，进而优选为50℃至72℃。
在说明书中使用的术语“上游引物(upstream primer)”意味着在下游位点而不是杂交靶区分性探针的位点与核酸序列进行退火，从而借助模板-依赖性核酸聚合酶形成与靶核酸序列互补的序列的引物。
靶区分性探针、上游引物及反向引物分别包含与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列。在本说明书中使用的术语“互补的”意味着在预定的退火条件或者严格条件(stringentconditions)下引物或者探针以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地互补，并包括术语“实质上互补的(substantially complementary)”及“完全互补的(perfectlycomplementary)”，优选地意味着完全互补的意思。
根据本发明的优选实例，上述靶区分性探针的上述5’-第二次杂交部位与靶核酸序列互补。即，5’-第二次杂交部位对于靶核酸序列来说，可以是完全匹配序列或者不完全匹配序列。必要时，5’-第二次杂交部位可以制备为包含部分错配核苷酸。
根据本发明的优选实例，上述靶区分性探针的上述5’-第二次杂交部位可以在其5’-末端追加包含一个至三个错配核苷酸。据报告，存在着在具有5’→3’外切核酸酶活性的酶(即，核酸聚合酶)中，能够从与靶序列杂交的寡核苷酸的5’-末端切割一个至三个核苷酸的酶(参考Murante et al.，Journal of Biological Chemistry Vol.269.1191-1196(1994)及实施例1)。利用如上的酶时，靶区分性探针可制备成在其5’-末端包含一个至三个人为的错配核苷酸。
在本发明中能够检测的靶核酸序列包含任何核酸分子，例如，也可以均包含DNA(gDNA或者cDNA)及RNA分子。靶核酸序列还都包含任何自然(naturally occurring)原核细胞核酸、真核细胞(例如，原生动物和寄生动物、菌类、酵母、高等植物、下等动物及包含哺乳动物和人类的高等动物)核酸、病毒(例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV：HUMANIMMUNODEFICIENCY VIRUS)、流感病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等)核酸或者类病毒核酸。
试样内靶核酸序列可以是DNA或者RNA中的一个。上述分子可以是双链或者单链形态中的一个。作为初期物质的核酸为双链时，优选为将两个链成为单链或者部分单链形态。用于分离链的公知的方法包括加热、碱、甲酰胺、尿素及乙醇酸处理、酶方法(例如，解旋酶反应)及结合蛋白质，但是不局限于此。例如，链的分离可以通过以80℃至105℃范围的温度进行加热而达成。用于达成这种处理的一般的方法提供在Joseph Sambrook，等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(2001)。
将mRNA利用为初期物质时，实施退火步骤之前需要进行反转录步骤，对此的详细内容公开在Joseph Sambrook，等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)；及Noonan，K.F.等，Nucleic Acids Res.16：10366(1988)。为了反转录反应，利用与随机六聚体或者mRNA的聚腺苷酸尾巴(poly A tail)杂交的寡核苷酸dT引物。寡核苷酸dT引物由dTMPs构成，且在dT引物可以起到引物作用的范围内其dTMPs的一个或者其以上可由脱氧单磷酸核苷(dNMP)来代替。反转录可以由具有核糖核酸酶(RNase H：Ribonuclease H)活性的反转录酶来实施。利用具有核糖核酸酶(RNase H：Ribonuclease H)活性的酶时，慎重地选择反应条件，从而可以省略核糖核酸酶(RNase H：Ribonuclease H)切割过程。
在本发明中使用的探针或者引物在靶核酸序列(作为模板)上的位点进行杂交或者退火，从而形成双链结构。适合于形成这种双链结构的核酸杂交或者退火的条件在Joseph Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)及Haymes，B.D.，等，Nucleic AcidHybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，D.C.(1985)进行了说明。
根据本发明的优选实例，上述上游引物和/或反向引物具有以下通式II的双重特异性寡核苷酸(DSO)结构：
5’-Xp-Yq-Zr-3’ (II)
在上述通式中，Xp是具有与上述靶核酸序列互补的杂交序列的5’-第一次杂交部位；Yq是包含至少三个通用碱基的分离部位，Zr为具有与上述靶核酸序列互补的杂交序列的3’-第二次杂交部位；p、q及r表示核苷酸的个数，X、Y及Z为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；上述5’-第一次杂交部位的Tm高于上述3’-第二次杂交部位的Tm，上述分离部位在上述三个部位中具有最低的Tm；上述分离部位在对于上述靶核酸序列的杂交方面，使上述5’-第一次杂交部位从上述3’-第二次杂交部位分离，由此寡核苷酸的杂交特异性借助上述5’-第一次杂交部位及上述3’-第二次杂交部位来双重性地决定，这将提高上述寡核苷酸的整体杂交特异性。
双重特异性寡核苷酸(DSO)结构的详细说明可以引用变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构来进行说明。
优选地，双重特异性寡核苷酸结构的5’-第一次杂交部位比3’-第一次杂交部位更长。5’-第一次杂交部位优选地具有15-60核苷酸的长度，更优选地具有15-40核苷酸的长度，进而优选地具有15-25核苷酸的长度。3’-第二次杂交部位优选地具有3-15核苷酸的长度，更优选地具有5-15核苷酸的长度，进而优选地具有6-13核苷酸的长度。分离部位优选地具有3-10核苷酸的长度，更优选地具有4-8核苷酸的长度，最优选地具有5-7核苷酸的长度。根据本发明的优选实例，上述5’-第一次杂交部位具有40℃-80℃的Tm，更优选地具有45℃-65℃的Tm。上述3’-第二次杂交部位优选地具有10℃-40℃的Tm。上述分离部位优选地具有3℃-15℃的Tm。
优选地，在本发明中利用的具有5’→3’外切核酸酶活性的酶及具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶还可以包含任何一种具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶(例如，大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、热稳定性DNA聚合酶及噬菌体T7DNA聚合酶)，最优选地，包含从多种细菌种得到的热稳定性DNA聚合酶，例如，Thermusaquaticus(Taq)，Thermus thermophilus，Thermus filiformis，Thermus flavus，Thermusantranikianii，Thermus caldophilus，Thermus chliarophilus，Thermus igniterrae，Thermus lacteus，Thermus oshimai，Thermus ruber，Thermus rubens，Thermusscotoductus，Thermus silvanus，Thermus species Z05及Thermus species sps 17的DNA聚合酶。最优选地，具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶为Taq DNA聚合酶。
由5’→3’外切核酸酶活性的酶(优选为具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶)来切割靶区分性探针，产生表示靶核酸序列的信号。对于各标记的信号可借助现有方法进行检测或测定。例如，荧光信号可借助现有方法，例如荧光光度计(fluorometer)进行检测或测定。
在本说明书中使用的术语“信号产生”或者“信号的产生”包括荧光信号强度的变化，不仅包括荧光信号强度的增加，而且还包括荧光信号强度的减少。根据本发明的优选实例，表示靶核酸序列的存在的信号是从荧光报道分子发出的信号。选择性地，猝灭分子是荧光，所检测的用于表示靶核酸序列的存在的信号是从荧光猝灭分子发出的信号。
靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，5’-第二次杂交部位不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，从而不产生荧光信号。
在本说明书中使用的术语“未产生荧光的信号(no fluorescence signal)”意味着不仅不产生可以忽略的微弱的荧光信号，而且也不产生任何荧光信号。例如，上述术语包括一般从阴性对照组或者本底测定或观察到的荧光强度。
根据本发明的优选实例，本发明还包括反复进行上述步骤(a)-(b)或者(a)-(c)的步骤，为了反复进行上述步骤(a)-(b)或者(a)-(c)，本发明在反复循环过程之间还包括变性过程。
变性方法包括热、碱、甲酰胺、尿素及乙醇酸处理、酶方法(例如，解旋酶反应)及结合蛋白质，但是不局限于此。例如，变性可以通过以80℃至105℃范围的温度加热来达成。用于达成这种处理的一般方法提供在Joseph Sambrook，等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)。
反复过程用于增加从荧光报道分子发出的荧光信号的强度。特别是，就本发明的方法而言，利用反向引物的反复过程通过增加靶核酸序列的量来提高从荧光报道分子发出的荧光信号的强度。
根据本发明的优选实例，所利用的靶核酸序列为借助扩增引物而预-扩增的核酸序列。
就预-扩增的靶核酸序列而言，包含在与对于步骤(a)-(c)的反应环境(或者反应容器(vessel))不同的反应环境(或者反应容器(vessel))中预-扩增的靶核酸序列。
本发明还包括反复进行步骤(a)-(b)或者(a)-(c)的步骤时，优选地，信号检测在反复的各循环(即，实时方式)、反复的结束点(即，终点方式)或者反复的各个预定时间间隔中实施。优选地，信号检测在反复的各循环中实施，这将提高检测的正确性。
根据本发明的优选实例，用于生成预-扩增的靶核酸序列的上述扩增引物(例如，正向引物及反向引物)具有在本说明书中所述的通式II的双重特异性寡核苷酸(DSO)结构。
根据本发明的优选实例，上述靶区分性探针具有阻断剂部位，该阻断剂部位包含对于具有上述5’→3’外切核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的至少一个核苷酸阻断剂(blocker)。根据本发明的优选实例，上述阻断剂部位位于由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的靶区分性探针的一个位点，优选地位于靶区分性探针的3’-杂交部位。
利用具有5’→3’外切核酸酶活性及内切核酸酶活性的酶(例如，具有5’→3’外切核酸酶活性及内切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶)时，为了实现更加确切的靶检测，可在靶区分性探针的3’-第一次杂交部位包含阻断剂，这将抑制与非-靶核酸序列杂交的靶区分性探针的3’-第一次杂交部位的内切核酸酶-催化剂切割。
根据本发明的优选实例，上述靶区分性探针具有阻断剂部位(site)，该阻断剂部位(site)包含对于具有上述5’→3’外切核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的至少一个核苷酸作为阻断剂(blocker)，上述阻断剂部位，在靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，位于由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的部位；包含上述阻断剂部位的靶区分性探针与靶核酸序列进行杂交时，其5’-第二次杂交部位由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，从靶区分性探针上的猝灭分子分离荧光报道分子，从而产生荧光信号；包含上述阻断剂部位的靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，不被具有外切核酸酶活性的酶所切割，从而不产生荧光信号。
根据本发明的优选实例，上述靶区分性探针的阻断剂部位位于靶区分性探针的3’-第一次杂交部位上。更优选为，靶区分性探针的阻断剂部位位于邻近于分离部位的3’-末端的3’-第一次杂交部位。
根据本发明的优选实例，上述阻断剂部位包含1-15阻断剂，更优选地包含2-10阻断剂，进而优选地包含3-5阻断剂。
作为阻断剂的核苷酸，即包含对于具有5’→3’外切核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的主链(backbone)的核苷酸，包含本发明所属的技术领域中公知的任何物质。例如，上述核苷酸包含多种硫代磷酸酯键合(linkage)、磷酸酯键合、磷酰胺酯键合及2’-碳水化合物改性。根据本发明的优选实例，包含对于具有5’→3’外切核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的主链的核苷酸包含硫代磷酸酯合(phosphorothioate inkage)、烷基磷酸酯键合(alkyl phosphonate linkage)、氢磷酸酯键合(hydrogen phosphonate linkage)、烷基磷酰胺酯键合(alkyl phosphoroamidate linkage)、芳基磷酰胺酯键合(arylphosphoroamidate linkage)、磷硒酸酯键合(phosphoroselenate linkage)、2’-O-氨丙基改性(2’-O-aminopropyl modification)、2’-O-烷基改性(2’-O-alkyl modification)、2’-O-烯丙基改性(2’-O-allyl modification)、2’-O-丁基改性(2’-O-butylmodification)、α-异头寡核苷酸(α-anomeric oligodeoxynucleotide)及1-(4’-硫代-β-D-呋喃核糖基)改性(1-(4’-thio-β-D-ribofuranosyl)modification)。存在于靶区分性探针的阻断剂核苷酸为一个或者连续或不连续地存在的一个以上的核苷酸。
根据本发明的优选实例，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，上述靶区分性探针包含至少两种探针(优选为至少三种，更优选为至少五种)。
根据本发明的优选实例，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，上述靶区分性探针包含至少两种的探针(优选为至少三种，更优选为至少五种)，上述上游引物包含至少两种引物(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)。
根据本发明的优选实例，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，上述靶区分性探针包含至少两种的探针(优选为至少三种，更优选为至少五种)，上述反向引物包含至少两种引物(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)。
并且，本发明对核苷酸变异的检测而言非常有用。在本发明中使用的术语“核苷酸变异(nucleotide variation)”意味着在连续的DNA片段或者序列类似的DNA片段中存在于特定位点的DNA序列的核苷酸的多样性。这种连续的DNA片段包含一个基因或者一个染色体的任意其他部位。例如，可以通过本发明的方法检测的核苷酸变异包括单核苷酸多态性(SNP：single nucleotide polymorphism)、缺失、插入、置换及移位。核苷酸变异的例子包括：人类基因组的多种变异(例如，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR：methylenetetrahydrofolate reductase)基因的变异)、药物耐性病原体的核苷酸变异及癌产生-相关核苷酸的变异。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列上的上述核苷酸变异位于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位的对面。
【2.固相中的靶检测方法】
本发明不仅在液相，而且还在固相(例如，微阵列)中具有卓越的适应性。
根据本发明的其他实施方式，本发明提供一种利用靶区分性探针(TD probe)来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将上述靶核酸序列与上述靶区分性探针进行杂交的步骤，上述靶区分性探针包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述靶区分性探针通过3’-末端固定化在固体基质的表面；上述靶区分性探针具有以下通式I的变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在上述通式中，X’p是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次杂交部位(5’-second hybridization portion)；Y’q是包含至少三个通用碱基的分离部位(separation portion)，Z’r是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次杂交部位(3’-first hybridization portion)；上述靶区分性探针具有产生可检测信号的标记，上述标记位于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位；p、q及r表示核苷酸的个数；并且X’、Y’及Z’为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；上述5’-第二次杂交部位的Tm低于上述3’-第一次杂交部位的Tm，上述分离部位在上述三个部位中具有最低的Tm；上述分离部位在对于靶核酸序列的杂交方面，使上述5’-第二次杂交部位从上述3’-第一次杂交部位分离，由此借助上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位来双重性地决定上述靶区分性探针的杂交特异性，其结果，提高上述靶区分性探针的整体杂交特异性；
上述靶区分性探针与上述靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位均与上述靶核酸序列进行杂交，上述5’-第二次杂交部位由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割；上述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位都形成单链，上述5’-第二次杂交部位不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，由此上述靶区分性探针区分上述靶核酸序列与非-靶核酸序列；
(b)将上述步骤(a)的结果物与具有5’→3’外切核酸酶活性的酶进行反应的步骤；上述靶区分性探针与上述靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位由具有上述5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，从而从上述靶区分性探针放出上述标记，在固定化在上述固体基质上的靶区分性探针出现信号变化；上述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位不被上述具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，因此在固定化在上述固体基质上的靶区分性探针不发生信号变化；由此检测上述固体基质上的信号变化决定上述靶核酸序列的存在；以及
(c)检测上述固体基质上的上述信号变化的步骤，通过切割上述5’-第二次杂交部位而产生的上述信号变化表示上述靶核酸序列的存在。
本发明的固相方法利用靶区分性探针且根据上述的液相方法的步骤，因此为了避免本说明书的复杂性，省略与此重复的内容。
为了上述固相反应，靶区分性探针通过3’-末端直接或者间接地固定化在固体基质表面。并且，上述探针能够给以共有或者非共有结合方式固定化在固相基质表面。固定化的探针固定化在固相基质表面时，连接肽将会干预。可以在本发明中使用的连接肽包含利用于在微阵列中对探针进行固定化的任何连接肽。例如，具有胺基的烷基或者芳基化合物、或者具有硫醇基的烷基或者芳基化合物可作为连接肽利用于探针固定化。追加地，聚(T)碱基或者聚(A)碱基作为连接肽而利用，能够最小化对酶作用(例如，酶性切割反应)的空间性妨碍(space hindrance)或者增加杂交效率。聚(T)碱基或者聚(A)碱基不能视为生成(spanning)靶区分性探针的序列。例如，与靶区分性探针的3’-第一次杂交部位末端相连接的聚(T)碱基或者聚(A)碱基不被视为3’-第一次杂交部位。
