KR20240028084A

KR20240028084A - 표지자가 결합된 태그 프로브 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20240028084A
Application number: KR1020220106165A
Authority: KR
Inventors: 최준엽
Original assignee: 주식회사 멀티렉스
Priority date: 2022-08-24
Filing date: 2022-08-24
Publication date: 2024-03-05

Abstract

본 발명은 하나의 반응 용기 내에 존재하는 복수의 타겟 핵산을 해리온도(Melting temperature, Tm) 차이를 이용하여 동시에 검출할 수 있는 리포터 염료(Reporter dye) 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)와 이를 포함하는 다중 핵산 동시 검출용 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 발명 따른 표지자가 결합된 태그 프로브(LTP)는 PCR 반응 과정에서 타겟 핵산 서열의 증폭 후에 리포터-태그(Reporter-tag)로 분리되고, 이는 Q-태그(quencher tag, Q-tag)와 결합한 뒤, 리포터-태그(Reporter-tag)와 Q-태그 복합체가 해리온도(Tm)를 넘어서는 온도에서 형광 신호를 방출하기 때문에, 융해 곡선 분석을 통해 다중 타겟 핵산의 동시 검출이 가능하다. 상기 표지자가 결합된 태그 프로브(LTP)는 태그부의 염기서열에 따라 해리온도(Tm)를 조절할 수 있고, 결과적으로 한 종류의 형광 채널(channel)에 다수의 타겟 설정이 가능하여 복수 형광 채널 사용에 따른 간섭현상 없이 복수의 타겟 핵산을 동시에 검출할 수 있는 장점을 가진다.

Description

표지자가 결합된 태그 프로브 및 이의 용도 {Label-conjugated Tag Probe and Uses thereof}

본 발명은 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP) 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 프로브의 해리온도(Melting temperature, Tm) 차이를 이용하여 복수의 타겟 핵산을 동시에 검출할 수 있는 표지자가 결합된 태그 프로브(LTP), 이를 포함하는 다중 타겟 핵산의 동시 검출용 조성물 및 방법에 관한 것이다.

분자 진단은 미지의 다양한 핵산이 포함되어 있는 시료 속에서 표적 핵산의 유무를 신속하게 검출 또는 분석하는 것으로 정의된다. 분자 진단을 통해서 특정 생물종의 확인, 병원체의 식별, 유전자 변형 유기체의 검출 뿐만아니라, 감염병, 암 및 유전적 이상의 질병을 진단하고 질병의 진행 및 치료에 대한 반응도 예측 가능하다. 이러한 분자 진단은 감염병을 일으키는 병원성 미생물이나, 지속적인 환경 오염과 이상 기후변화 등에 인해 출현하는 신종 바이러스의 감염 여부까지도 신속하고 높은 정확도로 확인할 수 있는 장점을 가지고 있어 꾸준히 높은 성장세를 보이며 많은 연구가 진행 중인 분야이다.

분자 진단 분야에서는 핵산 서열을 검출하기 위해서, 핵산을 증폭하는 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR) 방법과 핵산 서열을 직접 분석하는 DNA 시퀀싱(DNA sequencing) 방법을 주로 이용하고 있다. 그러나 DNA 시퀀싱은 수행하기 위해서 장비의 사용이나 그 비용에 제약이 있고, PCR 방법에 비해 타겟 검출의 신속성이 떨어지기 때문에, PCR 방법이 더 선호되며 표준 기술로 인정되고 있다.

특히, 중합효소연쇄반응(PCR)을 기반으로 하여 핵산 산물의 양을 실시간으로 측정하는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction, qPCR)은 핵산 시료에서 특정 서열의 핵산을 검출 및 수량 측정까지 가능하여 신속한 핵산 서열 검출에 유용한 수단이 되고 있다. 이 때, 실시간으로 증폭 핵산을 정량적으로 검출하기 위해서 표지자가 부착되어 있는 표적 서열 특이적 프로브 또는 표지자가 부착된 프라이머가 사용된다. 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR)은 사용되는 프로브에 따라 표적 특이적 분자 비콘(Molecular Beacon), TaqMan 프로브, 가수분해 프로브, Scorpion 프로브 및 인터칼레이팅 염료(Intercalating Dye) 등의 방법들이 알려져 있다.

그러나, 기존 TaqMan probe를 사용하는 PCR 반응에서는 PCR thermal cycler의 한 개의 형광 채널(channel), 다시 말해 특정 범위의 파장의 빛을 인식하는 범위에서 한 종류만의 리포터 염료(reporter dye)를 사용할 수 있기 때문에, 프로브 구조상 한 개의 채널(channel)에서 한 개의 타겟 핵산 밖에 검출하지 못하는 제약이 있다.

실시간 중합효소연쇄반응(qPCR)은 형광 표지자의 구별되는 파장을 검출할 수 있는, 이용 가능한 형광 채널 수에 따라 하나의 PCR 반응 용기에서 검출할 수 있는 타겟 핵산의 수를 제한해야 하는 제약이 있다. 이런 이유로 종래의 실시간 중합효소연쇄반응 방법은 하나의 PCR 반응 용기에서 복수 개의 형광 채널 대해 각각 대응하는 형광 표지자가 부착된 프로브를 이용하여 각 프로브에 상보적으로 결합하는 타겟 핵산의 유무에 따라 형광이 발광되도록 설계하고 상기 각각의 프로브를 이용함으로써, 하나의 PCR 반응 용기에서 반응시켜 동시에 검출할 수 있는 타겟 핵산의 개수는 형광 채널의 개수에 대응되는 수인 것이었다.

그런데 하나의 PCR 반응 용기에서 동시에 이용 가능한 형광 채널 수는 서로 다른 색상의 형광단 검출 파장의 제한 또는 간섭현상으로 5개 이상은 어렵기 때문에 감지할 수 있는 특정 타겟의 수에 제한이 있다. 게다가, 이를 수행하게 하는 프로브의 설계가 까다로우며, 여러 종류의 형광 라벨들 간의 간섭현상에 의한 위양성 시그널(false-positive signal) 결과와 반응성이 떨어져 검출 신뢰도가 낮은 문제가 있었다.