根据本发明的优选实例，在本发明中利用的上述固体基质为微阵列。在本发明中提供反应环境的微阵列包括在本发明所属的技术领域中公知的任何微阵列。本发明的全部过程，即与靶序列的退火、延长/切割反应及荧光的检测在微阵列上完成。在微阵列中固定化探针利用为杂交阵列因素(hybridizable array element)。用于制备微阵列的固体基质(solid substrate)包括，例如金属(例如，金、金与铜的合金及铝)、金属氧化物、玻璃、陶瓷、石英、硅、半导体、Si/SiO2晶圆、锗、砷化镓、碳、碳纳米管、聚合物(例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯及聚丙烯酰胺)、琼脂糖凝胶(sepharose)、琼脂糖(agarose)及胶体(colloids)，但是不局限于此。本发明的多个固定化探针固定化在固体基质上的一个可设定地址的(addressable)区域(region)或者多个可设定地址的区域(region)，固体基质可包括2-1000000个可设定地址的区域(region)。为了借助如光刻法、喷墨打印法、机械点样法及与其类似的方法等现有制造技术提供用于特定应用的阵列而可以组装固定化探针。
根据本发明的优选实例，具有5’→3’外切核酸酶活性的酶为热稳定性酶。根据本发明的优选实例，具有5’→3’外切核酸酶活性的酶为模板-依赖性核酸聚合酶，更优选为热稳定性模板-依赖性核酸聚合酶。
根据本发明的优选实例，上述步骤(a)一同利用与在杂交了靶区分性探针的位置的下游位点上杂交的上游引物及靶区分性探针而实施，具有5’→3’外切核酸酶活性的酶为5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶，上游引物在上述步骤(b)中借助上述模板-依赖性核酸聚合酶而延长。
根据本发明的优选实例，上述步骤(a)均利用靶区分性探针及反向引物来实施，具有5’→3’外切核酸酶活性的酶为具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性聚合酶，步骤(b)通过模板-依赖性核酸聚合酶引起的反向引物的延长反应，来生成与靶区分性探针杂交的靶核酸序列。
根据本发明的优选实例，上述标记为化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、相互作用性标记、发光标记、化学发光标记或者金属标记。
如图4或者图5所示，本发明的固相中的方法利用单一标记(例如，单一荧光标记)或者相互作用性标记(例如，报道分子及猝灭分子)来实施。
例如，包含单一荧光标记的靶区分性探针利用于靶核酸序列的检测时，5’-第二次杂交部位上的荧光标记从固定化在固体基质的靶区分性探针放出，从而减少固体基质上的荧光信号强度。荧光信号减少或者消灭表示靶核酸序列的存在。
根据本发明的优选实例，上述单一标记为荧光报道分子时，信号变化为固体基质上荧光的减少或者消灭。
根据本发明的优选实例，就包含上述单一荧光标记的靶区分性探针而言，在检测之前还包括在步骤(c)中清洗的步骤。选择性地，就包含上述单一荧光标记的靶区分性探针而言，检测之前不包括在步骤(c)中清洗的步骤。
根据本发明的优选实例，上述单一荧光分子位于由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的5’-第二次杂交部位上的一个位点(site)。
为了明确性，上述“由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的5’-第二次杂交部位上的点位(site)”的内容意味着由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的5’-第二次杂交部位上的所有部分(part)、一个部位或者一个位置(position)可由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，上述标记可位于切割5’-第二次杂交部位的任何位点。因此，上述“由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的5’-第二次杂交部位上的点位(site)”的内容可记载为“借助5’-第二次杂交部位上的具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的位置”。
更优选地，上述单一荧光分子从靶区分性探针的5’-末端位于包含1-10核苷酸、更优选地包含1-5核苷酸、进而优选地包含1-3核苷酸的序列的任意一个位点。最优选为，单一荧光分子位于靶区分性探针的5’-末端。
根据本发明的优选实例，上述标记为由一对荧光报道分子及猝灭分子构成的相互作用性标记系统。
根据本发明的优选实例，上述报道分子及猝灭分子中的一个位于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位上的一个位点，剩余一个位于不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的位点。
根据本发明的优选实例，上述报道分子及猝灭分子中的一个位于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位上的由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的位点，剩余一个位于不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的位点。
根据本发明的优选实例，不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的上述位点可存在于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位、分离部位或者3’-第一次杂交部位上。
根据本发明的优选实例，将本发明的方法在固相中实施时，上述靶区分性探针通过其3’-末端固定在固体基质的表面上；上述猝灭分子位于由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的上述靶区分性探针的5’-第二次杂交部位上的一个位点(site)，上述荧光报道分子位于不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的位点；上述靶区分性探针与靶核酸序列进行杂交时，其5’-第二次杂交部位由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，从而荧光报道分子从靶区分性探针上的猝灭分子分离，并且从报道分子产生荧光信号；上述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，5’-第二次杂交部位不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，从而不产生荧光信号，由此检测固体基质上的荧光信号以便决定靶核酸序列的存在。
固定化靶区分性探针与靶核酸序列进行杂交时，在5’-末端由3’-末端方向的具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割。此时，如果固定化靶区分性探针片段及靶核酸序列之间的结合微弱，由此则从固体基质上的固定化靶区分性探针片段解离靶序列。因此，上述固定化靶区分性探针可考虑为包含由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的部位及非切割部位的两种部位。因此，位于上述探针的非切割部位上的标记留在固体基质的表面。
考虑到固定化靶区分性探针的切割模式，靶区分性探针同样可以在5’-第二次杂交部位内包含切割部位及非切割部位。靶区分性探针内的切割部位及非切割部位的形成可能受到分离部位的影响。
根据本发明的优选实例，在猝灭分子及报道分子之间的靶区分性探针的一个位点包含如变形成对于5’→3’外切核酸酶活性具有耐性的核苷酸或者主链等阻断剂时，具有5’→3’外切核酸酶活性的酶因阻断剂而不能追加地切割，从而包含成为非切割部位的固定化靶区分性探针片段的单一标记留在固体基质上。
根据本发明的优选实例，上述猝灭分子位于由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的5’-第二次杂交部位上。
根据本发明的优选实例，上述荧光报道分子位于不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的5’-第二次杂交部位上。
根据本发明的优选实例，上述荧光报道分子位于不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的3’-第一次杂交部位上。
根据本发明的优选实例，位于不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的位点的上述荧光报道分子在步骤(b)之后留在固体基质的表面上，由此以没有清洗步骤的实时方式能够便利地检测从报道分子发出的荧光信号。
优选地，猝灭分子位于靶区分性探针的5’-末端或者位于从5’-末端与1-3核苷酸隔离的位置，荧光报道分子与靶区分性探针的3’-末端邻近，或者位于靶区分性探针的3’-第一次杂交部位的中间。
根据本发明的优选实例，上述猝灭分子从靶区分性探针的5’-末端位于包含1-10核苷酸、更优选地包含1-5核苷酸、进而优选地包含1-3核苷酸的序列的任意一个位点。最优选地，上述猝灭分子位于靶区分性探针的5’-末端。
根据本发明的优选实例，上述报道分子位于从靶区分性探针的3’-末端包含1-30核苷酸、更优选地包含1-20核苷酸、进而优选地包含1-15核苷酸的序列的任意一个位点。
根据本发明的优选实例，上述上游引物和/或者反向引物具有通式II的双重特异性寡核苷酸(DSO)结构。
根据本发明的优选实例，本发明还包括反复进行上述步骤(a)-(b)或者(a)-(c)的步骤，为了反复进行上述步骤(a)-(b)或者(a)-(c)，本发明在反复循环之间还包括变性过程。
本发明还包括反复进行的步骤(a)-(b)或者(a)-(c)的步骤时，优选为，信号检测在反复的各循环(即，实时方式)、在反复的结束点(即，终点方式)或者在反复的各个预定时间间隔实施。优选地，信息检测在反复的各循环实施，这将提高检测的正确性，还可以定量靶核酸。
根据本发明的优选实例，利用的靶核酸序列为由扩增引物进行预-扩增的核酸序列。
根据本发明的优选实例，用于生成预-扩增的靶核酸序列的上述扩增引物(例如，包含正向引物及反向引物)具有在本说明书中叙述的通式II的双重特异性寡核苷酸(DSO)结构。
根据本发明的优选实例，为了以实时方式检测靶核酸序列，上述步骤(a)及(b)与靶核酸序列的扩增同时实施。
根据本发明的优选实例，上述靶区分性探针具有阻断剂部位，该阻断剂部位包含对于具有上述5’→3’外切核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的至少一个核苷酸阻断剂(blocker)。根据本发明的优选实例，上述阻断剂部位位于由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的靶区分性探针的一个位点，优选为，位于靶区分性探针的3’-杂交部位。
根据本发明的优选实例，上述靶区分性探针具有阻断剂部位，该阻断剂部位包含对于酶(例如，具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶)的5’→3’外切核酸酶活性具有耐性的至少一个核苷酸阻断剂(blocker)，靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，上述阻断剂部位位于由酶的内切核酸酶活性所切割的位点。
根据本发明的优选实例，靶区分性探针的上述阻断剂部位位于靶区分性探针的3’-第一次杂交部位。更优选地，靶区分性探针的阻断剂部位位于与分离部位邻近的3’-末端的3’-第一次杂交部位。
根据本发明的优选实例，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，上述靶区分性探针包含至少两种探针(优选为至少三种，更优选为至少五种)。
根据本发明的优选实例，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，上述靶区分性探针包含至少两种探针(优选为至少三种，更优选为至少五种)，上述上游引物包含至少两种引物(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)。
根据本发明的优选实例，上述靶核酸序列包含至少两种核酸序列(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，上述靶区分性探针包含至少两种探针(优选为至少三种，更优选为至少五种)，上述反向引物包括至少两种引物(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)。
尤其，本发明对核苷酸变异的检测而言非常有用。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列上的上述核苷酸变异位于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位的对面。
【II.优选实例：利用靶区分性探针的实时聚合酶链式反应(PCR)试验】
优选地，本发明与利用由能够扩增靶核酸序列的正向引物及反向引物构成的一对引物的靶核酸序列的扩增同时实施。优选地，上述扩增根据聚合酶链式反应而实施，这公开于U.S.专利编号4,683,195、4,683,202及4,800,159。
本发明的另一实施方式提供一种利用靶区分性探针(TD probe)及聚合酶链式反应(PCR)来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，该方法包括以下步骤：
(a)准备PCR混合物的步骤，该PCR混合物包含：(i)上述靶核酸序列、(ii)具有与上述靶核酸序列互补的杂交序列的上述靶区分性探针、(iii)作为具有与上述靶核酸序列互补的杂交序列的正向引物及反向引物，由两个引物构成的一对引物、及(iv)具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶；上述靶区分性探针在上述两个引物之间的位点进行杂交；上述靶区分性探针具有以下通式I的变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在上述通式中，X’p是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次杂交部位(5’-second hybridization portion)；Y’q是包含至少三个通用碱基的分离部位(separation portion)，Z’r是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次杂交部位(3’-first hybridization portion)；上述靶区分性探针由荧光报道分子及粗灭报道分子的荧光的猝灭分子进行双重标记；上述荧光报道分子及猝灭分子均位于上述5’-第二次杂交部位，或者上述报道分子及猝灭分子分别位于上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位的各个不同的部位；p、q及r表示核苷酸的个数；并且X’、Y’及Z’为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；上述5’-第二次杂交部位的Tm低于上述3’-第一次杂交部位的Tm，上述分离部位在上述三个部位中具有最低的Tm；上述分离部位在对于上述靶核酸序列的杂交方面，使上述5’-第二次杂交部位从上述3’-第一次杂交部位分离，由此借助上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位来双重性地决定上述靶区分性探针的杂交特异性，其结果，提高上述靶区分性探针的整体杂交特异性；
上述靶区分性探针与上述靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位均与上述靶核酸序列杂交，上述5’-第一次杂交部位由上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性所切割；上述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位均形成单链，从而上述5’-第二次杂交部位不被上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性所切割，由此上述靶区分性探针区分上述靶核酸序列与非-靶核酸序列；
(b)利用上述聚合酶链式反应(PCR)混合物，借助至少两个循环的引物退火、引物延长及变性来扩增上述靶核酸序列的步骤，上述两个引物由上述模板-依赖性核酸聚合酶的聚合酶活性所延长，来扩增上述靶核酸序列；上述靶区分性探针与上述靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位由上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性所切割，由此上述荧光报道分子从位于上述靶区分性探针上的猝灭分子分离，并产生荧光信号；上述靶区分性探针与上述非-靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位不被上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性所切割，其结果，上述荧光报道分子不从位于上述靶区分性探针上的上述猝灭分子分离，由此不出现荧光信号；以及
(c)检测上述荧光信号的步骤，上述产生的荧光信号表示上述靶核酸序列的存在。
本发明的实时聚合酶链式反应(PCR)分析利用靶区分性探针并且按照上述本发明的步骤，因此，为了避免本说明书的过度的复杂性，省略其之间的共同的内容。
在利用5’→3’核酸切割反应的实时聚合酶链式反应(PCR)试验中，具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶不仅为信号产生，而且还为靶的扩增而利用(例如，拖慢(TaqMan)探针方法)。如上所述，模板-依赖性核酸聚合酶可以具有包含5’→3’外切核酸酶活性及内切核酸酶活性的两种核酸切割活性。上述内切核酸酶活性在实施靶的扩增的过程中可能产生假阳性信号。
为了完全克服关于上述内切核酸酶活性的问题，本发明采取独特的战略，是所有双重标记都位于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位上。
根据本发明的优选实例，在实时聚合酶链式反应(PCR)中，上述荧光报道分子及上述猝灭分子均位于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位，或者上述荧光报道分子及上述猝灭分子分别位于靶区分性探针的上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位的各个不同的位点。
在聚合酶链式反应(PCR)过程中靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，即使模板-依赖性核酸聚合酶的内切核酸酶活性作用于形成在3’-第一次杂交部位的分歧点(bifurcation)，位于5’-第二次杂交部位上的荧光报道分子及猝灭分子不相分离，因此从荧光报道分子发出的荧光信号不借助内切核酸酶活性而产生。
在这一点，本发明的实时聚合酶链式反应(PCR)试验完全保障去除任何假阳性信号产生的可能性。
根据本发明的优选实例，上述信号检测在反复的各循环中(即，实时方式)、在反复的结束点中(即，终-点方式)或者在反复的各个预定时间间隔中实施。优选地，信号检测在反复的各循环中实施，这将提高检测的正确性。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，靶区分性探针包含至少两种探针(优选为至少三种，更优选为至少五种)，正向引物包含至少两种引物(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，且反向引物包含至少两种引物(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含核苷酸变异。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列上的核苷酸变异位于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位的对面。
根据本发明的优选实例，正向引物和/或反向引物具有上述的通式II的双重特异性寡核苷酸(DSO)结构。
【III.基于液相或者固相中的连接反应的靶检测方法】
根据本发明的另一实施方式提供一种包括以下步骤，并利用靶区分性探针(TDprobe)，借助连接(ligation)反应来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法：
(a)将靶核酸序列与第一次探针及第二次探针进行杂交的步骤，上述第一次探针包含与上述靶核酸序列的第一位点互补的杂交核苷酸序列，第二次探针包含位与位于上述第一位点的上游的上述靶核酸序列的第二位点互补的杂交核苷酸序列；上述第一次探针及上述第二次探针中至少一个具有产生可检测信号的标记；上述第二次探针为靶区分性探针；上述靶区分性探针具有以下通式I的变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在上述通式中，X’p为具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次杂交部位(5’-second hybridization portion)；Y’q为包含至少三个通用碱基的分离部位(separation portion)，Z’r为具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次杂交部位(3’-first hybridization portion)；p、q及r表示核苷酸的个数；并且X’、Y’及Z’为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；上述5’-第二次杂交部位的Tm低于上述3’-第一次杂交部位的Tm，上述分离部位在上述三个部位中具有最低的Tm；上述分离部位在对于上述靶核酸序列的杂交方面，使上述5’-第二次杂交部位从上述3’-第一次杂交部位分离，由此借助上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位来双重性地决定上述靶区分性探针的杂交特异性，其结果，提高上述靶区分性探针的整体杂交特异性；上述第二次探针与上述靶核酸序列进行杂交时，上述第二次探针的上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位均与上述靶核酸序列杂交，从而发生上述第一次探针及上述第二次探针的连接；上述第二次探针与非-靶核酸序列进行杂交时，上述第二次杂交的上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位均形成单链，从而上述第一次探针及上述第二次探针不进行连接，由此上述第二次探针区分上述靶核酸序列与非-靶核酸序列；
(b)将与上述靶核酸序列杂交的上述第一次探针及第二次探针进行连接的步骤，由此生成已连接的探针(ligated probe)；
(c)使上述步骤(b)的结果物实现变性的步骤；
(d)检测来自上述已连接的探针上的上述标记的信号的步骤，上述信号表示上述靶核酸序列的存在。
利用连接反应的本发明的方法使用靶区分性探针，为了避免本说明书的过度的复杂性，因此省略其之间的共同的内容。
本发明的方法可在液相或者固相中实施。优选地，本发明的方法在固相中实施。
利用连接反应的本发明的方法，第一次探针及第二次探针与靶核酸序列进行杂交。第二次探针为上述的靶区分性探针。第一次探针包含与上述靶核酸序列的第一位点互补的杂交核苷酸序列，第二次探针与位于上述第一位点的上游的上述靶核酸序列的第二位点互补的杂交核苷酸序列。按照上述的顺序，第一次探针及第二次探针应与靶核酸序列进行杂交。如果第一次探针及第二次探针不能如上所述实施，则不能达成基于本发明的靶-特异检测。
根据本发明的优选实例，第一次探针及第二次探针与上述靶核酸序列进行杂交时，第一次探针及第二次探针位于相互紧邻的(immediately adjacent)位点。
为了两个探针之间的连接反应，需要位于邻近位点，。在本说明书中揭示第一次探针及第二次探针的杂交位点而使用的术语“邻近的(adjacent)”意味着上述一个探针的3’-末端及剩余一个探针的5’-末端相互充分毗邻，使得上述两个探针的末端相互连接。
根据本发明的优选实例，第一次探针的3’-末端具有羟基，第二次探针的5’-末端具有磷酸酯基。
在本说明书中揭示第一次探针及第二次探针的杂交位点而使用的术语“紧邻的(immediately a djacent)”意味着第二次探针的5’-末端与第一次探针的3’-末端毗邻(juxtaposition)而上述两个探针借助适当的作用剂，例如连接酶进行连接。第二次探针的5’-末端从第一次探针的3’-末端与0核苷酸隔离时，两个探针形成借助连接酶来连接的缺口(nick)。
第一次探针或者第二次探针中的一个具有生成可检测信号的标记。选择性地，第一次探针及第二次探针均具有标记。
根据本发明的优先实例，标记为化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、相互作用性标记、发光标记、化学发光标记或者金属标记。
更优选地，标记为由一对的报道分子及猝灭分子构成的相互作用性标记系统。例如，第一次探针由报道分子或者猝灭分子中的一个进行标记，第二次探针由猝灭分子或者报道分子中的一个进行标记。
根据本发明的优选实例，第一次探针具有上述的通式II的双重特异性寡核苷酸(DSO)结构。
更优选地，第一次探针具有双重特异性寡核苷酸(DSO)结构，第二次探针为靶区分性探针，第一次探针的3’-末端位于与第二次探针的5’-末端紧邻的位点。
利用探针的靶序列检测的正确性一般依赖于对于靶序列的探针的特异性。具有双重特异性寡核苷酸(DSO)结构的第一次探针及具有变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构的第二次探针(靶区分性探针)时，两个探针与靶核酸序列进行杂交时，第一次探针的3’-第二次杂交部位及第二次探针的5’-第二次杂交部位位于相互紧邻的位点。之后，第一次探针的3’-第二次杂交部位及第二次探针的5’-第二次杂交部位进行连接。第一次探针及第二次探针与非-靶序列进行杂交时，仅有探针的第一次杂交部位实现非-特异性杂交，探针的第二次杂交部位分别形成单链，从而第一次探针及第二次探针不进行连接(图6)。
如上所述，具有双重特异性寡核苷酸(DSO)结构的第一次探针及具有变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构的第二次探针等一对探针，对于靶检测来说，从假阳性结果完全自由。
杂交后，与靶核酸序列杂交的第一次探针及第二次探针进行连接。
酶性连接为由共价键连接第一次探针及第二次探针的优选的方法，术语“连接”在本说明书全文中利用。但是，术语“连接”为一般的术语，理解为包括将两个探针由共价键进行连接的任何方法。对酶性连接的其他选择性方法为在EP0324616中详述的光连接(photoligation)。
本发明的连接可根据两种选择性的方法实施：第一，连接可借助间隙填补连接(gap filling ligation)方法实施(美国专利第6,004,826号)。借助DNA聚合酶来延长的探针的3’-末端连接在剩余探针的5’-末端。第二，连接可以无需延长反应地通过缺口密封(nick sealing)方法实施。
根据本发明的优选实例，本发明的连接借助缺口密封来实施，无需任何追加的延长反应地连接探针的3’-末端与剩余探针的5’-末端。
连接反应可利用非常多样的连接作用剂来实施，包含酶性连接作用剂及非-酶性连接作用剂(例如，化学作用剂及光连接作用剂)。化学连接作用剂包含碳二亚胺(carbodiimide)、溴化氰(BrCN：cyanogen bromide)、N-氰基咪唑(N-cyanoimidazole)、咪唑(imidazole)、1-甲基咪唑/碳二亚胺/胱胺(1-methylimidazole/carbodiimide/cystamine)、二硫苏糖醇(DTT：dithiothreitol)及如紫外光等活性剂、冷凝剂及还原剂，但是不局限于此。并且，自动连接，即在连接作用剂的不存在下的自发的连接也包含在本发明的揭示范围内。化学连接方法的详细实验方案及适当的官能团的详细说明可在Xu等，Nucl.Acids Res.，27：875-81(1999)；Gryaznov and Letsinger，Nucl.Acids Res.21：1403-08(1993)；Gryaznov等，Nucleic Acid Res.22：2366-69(1994)；Kanaya与Yanagawa，Biochemistry 25：7423-30(1986)；Luebke与Dervan，Nucl.Acids Res.20：3005-09(1992)；Sievers与von Kiedrowski，Nature369：221-24(1994)；Liu与Taylor，Nucl.Acids Res.26：3300-04(1999)；Wang与Kool，Nucl.Acids Res.22：2326-33(1994)中找到。
作为连接作用剂利用适合波长的光的光连接也包括在本发明的揭示范围内。根据本发明的实例，光连接包含具有核苷酸模拟的探针，包含4-硫代胸腺嘧啶核苷(s4T：4-thiothymidine)、5-乙烯尿嘧啶(5-vinyluracil)及其类似物或者其组合物，但是不局限于此。根据本发明的实例，连接作用剂包含(a)UV-A范围(约320nm至约400nm)、UV-B范围(约290nm至约320nm)或者其组合的光，(b)约300nm和约375nm之间的波长的光，(c)约360nm至约370的波长的光，(d)约364nm至约368nm的波长的光，或者(e)约366nm的波长的光。光连接的详细说明也可在其他许多文献中Fujimoto等，Nucl.Acid Symp.Ser.42：39-40(1999)；Fujimoto等，Nucl.Acid Res.Suppl.201：185-86(2001)；Fujimoto等，Nucl.Acid Suppl.，2：155-56(2002)；Liu与Taylor，Nucl.Acid Res.26：3300-04(1998)中找到。
根据本发明的优选实例，连接反应利用如噬菌体T4连接酶、E.coli连接酶及热稳定性连接酶的连接酶来实施。更优选地，连接反应利用包含Afu连接酶、Taq连接酶、Tfl连接酶、Mth连接酶、Tth连接酶、Tth HB8连接酶、栖热菌门物种(Thermus species)AK16D连接酶、Ape连接酶、LigTk连接酶、Aae连接酶、Rm连接酶及Pfu连接酶的热稳定性连接酶来实施(Housby等，Nucl.Acids Res.28：e10(2000)；Tong等，Nucl.Acids Res.28：1447-54(2000)；Nakatani等，Eur，J.Biochem.269：650-56(2002)；Zirvi等，Nucl.Acids Res.27：e40(1999)；Sriskanda等，Nucl.Acids Res.11：2221-28(2000))。
通过连接而生成的核苷酸间键合(internucleotide linkage)包含磷酸二酯(phosphodiester)键及其他键合。例如，利用连接酶的连接一般生成磷酸二酯键。用于连接的非-酶性方法可形成其他核苷酸间键合。其他核苷酸间键合包含形成在α-卤代酰基(α-haloacyl group)及硫代磷酸酯基(phosphorothioate group)之间的硫代磷酰乙酰氨基(thiophosphorylacetylamino group)、形成在硫代磷酸酯基及甲苯磺酸酯基(tosylategroup)或者碘化物基(iodide group)之间的5’-硫代磷酸酯(5′-phosphorothioester)以及如焦磷酸酯(pyrophosphate)键合等适当的反应基之间的共价键的形成，但是不局限于此。
连接反应后，其结果物变性后且从靶核酸序列分离。
在本发明的在固相中实施的方法中，作为固定化探针的第一次探针或者第二次探针在固体基质的表面上实现固定化。作为非固定化探针的剩余探针未被固定化。
更优选地，在固相中实施的方法中，第一次探针通过其5’-末端在固体基质的表面上实现固定化，第二次探针未被固定化。选择性地，在固相中实施的方法中，第二次探针通过其3’-末端在固体基质的表面上实现固定化，第一次探针未被固定化(图6)。
将单一标记分子利用于固相时，优选地，上述单一标记位于非固定化探针上(图7)。
两个探针与非-靶核酸序列进行杂交时，探针不相互连接，变性的过程中非固定化探针从固定化探针分离，从而不生成信号。
如上所述，在本发明中变性步骤是特异性地检测靶核酸序列的检查点中的一个。
最终，检测到从第一次探针及第二次探针的连接结果物上的标记发出的信号，从而确认靶核酸序列的存在。
根据本发明的优选实例，本发明的固相方法在步骤(d)之前还包括为了去除未与固定化探针连接的非固定化探针而清洗步骤(c)的结果物的步骤。
根据本发明的优选实例，上述方法还包括反复进行步骤(a)-(c)或者步骤(a)-(d)的步骤。
根据本发明的优选实例，利用于步骤(a)的靶核酸序列为借助扩增引物进行预-扩增的核酸序列。优选地，扩增引物具有通式II的双重特异性寡核苷酸(DSO)结构。
已预-扩增的靶核酸序列可包含在与对于步骤(a)-(c)的反应环境(或者反应容器(vessel))不同的反应环境(或者反应容器)中进行预-扩增的靶核酸序列。选择性地，已预-扩增的靶核酸序列可得到在与对于步骤(a)-(c)的反应环境(或者反应容器(vessel))相同的反应环境(或者反应容器)中进行预-扩增的靶核酸序列。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)，第一次探针包含至少两种探针(优选为至少三种，更优选为至少五种)，第二次探针包含至少两种探针(更优选为至少三种，进而优选为至少五种)。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含核苷酸变异，更优选为单核苷酸多态性(SNP：single nucleotide polymorphism)。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列上的核苷酸变异位于第二次探针的5’-第二次杂交部位的对面。
【IV.基于液相或者固相中的杂交引起的荧光信号变化的靶检测方法】
根据本发明的还有一个实施方式，本发明提供一种利用靶区分性探针(TD probe)来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，该方法包括以下步骤：
(a)将上述靶核酸序列与靶区分性探针进行杂交的步骤，上述靶区分性探针包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述靶区分性探针具有以下通式I的变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在上述通式中，X’p是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次杂交部位(5’-second hybridization portion)；Y’q是包含至少三个通用碱基的分离部位(separation portion)，Z’r是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次杂交部位(3’-first hybridization portion)；上述靶区分性探针在上述5’-第二次杂交部位上用荧光报道分子进行标记；p、q及r表示核苷酸的个数；并且X’、Y’及Z’为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；上述5’-第二次杂交部位的Tm低于上述3’-第一次杂交部位的Tm，上述分离部位在上述三个部位中具有最低的Tm；上述分离部位在对于上述靶核酸序列的杂交方面，使上述5’-第二次杂交部位从上述3’-第一次杂交部位分离，由此上述靶区分性探针的杂交特异性借助上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位来双重性地决定，其结果，提高上述靶区分性探针的整体杂交特异性；
上述靶区分性探针与上述靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位均与靶核酸序列杂交，从而诱导从上述荧光报道分子发出的荧光的变化；上述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位均形成单链，从而不能诱导从上述荧光报道分子发出的荧光的变化，由此上述靶区分性探针区分上述靶核酸序列与非-靶核酸序列；以及
(b)检测上述荧光变化的步骤，上述荧光变化表示上述靶核酸序列的存在。
本发明利用靶区分性探针的5’-第二次杂交部位的其他杂交模式，因此为了避免本说明书的过度的复杂性，省略了相同的内容。
公开了单一荧光团(fluorophore)-标记寡核苷酸在单链及双链状态下发生其他荧光放出(参考；美国专利第7,348,141号及第7,537,886号)。
本发明者发现了靶区分性探针在其5’-第二次杂交部位上用单一荧光报道分子标记时，根据与靶或者非-靶核酸序列的杂交产生其他荧光强度。
最终检测的，从荧光报道分子发出的荧光的变化不仅包括荧光的增加而且还包括荧光的减少。能够检测变化的荧光的种类包括荧光强度、荧光极性、荧光寿命及荧光的量子产率，但是不局限于此。最优选为，检测的荧光为从荧光报道分子发出的荧光的强度。
根据与靶序列的杂交，从荧光报道分子发出的荧光的变化依赖于如标记的种类及位点等几种因素，这公开于美国专利第7,348,141号及第7,537,886号中。
在本发明中利用的荧光报道分子可参照上述本说明书的详细说明进行说明。根据本发明的优选实例，荧光报道分子为荧光素分子(例如，JOE、TET或则FAM)、罗丹明分子(例，TAMRA或者ROX)或者BODIPY530/550。
荧光报道分子位于在靶区分性探针中具有对于靶及非-靶序列的最大区分能力的5’-第二次杂交部位上。如本说明书全文所述，5’-第二次杂交部位的杂交动作为区分靶序列与非-靶序列的最决定性因素。
荧光报道分子位于5’-第二次杂交部位的5’-末端、3’-末端或者内部核苷酸(internal nucleotide)上。更优选为，荧光报道分子位于内部核苷酸上。
根据本发明的优选实例，荧光报道分子与尿嘧啶残基相连接。
根据本发明的优选实例，荧光变化在预定温度(predetermined temperature)或者规定范围的温度下进行观察。
根据本发明的优选实例，步骤(a)一同利用上述靶区分性探针、反向引物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施，由此追加生成与上述靶区分性探针杂交的上述靶核酸序列，从而增加表示上述靶核酸序列的存在的上述荧光变化。
根据本发明的优选实例，步骤(a)利用靶区分性探针、由正向引物及反向引物的量个引物构成的一对引物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施，与靶区分性探针杂交的靶核酸序列借助聚合酶链式反应(PCR)来扩增，从而提高表示靶核酸序列的存在的荧光变化。
选择性地，靶区分性探针由能够猝灭报道分子的荧光的猝灭分子追加进行标记。靶区分性探针或者靶区分性探针的5’-第二次杂交部位不与靶核酸序列进行杂交时，使上述猝灭剂对报道分子的荧光进行猝灭。
根据本发明的优选实例，靶区分性探针或者靶区分性探针的5’-第二次杂交部位不与靶核酸序列进行杂交时，使上述猝灭剂结构性(conformationally)地对报道分子的荧光进行猝灭。
根据本发明的优选实例，猝灭分子为荧光，表示所检测的靶核酸序列的存在的信号为从荧光猝灭分子发出的信号。
本发明利用反向引物或者一对引物实施时，模板-依赖性核酸聚合酶优选为没有5’→3’外切核酸酶活性的热稳定性聚合酶，这包含Taq聚合酶的斯托菲尔片段(Stoffelfragment)(F C Lawyer等，Genome Res.2：275-287(1993))及Thermus aq uaticus，Thermus flavus或者Thermus thermophilus的DNA聚合酶的突变型(美国专利第5885813号)。其例子如下：KOD(exo-)DNA聚合酶(TOYOBO)、Vent(exo-)DNA聚合酶(NEB)、Deep vent(exo-)DNA聚合酶(NEB)、PlatinumTM Tfi Exo(-)DNA聚合酶(Invitrogen)、Amplitaq DNA聚合酶stoffel fragment(ABI)、Exo-Pfu DNA聚合酶(Agilent)。
本发明的方法还可以利用具有5’→3’外切核酸酶活性的热稳定性聚合酶来实施。
根据本发明的优选实例，本发明的方法在液相或者固相中实施。本发明的方法在固相中实施时，靶区分性探针通过其3’-末端固定化在固体基质的表面上。
V.能够区分靶序列的探针的设计及制备
根据本发明的又一实施方式，本发明提供一种探针分子从非-靶核酸序列区分靶核酸序列的方法，该方法包括以下步骤：
(a)选择靶核酸序列的步骤；
(b)设计(designing)探针分子的序列的步骤，由此具有(i)与上述靶核酸序列互补的杂交序列及(ii)包含至少三个通用碱基的分离部位的分离部位，上述分离部位存在于杂交序列内，用于形成上述探针分子的三个部位；以及