또한, 종래의 하나의 PCR 반응 용기에서 3개 내지 4개 이하의 타겟을 검출하는 실시간 중합효소연쇄반응 방법으로는 10종 이상의 다중 핵산을 동시에 검출해야 하는 경우에 이를 수행하기 위해는 여러 PCR 반응을 그룹으로 나누어 여러차례 진행하여야 하므로 소요되는 시간 및 수반되는 인건비가 상당한 문제가 있었다.

이에, 복수 종의 핵산을 빠른 시간 안에 정확하게 검출해야 하는 다양한 상황에서 하나의 PCR 반응 용기에서 보다 편리하고, 높은 신뢰성 및 재현성을 가지는 방식으로 복수의 타겟 핵산을 동시에 검출해 낼 수 있는 프로브 및 이를 이용하는 검출 방법의 개발이 절실히 요구되는 실정이다.

더욱이, 이 기술분야에서 형광 표지자 등의 종류와 수에 제한받지 않고 하나의 PCR 반응 용기에서 복수 종의 핵산을 간섭없이 효과적으로 검출 또는 구별할 수 있는 다중 타겟 핵산의 동시 검출 방법 및 수단에 대한 개발 요구가 계속되고 있다.

대한민국 공개 특허공보 제10-2021-0057028호 대한민국 공개 특허공보 제10-2014-0112060호 대한민국 공개 특허공보 제10-2013-0008283호 대한민국 등록 특허공보 제10-2144163호 대한민국 등록 특허공보 제10-1481004호

J. Mol. Endocrinol, Vol. 29, pp. 23-39, 2002 Scientific Reports, Vol. 7, No. 41392, pp. 1-10, 2017

본 발명자들은 하나의 PCR 반응 용기에서 하나 이상의 타겟 핵산을 동시에 검출 또는 구별하고자 할 때, 종래에 형광 표지자(Label, reporter dye)가 부착된 프로브를 사용함에 따라 야기되는 형광 채널의 한계, 낮은 반응성 및/또는 위양성 시그널의 문제를 해결하는 다중 타겟 핵산의 동시 검출 방법 및 이에 이용되는 프로브를 개발하기 위하여 예의 노력하였다.

이에, 본 발명은 핵산 혼합물 또는 시료로부터 하나 이상의 타겟 핵산을 동시에 검출하는데 이용될 수 있고, 다중 타겟 핵산을 형광 발광제인 리포터 염료(reporter dye) 표지자에 의한 간섭없이 실시간으로 검출가능한, 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적은 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)를 이용하여 핵산 혼합물 또는 시료로부터 하나 이상의 타겟 핵산을 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)를 포함하는, 핵산 혼합물 또는 시료로부터 하나 이상의 타겟 핵산을 동시에 검출하기 위한 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.

본 출원이 해결하고자 하는 과제가 상술한 과제로 제한되는 것은 아니며, 언급되지 아니한 과제들은 본 명세서 및 첨부된 도면으로부터 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 다음의 발명을 제공한다.

본 발명은 핵산 혼합물 또는 시료로부터 하나 이상의 타겟 핵산을 동시에 검출하는데 이용될 수 있고, 다중 타겟 핵산을 리포터 염료(reporter dye) 표지자에 의한 간섭없이 실시간으로 검출가능한, 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 LTP는

타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region);

특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region);

형광 라벨부(Reporter label, R); 및

소광 라벨부(Quencher label, Q);를 포함한다.

여기서, 상기 태그부는 상기 형광 라벨부(R)에 결합되고, 상기 타겟 핵산 결정부는 상기 소광 라벨부(Q)에 결합되는 것을 특징으로 하는, 표지자가 결합된 태그 프로브일 수 있다.

구체적으로, 상기 LTP는 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region); 형광 라벨부(R); 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region); 및 소광 라벨부(Q)가 순서대로 연결된, iFAM 프로브(iFAM probe) 구조일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

다른 일 구현예로, 상기 LTP는 연결부(Linker)가 더 포함되고, 상기 연결부는 형광 라벨부(R)가 결합된 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region)와 소광 라벨부(Q)가 결합된 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region)를 연결하는 것을 특징으로 하는 프로브일 수 있다.

구체적으로, 상기 LTP는 형광 라벨부(R); 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region); 연결부(Linker); 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region); 및 소광 라벨부(Q)가 순서대로 연결된, 테일 프로브(Tail probe) 구조일 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니다.

또다른 일 구현예로, 상기 LTP는 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)을 통해 핵산 혼합물 또는 시료로부터 하나 이상의 타겟 핵산을 동시에 검출하기 위해서, 상기 LTP 내의 태그부에 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드(Oligo nucleotide) 및 소광자(Quencher)를 포함하는 Q-태그(Q-tag)와 함께 사용되는 것을 특징으로 할수 있다.

여기서, 상기 Q-태그(Q-tag) 내에 포함되는 올리고뉴클레오티드(Oligo nucleotide)는 태그부의 핵산 서열과 적어도 50% 이상 상보적으로 결합하는 핵산을 포함하고, 바람직하게는 태그부의 핵산 서열과 적어도 60%, 70%, 또는 80% 이상 상보적으로 결합하는 핵산을 포함하며, 가장 바람직하게는 태그부의 핵산 서열과 적어도 90% 이상 상보적으로 결합하는 핵산을 포함한다. 상기 핵산은 DNA(deoxyribonucleic acid), LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid), HNA(Hexose nucleic acid), RNA(Ribonucleic acid), 다양한 핵산(nucleic acid)의 유사체들 또는 이들의 조합으로 이루어진 것일 수 있다.

한편, Q-태그(Q-tag) 내에 포함되는 올리고뉴클레오티드(Oligo nucleotide)는 태그부의 핵산과 동일 물질 또는 다른 물질일 수 있다.