(c)决定上述探针分子的上述分离部位位点的步骤，使得位于上述分离部位的上述5’-方向的部位具有低于上述分离部位的3’-方向的部位的Tm，使得上述分离部位在上述三个部位中具有最低的Tm，由此提供具有三个不同部位的探针分子，该探针分子具有相互不同的Tm值；在上述三个部位中，(i)上述探针分子的5’-第二次杂交部位具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，(ii)上述探针分子的3’-第一次杂交部位包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(iii)位于上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位之间的上述探针分子的分离部位具有至少三个通用碱基；上述5’-第二次杂交部位的Tm低于3’-第一次杂交部位的Tm，上述分离部位在三个部位中具有最低的Tm，
上述靶区分性探针与上述非核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位均与靶核酸序列杂交；上述靶区分性探针与上述非-靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位均形成单链，由此上述探针分子区分上述靶核酸序列与非-靶核酸序列。
本发明的方法提供一种极致增加对于靶序列的探针的区分能力的新颖的接近法。本发明的方法也同样表现为改善对于靶序列的探针的区分能力的方法。
本发明的方法为了制备在本说明书中议论的靶区分性探针而实施。因此，为了避免本说明书的不必要的重复，不反复记载其之间共同的内容，但是上述记载事项与反复记载相同地插入到本说明书中。
本发明的方法将新颖的特征导入到寡核苷酸序列本身，因此提供增加区分能力的新颖的战略，这使新颖的探针对于靶及非-靶序列表现相互不同的杂交动作。
对于本发明的方法而言，设计探针分子的序列是非常重要的事。上述探针分子具有(i)与靶核酸序列互补的杂交序列及(ii)包含至少三个通用碱基的分离部位，这样的分离部位存在于杂交序列内，用于形成探针分子的三个部位。
在这步骤中，提供寡核苷酸的结构形态，从而在寡核苷酸具有5’-末端部位/分离部位/3’-末端部位。5’-末端部位及3’-末端部位均具有与靶核酸序列互补的杂交序列，分离部位介于上述两个部位之间。
在本发明中最重要的步骤为决定探针内分离部位的位置，这使在分离部位的5’-方向的部位具有低于在分离部位的3’-方向的部位的Tm，使分离部位在三个部位中具有最低的Tm，由此提供具有三个不同部位的寡核苷酸，该三个不同部位具有相互不同的Tm值。
根据本发明的方法，导入到寡核苷酸的新颖的结构特征如下：(i)寡核苷酸序列中三个不同部位(5’-第二次杂交部位、分离部位及3’-第一次杂交部位)；(ii)三个部位的相互不同的Tm值；(iii)在5’-第二次杂交部位及3’-第一次杂交部位之间包含至少三个通用碱基的分离部位；(iv)对于杂交，干预与靶的分子性相互作用的两个部位，上述两个部位在杂交过程中借助分离部位分离；(v)3’-第一次杂交部位、5’-第二次杂交部位及分离部位顺序的Tm值。这样的结构性特征，使探针的杂交相对于靶序列及非-靶序列以明确不同的方式发生，这将极致地增加对于靶序列的探针的杂交特异性。
【IV.用于靶检测的试剂盒】
【1.用于液相中的靶检测的试剂盒】
根据本发明的另一实施方式，本发明提供用于从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，该试剂盒包含具有上述的通式I的变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构的靶区分性探针(TD probe)，该靶区分性探针用于区分靶核酸序列与非-靶核酸序列。
本发明的试剂盒是为了实施上述的本发明的检测方法而制备的，为了避免本说明书的复杂性，省略其之间的重复的内容。
根据本发明的优选实例，靶区分性探针具有包含产生可检测信号的一个标记或者多个标记的相互作用性标记系统。
更优选地，相互作用性标记系统为由位于靶区分性探针上的报道分子及猝灭分子构成的一对。
根据本发明的优选实例，报道分子及上述猝灭分子均位于5’-第二次杂交部位，或者报道分子及上述猝灭分子分别位于5’-第二次杂交部位及分离部位的各个不同的位点。
根据本发明的优选实例，靶区分性探针在其5’-第二次杂交部位具有报道分子及猝灭分子中的一个，在其3’-第一次杂交部位具有另一个。
根据本发明的优选实例，上述试剂盒还包含具有5’→3’外切核酸酶活性的酶。
根据本发明的优选实例，试剂盒在与具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸序列聚合酶及靶区分性探针的杂交位点的下游位置杂交的上述引物和反向引物中还包含至少一个引物。
根据本发明的优选实例，使用的靶核酸序列是通过扩增引物预扩增的核酸序列，且所述试剂盒还包含扩增引物。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列，靶区分性探针包含至少两种探针。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列，靶区分性探针包含至少两种探针，上游引物包含至少两种引物，或者反向引物包含至少两种引物。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含核苷酸变异。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列上的上述核苷酸变异存在于上述靶区分性探针的上述5’-第二次杂交部位的对面。
根据本发明的优选实例，靶区分性探针具有阻断剂部位，该阻断剂部位包含对具有上述5’→3’外切核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的至少一个核苷酸作为阻断剂(blocker)，上述阻断剂部位位于靶区分性探针的3’-第一次杂交部位。
【2.用于固相中的靶检测的试剂盒】
根据本发明的又一实施方式，本发明提供一种利用靶区分性探针(TD probe)，在固相中，用于从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其包含：
(a)上述靶区分性探针，其具有与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述靶区分性探针通过其3’-末端，在固体基质的表面上实现固定化；上述靶区分性探针具有下述通式I的变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在上述通式中，X’p是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次杂交部位(5’-second hybridization portion)；Y’q是包含至少三个通用碱基的分离部位(separation portion)，Z’r是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次杂交部位(3’-first hybridization portion)；上述靶区分性探针具有产生可检测信号的标记，上述标记位于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位；p、q及r表示核苷酸的个数；并且X’、Y’及Z’是脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；上述5’-第二次杂交部位的Tm低于上述3’-第一次杂交部位的Tm，上述分离部位在上述三个部位中具有最低的Tm；上述分离部位在对于上述靶核酸序列的杂交方面，使上述5’-第二次杂交部位从上述3’-第一次杂交部位分离，由此借助上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位来双重性地决定上述靶区分性探针的杂交特异性，其结果，提高上述靶区分性探针的整体杂交特异性；
上述靶区分性探针与上述靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位均与上述靶核酸序列杂交，上述5’-第二次杂交部位由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割；上述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位均形成单链，由此上述5’-第二次杂交部位不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，据此上述靶区分性探针从上述非-靶核酸序列区分上述靶核酸序列；以及
(b)上述固体基质。
本发明的试剂盒是为了实施上述的本发明的检测方法而制备的，因此为了避免本说明书的复杂性。省略重复的内容。
根据本发明的优选实例，标记为化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、相互作用性标记、发光标记、化学发光标记或者金属标记。更优选为，就标记而言，相互作用性标记为由位于靶区分性探针上的报道分子及猝灭分子构成的一对，靶区分性探针在位于由具有上述5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的上述5’-第二次杂交部位上的一个位点(site)具有上述报道分子及上述猝灭分子中的一个，在不被具有上述5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的一个位点具有另一个。
根据本发明的优选实例，猝灭分子位于由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的上述靶区分性探针的5’-第二次杂交部位上的一个位点(site)，上述荧光报道分子位于不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的位点；靶区分性探针与靶核酸序列进行杂交时，其5’-第二次杂交部位由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，荧光报道分子从靶区分性探针上的猝灭分子解离，从而产生荧光信号；靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，5’-第二次杂交部位不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，从而不产生荧光信号，由此检测固体基质上的荧光信号，以便决定靶核酸序列的存在。
根据本发明的优选实例，试剂盒还包含具有5’→3’外切核酸酶活性的酶。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列，靶区分性探针包含至少两种探针。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含核苷酸变异，靶核酸序列上的核苷酸变异存在于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位的对面。
根据本发明的优选实例，靶区分性探针具有阻断剂部位，该阻断剂部位包含对具有上述5’→3’外切核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的至少一个核苷酸作为阻断剂(blocker)，上述阻断剂部位位于靶区分性探针的3’-第一次杂交部位。
【3.利用聚合酶链式反应(PCR)的靶检测用试剂盒】
根据本发明的另一实施方式，提供一种利用靶区分性探针(TD probe)及聚合酶链式反应(PCR)，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其包含：
(a)靶区分性探针，其具有与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及
(b)一对引物，其由两个引物构成，即为分别具有与上述靶核酸序列互补的杂交序列的上游引物及反向引物；
靶区分性探针在两个引物之间的位置进行杂交；靶区分性探针具有以下通式I的变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在上述通式中，X’p是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次杂交部位(5’-second hybridization portion)；Y’q是包含至少三个通用碱基的分离部位(separation portion)，Z’r是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次杂交部位(3’-first hybridization portion)；上述靶区分性探针由猝灭荧光报道分子及报道分子的荧光的猝灭分子进行双重标记；上述荧光报道分子及上述猝灭分子均位于上述5’-第二次杂交部位，或者上述报道分子及上述猝灭分子分别位于上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位的各个不同的部位；p、q及r表示核苷酸的个数；并且X’、Y’及Z’为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；上述5’-第二次杂交部位的Tm低于上述3’-第一次杂交部位的Tm，上述分离部位在上述三个部位中具有最低的Tm；上述分离部位在对于上述靶核酸序列的杂交方面，使上述5’-第二次杂交部位从上述3’-第一次杂交部位分离，由此借助上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位来双重性地决定上述靶区分性探针的杂交特异性，其结果，提高上述靶区分性探针的整体杂交特异性；
上述靶区分性探针与上述靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位均与上述靶核酸序列杂交，上述5’-第二次杂交部位由上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性所切割；上述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位均形成单链，从而上述5’-第二次杂交部位不被上述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性所切割，由此上述靶区分性探针区分上述靶核酸序列与非-靶核酸序列。
根据本发明的优选实例，试剂盒还包含具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列为利用扩增引物进行预-扩增的(pre-amplified)核酸序列，试剂盒还包含扩增引物。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列，靶区分性探针包含至少两种探针，正向引物包含至少两种引物，反向引物包含至少两种引物。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含核苷酸变异。
根据本发明的优选实例，正向引物、反向引物、或者扩增引物具有通式II的双重特异性寡核苷酸(DSO)结构。
根据本发明的优选实例，靶区分性探针具有阻断剂部位，该阻断剂部位包含对具有上述5’→3’外切核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的至少一个核苷酸作为阻断剂(blocker)，上述阻断剂部位位于靶区分性探针的3’-第一次杂交部位。
根据本发明的优选实例，靶区分性探针的阻断剂部位位于靶区分性探针的3’-第一次杂交部位上。更优选为，靶区分性探针的阻断剂部位与分离部位的3’-末端毗邻而定位。
根据本发明的优选实例，阻断剂部位包含1-10阻断剂。
【4.利用连接反应的靶检测用试剂盒】
根据本发明的又一实施方式，提供一种利用靶区分性探针(TD probe)，借助连接反应从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其包含：
(a)第一次探针，其具有与靶核酸序列的第一位点互补的杂交核酸序列；以及
(b)第二次探针，其具有与位于第一位点的上游的上述靶核酸序列的第二位点互补的杂交核酸序列的；
上述第一次探针及上述第二次探针中至少一个具有产生可检测信号的标记；上述第二次探针是靶区分性探针；上述靶区分性探针具有下述通式I的变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在上述通式中，X’p是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次杂交部位(5’-second hybridization portion)；Y’q是包含至少三个通用碱基的分离部位(separation portion)，Z’r是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次杂交部位(3’-first hybridization portion)；p、q及r表示核苷酸的个数；并且X’、Y’及Z’为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；上述5’-第二次杂交部位的Tm低于上述3’-第一次杂交部位的Tm，上述分离部位在上述三个部位中具有最低的Tm；上述分离部位在对于上述靶核酸序列的杂交方面，使上述5’-第二次杂交部位从上述3’-第一次杂交部位分离，由此借助上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位来双重性地决定上述靶区分性探针的杂交特异性，其结果，提高上述靶区分性探针的整体杂交特异性；
上述第二次探针与上述靶核酸序列进行杂交时，上述第二次探针的上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位均与上述靶核酸序列杂交，发生上述第一次探针及上述第二次探针的连接；上述第二次探针与非-靶核酸序列进行杂交时，上述第二次探针的上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位均形成单链，不发生上述第一次探针及上述第二次探针的连接，由此上述第二次探针区分上述靶核酸序列与非-靶核酸序列。
根据本发明的优选实例，试剂盒还包含用于连接与靶核酸序列杂交的第一次探针及第二次探针的连接酶。
根据本发明的优选实例，标记为化学标记、酶标记、放射性标记、荧光标记、相互作用性标记、发光标记、化学发光标记或者金属标记。
根据本发明的优选实例，标记为包含一对的报道分子及猝灭分子的相互作用性标记系统。
根据本发明的优选实例，第一次探针具有通式II的双重特异性寡核苷酸(DSO)结构。
根据本发明的优选实例，利用的靶核酸序列为利用扩增引物进行预-扩增的(pre-amplified)核酸序列，试剂盒还包含扩增引物。
根据本发明的优选实例，试剂盒在固相中利用；上述第一次探针通过其5’-末端在固体基质的表面上实现固定化，第二次探针未被固定化。
根据本发明的优选实例，试剂盒在固相中利用；上述第二次探针通过其3’-末端在上述固体基质的表面上实现固定化，上述第一次探针未被固定化。
根据本发明的优选实例，当与靶核酸序列杂交时，该第一引物和第二引物位于彼此紧邻的位置。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含至少两种核酸序列，第一次探针及第二次探针分别包含至少两种探针。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列包含核苷酸变异。
根据本发明的优选实例，靶核酸序列上的核苷酸变异存在于第二次探针的5’-第二次杂交部位的对面。
5.基于杂交的靶检测用试剂盒
根据本发明的另一实施方式，提供一种利用靶区分性探针(TD probe)，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其包含：
靶区分性探针(TD probe)具有用于区分靶核酸序列与非-靶核酸序列的以下通式I的变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在上述通式中，X’p是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二次杂交部位(5’-second hybridization portion)；Y’q是包含至少三个通用碱基的分离部位(separation portion)，Z’r是具有与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一次杂交部位(3’-first hybridization portion)；上述靶区分性探针由荧光报道分子在上述5’-第二次杂交部位上进行标记；p、q及r表示核苷酸的个数；并且X’、Y’及Z’为脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；上述5’-第二次杂交部位的Tm低于上述3’-第一次杂交部位的Tm，上述分离部位在上述三个部位中具有最低的Tm；上述分离部位在对于上述靶核酸序列的杂交方面，使上述5’-第二次杂交部位从上述3’-第一次杂交部位分离，由此借助上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位来双重性地决定上述靶区分性探针的杂交特异性，其结果，提高上述靶区分性探针的整体杂交特异性；上述靶区分性探针与上述靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述3’-第一次杂交部位均与靶核酸序列杂交，从而诱导从上述荧光报道分子发出的荧光的变化；上述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，上述5’-第二次杂交部位及上述分离部位均形成单链，从而不能诱导从上述荧光报道分子发出的荧光信号，由此上述靶区分性探针区分上述靶核酸序列与非-靶核酸序列；以及