또한, 상기 LTP의 태그부는 타겟 핵산에 따라 미리 설정된 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 것일 수 있다. 또한, 하나의 PCR 반응 용기에는 검출하고자 하는 타겟 핵산의 개수에 따라, 해리온도(Tm) 값이 각각 적어도 3 ℃ 이상, 바람직하게는 5 ℃ 이상, 가장 바람직하게는 7 ℃ 이상 차이가 나는 태그부가 선택되고, 선택된 각 태그부를 포함하는 LTP가 검출하고자 하는 타겟 핵산의 개수 만큼 하나의 반응 용기에 포함될 수 있다.

또한 본 발명의 일 구현예로, 상기 LTP의 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region)는 타겟 핵산 서열과 적어도 50% 이상 상보적으로 결합하는 영역을 포함하고, 바람직하게는 타겟 핵산 서열과 적어도 60%, 70%, 또는 80% 이상 상보적으로 결합하는 영역을 포함하며, 가장 바람직하게는 타겟 핵산 서열과 적어도 90% 이상 상보적으로 결합하는 영역을 포함한다.

여기서 상기 영역은 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드(Oligo nucleotide)일 수 있고, DNA(deoxyribonucleic acid), LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid), HNA(Hexose nucleic acid), RNA(Ribonucleic acid), 다양한 핵산(nucleic acid)의 유사체들 또는 이들의 조합으로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명은 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)를 포함하는, 핵산 혼합물 또는 시료로부터 하나 이상의 타겟 핵산을 검출하기 위한 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명의 LTP를 유효성분으로 포함하며 핵산 혼합물 또는 시료로부터 하나 이상의 타겟 핵산을 동시에 검출하기 위한, 핵산 검출용 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 LTP를 유효성분으로 포함하며 핵산 혼합물 또는 시료로부터 하나 이상의 타겟 핵산을 동시에 검출하기 위한, 다중 핵산 동시 검출용 키트를 제공할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 상기 조성물 또는 키트는 표지자가 결합된 태그 프로브(LTP)의 태그부 핵산에 상보적으로 결합하는 Q-태그(Q-tag)를 추가로 포함할 수 있다.

여기서, Q-태그(Q-tag)는 상기 태그부에 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드(Oligo nucleotide) 및 소광자(Quencher)를 포함하고, 상기 LTP의 타겟 핵산 염기서열(결정부의 염기서열)에는 혼성화하지 않는 것, 바람직하게는 LTP의 태그부 이외의 염기서열에 혼성화되지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 Q-태그(Q-tag) 내에 포함되는 올리고뉴클레오티드(Oligo nucleotide)는 태그부의 핵산 서열과 적어도 50% 이상 상보적으로 결합하는 핵산을 포함하고, 바람직하게는 태그부의 핵산 서열과 적어도 60%, 70%, 또는 80% 이상 상보적으로 결합하는 핵산을 포함하며, 가장 바람직하게는 태그부의 핵산 서열과 적어도 90% 이상 상보적으로 결합하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 DNA(deoxyribonucleic acid), LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid), HNA(Hexose nucleic acid), RNA(Ribonucleic acid), 다양한 핵산(nucleic acid)의 유사체들 또는 이들의 조합으로 이루어진 것일 수 있으며, Q-태그(Q-tag) 내에 포함되는 올리고뉴클레오티드(Oligo nucleotide)는 태그부의 핵산과 동일 물질 또는 다른 물질일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 조성물 또는 키트는 검출하고자 하는 타겟 핵산의 수 만큼의 LTP 및 이에 상보적으로 결합하는 Q-태그(Q-tag)를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 LTP는 각 타겟 핵산에 따라 서로 다른 해리온도(Tm)를 가지는 태그부를 포함하는 것을 특징으로 하고, 상기 Q-태그는 상보적으로 결합하는 상기 LTP의 태그부 해리온도(Tm)와 0 ℃ 내지 3 ℃의 Tm 값 차이를 가지는 것일 수 있다. 다만, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 LTP는 하나의 PCR 반응 용기에는 검출하고자 하는 타겟 핵산의 개수에 따라 그 수와 동일한 개수의 LTP가 포함되는데, 이때, LTP는 각각 해리온도(Tm) 값이 적어도 3 ℃ 이상, 바람직하게는 5 ℃ 이상, 가장 바람직하게는 7 ℃ 이상 차이가 나는 태그부를 포함하는 LTP일 수 있다. 또한, 상기 Q-태그는 상기 각 LTP의 태그부 해리온도(Tm)와 0 ℃ 내지 3 ℃의 Tm 값 차이를 가지는 것일 수 있으며, 바람직하게는 상기 Q-태그는 상기 각 LTP의 태그부 해리온도(Tm)와 동일한 Tm 값을 가지는 것일 수 있다.

다른 일 구현예에 따르면, 상기 조성물 또는 키트는 표지자가 결합된 태그 프로브(LTP) 및 상기 태그부 핵산에 상보적으로 결합하는 Q-태그(Q-tag)를 포함하고, 상기 Q-태그는 PCR 증폭 반응 후에 LTP에서 떨어져 나온 리포터-태그(Reporter-tag)와 상보적으로 결합하여 이중가닥 핵산 복합체를 형성하여 융해 곡선 분석에 이용되는 것을 특징으로 할 수 있다.

여기서 리포터-태그(Reporter-tag)는 본 발명의 LTP에서 형광 라벨부(R)가 결합된 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region)이고, PCR 증폭 반응 시 연장(Elongation) 과정에서 중합효소(polymerase)의 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성에 의해 LTP로부터 분리된다. 상기 리포터-태그(Reporter-tag)는 LTP의 소광자(Quencher)와 분리되어 형광 신호를 발생시키고, 발생된 형광 신호를 통해 핵산의 증폭 여부를 확인할 수 있다. 이 신호를 소광시키기 위해서 소광자(Quencher) 결합되어 있는 Q-태그(Q-tag)가 함께 제공되는데, 상기 Q-태그는 융해 곡선 분석 과정에서 Tm 값 보다 낮은 온도에서 리포터-태그(Reporter-tag)와 결합하고, Tm 값 보다 높은 온도에서 분리되어 증가된 리포터-태그(Reporter-tag)에 의해 발생하는 형광 신호의 변화를 검출할 수 있게 한다. 특정 온도 구간에서 상기 리포터-태그(Reporter-tag)와 상기 Q-태그(Q-tag)가 해리되어 형광 신호가 급격히 증가하게 되면 그 때의 해리온도(Tm) 값을 통해서 타겟 핵산의 동시 검출이 가능하게 된다.