根据本发明的优选实例，本发明的试剂盒为了追加生成与靶区分性探针杂交的靶核酸序列，包含反向引物及模板-依赖性核酸聚合酶，这将增加表示靶核酸序列的存在的荧光的变化。
优选地，试剂盒为了通过聚合酶链式反应(PCR)对与靶区分性探针杂交的靶核酸序列进行扩增，包含由正向引物及反向引物等两个引物构成的一对引物及模板-依赖性核酸聚合酶，这将增加表示靶核酸序列的存在的荧光的变化。
选择性地，靶区分性探针由能够猝灭报道分子的荧光的猝灭分子进行追加标记。就猝灭剂而言，靶区分性探针不干预与靶核酸序列的杂交时，能够在靶区分性探针上诱导自发性猝灭(self quenching)。
本发明的试剂盒包含反向引物或者一对引物时，模板-依赖性核酸聚合酶优选为没有5’→3’外切核酸酶活性的热稳定性聚合酶，这将包含Taq聚合酶的斯托菲尔片段(Stoffel fragment)(F C Lawyer等，Genome Res.2：275-287(1993))及Thermusaquaticus，Thermus flavus或者Thermus thermophilus的DNA聚合酶的突变型(美国专利第5885813号)。
本发明的试剂盒为液相用或者固相用。
在本发明中，上述的本发明的试剂盒选择性地可包含在靶扩增聚合酶链式反应(PCR)(例如，聚合酶链式反应)中所需的如缓冲液、DNA聚合酶辅因子及脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸酯等试剂。追加地，本发明的试剂盒还可包含多种多聚核苷酸分子、反转录酶、多种缓冲液及试剂以及抑制DNA聚合酶活性的抗体。并且，试剂盒可包含实施阳性对照组及阴性对照组反应时所需的试剂。熟知本说明书的公开事项的本领域的技术人员能够容易地决定在任意一个特定反应中使用的试剂的最适量。典型的是，本发明的试剂盒由包含在前面揭示的构成成分的额外的包装或者部分而制备。
本发明的特征与优点可归纳为如下：
(a)具有变性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构的靶区分性探针，通过包含5’-第二次杂交部位及3’-第一次杂交部位的其整体序列与靶核酸序列杂交，其包含5’-第二次杂交部位及3’-第一次杂交部位。在靶区分性探针的靶特意性杂交的条件下，靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，其3’-第一次杂交部位与非-靶核酸序列进行非-特异性结合，但是5’-第二次杂交部位及分离部位均不与非-靶核酸序列杂交，因此形成单链，这起源于其低的Tm值。
如上所述，靶区分性探针对于靶核酸序列与非-靶核酸序列，其5’-第二次杂交部位的杂交模式存在差异，这使其通过更高的特异性区分靶核酸序列与非-靶核酸序列。
(b)利用靶区分性探针的靶检测应用表示极致地改善的靶-特异性，其起源于如下的靶-监控事件(target-surveillance event)：第一，如上所述，对靶及非-靶核酸序列具有分别不同杂交模式的靶区分性探针能够以非常高的特异性区分靶核酸序列与非-靶核酸序列。第二，连续的酶反应(5’→3’外切核酸反应或者连接)的发生与否，取决于靶区分性探针的杂交模式，这在靶检测过程中，使得靶-特异性得到提升。
(c)基于靶区分性探针的杂交模式的差异的靶区分性特征成功应用于利用具有5’→3’外切核酸酶活性的酶的靶检测方法，因此完全防止假阳性信号(结果)生成。例如，在5’-末端部位包含标记的现有探针在其5’-部位与非-靶核酸序列进行杂交时，5’-部位由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，从而可产生假阳性信号。与此不同地，靶区分性探针即使与非-靶核酸序列杂交，5’-第二次杂交部位也不进行杂交，因此不产生假阳性信号。
(d)在用于检测靶核酸序列的实时聚合酶链式反应(PCR)方法中，报道分子及猝灭分子均位于5’-第二次杂交部位，或者分别位于5’-第二次杂交部位及分离部位的靶区分性探针，表示卓越的假阳性信号生成防止效果。如TaqManTM探针方法等现有的技术，特别是在多重靶检测时假阳性信号更能成为问题，但是本发明使用将报道分子及猝灭分子均位于5’-第二次杂交部位的靶区分性探针，因此能够有效地克服这种问题。并且，使用在上述的5’-第二次杂交部位具有双重标记的靶区分性探针，因此能够克服根据使用的聚合酶的种类及反应条件而可能成为问题的与聚合酶的5’→3’内切核酸酶相关的缺点。
(e)靶区分性探针的独特的杂交模式卓越地抑制在利用连接活性的靶检测方法中的假阳性信号。一般而言，通过两个探针(上游第一次探针及下游第二次探针)的连接来检测靶核酸序列的方法，为了实现连接，两个(two)探针的毗邻末端部位需要形成双链(双链体)。在作为第二次探针使用靶区分性探针的本发明的连接试验中，靶区分性探针与非-靶序列进行杂交时，靶区分性探针的5’-第二次杂交部位形成单链，因此防止连接反应而不产生假阳性信号。
(f)利用5’-第二次杂交部位的其他杂交模式，因此靶区分性探针提供区分单一碱基变异的卓越的特异性。即使在靶区分性探针的5’-第二次杂交部位与核酸序列之间只存在一个错配碱基时，靶区分性探针将上述序列识别为非-靶，从而5’-第二次杂交部位不进行杂交而形成单链，从而不产生假阳性信号。因此，靶区分性探针对单核苷酸多态性(SNP)检测具有非常优秀的区分能力。
(g)靶区分性探针使用于固相，从而能够体现正确且大容量的靶核酸序列检测用微阵列系统。利用现有的探针的微阵列系统存在因非-特异性杂交而产生假阳性信号的问题。与此对照地，从5’-第二次杂交部位的杂交模式的差异区分靶核酸序列与非-靶核酸序列的靶区分性探针及基于5’→3’外切核酸酶活性(或者连接活性)的本发明的固相试验不仅能够以实时方式检测靶核酸序列，并能够正确且迅速地检测靶核酸序列。
以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。这些实施例仅是用于更加具体地说明本发明的，根据本发明的主旨本发明的范围不局限于这些实施例，这对本发明所属的技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
【实施例】
【实施例1：对具有5’→3’外切核酸酶活性的酶的5’-末端错配探针的切割活性评价】
本发明者进行了具有5’→3’外切核酸酶活性的酶是否能够切割具有错配在5’-末端部位的核苷酸的探针的实验。
为了对该评价进行实验，将对于金黄色葡萄球菌(SA：Staphylococcus aureus)基因的合成寡核苷酸利用为模板。利用了5个不同类型的双重-标记(dual-labeled)探针，其分别在5’-末端部位包含匹配(matching)序列、一个错配核苷酸、三个错配核苷酸、六个错配核苷酸及九个错配核苷酸。上述双重-标记的探针，作为荧光报道分子在5’-末端部位具有6-羧基荧光素(6-FAM：6-carboxyfluorescein)，作为猝灭分子在3’-末端部位具有黑洞猝灭剂-1(BHQ-1：Black Hole Quencher 1)。上述双重-标记探针借助在其3’-末端部位的C3间隔区而变形(modifying)，但这样的双重-标记探针并不会延长。
为了上述双重-标记探针及模板(金黄色葡萄球菌基因：S.aureus基因)的5’→3’外切核酸反应(5’→3’exonucleolytic reaction)，利用了具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。在各循环的杂交步骤中测定了信号。
在本实施例中利用的对于金黄色葡萄球菌基因的合成模板及双重-标记探针的序列如下：
SA_T705’-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3’(SEQ ID NO：1)
SA_P05’-[FAM]CATTCGGT[T(BHQ-1)]TACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ IDNO：2)
SA_P15’-[FAM]CCATTCGGT[T(BHQ-1)]TACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ IDNO：3)
SA_P35’-[FAM]TGCCATTCGGT[T(BHQ-1)]TACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ IDNO：4)
SA_P65’-[FAM]ACTTGCCATTCGGT[T(BHQ-1)]TACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQID NO：5)
SA_P95’-[FAM]ACAACTTGCCATTCGGT[T(BHQ-1)]TACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：6)
(下划线及粗体字表示错配核苷酸。)
在含有对于金黄色葡萄球菌(SEQ ID NO：1)的合成寡核苷酸0.2pmole(皮摩尔)、双重-标记探针(SEQ ID NO：2、3、4、5或者6)5pmole及2X主混合液10μl的20μl的最终体积中实施了外切核酸反应。上述主混合液含有6mM氯化镁(MgCl2)、dNTPs 200μM及DiaStarTMTaqDNA聚合酶(索尔杰恩特公司，韩国(Solgent，Korea))2单元(unit)；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司：Bio-Rad)；将上述反应混合物在95℃中进行2分钟变性后，在95℃下，20秒及在60℃下，60秒过程反复进行了40次。检测了在各循环的杂交步骤(60℃)中产生的信号。
如图8所示，利用在5’-末端部位具有匹配序列的双重-标记探针及在5’-末端部位具有一个错配核苷酸的双重-标记探针时，产生对于金黄色葡萄球菌(SA)的荧光信号(NOs.1及3)。另一方面，利用在5’-末端部位具有至少三个错配核苷酸的双重-标记探针时，未得到对于SA的任何荧光信号(NOs.5、7及9)。就没有模板的阴性对照组而言，也没有信号(NOs.2、4、6、8及10)。
这样的结果是指，具有5’→3’外切核酸酶活性的酶不切割在5’-末端部位具有至少三个错配核苷酸的双重-标记探针。
【实施例2：对于利用具有5’→3’外切核酸酶活性的酶的靶核酸序列及非-靶核酸序列的区分的双重-标记靶区分性探针的评价】
对于双重-标记靶区分性探针利用具有5’→3’外切核酸酶活性的酶，能否从非-靶核酸序列中区分靶核酸序列，评价了本发明的靶区分性探针。
首先，本发明者借助靶区分性探针的5’-第二次杂交部位(second hybridizationportion)的相异的杂交模式确认了是否产生靶-特意信号。
为了对该评价进行实验，将对于金黄色葡萄球菌(SA：Staphylococcus aureus)及淋病奈瑟球菌(NG：Neisseria gonorrhoeae)基因的合成寡核苷酸利用为模板。对于各基因的靶区分性探针的两种不同类型分别在5’-第二次杂交部位具有匹配序列及错配序列。双重-标记靶区分性探针作为荧光报道分子在5’-末端具有6-羧基荧光素(6-FAM：6-carboxyfluorescein)，作为猝灭分子在3’-第一次杂交部位具有黑洞猝灭剂-1(BHQ-1：Black Hole Quencher 1)。上述双重-标记探针借助在其3’-末端的C3间隔区而变形(modifying)，这样的双重-标记探针不会延长。
为了上述双重-标记靶区分性探针及上述靶模板(金黄色葡萄球菌或者淋病奈瑟菌基因)的5’→3’外切核酸反应，利用了具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。在各循环的杂交步骤测定了上述信号。
【A.产生对于利用TD探针的金黄色葡萄球菌(S.aureus)基因的靶-特异信号】
在本实施例中利用的对于金黄色葡萄球菌(S.aureus)基因的合成模板及双重-标记靶区分性探针的序列如下：
SA_T705’-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3’(SEQ ID NO：1)
SA_TD_M5’-[6-FAM]CATTCCGTGGIIIIICATTCGGTT[T(BHQ-1)]ACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：7)
SA_TD_m5’-[6-FAM]TGCCTTATAAIIIIICATTCGGTT[T(BHQ-1)]ACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：8)
(下划线及粗体字表示错配核苷酸。)
在含有对于金黄色葡萄球菌(SEQ ID NO：1)的合成寡核苷酸0.2pmole、双重-标记靶区分性探针(SEQ ID NO：7或者8)5pmole及2X主混合液10μl的20μl的最终体积中实施了外切核酸反应。上述主混合液含有6mM氯化镁(MgCl2)、dNTPs 200μM及DiaStarTMTaq DNA聚合酶(索尔杰恩特公司，韩国(Solgent，Korea))2单元；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司：Bio-Rad)；将上述反应混合物在95℃中进行2分钟的变性(denaturing)后，将在95℃中20秒及60℃中60秒过程反复了40次。由此检测了在各循环的杂交步骤(60℃)中产生的信号。
如图9A所示，利用在5’-第二次杂交部位具有匹配序列的双重-标记靶区分性探针时，产生了对于金黄色葡萄球菌(SA)靶核酸序列的荧光信号(NO.1)。另一方面，利用在5’-第二次杂交部位具有错配序列的双重-标记靶区分性探针时，得不到对于金黄色葡萄球菌靶核酸序列的任何荧光信号(NO.3)。就没有模板的阴性对照组而言，也没有信号(NOs.2及4)。
【B.产生对于利用靶区分性探针的淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)基因的靶-特异信号】
在本实施例中利用的对于淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)基因的合成模板及双重-标记靶区分性探针的序列如下：
NG_T1005’-GAAATTATGCCCTTAAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3’(SEQ ID NO：9)；
NG_TD_M5’-[6-FAM]AGCATCATGCIIIIIATTGGCGTG[T(BHQ-1)]TTCGCATATTTAAG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：10)；
NG_TD_m5’-[6-FAM]GATGCTGTATIIIIIATTGGCGTG[T(BHQ-1)]TTCGCATATTTAAG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：11)；
(下划线及粗体字表示上述错配的核苷酸。)
除了模板(淋病奈瑟菌：N.gonorrhoeae 2 pmole)及双重-标记靶区分性探针(SEQID NO：10或者11)以外，通过与对于金黄色葡萄球菌(S.aureus)利用的相同的实验方案实施了外切核酸反应。
如图9B所示，利用在5’-第二次杂交部位具有匹配序列的双重-标记靶区分性探针时，产生对于淋病奈瑟菌(NG)靶核酸序列的荧光信号(NO.1)。另一方面，利用在5’-第二次杂交部位具有错配序列的双重-标记靶区分性探针时，未得到对于NG靶核酸序列的任何荧光信号(NO.3)。就没有模板的阴性对照组而言，也没有信号(NOs.2及4)。
这样的结果表现出依赖于5’-第二次杂交部位的杂交的靶区分性探针的靶信号产生，这表示靶区分性探针能够区分靶核酸序列与非-靶核酸序列。
【实施例3：靶区分性探针及现有探针的5’-末端部位的效果】
调查了现有探针的5’-末端部位是否具有与靶区分性探针的5’-第二次杂交部位相同的效果。
为了这实验，利用了两种不同形态的靶区分性探针；一个靶区分性探针在5’-第二次杂交部位具有匹配序列，另一个在5’-第二次杂交部位具有三个错配核苷酸。现有探针除了脱氧肌苷(deoxyinosine)以外具有与上述靶区分性探针相同的序列。
将对于金黄色葡萄球菌(SA：Staphylococcus aureus)的合成寡核苷酸利用为模板。上述现有探针及靶区分性探针分别作为荧光报道分子在5’末端具有6-羧基荧光素(6-FAM：6-carboxyfluorescein)，作为猝灭分子在3’-末端部位具有黑洞猝灭剂-1(BHQ-1：Black Hole Quencher 1)。所有探针借助在其3’-末端的C3间隔区而变形(modifying)。
为了上述双重-标记靶区分性探针及上述靶模板(金黄色葡萄球菌：S.aureus)的5’→3’外切核酸反应，利用了具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。
在本实施例中利用的对于金黄色葡萄球菌(S.aureus)基因的合成模板、双重-标记现有探针及靶区分性探针的序列如下：
SA_T705’-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3’(SEQ ID NO：1)
SA_TD_M5’-[6-FAM]CATTCCGTGGIIIIICATTCGGTT[T(BHQ-1)]ACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：7)
SA_TD_m15’-[6-FAM]CACCTCGTGGIIIIICATTCGGTT[T(BHQ1)]ACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：12)
SA_Con_M5’-[6-FAM]CATTCCGTGGTCAATCATTCGGTT[T(BHQ-1)]ACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：13)
SA_Con_m15’-[6-FAM]CACCTCGTGGTCAATCATTCGGTT[T(BHQ-1)]ACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：14)
(下划线及粗体字表示上述错配核苷酸。)
在含有对于金黄色葡萄球菌(SEQ ID NO：1)的合成寡核苷酸0.2pmole、上述双重-标记TD探针(SEQ ID NO：7、12、13或者14)5pmole及2X主混合液10μl的20μl的最终体积中实施了外切核酸反应。上述主混合液包含6mM氯化镁(MgCl2)、dNTPs 200μM及DiaStarTMTaqDNA聚合酶(索尔杰恩特公司，韩国(Solgent，Korea))2单元；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司：Bio-Rad)；将上述反应混合物在95℃下进行两分钟变性后(denaturing)，将在95℃中20秒及60℃中60秒过程反复了40次。检测了在各循环的杂交步骤(60℃)中产生的信号。
如图10所示，利用在5’-第二次杂交部位具有匹配序列的双重-标记靶区分性探针时，产生了对于靶核酸序列的荧光信号(NO.1)。令人关注的是，利用在5’-第二次杂交部位具有三个错配核苷酸的靶区分性探针时，未得到任何荧光信号(NO.3)。相反地，不仅利用在5’-末端部位具有三个错配核苷酸的现有探针，还是利用在5’-末端部位具有匹配序列的现有探针时(NO.5及7)，都产生了信号。就没有模板的阴性对照组而言，也没有信号(NO.2、4、6及8)。
这样的结果显示，与靶区分性探针相对地，现有探针对非-特异性杂交而言产生假阳性信号。因此，靶区分性探针能够没有假阳性信号地检测靶核酸序列。
【实施例4：为了检测靶核酸序列而利用靶区分性探针的实时聚合酶链式反应(PCR)】
本发明者利用具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，并且为了检测靶核酸序列，在实时聚合酶链式反应(real-time PCR)应用了靶区分性探针。
为了此应用，将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及淋病奈瑟球菌(Neisseria gonorrhoeae)的基因组DNA(genomic DNAs)从各个细胞株提取而利用。靶区分性探针在5’-第二次杂交部位具有匹配序列或者错配序列。报道分子及猝灭分子均位于双重-标记靶区分性探针的5’-第二次杂交部位。
【A.用于检测金黄色葡萄球菌(S.aureus)基因的实时聚合酶链式反应(PCR)】
将金黄色葡萄球菌基因的靶核酸序列利用为模板时，在本实施例中利用的引物序列及双重-标记靶区分性探针的序列如下：
SA_F5’-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAAIIIIITAGCGACTTT-3’(SEQ ID NO：15)