본 발명의 또다른 일 구현예에서, 상기 조성물 또는 키트는 PCR 또는 실시간 중합효소 연쇄 반응(real-time PCR, qPCR)에 관여하는 효소를 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 효소는 타겟 핵산 서열과 관련된 올리고 뉴클레오타이드의 적어도 일부에 대한 증폭 산물의 생성에 관여하는 DNA 중합효소(Polymerase)이고, 상기 중합효소는 핵산 말단 가수분해 효소(exonucelease) 활성을 가지고 있는 것일 수 있다.

또한, 상기 조성물 또는 키트에는 타겟 핵산에 상보적으로 결합하는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머가 포함될 수 있다.

상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 타겟 핵산과 적어도 50% 이상 상보적으로 결합하는 핵산을 포함하고, 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 또는 80% 이상 상보적으로 결합하는 핵산을 포함하며, 가장 바람직하게는 적어도 90% 이상 상보적으로 결합하는 핵산을 포함할 수 있다. 상기 핵산은 DNA (deoxyribonucleic acid), LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid), HNA(Hexose nucleic acid), RNA(Ribonucleic acid), 다양한 핵산(nucleic acid)의 유사체들 또는 이들의 조합으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이 때, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머는 각각 타겟 핵산에 상보적으로 결합하는 핵산의 %는 다를 수 있고, 상기 가능한 핵산 물질도 동일하거나 다른 물질일 수 있다.

또한, 상기 조성물 또는 키트에 포함되는 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 비율은 0.5 : 2 내지 2 : 0.5의 범위일 수 있고, 바람직하게는 1 : 1의 비율일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP) 및 이에 상보적으로 결합하는 Q-태그(Q-tag)를 이용하여 하나의 반응 용기에서 핵산 혼합물 또는 시료로부터 다중 타겟 핵산을 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 방법은 다음의 단계를 포함하는 것인 방법일 수 있다.

(a) 타겟 핵산에 상보적인 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)를 타겟 핵산과 혼성화하는 단계;

여기서, 상기 LTP는 형광 라벨부(R)가 결합된 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region) 및 소광 라벨부(Q)가 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region)가 포함되거나, 형광 라벨부(R)가 결합된 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region) 및 소광 라벨부(Q)가 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region)가 연결부(Linker)로 연결되어포함되고, 상기 LTP의 타겟 핵산과의 혼성화 부위는 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 타겟 핵산과의 혼성화 위치 사이에 존재한다.

(b) 중합효소(polymerase)의 중합 반응으로 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로부터 타겟 핵산의 적어도 일부를 증폭하면서, 중합효소(polymerase)의 5'-말단 엑소뉴클레아제(exonuclease) 작용으로 혼성화 되어있는 LTP의 타겟 핵산 결정부 서열이 분해되고 리포터-태그(Reporter-tag)가 분리되는 단계;

여기서, 상기 리포터-태그(Reporter-tag)는 LTP 내의 형광 라벨부(R)가 결합된 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region)이고, 타겟 핵산이나 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머와는 상보적으로 결합하지 않는다.

(c) 상기 (b) 단계에서 분리된 리포터-태그(Reporter-tag)에서 발생한 형광 신호를 측정하고, 측정된 형광 신호의 크기가 역치(threshold) 값을 넘기는지 확인하는 단계;

여기서, 상기 역치(threshold) 값은 미리 정해둔 특정의 값으로, 이 역치 값을 넘기면, 타겟 핵산이 증폭되었다고 판단할 수 있다.

(d) 상기 (c) 단계에서 형광 신호 크기가 역치 값을 넘긴 PCR cycle을 끝내고, 융해 단계(melt stage)로 진입하여 동일한 반응 용기에 포함되어 있는 상기 리포터-태그(Reporter-tag)와 Q-태그(Q-tag)의 해리 온도를 측정하는 융해 곡선 분석(melting curve analysis) 단계;

여기서, 상기 리포터-태그(Reporter-tag)는 타겟 핵산에 따라 고유한 특정 해리온도(Tm)을 갖도록 설계되고, 상기 리포터-태그(Reporter-tag)와 Q-태그(Q-tag)는 오직 서로에게만 혼성화 되도록 설계될 수 있으며, 상기 융해 단계(melt stage)에서 반응 용기의 온도는 10 ℃부터 서서히 증가시켜 60 ℃에 도달하게 할 수 있다. 그리고,

(e) 융해 곡선 분석(melting curve analysis) 결과로부터 타겟 핵산의 존재 여부를 결정하는 단계.

본 발명에 따른 상기 핵산 혼합물 또는 시료로부터 하나 이상의 타겟 핵산 서열을 동시에 검출하는 방법은 융해 단계(melt stage)에서 상기 리포터-태그(Reporter-tag)의 해리온도(Tm) 보다 낮은 온도에서는 리포터-태그(Reporter-tag)와 Q-태그(Q-tag)는 혼성화되어 리포터 표지자(reporter dye)의 형광 신호가 형광제어(quenching)되지만, 온도를 점차 높이는 과정에서 해리온도(Tm) 보다 온도가 높아지면 리포터-태그(Reporter-tag)와 Q-태그(Q-tag)가 해리되면서 리포터 표지자(reporter dye)의 형광 신호가 형광제어(quenching) 없이 증폭된다. 이렇게 형광 신호가 증폭되는 지점의 해리온도를 측정하여, 미리 설계된 특정 해리온도를 가지는 LTP에 의해 증폭된 특정 타겟 핵산의 존재를 알 수 있는 것이다.

다른 일 구현예에서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함하는 것인 방법일 수 있다.

(a) PCR 증폭 반응 전에, 하나의 반응 용기 내에 존재하는 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)와 Q-태그(Q-tag)의 해리온도를 측정하는 기준 융해 곡선(Reference melting curve) 측정 단계;

여기서, 상기 LTP는 형광 라벨부(R)가 결합된 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region) 및 소광 라벨부(Q)가 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region)가 포함되거나, 형광 라벨부(R)가 결합된 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region) 및 소광 라벨부(Q)가 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region)가 연결부(Linker)로 연결되어포함된다.

(b) 타겟 핵산에 상보적인 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 LTP를 타겟 핵산과 혼성화하는 단계;

여기서, 상기 LTP의 타겟 핵산과의 혼성화 부위는 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 타겟 핵산과의 혼성화 위치 사이에 존재한다.

(c) 중합효소(polymerase)의 중합 반응으로 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로부터 타겟 핵산의 적어도 일부를 증폭하면서, 중합효소(polymerase)의 5'-말단 엑소뉴클레아제(exonuclease) 작용으로 혼성화 되어있는 LTP의 타겟 핵산 결정부 서열이 분해되고 리포터-태그(Reporter-tag)가 분리되는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 분리된 리포터-태그(Reporter-tag)에서 발생한 형광 신호를 측정하고, 측정된 형광 신호의 크기가 역치(threshold) 값을 넘기는지 확인하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계에서 형광 신호 크기가 역치 값을 넘긴 PCR cycle을 끝내고, 융해 단계(melt stage)로 진입하여 동일한 반응 용기에 포함되어 있는 상기 리포터-태그(Reporter-tag)와 Q-태그(Q-tag)의 해리 온도를 측정하는 융해 곡선 분석(melting curve analysis) 단계;

여기서, 상기 리포터-태그(Reporter-tag)는 타겟 핵산에 따라 고유한 특정 해리온도(Tm)을 갖도록 설계되고, 상기 리포터-태그(Reporter-tag)와 Q-태그(Q-tag)는 오직 서로에게만 혼성화 되도록 설계될 수 있다. 그리고,

(f) 상기 융해 곡선 분석(melting curve analysis) 결과에 상기 (a) 단계에서 얻은 기준 융해 곡선(Reference melting curve) 측정 결과를 비교하여 타겟 핵산의 존재 여부를 결정하는 단계.

상기 방법은 PCR 증폭이 일어나기 전에도 LTP의 태그부와 Q-태그가 하나의 반응 용기에 존재하여 서로 상보적으로 결합하여 LTP의 형광 표지자(reporter dye)에 의한 신호를 Q-태그의 소광자(Quencher)가 추가적으로 형광제어(quenching) 시킬 수 있기 때문에, 이 추가적인 형광제어 값을 실제 융해 곡선 분석(melting curve analysis) 시에 반영하기 위해서 제공된다.

비록 PCR 증폭 반응 전에 Q-태그와 LTP의 이중가닥 결합에 의한 형광제어(quenching)는 LTP에 결합되어 있는 소광자(Quencher)에 의해 이미 형광제어(quenching)되어 있는 상태이기 때문에, Q-태그로 인한 추가적인 형광제어(quenching) 효과는 상대적으로 적고 융해 단계(melt stage)에서 derivative melting curve의 peak 값 크기도 작을 수 있다. 그러나 상기 기준 융해 곡선(Reference melting curve)을 측정함으로써 상기 방법의 (f) 단계에서 추가적인 peak 값 크기 비교를 통해 해당 타겟 핵산이 증폭됨을 더욱 명확히 알 수 있다.

또 다른 일 구현예에서, 상기 방법은 한 개의 반응 용기에서 다수의 형광 채널이 이용되고, 각 동일 형광 채널(channel)에는 다수의 LTP가 각각 조합됨으로써 수 십 개의 타겟 핵산 검출이 가능한, 다중 타겟 핵산 서열을 동시에 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

다중 타겟 핵산의 동시 검출은 표지자가 결합된 태그 프로브(LTP)의 주형과의 혼성화 뿐만 아니라, PCR 중합효소(Taq polymerase)의 5'-말단 엑소뉴클레아제 효소 반응에 의한 증폭 반응 후에 프로브에서 절단된 리포터-태그와 퀀처 태그(Quencher tag, Q-tag)의 혼성화 반응 및 이 혼성화된 복합체의 융해 곡선(Melting curve) 분석을 통해 액상 또는 고상에서 5'-말단에서 3'-말단 방향으로 진행되는 핵산 절단반응에 의한 핵산 혼합물로부터 다중 타겟 핵산을 동시에 검출 방법을 제공하는 데 있다.

이는 앞서 설명한, 본 발명의 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP) 및 이에 상보적으로 결합하는 Q-태그(Q-tag)를 이용하여 한 개의 반응 용기에서 핵산 혼합물 또는 시료로부터 하나 이상의 타겟 핵산 서열을 동시에 검출하는 방법으로, 상기 (a) 단계 내지 (e) 단계를 포함하는 방법 또는 상기 (a) 단계 내지 (f) 단계를 포함하는 방법과 동일하다.

다만, 상기 방법에서 사용되는 LTP 및 이에 상보적인 Q-태그가 각각 서로 다른 형광 채널에 조합되는 것, 즉 LTP의 형광 라벨부가 적어도 한 종류 이상, 또는 2 종류 이상, 바람직하게는 3 종류 이상 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 상기 방법에 사용되는 LTP는 10 ℃ 이상에서 60 ℃ 이하의 구간에서 특정 해리온도(Tm)를 갖도록 설계될 수 있고, 각 LTP는 해리온도(Tm) 값이 각각 적어도 3 ℃ 이상, 바람직하게는 5 ℃ 이상, 가장 바람직하게는 7 ℃ 이상 차이가 나는 태그부를 포함하도록 설계하여 동일 형광 채널을 통해 적어도 5 내지 7 종류 이상의 타겟 핵산을 동시에 검출할 수 있다. 따라서 서로 다른 3 종류의 형광 채널을 사용하는 경우에는 한 채널 당 적어도 5 내지 7 종류의 LTP가 이용 가능하므로, 하나의 PCR 반응 용기 내에서 적어도 15 내지 21 종류 이상의 타겟 핵산을 동시에 검출할 수 있고, 5 종류의 형광 채널을 사용하면, 적어도 25 내지 35 종류 이상의 타겟 핵산을 동시에 검출 가능하다.