SA_R5’-GATAAGTTTAAAGCTTGACCGTCIIIIITGATAGCGAT-3’(SEQ ID NO：16)
SA_TD2_M5’-[6-FAM]CATTCCG[T(BHQ-1)]GGIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：17)
SA_TD2_m5’-[6-FAM]TGCCTTA[T(BHQ-1)]]AAIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：18)；
(下划线及粗体字表示上述错配的核苷酸。)
在含有金黄色葡萄球菌基因组DNA 1ng、双重-标记靶区分性探针(SEQ ID NO：17或者18)5pmole、正向引物(SEQ ID NO：15)10pmole、反向引物(SEQ ID NO：16)10pmole及2X主混合液10μl的20μl的最终体积中实施了实时-聚合酶链式反应(PCR)。上述主混合液含有6mM氯化镁(MgCl2)、dNTPs 200μM及DiaStarTMTaq DNA聚合酶(索尔杰恩特公司，韩国(Solgent，Korea))2单元；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司：Bio-Rad)；将上述反应混合物在95℃中进行两分钟的变性后(denaturing)，将在95℃中20秒及再60℃中60秒过程反复了40次。检测了在各循环的杂交步骤(60℃)中产生的信号。
如图11A所示，利用在5’-第二次杂交部位具有匹配序列的上述双重-标记TD探针时，产生了对于金黄色葡萄球菌基因的靶荧光信号(NO.1)。另一方面，利用在5’-第二次杂交部位具有错配序列的双重-标记TD探针时，未得到对于金黄色葡萄球菌基因的靶核酸序列的荧光信号(NO.3)，这表示，位于5’-第二次杂交部位的报道分子及猝灭分子并没有分离。就没有模板的阴性对照组而言，也没有信号(NOs.2及4)。
【B.用于检测淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)的实时聚合酶链式反应(PCR：polymerase chain reaction)】
将淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)基因的靶核酸序列利用为模板时，在本实施例中利用的引物序列及双重-标记靶区分性探针的序列如下：
NG_F5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’(SEQ ID NO：19)
NG_R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’(SEQ ID NO：20)
NG_TD2_M5’-[6-FAM]AGCATCA[T(BHQ-1)]GCIIIIIATTGGCGTGTTTCGCATATTTAAG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：21)；
NG_TD2_m5’-[6-FAM]GATGCTG[T(BHQ-1)]ATIIIIIATTGGCGTGTTTCGCATATTTAAG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：22)；
(下划线及粗体字表示上述错配的核苷酸。)
除了模板(淋病奈瑟菌：N.gonorrhoeae 1ng)、双重-标记靶区分性探针(SEQ IDNOs：21及22)及引物(SEQ ID NOs：19及20)以外，通过与对于金黄色葡萄球菌所利用的相同的实验方案实施了实时聚合酶链式反应(PCR：polymerase chain reaction)。
如图11B所示，利用在5’-第二次杂交部位具有匹配序列的双重-标记靶区分性探针时，产生了对于淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)基因的靶荧光信号(NO.1)。另一方面，利用在5’-第二次杂交部位具有错配序列的双重-标记靶区分性探针时，未得到对于淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)基因的靶核酸序列的荧光信号(NO.3)，这表示，位于5’-第二次杂交部位的报道分子及猝灭分子并没有分离。就没有模板的阴性对照组而言，也没有信号(NOs.2及4)。
这样的结果表示，在5’-第二次杂交部位具有相互作用性标记系统的靶区分性探针可以利用于用于从非-靶核酸序列区分靶核酸序列的实时聚合酶链式反应(PCR：polymerase chain reaction)。
【实施例5：在实时聚合酶链式反应(PCR：polymerase chain reaction)中，利用双重-标记靶区分性探针的单核苷酸变异的检测】
本发明者对靶区分性探针是否能够区分核酸序列上的单核苷酸变异进行了调查。
为此实验，靶区分性探针在5’-第二次杂交部位具有匹配序列或者单错配核苷酸。报道分子及猝灭分子均位于双重-标记靶区分性探针的5’-第二次杂交部位。
将金黄色葡萄球菌(S.aureus)的基因组DNA利用为模板。在本实施例中利用的引物序列及双重-标记靶区分性探针的序列如下：
SA_F5’-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAAIIIIITAGCGACTTT-3’(SEQ ID NO：15)
SA_R5’-GATAAGTTTAAAGCTTGACCGTCIIIIITGATAGCGAT-3’(SEQ ID NO：16)
SA_TD_S_M5’-[6-FAM]TTCCG[T(BHQ-1)]GGIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：23)
SA_TD_S_m5’-[6-FAM]TTCTG[T(BHQ-1)]GGIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：24)
在含有金黄色葡萄球菌(S.aureu)基因组DNA500pg、双重-标记靶区分性探针(SEQID NO：23或者24)5pmole、正向引物(SEQ ID NO：15)10pmole、反向引物(SEQ ID NO：16)10pmole及2X主混合液10μl的20μl的最终体积中实施了实时聚合酶链式反应(PCR：polymerase chain reaction)。上述主混合液含有6mM氯化镁(MgCl2)、dNTPs 200μM及DiaStarTMTaq DNA聚合酶(索尔杰恩特公司，韩国(Solgent，Korea))2单元；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，伯乐公司：Bio-Rad)；将上述反应混合物在95℃中进行两分钟的变性后(denaturing)，将在95℃中20秒及再63℃中60秒的过程反复的40次。检测了在各循环的上述杂交步骤(63℃)中产生的信号。
如图12所示，利用在5’-第二次杂交部位具有匹配序列的双重-标记靶区分性探针时，产生了对于金黄色葡萄球菌(S.aureu)基因的荧光信号(NO.1)。另一方面，利用在5’-第二次杂交部位具有单错配核苷酸的双重-标记靶区分性探针时，未得到荧光信号(NO.3)。就没有模板的阴性对照组而言，也没有信号(NOs.2及4)。
这样的结果显示，在5’-第二次杂交部位具有单核苷酸错配时，靶区分性探针表示其他杂交模式。因此，可知靶区分性探针在实时聚合酶链式反应(PCR：polymerase chainreaction)中具有没有假阳性信号地区分包含单核苷酸多态性(SNP)的单核苷酸变异的高特异性。
【实施例6：在利用具有5’→3’外切核酸酶活性的酶的固相中的固定化靶区分性探针的评价】
本发明者对在固相中固定化靶区分性探针(immobilized TD probe)能否利用具有5’→3’外切核酸酶活性的酶，从非-靶核酸序列中区分靶核酸序列进行了追加的评价。
为此评价，将对于金黄色葡萄球菌(SA：Staphylococcus aureus)基因的合成寡核苷酸利用为模板。靶区分性探针在5’-第二次杂交部位具有匹配序列或者错配序列。就靶区分性探针而言，作为荧光报道分子在3’-第一次杂交部位具有Quasar570，作为猝灭分子在5’-末端具有黑洞猝灭剂-2(BHQ-2：Black Hole Quencher 2)，作为连接肽具有聚(T)7。就上述双重-标记靶区分性探针而言，利用3’-末端的氨基(AminnoC7)固定在固体基质(solidsubstrate)的表面上。将具有5’→3’外切核酸酶活性的Bst DNA聚合酶利用于5’→3’外切核酸反应。
在本实施例中利用的合成模板序列及双重-标记靶区分性探针的序列如下：
SA_T705’-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3’(SEQ ID NO：1)
SA_TD1_Chip_M5’-[BHQ2]CATTCCGTGGIIIIICATTCGGTT[T(QBasar570)]ACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO：25)
SA_TD1_Chip_m5’-[BHQ-2]TGCCTTATAAIIIIICATTCGGTT[T(QBasar570)]ACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7](SEQ ID NO：26)
(下划线及粗体字表示错配核苷酸。)
将靶区分性探针的两种不同类型(SEQ ID NO：25及26)在NSB9NHS载玻片(NSB浦项科技有限公司，韩国：NSB POSTECH，Korea)上实现固定化。将利用NSB测定点位缓冲液(NSBspotting buffer)溶解成最终浓度为20μM的靶区分性探针，利用基因芯片点样仪微阵列(OmniGrid Accent Microarrayer)(蒂吉莱博公司，美国：DIGILAB，US)印刷在NSB9NHS载玻片上。将各个靶区分性探针由2×1格式(双重点(duplicate spots))并行了测定点位(spotting)，将如此制备的微阵列在约85％湿度的腔室培养了一宿。为了去除非-特异性地结合的靶区分性探针，在37℃下，用含有2x SSPE(0.3M氯化钠(sodium chloride)、0.02M磷酸氢钠(sodium hydrogen phosphate)、2.0mM乙二胺四乙酸(EDTA：ETHYLENEDIAMINETETRAACETIC ACID))及7.0mM十二烷基硫酸钠(SDS：Sodium dodecylsulfate)的pH 7.4缓冲溶液中，对上述载玻片进行10分钟清洗之后用蒸馏水清洗。随后，利用载玻片离心分离器，将上述DNA-功能化的(DNA-functionalized)载玻片进行干燥，保管在4℃的暗室内以备后用。
以含有对于金黄色葡萄球菌(SEQ ID NO：1)的合成寡核苷酸10pmole、10x反应缓冲液3μl、各10mM dNTP 0.6μl及Bst DNA聚合酶(恩益碧公司，美国(NEB，USA))2单元的30μl的最终体积，在DNA-功能化的载玻片的表面上实施了外切核酸反应。在组装在交联(cross-linked)了靶区分性探针的NSB玻璃载玻片的表面上的腔室应用了上述整体混合物。利用原处(in situ)块方式使载玻片位于热循环仪(基因扩增仪B4I，中国：Genepro B4I，China)。在50℃下30分钟进行外切核酸反应，在95℃下，用蒸馏水清洗1分钟并停止。利用共聚焦激光扫描仪Axon Genepix4100A(分子器件，美国：molecular Device，US)通过5-μm像素分辨率的扫描获取了图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePix pro5.1软件(分子器件，美国：molecular Device，US)分析了荧光强度。就荧光强度而言，去除周边本底后用点-中央值表现。为了调查各点的再现性，反复进行了两次实验。用反复的点的平均值表示了荧光强度。
如图13所示，利用在5’-第二次杂交部位具有匹配序列的双重-标记靶区分性探针及模板时，产生了对于金黄色葡萄球菌(S.aureus)的荧光信号(SA_TD1_Chip_M，RFU65472.0±4.2)。另一方面，利用在5’-第二次杂交部位具有错配序列的双重-标记靶区分性探针时，未得到对于金黄色葡萄球菌(S.aureus)的荧光信号(SA_TD1_Chip_m，RFU3227.0±17.0)。就没有模板的阴性对照组而言，也没有信号(SA_TD1_Chip_M，RFU2798.0±4.2或者SA_TD1_Chip_m，RFU3077.0±9.9)。
这样的结果表示，上述固定化靶区分性探针应用于微阵列，能够从非-靶核酸序列区分靶核酸序列。
【实施例7：固定化靶区分性探针的5’-第二次杂交部位的效果】
本发明者对固定化靶区分性探针是否能够借助5’-第二次杂交部位的效果，在固相中去除假阴性信号进行了追加的实验。
为此实验，将对于金黄色葡萄球菌(SA：Staphylococcus aureus)基因的合成寡核苷酸利用为模板。靶区分性探针在5’-第二次杂交部位具有匹配序列或者三个错配核苷酸。现有的探针除了脱氧肌苷(deoxyinosine)之外，具有与靶区分性探针相同的序列。上述靶区分性探针及现有的探针作为荧光报道分子，在3’-第一次杂交部位具有Quasar570，作为猝灭分子，在5’-末端具有黑洞猝灭剂-2(BHQ-2：Black Hole Quencher 2)，作为连接肽具有聚(T)7。上述双重-标记靶区分性探针借助3’-末端的氨基(AminnoC7)而固定在固体基质的表面上。将具有5’→3’外切核酸酶活性的Bst DNA聚合酶利用于5’→3’外切核酸反应中。
在本实施例中利用的合成模板、双重-标记靶区分性探针及现有探针的序列如下：
SA_T705’-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3’(SEQ ID NO：1)
SA_TD1_Chip_M5’-[BHQ2]CATTCCGTGGIIIIICATTCGGTT[T(Quasar570)]ACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO：25)
SA_TD1_Chip_m15’-[BHQ-2]CACCTCGTGGIIIIICATTCGGTT[T(Quasar570)]ACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO：27)
SA_Con_Chip_M5’-[BHQ-2]CATTCCGTGGTCAATCATTCGGTT[T(Quasar570)]ACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO：28)
SA_Con_Chip_m15’-[BHQ-2]CACCTCGTGGTCAATCATTCGGTT[T(Quasar570)]ACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO：29)
(下划线及粗体字表示错配核苷酸。)
将上述探针(SEQ ID NO：25、27、28及29)固定化在NSB9 NHS载玻片(NSB浦项科技有限公司，韩国：NSB POSTECH，Korea)上。将借助NSB测定点位缓冲液(NSB spottingbuffer)溶解成最终浓度为20μM的各探针，利用基因芯片点样仪微阵列(OmniGrid AccentMicroarrayer)(蒂吉莱博公司，美国：DIFILAB，US)印刷在NSB9NHS载玻片上。将各个探针由2x1格式(双重点：duplicate spots)并行了测定点位(spotting)，将如此制备的微阵列在85％湿度的腔室培养了一宿。为了去除非-特异性地结合的探针，在37℃下，用含有2x SSPE(0.3M氯化钠(sodium chloride)、0.02M磷酸氢钠(sodium hydrogen phosphate)、2.0mM乙二胺四乙酸(EDTA：ETHYLENEDIAMINETETRAACETIC ACID))及7.0mM十二烷基硫酸钠(SDS：Sodium dodecyl sulfate)的pH 7.4缓冲溶液中，对上述载玻片进行10分钟清洗之后用蒸馏水清洗。随后，利用载玻片离心分离器，将上述DNA-功能化的(DNA-functionalized)载玻片进行干燥，保管在4℃的暗室内以备后用。
以含有对于金黄色葡萄球菌(SEQ ID NO：1)的合成寡核苷酸10pmole、10x反应缓冲液3μl及Bst DNA聚合酶(恩益碧，美国(NEB，USA))2单元的30μl的最终体积，在DNA-功能化的载玻片的表面上实施了外切核酸反应。将上述整体混合物应用于组装在交联了探针的NSB玻璃载玻片的表面上的腔室。以原处(in situ)块方式使载玻片位于热循环仪(基因扩增仪B4I，中国：Genepro B4I，China)。在50℃下实施了30分钟外切核酸反应，在95℃下用蒸馏水清洗了1分钟并停止。利用共聚焦激光扫描仪Axon GenePix4100A(分子器件，美国：molecular Device，US)，通过5-μm像素分辨率的扫描获取了图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePix pro5.1软件(分子器件，美国：molecular Device，US)分析了荧光强度。就荧光强度而言，去除周边本底后用点-中央值表现。为了调查各点的再现性，反复进行了两次实验。以反复的点的平均值表示了荧光强度。
如图14所示，利用在5’-第二次杂交部位具有匹配序列的上述双重-标记固定化探针及模板时，产生了对于金黄色葡萄球菌(SA)的靶核酸序列的荧光信号(SA_TD1_Chip_M，RFU：65467.0±5.7)。利用在5’-第二次杂交部位具有三个错配核苷酸的TD探针时，未得到信号(SA_TD1_Chip_m1，RFU：6679.5±222.7)。另一方面，不仅利用具有匹配序列(SA_Con_Chip_M，RFU：65464.5±6.4)的上述现有探针，而且利用具有三个错配核苷酸(SA_Con_Chip_m1，RFU：65464.0±5.7)的现有探针时，产生了信号。就没有模板的阴性对照组而言，也没有信号(SA_TD1_Chip_M，RFU：2716.5±12.0)(SA_TD1_Chip_m1，RFU：2810.5±14.8)(SA_Con_Chip_m1，RFU：3216.5±41.7)(SA_Con_Chip_M，RFU：2749.5±19.1)。
这样的结果与固定化靶区分性探针相反地显示，现有固定化探针借助非-特异性杂交而产生假阳性信号。因此，可以理解固定化靶区分性探针能够没有假阳性信号地检测靶核酸序列。
【实施例8：利用固定化在固体基质的表面上的单一标记靶区分性探针的靶核酸序列的检测】
本发明者为了在固相中检测靶核酸序列，追加利用了单一标记靶区分性探针。
为此评价，将对于金黄色葡萄球菌(SA：Staphylococcus aureus)基因的合成寡核苷酸利用为模板。靶区分性探针在5’-第二次杂交部位具有匹配序列或者错配序列。就上述靶区分性探针而言，作为荧光报道分子，在5’-末端具有6-羧基荧光素(6-FAM)或者6-羧基四甲基罗丹明(6-TAMRA：6-Carboxytetramethylrhodamine)，作为连接肽(linker)具有聚(T)7。单一标记靶区分性探针利用3’-末端的氨基(AminnoC7)来固定在固体基质(solidsubstrate)的表面上。在5’→3’外切核酸反应利用了具有5’→3’外切核酸酶活性的Bst或者Taq聚合酶。
【A.基于外切核酸反应的信号产生】
在本实施例中利用的合成模板序列及单一标记靶区分性探针的序列如下：
SA_T705’-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3’(SEQ ID NO：1)
SA_TD2_Chip_M5’-[6-FAM]CATTCCGTGGIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO：30)
SA_TD2_Chip_m5’-[6-FAM]TGCCTTATAAIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO：31)
(下划线及粗体字表示错配核苷酸。)
将上述探针(SEQ ID NO：30及31)固定化在NSB9 NHS载玻片(NSB浦项科技有限公司，韩国：NSB POSTECH，Korea)。将利用NSB测定点位缓冲液(NSB spotting buffer)溶解成最终浓度为20μM的上述探针，以基因芯片点样仪微阵列(OmniGrid Accent Microarrayer)(蒂吉莱博公司，美国(DIGILAB，US))印刷在NSB9 NHS载玻片上。将各个探针由2x1格式(双重点：duplicate spots)并行了测定点位(spotting)，将如此制备的微阵列在85％湿度的腔室培养了一宿。为了去除非-特异性地结合的探针，在37℃下，用含有2x SSPE(0.3M氯化钠(sodium chloride)、0.02M磷酸氢钠(sodium hydrogen phosphate)、2.0mM乙二胺四乙酸(EDTA：ETHYLENEDIAMINETETRAACETIC ACID))及7.0mM十二烷基硫酸钠(SDS：Sodiumdodecyl sulfate)的pH 7.4缓冲溶液中，对上述载玻片进行10分钟清洗之后用蒸馏水清洗。随后，利用载玻片离心分离器，将上述DNA-功能化的(DNA-functionalized)载玻片进行干燥，保管在4℃的暗室内以备后用。