본 발명의 또 다른 일 구현예에서, LTP 및 이에 상보적인 Q-태그를 이용하여 핵산 혼합물 또는 시료에서 다중 타겟 핵산을 동시에 검출하기 위한 방법에 있어서, 상기 핵산 혼합물 또는 시료는 미지의 복수 핵산이 포함되어 있는 것을 특징으로 한다.

이 때, 상기 미지의 복수 핵산을 검출하기 위해서, 복수의 타겟 핵산을 적어도 일부를 증폭시키는 단계 및 광학적 성질에 기초한 신호를 검출하는 단계를 포함하고, 타겟 핵산의 포함 여부를 확인하기 위해서 융해 단계(Melt stage)에서 LTP에서 분리된 리포터-태그와 이에 상보적인 Q-태그 복합체의 해리온도(Tm)와 관련된 해리피크값을 확인하는 단계;를 포함하는 다중 타겟 핵산을 동시에 검출하기 위한 방법이 제공될 수 있다.

또한, 상기 융해 단계(Melt stage)에서 반응 용기의 온도를 적어도 10 ℃로 낮춰 상기 반응 용기에 포함된 적어도 하나의 리포터-태그와 이에 상보적인 Q-태그의 결합을 유도하는 안정화 단계;를 더 포함하는, 다중 타겟 핵산을 동시에 검출하기 위한 방법이 제공될 수 있다.

상기 해리피크값을 확인하는 단계는, 상기 리포터-태그와 이에 상보적인 Q-태그 세트 각각에 따른 여러 해리피크값을 확인하는 단계를 포함하고, 얻어진 서로 다른 각 해리피크값은 하나의 반응 용기 내에 얻어진 해리피크값의 수 만큼의 타겟핵산이 존재하고, 그 해리피크값을 통해서 타겟 핵산이 무엇인지 확인 또는 검출하는 다중 타겟 핵산을 동시에 검출하기 위한 방법이 제공될 수 있다.

상기 타겟 핵산의 적어도 일부를 증폭시키는 단계는, 상기 타겟 핵산을 단일 가닥(single strand)으로 열변성 하는 단계, 상기 타겟 핵산에 LTP의 타겟 핵산 결정부가 결합되는 단계 및 상기 타겟 핵산 결정부를 개시점으로 하여 상기 타겟 핵산에 대한 증폭 산물이 생성되는 단계를 포함하는, 다중 타겟 핵산을 동시에 검출하기 위한 방법이 제공될 수 있다.

또한, 타겟 핵산의 적어도 일부를 증폭시키는 과정은, 열변성(Denaturation)하는 단계; 및 어닐링(annealing)과 연장(elogation)이 통합된 단계;로 구성되는 2 단계 과정일 수 있으며, 상기 증폭시키는 단계는 순차적으로 적어도 2 회 이상 수행되는, 다중 타겟 핵산을 동시에 검출하기 위한 방법이 제공될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법에 따라 다중 타겟 핵산은 실시간 방식, 엔드-포인트(end-point) 방식 또는 지정 시간 간격(predetermined time interval) 방식으로 검출되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 상기 타겟 핵산은 적어도 2 종 이상의 핵산을 포함하고, 이에 대응하는 상기 프로브 및 상기 Q-태그(Q-tag)도 각각 적어도 2 종 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 타겟 핵산은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산은 DNA (deoxyribonucleic acid), LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid), HNA(Hexose nucleic acid), RNA(Ribonucleic acid), 다양한 핵산(nucleic acid)의 유사체들 또는 이들의 조합으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 프로브는 태그(tag)의 해리온도(Tm)를 이용하여 샘플 내의 다중 타겟 핵산을 동시에 검출할 수 있다. 본 발명의 표지자가 결합된 태그 프로브(LTP)는 PCR 반응 과정에서 타겟 핵산 서열의 증폭 후에 분리되고 퀀처 태그(quencher tag)와 결합하여 해리온도를 넘어간 순간 형광 신호를 방출하기 때문에, 해리온도 곡선 분석을 통해 다중 핵산을 검출가능하다.

특히, 본 발명에 따른 프로브는 태그(tag)의 염기서열에 따라 해리온도(Tm)를 상이하게 설계 조절할 수 있고, 복수 종류의 프로브를 이용하여, 하나의 형광 채널당 복수 종류의 타겟 검출을 수행하는데 이용할 수 있다. 여러 개의 형광 채널을 사용하는 경우에는 사용된 형광 채널과 프로브의 조합 수 만큼의 다수의 타겟을 간섭없이 검출할 수 있는 장점을 가진다.

또한, 종래 융해 곡선 분석에서는 프로브와 타겟 핵산의 혼성화 결과물(hybrid)에 대한 Tm 값이 타겟 핵산 서열에 존재하는 서열 변이에 의해 영향을 받지만, 본 발명의 LTP와 Q-태그를 이용하는 융해 곡선 분석 방에서는 타겟 핵산 상의 서열 변이에 관계없이 일정한 Tm 값을 갖기 때문에 우수한 정확도로 융해 곡선 분석이 가능하다.

본 출원의 효과가 상술한 효과들로 제한되는 것은 아니며, 언급되지 아니한 효과들은 본 명세서 및 첨부된 도면으로부터 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 따라 제작된 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)의 예시적 구조를 나타낸 도면이다.
a 내지 c는 각각 연결부를 포함하는 LTP(Tail probe), 연결부를 포함하지 않는 LTP(iFAM probe) 및 상기 LTP의 태그부에 상보적으로 결합하는 Q-태그(Q-tag)의 대표적인 모식도를 나타낸다.
도 2는 PCR 증폭 과정에서 LTP 내의 리포터-태그(Reporter-tag) 분리에 의한 형광 신호 증폭의 원리를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 PCR 증폭에 의해 얻은 증폭 신호를 나타내는 통합 PCR 증폭 곡선을 사용된 LTP에 따라 분리된 증폭 곡선으로 나타낸 결과이다.
a는 본 발명의 실시예에 따라 얻어진 형광 증폭 신호의 통합 PCR 증폭 곡선이고, b는 PCR 증폭 과정에서의 신호를 소프트웨어 그래프 피팅을 통해서 각 LTP에 따른 증폭 곡선으로 분리한 결과이다.
도 4는 LTP에서 떨어져 나온 리포터-태그(Reporter-tag)와 Q-태그 복합체의 해리온도(Tm) 전후에서 결합 상태 및 증폭된 형광 신호에 따른 해리온도(Tm)를 나타내는 융해 곡선을 나타낸 모식도이다.
a는 해리온도(Tm) 전후의 반응 용기 온도에 따른 리포터-태그(Reporter-tag)와 Q-태그 복합체의 결합 상태를 나타내고, b는 해리온도(Tm) 이상의 온도에서 Q-태그의 분리에 의한 증폭된 형광 신호 피크를 보이는 융해 곡선(Melting Curve)을 나타낸다. c는 본 발명에 따른 리포터-태그(Reporter-tag)의 예시적인 태그 염기서열 및 해리온도(Tm)와 융해 곡선(Melting Curve) 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 기준 융해 곡선(Reference Melting Curve)의 측정 이유를 설명하는 도면이다.
도 6은 복수 개의 타겟 핵산이 존재하는 경우, 이를 검출하기 위한 qPCR 진행 및 융해 곡선(Melt Curve) 확인 과정을 나타내는 모식도이다.
a는 하나의 PCR 반응 용기에 타겟 핵산이 2 개 존재하는 경우의 융해 곡선(Melt Curve) 확인 과정이고, b는 타겟 핵산이 수 개 존재하는 경우의 융해 곡선(Melt Curve) 확인 과정을 나타내는 예시적인 모식도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 qPCR 증폭 단계에서 얻어진 증폭 신호 데이터(data)를 수렴하도록 처리하여 얻은 통합 증폭 곡선을 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 qPCR 증폭 단계에서 얻어진 통합 증폭 곡선 및 이를 각각의 타겟 핵산의 증폭에 따라 분리한 증폭 곡선을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 각 타겟 핵산의 증폭에 따라 분리한 증폭 곡선에서 임계치 설정에 따른 Ct 값을 나타내는 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 융해 단계(Melt stage)의 Peak 값 결과를 나타낸다.
a는 각 융해 단계(Melt stage)의 통합 증폭 곡선을 나타내고, b는 증폭된 타겟 핵산이 수 만큼 분리된 증폭 곡선을 나타낸다. 여기서, 파란색, 주황색 및 회색 그래프는 각각 A.bau tag, P.aer tag 및 K.pne tag의 융해 곡선 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 타겟 핵산 증폭에 대응한 융해 단계(Melt stage)에 따른 ΔPeak 값을 측정한 결과이다.
도 12는 도 11의 결과로부터 다중 타겟 핵산이 포함된 시료에서 A.bau의 동시 검출 여부를 나타내는 융해 곡선 그래프 결과이다.
도 13은 도 11의 결과로부터 다중 타겟 핵산이 포함된 시료에서 P.aer의 동시 검출 여부를 나타내는 융해 곡선 그래프 결과이다.
도 14는 도 11의 결과로부터 다중 타겟 핵산이 포함된 시료에서 K.pne의 동시 검출 여부를 나타내는 융해 곡선 그래프 결과이다.

본 발명자들은 다중 타겟 핵산을 동시에 검출 또는 구별할 때, 형광단의 간섭현상에 의한 한계, 낮은 반응성 및/또는 위양성 시그널의 문제를 해결하고자 노력한 결과, 단일 형광단으로 다수의 표적 핵산을 하나의 용기에서 동시에 검출할 수 있도록 상이한 해리온도(Tm)를 갖는 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)를 발명하였다.

표지자로써 형광 발광제인 리포터 염료(reporter dye)가 부착되고 특정 해리온도(Melting temperature, Tm) 값을 갖는 태그(Tag)를 타겟 핵산 서열에 대해 상보적인 핵산 서열을 가지고 있는 프로브에 결합시켜 제작된 '표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)'를 이용하는 경우, 융해곡선 분석(Melting curve analysis)에서 상기 태그(Tag)의 해리온도(Tm) 차이에 의해 복수의 타겟을 한 개의 형광단 channel에서 동시에 검출할 수 있고, 다른 종류의 리포터 염료(reporter dye)를 사용하는 경우에는 리포터 염료당 해리온도(Tm)가 다른 태그를 사용하여 제작되는 조합의 수 만큼 타겟 핵산의 수를 늘려 동시에 검출 또는 구별할 수 있는 신규한 프로브를 검증하였다.

또한, 상기 다중 타겟 핵산의 동시 검출은 표지자가 결합된 태그 프로브(LTP)의 주형과의 혼성화 뿐만 아니라, PCR 중합효소(Taq polymerase)의 5'-말단 엑소뉴클레아제 효소 반응에 의한 증폭 반응 후에 프로브에서 절단된 리포터-태그(R-tag)와 퀀처 태그(Q-tag)의 혼성화 반응 및 이 혼성화된 복합체의 융해 곡선(Melting curve) 분석을 통해 보다 정확하고 편리하게 수행됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 용어의 설명, 특정한 예시 및 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 본 명세서에 기재된 특정한 예시 및 실시예는 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 출원의 사상을 명확히 설명하기 위한 것이므로, 본 출원이 본 명세서에 기재된 실시예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 출원의 범위는 본 출원의 사상을 벗어나지 아니하는 수정예 또는 변형예를 포함하는 것으로 해석되어야 하는 것은 자명하다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 출원에서의 기능을 고려하여 가능한 현재 널리 사용되고 있는 일반적인 용어를 선택하였으나 이는 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 의도, 관례 또는 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 다만, 이와 달리 특정한 용어를 임의의 의미로 정의하여 사용하는 경우에는 그 용어의 의미에 관하여 별도로 기재할 것이다. 따라서 본 명세서에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌 그 용어가 가진 실질적인 의미와 본 명세서의 전반에 걸친 내용을 토대로 해석되어야 한다.