以含有对于金黄色葡萄球菌(SA)(SEQ ID NO：1)的合成寡核苷酸10pmole、10x反应缓冲液3μl、各50μM dNTP及Bst DNA聚合酶2单元的30μl的最终体积，在DNA-功能化的载玻片的表面上实施了外切核酸反应。将上述整体混合物应用于组装在交联了探针的NSB玻璃载玻片的表面上的腔室。以原处(in situ)块方式使载玻片位于热循环仪(基因扩增仪B4I，中国：Genepro B4I，China)。在50℃下实施了30分钟外切核酸反应，在95℃下利用蒸馏水清洗1分钟并停止。利用共聚焦激光扫描仪Axon GenePix4100A(分子器件，美国：molecular Device，US)，通过5-μm像素分辨率的扫描获取了图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePix pro5.1软件(分子器件，美国：molecular Device，US)对荧光强度进行了分析。去除周边本底后以点-中央值表示了荧光强度。为了调查各点的再现性，反复进行了2次实验。以反复的点的平均值表示了荧光强度。
【B.基于反复的酸切割反应的信号产生】
在本实施例中利用的合成模板序列及单一标记靶区分性探针的序列如下：
SA_T705’-GGTGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTA-3’(SEQ ID NO：1)
SA_TD2_Chip_M_25’-[6-TAMRA]CATTCCGTGGIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO：32)
SA_TD2_Chip_m_25’-[6-TAMRA]TGCCTTATAAIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO：33)
(下划线及粗体字表示错配核苷酸。)
将上述探针(SEQ ID NO：32及33)固定化在NSB9 NHS载玻片(NSB浦项科技有限公司，韩国：NSB POSTECH，Korea)。将利用NSB测定点位缓冲液(NSB spotting buffer)溶解成最终浓度为20μM的各探针，利用基因芯片点样仪微阵列(OmniGrid Accent Microarrayer)(蒂吉莱博公司，美国(DIGILAB，US))印刷在NSB9NHS载玻片上。将各个探针由2x1格式(双重点：duplicate spots)并行了测定点位(spotting)，将如此制备的微阵列在约85％湿度的腔室培养了一宿。为了去除非-特异性地结合的探针，在37℃下，用含有2x SSPE(0.3M氯化钠(sodium chloride)、0.02M磷酸氢钠(sodium hydrogen phosphate)、2.0mM乙二胺四乙酸(EDTA：ETHYLENEDIAMINETETRAACETIC ACID))及7.0mM十二烷基硫酸钠(SDS：Sodiumdodecyl sulfate)的pH 7.4缓冲溶液中，对上述载玻片进行10分钟清洗之后用蒸馏水清洗。随后，利用载玻片离心分离器，将上述DNA-功能化的(DNA-functionalized)载玻片进行干燥，保管在4℃的暗室内以备后用。
以含有对于金黄色葡萄球菌(SA)(SEQ ID NO：1)的合成寡核苷酸10pmole、10x反应缓冲液(5mM氯化镁(MgCl2))3μl、各50μM dNTP及Taq DNA聚合酶(索尔杰恩特公司，韩国：Solgent，Korea)2单元的30μl的最终体积，在DNA-功能化的载玻片的表面上实施了反复的外切核酸反应。将上述整体混合物应用于组装在交联了探针的NSB玻璃载玻片的表面的腔室。利用原处(in situ)块方式使载玻片位于热循环仪(基因扩增仪B4I，中国：GeneproB4I，China)。如下实施了热循环反应(thermocycling)：在95℃下进行两分钟变性后，反复95℃下20秒、55℃下20秒的过程(5、10、20、30、40或者50周期)。利用共聚焦激光扫描仪AxonGenePix4100A(分子器件，美国：molecular Device，US)，通过5-μm像素分辨率的扫描获取了图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePix pro5.1软件(分子器件，美国：molecularDevice，US)分析了荧光强度。荧光强度去除周边本底后以点-中央值表示。为了调查各点的再现性，反复进行了2次实验。将荧光强度以反复的点的平均值表示。
在外切核酸反应中，利用在5’-第二次杂交部位具有匹配序列的上述单一标记固定化靶区分性探针及模板时，固体基质上的荧光信号最终被消灭。就反复的外切核酸反应而言，固体基质上的荧光强度随着循环数而减少。
【实施例9：在利用靶区分性探针及连接酶的固相中检测单核苷酸变异】
本发明者在固相中对靶区分性探针是否能够在连接酶反应中区分核酸序列上的单核苷酸变异进行了追加的实验。
为此实验，具有双重特异性寡核苷酸(DSO：dual specificity oligonucleotide)结构的第一次探针(first probe)作为荧光报道分子在5’-末端具有Quasar570，并且用作非固定化(mobilized)探针。作为第二次探针(second probe)的靶区分性探针在5’-第二次杂交部位具有匹配序列或者一个错配核苷酸。靶区分性探针具有聚(T)7作为连接肽。通过3’-末端的氨基(AminnoC7)将靶区分性探针固定在固体基质的表面上。将对于金黄色葡萄球菌(SA：Staphylococcus aureus)基因的合成寡核苷酸利用为模板。将具有5’→3’外切核酸酶活性的Bst或者Taq聚合酶利用于5’→3’外切核酸反应。将腺苷一磷酸连接酶(腺苷一磷酸连接酶热稳定性DNA连接酶：Amp ligase Thermostable DNA Ligase)利用于连接。
本实施例中利用的合成模板、第一次探针及第二次探针的序列如下：
SA_T110：5’-TGTAGGTGGTGGCGGTAACAACGCCGTAAACCGAATGATTGACCACGGAATGAATAATGTTGAATTTATCGCTATCAACACAGACGGTCAAGCTTTAAACTTATCTAAAG-3’(SEQ ID NO：34)
SA_TD_Chip_S_M：5’-TTCCGTGGIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO：35)
SA_TD_Chip_S_m：5’-TTCTGTGGIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACCTTTTT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO：36)
SA_Chip_DSO：5’-[Quasar570]ACCGTCTGTGTTGATAGCGATAAIIIIIACATTATTCA-3’(SEQ ID NO：37)
(下划线及粗体字表示错配核苷酸。)
将上述靶区分性探针(SEQ ID NO：35及36)固定在NSB9 NHS载玻片(NSB浦项科技有限公司，韩国：NSB POSTECH，Korea)。将利用NSB测定点位缓冲液(NSB spotting buffer)溶解成最终浓度为20μM的各探针，利用基因芯片点样仪微阵列(OmniGrid AccentMicroarrayer)(蒂吉莱博公司，美国：DIGILAB，US)印刷在NSB9NHS载玻片上。将各个探针由2x1格式(双重点：duplicate spots)并行了测定点位(spotting)，将如此制备的微阵列在约85％湿度的腔室内培养了一宿。为了去除非-特异性地结合的探针，在37℃下，用含有2xSSPE(0.3M氯化钠(sodium chloride)、0.02M磷酸氢钠(sodium hydrogen phosphate)、2.0mM乙二胺四乙酸(EDTA：ETHYLENEDIAMINETETRAACETIC ACID))及7.0mM十二烷基硫酸钠(SDS：Sodium dodecyl sulfate)的pH 7.4缓冲溶液中，对上述载玻片进行10分钟清洗之后用蒸馏水清洗。随后，利用载玻片离心分离器，将上述DNA-功能化的(DNA-functionalized)载玻片进行干燥，保管在4℃的暗室内以备后用。
以含有对于金黄色葡萄球菌(SA)(SEQ ID NO：34)的合成寡核苷酸10pmole、第一次探针(SEQ ID NO：37)5pmole、腺苷一磷酸连接酶(Amp ligase)10x反应缓冲液3μl及腺苷一磷酸连接酶(腺苷一磷酸连接酶热稳定性DNA连接酶，5U/μl，震中生物技术公司，美国：Epicentre Biotechnologies，USA))0.2μl的30μl的最终体积，在DNA-功能化的载玻片的表面上实施了连接酶反应。上述腺苷一磷酸连接酶(Amp ligase)10x反应缓冲液含有20mM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)(pH8.3)、25mM氯化钾(KCl)、10mM氯化镁(MgCl2)、0.5mM烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD：nicotinamide adenine dinucleotide)及0.01％聚乙二醇辛基苯基醚(X-100)。将上述整体混合物应用于组装在交联了探针的NSB玻璃载玻片的表面上的腔室。如下实施上述反应：在45℃下实施5分钟靶核酸序列、第一次探针及固定化靶区分性探针的杂交，追加地，在65℃下实施30分钟连接酶反应。停止上述反应，并用蒸馏水在95℃下清洗2分钟来实现变性。利用共聚焦激光扫描仪Axon GenePix4100A(分子器件，美国：molecular Device，US)，通过5μm像素分辨率的扫描获取了图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePix pro5.1软件(分子器件，美国：molecular Device，US)分析了荧光强度。为了调查各点的再现性，反复进行了2次实验。以反复的点的平均值表示荧光强度。
作为第二次探针利用在5’-第二次杂交部位具有匹配序列的靶区分性探针及模板时，产生了对于金黄色葡萄球菌(SA)的靶核酸序列的荧光信号。将在5’-第二次杂交部位具有错配核苷酸的靶区分性探针利用为第二次探针时，未得到信号。这样的结果表示本发明的连接反应能够检测单核苷酸变异。
【实施例10：基于靶区分性探针的5’-第二次杂交部位的杂交引起的荧光变化，检测靶核酸序列】
本发明者对基于已标记的部位的杂交引起的荧光信号变化的靶检测，能否应用于在5’-第二次杂交部位具有荧光分子的靶区分性探针进行了追加的实验。
为了这样的应用，将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的基因组DNA利用为模板。靶区分性探针在5’-第二次杂交部位具有匹配序列或者错配序列。将荧光分子与靶区分性探针的5’-第二次杂交部位的内部核苷酸相连接。将没有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶利用于靶的扩增。
在本实施例中利用的引物及单一标记靶区分性探针的序列如下：
SA_F5’-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAAIIIIITAGCGACTTT-3’(SEQ ID NO：15)
SA_R5’-GATAAGTTTAAAGCTTGACCGTCIIIIITGATAGCGAT-3’(SEQ ID NO：16)
SA_TD3_M5’-CATTCCG[T(FAM)]GGIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：38)
SA_TD3_m5’-TGCCTTA[T(FAM)]]AAIIIIICATTCGGTTTACGGCGTTGTTACC[C3spacer]-3’(SEQ ID NO：39)；
(下划线及粗体字表示错配核苷酸。)
以含有金黄色葡萄球菌(S.aureus)基因组DNA 1ng、单一标记靶区分性探针(SEQID NO：38或者39)5pmole、正向引物(SEQ ID NO：15)10pmole、反向引物(SEQ ID NO：16)10pmole、10x斯托菲尔缓冲液(Stoffel buffer)【含有100mM三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl)(pH8.3)及100mM氯化钾(KCl)】2μl、4种dNTPs(dATP、dCTP、dGTPs及dTTP)各200μM、氯化镁(MgCl2)5mM及DNA聚合酶、斯托菲尔片段(Stoffel Fragment)(美国应用生物系统公司，美国：Applied BioSystems，US)1单元的20μl的最终体积实施了实时聚合酶链式反应(PCR：Polymerase Chain Reaction)；将含有上述反应混合物的管设置在实时热循环仪(CFX96，伯乐公司：Bio-Rad)；在95℃下对上述反应混合物进行2分钟变性后，将95℃下20秒、55℃下30秒及72℃下10秒的过程反复了40次。检测了在各循环的杂交步骤(55℃)中产生的信号。
以上结果表示，测量从根据5’-第二次杂交部位的杂交的单一标记分子发生的荧光变化，由此靶区分性探针能够区分地检测靶序列。
详细记述了本发明的优选实例，可以进行按照本发明的原理的变形及修订，本发明的范围借助所附的权利要求及其等同取代来定义，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

Claims (36)

1.靶区分性探针在制备用于从核酸混合物中检测靶核酸序列的组合物中的用途，其中所述靶核酸序列的检测是通过包括以下步骤的方法来进行的：
(a)将所述靶核酸序列与所述靶区分性探针进行杂交的步骤，所述靶区分性探针具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；所述靶区分性探针具有以下通式Ⅰ的改性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在所述通式中，X’p是具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二杂交部位；Y’q是包含至少三个通用碱基的分离部位，Z’r是具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一杂交部位；所述靶区分性探针由荧光报道分子和猝灭报道分子的荧光的猝灭分子进行双重标记；所述荧光报道分子及所述猝灭分子中至少一个位于所述5’-第二杂交部位；p、q及r表示核苷酸的个数；并且，X’、Y’及Z’是脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；所述5’-第二杂交部位的Tm低于所述3’-第一杂交部位的Tm，所述分离部位在X’p、Y’q和Z’r所述三个部位中具有最低的Tm；所述5’－第二杂交部位的长度为3-15个核苷酸，3’－第一杂交部位的长度为15-60个核苷酸，并且所述3’－第一杂交部位比所述5’－第二杂交部位更长；所述分离部位的所述长度为3－10个核苷酸；所述分离部位在对于所述靶核酸序列的杂交事件方面，使所述5’-第二杂交部位从所述3’-第一杂交部位分离，由此所述靶区分性探针的杂交特异性借助所述5’-第二杂交部位及所述3’-第一杂交部位来双重性地决定，其结果，提高所述靶区分性探针的整体杂交特异性；
所述靶区分性探针与所述靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位及所述3’-第一杂交部位均与所述靶核酸序列进行杂交，所述5’-第二杂交部位由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割；所述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位及所述分离部位都形成单链，所述5’-第二杂交部位不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，由此所述靶区分性探针区分所述靶核酸序列与非-靶核酸序列；
(b)将所述步骤(a)的结果物与具有5’→3’外切核酸酶活性的酶接触的步骤；所述靶区分性探针与所述靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位由具有所述5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，位于所述靶区分性探针上的所述荧光报道分子从所述猝灭分子分离，产生荧光信号；所述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位不被具有所述5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，因此不会产生荧光信号；以及
(c)检测所述荧光信号的步骤，通过切割所述5’-第二杂交部位而产生的所述荧光信号表示所述靶核酸序列的存在。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，具有所述5’→3’外切核酸酶活性的酶是具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述步骤(a)与在所述靶区分性探针杂交的位点的下游位点杂交的上游引物一同利用所述靶区分性探针来实施，具有所述5’→3’外切核酸酶活性的酶是具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶，所述上游引物在所述步骤(b)中借助所述模板-依赖性核酸聚合酶来延长。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述步骤(a)一同利用反向引物及所述靶区分性探针来实施，具有所述5’→3’外切核酸酶活性的酶是具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶，在所述步骤(b)中，借助基于所述模板-依赖性核酸聚合酶的反向引物的延长反应来生成能够与靶区分性探针杂交的所述靶核酸序列。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述报道分子及所述猝灭分子均位于所述5’-第二杂交部位，或者所述报道分子及所述猝灭分子分别位于所述5’-第二杂交部位及所述分离部位的各个不同部位。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述报道分子及所述猝灭分子分别位于所述5’-第二杂交部位及所述3’-第一杂交部位的各个不同部位。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述方法在反复循环之间包括变性过程，还包括反复进行所述步骤(a)-(b)或者(a)-(c)的步骤。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，所述靶区分性探针包含至少两种探针。
9.根据权利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，所述靶区分性探针包含至少两种探针，并且，所述上游引物包含至少两种引物，或者所述反向引物包含至少两种引物。
10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述靶核酸序列包含核苷酸变异，且所述靶核酸序列上的所述核苷酸变异位于所述靶区分性探针的所述5’-第二杂交部位的对面。
11.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述靶区分性探针的3’-第一杂交部位的至少一个核苷酸包含对于具有5’→3’外切核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的主链，其中包含具有对于有5’→3’外切核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的主链的所述至少一个核苷酸的位点是阻断剂部位，并且所述阻断剂部位位于所述靶区分性探针的所述3’-第一杂交部位上。
12.靶区分性探针在制备用于在固相中从核酸混合物中检测靶核酸序列的组合物中的用途，其中所述靶核酸序列的检测是通过包括如下步骤的方法进行的：
(a)将所述靶核酸序列与所述靶区分性探针进行杂交的步骤，所述靶区分性探针包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；所述靶区分性探针通过3’-末端在固体基质的表面实现固定化；所述靶区分性探针具有下述通式Ⅰ的改性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在所述通式中，X’p是具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二杂交部位；Y’q是包含至少三个通用碱基的分离部位，Z’r是具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一杂交部位；所述靶区分性探针具有产生可检测的信号的标记，所述标记位于靶区分性探针的5’-第二杂交部位；p、q及r表示核苷酸的个数；并且，X’、Y’及Z’是脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；所述5’-第二杂交部位的Tm低于所述3’-第一杂交部位的Tm，所述分离部位在X’p、Y’q和Z’r所述三个部位中具有最低的Tm；所述5’－第二杂交部位的长度为3-15个核苷酸，3’－第一杂交部位的长度为15-60个核苷酸，并且所述3’－第一杂交部位比所述5’－第二杂交部位更长；所述分离部位的所述长度为3－10个核苷酸；所述分离部位在对于所述靶核酸序列的杂交事件方面，使所述5’-第二杂交部位从所述3’-第一杂交部位分离，由此所述靶区分性探针的杂交特异性借助所述5’-第二杂交部位及所述3’-第一杂交部位来双重性地决定，其结果，提高所述靶区分性探针的整体杂交特异性；
所述靶区分性探针与所述靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位及所述3’-第一杂交部位均与所述靶核酸序列进行杂交，所述5’-第二杂交部位由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割；所述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位及所述分离部位均形成单链，所述5’-第二杂交部位不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，由此所述靶区分性探针区分所述靶核酸序列与非-靶核酸序列；
(b)将所述步骤(a)的结果物与具有5’→3’外切核酸酶活性的酶进行反应的步骤；所述靶区分性探针与所述靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位由具有所述5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，从所述靶区分性探针放出所述标记，在固定化在所述固体基质上的靶区分性探针发生信号变化；所述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位不被具有所述5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，因此在固定化在所述固体基质上的靶区分性探针不发生信号变化；由此检测所述固体基质上的信号变化来决定所述靶核酸序列的存在；以及
(c)检测所述固体基质上的所述信号变化的步骤，通过切割所述5’-第二杂交部位而产生的所述信号变化表示所述靶核酸序列的存在。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述标记是荧光报道分子，所述信号变化在所述固体基质上实现荧光信号的减少或者消灭。
14.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述标记是包含一对荧光报道分子及猝灭分子的相互作用性标记系统，所述靶区分性探针在由具有所述5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的所述5’-第二杂交部位上的一个位点具有所述报道分子及所述猝灭分子中的一个，在不被具有所述5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的位点具有剩余的一个。
15.根据权利要求14所述的用途，其特征在于，所述猝灭分子位于由具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的所述靶区分性探针的5’-第二杂交部位上的一个位点，所述荧光分子位于不被具有5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割的位点；所述探针与靶核酸序列进行杂交时，其5’-第二杂交部位由具有所述5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，使得所述靶区分性探针的猝灭分子从荧光报道分子分离，由此产生荧光信号；所述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，5’-第二杂交部位不被具有所述5’→3’外切核酸酶活性的酶所切割，由此不产生荧光信号；据此检测到所述固体基质上的所述荧光信号，以便决定所述靶核酸序列的存在。
16.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述方法在反复循环之间包括变性过程，还包括反复进行所述步骤(a)-(b)或者(a)-(c)的步骤。
17.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，所述靶区分性探针包含至少两种探针。
18.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述靶核酸序列包含核苷酸变异，且所述靶核酸序列上的所述核苷酸变异位于所述靶区分性探针的所述5’-第二杂交部位的对面。
19.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述靶区分性探针的3’-第一杂交部位的至少一个核苷酸具有对于有5’→3’外切核酸酶活性的酶引起的切割有耐性的主链，其中包含具有对于有5’→3’外切核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的主链的所述至少一个核苷酸的位点是阻断剂部位，并且所述阻断剂部位位于所述靶区分性探针的所述3’-第一杂交部位上。
20.靶区分性探针在制备用于通过聚合酶链反应从核酸混合物中检测靶核酸序列的组合物中的用途，其中对靶核酸序列的检测通过包括如下步骤的方法进行：
(a)准备聚合酶链式反应混合物，该聚合酶链式反应混合物包含：(i)所述靶核酸序列，(ii)具有与所述靶核酸序列互补的杂交序列的所述靶区分性探针，(iii)由两个引物组成的一对引物，所述两个引物为具有分别与所述靶核酸序列互补的杂交序列的正向引物及反向引物，以及(iv)具有5’-3’外切核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶；所述靶区分性探针在所述两个引物之间的位点杂交；所述靶区分性探针具有下述通式Ⅰ的改性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在所述通式中，X’p是具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二杂交部位；Y’q是包含至少三个通用碱基的分离部位，Z’r是具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一杂交部位；所述靶区分性探针由荧光报道分子及猝灭报道分子的荧光的猝灭分子进行双重标记；所述荧光报道分子及所述猝灭分子均位于所述5’-第二杂交部位，或者所述报道分子及所述猝灭分子分别位于所述5’-第二杂交部位及所述分离部位的各个不同部位；p、q及r表示核苷酸的个数；并且X’、Y’及Z’是脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；所述5’-第二杂交部位的Tm低于所述3’-第一杂交部位的Tm，所述分离部位在X’p、Y’q和Z’r所述三个部位中具有最低的Tm；所述5’－第二杂交部位的长度为3-15个核苷酸，3’－第一杂交部位的长度为15-60个核苷酸，并且所述3’－第一杂交部位比所述5’－第二杂交部位更长；所述分离部位的所述长度为3－10个核苷酸；所述分离部位在对于所述靶核酸序列的杂交事件方面，使所述5’-第二杂交部位从所述3’-第一杂交部位分离，由此所述靶区分性探针的杂交特异性借助所述5’-第二杂交部位及所述3’-第一杂交部位来双重性地决定，其结果，提高所述靶区分性探针的整体杂交特异性；
所述靶区分性探针与所述靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位及所述3’-第一杂交部位均与所述靶核酸序列杂交，所述5’-第二杂交部位由所述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性所切割；所述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位及所述分离部位均形成单链，所述5’-第二杂交部位不被所述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性所切割，由此所述靶区分性探针区分所述靶核酸序列和非-靶核酸序列；
(b)利用所述聚合酶链式反应混合物，借助至少两个循环的引物退火、引物延长及变性来扩增所述靶核酸序列，所述两个引物借助所述模板-依赖性核酸聚合酶的聚合酶活性而延长，来扩增所述靶核酸序列；所述靶区分性探针与所述靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位由所述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性所切割，所述荧光报道分子从在所述靶区分性探针上的所述猝灭分子分离，并产生荧光信号；所述靶区分性探针与所述非-靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位不被所述模板-依赖性核酸聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性所切割，其结果，所述荧光报道分子不会从所述靶区分性探针上的所述猝灭分子分离，因而不产生荧光信号；以及
(c)检测所述荧光信号，所述产生的荧光信号表示所述靶核酸序列的存在。
21.根据权利要求20所述的用途，其特征在于，所述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，所述靶区分性探针包含至少两种探针，所述正向引物包含至少两种引物，所述反向引物包含至少两种引物。
22.根据权利要求20所述的用途，其特征在于，所述靶核酸序列包含核苷酸变异，且所述靶核酸序列上的所述核苷酸变异位于所述靶区分性探针的所述5’-第二杂交部位的对面。
23.靶区分性探针在制备用于借助连接反应从核酸混合物中检测靶核酸序列的组合物中的用途，其中所述对靶核酸序列的检测通过包括如下步骤的方法进行：
(a)将所述靶核酸序列与第一次探针及第二次探针进行杂交，所述第一次探针在所述靶核酸序列的第一位点包含互补的杂交核苷酸序列，第二次探针在位于所述第一位点的上游的所述靶核酸序列的第二位点包含互补的杂交核苷酸序列；所述第一次探针及所述第二次探针中至少一个具有产生可检测的信号的标记；所述第二次探针是靶区分性探针；所述靶区分性探针具有下述通式Ⅰ的改性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在所述通式中，X’p是具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二杂交部位；Y’q是包含至少三个通用碱基的分离部位，Z’r是具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一杂交部位；p、q及r表示核苷酸的个数；并且，X’、Y’以及Z’是脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；所述5’-第二杂交部位的Tm低于所述3’-第一杂交部位的Tm，所述分离部位在X’p、Y’q和Z’r所述三个部位中具有最低的Tm；所述5’－第二杂交部位的长度为3-15个核苷酸，3’－第一杂交部位的长度为15-60个核苷酸，并且所述3’－第一杂交部位比所述5’－第二杂交部位更长；所述分离部位的所述长度为3－10个核苷酸；所述分离部位在对于所述靶核酸序列的杂交事件方面，使所述5’-第二杂交部位从所述3’-第一杂交部位分离，由此所述靶区分性探针的杂交特异性借助所述5’-第二杂交部位及所述3’-第一杂交部位来双重性地决定，其结果，提高所述靶区分性探针的全部杂交特异性；
所述第二次探针与所述靶核酸序列进行杂交时，所述第二次探针的所述5’-第二杂交部位及所述3’-第一杂交部位均与所述靶核酸序列进行杂交，从而发生所述第一次探针及所述第二次探针的连接；所述第二次探针与非-靶核酸序列进行杂交时，所述第二次探针的所述5’-第二杂交部位及所述分离部位都形成单链，所述第一次探针及所述第二次探针不进行连接，由此所述第二次探针区分所述靶核酸序列与非-靶核酸序列；
(b)使与所述靶核酸序列进行杂交的所述第一次探针及第二次探针相连接，由此生成连接的探针；
(c)使所述步骤(b)的结果物变性；
(d)检测来自所述连接的探针上的所述标记的信号，所述信号表示所述靶核酸序列的存在。
24.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，所述标记是由一对的报道分子及猝灭分子构成的相互作用性标记系统。
25.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，所述第一次探针具有下述通式II的双重特异性寡核苷酸(DSO)结构：
5’-Xp-Yq-Zr-3’ (II)
在所述通式中，Xp是具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第一杂交部位；Yq是包含至少三个通用碱基的分离部位，Zr是具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第二杂交部位；p、q及r表示核苷酸的个数，并且X、Y及Z是脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；所述5’-第一杂交部位的Tm高于所述3’-第二杂交部位的Tm，所述分离部位在所述三个部位中具有最低的Tm；所述分离部位在对于所述靶核酸序列的杂交事件方面，使所述5’-第一杂交部位从所述3’-第二杂交部位分离，由此借助所述5’-第一杂交部位及所述3’-第二杂交部位来双重性地决定所述寡核苷酸的杂交特异性，这将提高所述寡核苷酸的整体杂交特异性。
26.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，所述方法还包括反复进行步骤(a)-(c)或者步骤(a)-(d)的步骤。
27.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，所述方法在固相中实施；所述第一次探针在固体基质的表面上通过其5’-末端来实现固定化，所述第二次探针未被固定化。
28.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，所述方法在固相中实施；所述第二次探针在固体基质的表面上通过其3’-末端来实现固定化，所述第一次探针未被固定化。
29.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，所述靶核酸序列包含至少两种核酸序列，所述第一次探针及所述第二次探针分别包含至少两种探针。
30.根据权利要求23所述的用途，其特征在于，所述靶核酸序列包含核苷酸变异，且所述靶核酸序列上的所述核苷酸变异位于所述靶区分性探针的所述5’-第二杂交部位的对面。
31.靶区分性探针在制备用于从核酸混合物中检测靶核酸序列的组合物中的用途，其中对靶核酸序列的检测通过包括如下步骤的方法进行：
(a)将所述靶核酸序列与靶区分性探针进行杂交，所述靶区分性探针包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；所述靶区分性探针具有下述通式Ⅰ的改性双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构：
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (I)
在所述通式中，X’p是具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的5’-第二杂交部位；Y’q是包含至少三个通用碱基的分离部位，Z’r是具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-第一杂交部位；所述靶区分性探针在所述5’-第二杂交部位上用荧光报道分子进行标记；p、q及r表示核苷酸的个数；并且X’、Y’及Z’是脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸；所述5’-第二杂交部位的Tm低于所述3’-第一杂交部位的Tm，所述分离部位在X’p、Y’q和Z’r所述三个部位中具有最低的Tm；所述5’－第二杂交部位的长度为3-15个核苷酸，3’－第一杂交部位的长度为15-60个核苷酸，并且所述3’－第一杂交部位比所述5’－第二杂交部位更长；所述分离部位的所述长度为3－10个核苷酸；所述分离部位在对于所述靶核酸序列的杂交事件方面，使所述5’-第二杂交部位从所述3’-第一杂交部位分离，由此借助所述5’-第二杂交部位及所述3’-第一杂交部位来双重性地决定所述靶区分性探针的杂交特异性，其结果，提高所述靶区分性探针的整体杂交特异性；
所述靶区分性探针与所述靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位及所述3’-第一杂交部位均与靶核酸序列进行杂交，从而诱导从所述荧光报道分子发出的荧光的变化；所述靶区分性探针与非-靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位及所述分离部位均形成单链，由此不能诱导从所述荧光报道分子发出的荧光的变化，据此所述靶区分性探针区分所述靶核酸序列与非-靶核酸序列；以及
(b)检测所述荧光变化，所述荧光变化表示所述靶核酸序列的存在。
32.根据权利要求31所述的用途，其特征在于，所述步骤(a)是一同利用所述靶区分性探针、反向引物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施的，由此追加生成与所述靶区分性探针杂交的所述靶核酸序列，从而增加表示所述靶核酸序列的存在的所述荧光变化。
33.根据权利要求31所述的用途，其特征在于，所述步骤(a)是通过将所述靶区分性探针与由两个引物作为正向引物及反向引物所构成的引物对及模板-依赖性核酸聚合酶一起应用来实施，由此与所述靶区分性探针进行杂交的所述靶核酸序列借助聚合酶链式反应来扩增，从而增加表示所述靶核酸序列的存在的所述荧光的变化。
34.根据权利要求31所述的用途，其特征在于，所述靶区分性探针用可猝灭所述报道分子的荧光的猝灭分子进行追加标记。
35.一种使探针分子区分靶核酸序列及非-靶核酸序列的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)选择靶核酸序列的步骤；
(b)设计探针分子的序列的步骤，由此具有(i)与所述靶核酸序列互补的杂交序列及(ii)包含至少三个通用碱基的分离部位，所述分离部位存在于杂交序列内，用于形成所述探针分子的三个部位；以及
(c)决定所述探针分子的所述分离部位位点的步骤，使得位于所述分离部位的所述5’-方向的部位具有低于所述分离部位的3’-方向的部位的Tm，使得所述分离部位在所述三个部位中具有最低的Tm，由此提供具有三个不同部位的探针分子，该探针分子具有相互不同Tm值；在所述三个部位中，(i)所述探针分子的5’-第二杂交部位具有与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，(ii)所述探针分子的3’-第一杂交部位包含与所述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(iii)位于所述5’-第二杂交部位及所述3’-第一杂交部位之间的所述探针分子的分离部位具有至少三个通用碱基；所述5’-第二杂交部位的Tm低于所述3’-第一杂交部位的Tm，所述分离部位在所述三个部位中具有最低的Tm，所述5’－第二杂交部位的长度为3-15个核苷酸，3’－第一杂交部位的长度为15-60个核苷酸，并且所述3’－第一杂交部位比所述5’－第二杂交部位更长；所述分离部位的所述长度为3－10个核苷酸；所述探针分子具有标记或者含有报道分子和猝灭分子的相互作用性标记系统而产生可检测标记，其中当所述探针分子具有标记时，所述标记被置于所述5’-第二杂交部位上，当所述靶区分性探针具有相互作用性标记系统时，所述报道分子和猝灭分子中至少一个被置于所述5’-第二杂交部位上；；
所述探针分子与所述靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位及所述3’-第一杂交部位均与靶核酸序列杂交；所述探针分子与所述非-靶核酸序列进行杂交时，所述5’-第二杂交部位及所述分离部位均形成单链，由此所述探针分子区分所述靶核酸序列与非-靶核酸序列。
36.根据权利要求1的用途或者根据权利要求12、20、23或31的用途，其中所述核酸混合物是DNA。
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