<용어의 설명>

프로브(Probe)

본 발명에서 사용되는 용어 "프로브(Probe)"는 중합효소연쇄반응(PCR) 과정에서 타겟 핵산의 적어도 일부분에 상보적으로 결합하여 타겟 핵산의 검출에 사용된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 대부분의 프로브에는 타겟 핵산의 증폭이나 검출 여부를 확인할 수 있도록 하는 리포터 염료(reporter dye)인 형광 표지자가 부착되어 있는 것이 특징이다.

본 발명에서는 표지자인 리포터 염료(reporter dye)가 부착되고 특정 해리온도(Melting temperature, Tm) 값을 갖는 태그(Tag)를 타겟 핵산 서열에 대해 상보적인 핵산 서열을 가지고 있는 프로브에 결합시켜 제작된 '표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)'가 사용된다. 본 발명에서 상기 "표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)"는 "LTP" 및 "LTP 프로브"라고도 칭하며, 서로 상호교환적으로 본원에 사용된다.

상기 LTP는 타겟 핵산 서열에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드(oligo nucleotide)에 태그(Tag) 및 리포터 염료(reporter dye) 뿐만 아니라, 소광자(Quencher)를 반드시 포함하고 있고, 이들을 연결하는 linker가 추가적으로 포함되어 구성되는지에 따라 Tail probe 구조 또는 iFAM probe 구조로 구분될 수 있다. 여기서, Tail probe 구조는 형광 라벨부(R); 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region); 연결부(Linker); 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region); 및 소광 라벨부(Q)가 순서대로 연결된 프로브 구조이고, iFAM probe 구조는 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region); 형광 라벨부(R); 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region); 및 소광 라벨부(Q)가 순서대로 연결된 프로브 구조를 포함한다.

태그(Tag) 및 리포터-태그(Reporter tag)

본 발명에서 사용되는 용어 "태그(Tag)" 및 "리포터-태그(Reporter tag)"는 본 발명의 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)의 일 구성요소로써, 특정 해리온도(Tm) 값을 갖도록 미리 설계된 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 의미한다.

특히, 리포터-태그(Reporter tag)는 PCR 증폭 과정에서, 타겟 핵산에 결합된 LTP가 중합효소(polymerase)의 5'-말단 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성에 의해 분리되어 얻어지는 것으로, 상기 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), 즉 태그(Tag)에 형광 라벨부(Q)인 리포터 염료(reporter dye)가 결합되어 있는 구조이다.

본 발명에서 상기 리포터-태그(Reporter tag)는 "R-태그(R-tag)"라고도 칭하며, Q-태그(Q-Tag)와 상보적으로 결합한다. R-태그(R-tag)와 Q-태그(Q-Tag)의 상보적 결합에 의해 형성된 이중가닥 핵산 복합체는 본 발명에 따른 방법의 융해 단계(melting stage)에서 이들의 해리온도(Tm) 이후에서 분리되고, 이때 발생하는 형광 신호에 의해 타겟 핵산의 존재 유무를 확인하는데 사용된다.

Q-태그(Q-Tag)

본 발명에서 사용되는 용어 "Q-태그(Q-Tag)"는 본 발명의 상기 리포터-태그(Reporter tag) 또는 LTP에 상보적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)에 소광자(Quencher)가 부착되어 있는 것을 지칭한다.

본 발명에서 상기 Q-태그(Q-Tag)는 PCR 반응 용기에 LTP와 함께 포함되어 사용되고, PCR 증폭 후, 융해 단계에서 R-태그(R-tag)와 상보적으로 결합하여 이중가닥의 핵산 복합체를 형성할 수 있다.

상기 Q-태그와 R-태그가 결합하고 있는 상태에서는 Q-태그의 소광자(Quencher)가 R-태그의 리포터 염료(reporter dye)에 의한 형광 신호 발생을 제어하고 있지만, 해리온도(Tm) 이상의 특정 온도에서는 서로 분리되어 Q-태그의 소광자(Quencher)에 의한 형광 제어 효과가 사라짐으로써 R-태그의 리포터 염료(reporter dye)에 의해 형광 신호가 발생하게 된다.

리포터(Reporter)

본 발명에서 사용되는 용어 "리포터(Reporter)"는 광 여기시 광을 다시 방출할 수 있는 형광 화합물을 지칭한다. 상기 "리포터(Reporter)"는 "리포터 염료(Reporter dye)", "형광 발광제", "형광 물질", "형광 채널", "형광 표지자", "형광단", "형광 라벨부" 또는 "표지자"라고도 칭하며, 서로 상호교환적으로 본원에 사용된다.

PCR 증폭 반응에 의해서 타겟 핵산이 증폭되는 경우, 프로브에 부착되어 있는 리포터(Reporter)에 의해 형광 시그널이 발생하고 그 시그널 값을 통해서 타겟 핵산의 증폭 유무를 확인할 수 있다. 형광 시그널 값의 종류는 흡광도(흡수 강도), 형광 강도 등이 있고, 특별히 제한되지 않는다. 상기 시그널 값은 형광 물질을 사용한 경우에 상기 형광 물질에 따른 여기광에 의해 방사되는 형광의 강도이거나 핵산 이중가닥의 융해 또는 형성에 의해 형광을 발하는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 리포터(Reporter)는 FAM(Fluorescein amidites), 5-FAM(5-carboxyfluorescein), 6-FAM(6-carboxyfluorescein), serinol FAM, Texas red, HEX(2', 4', 5', 7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Alexa 680, Cy5 또는 인터컬레이터 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

소광자(Quencher)

본 발명에서 사용되는 용어 "소광자(Quencher)"는 리포터(Reporter) 또는 형광단에 근접하여 위치할 때, 상기 리포터(Reporter) 또는 형광단에 의해 생성된 방출 에너지를 흡수하고, 열로서 에너지를 소산시키거나 형광단의 방출 파장보다 더 긴 파장의 광을 방출하는 분자를 지칭한다. 상기 "소광자(Quencher)"는 "퀀처", "소광자 염료(Quencher dye)" 또는 "소광 라벨부" 라고도 칭하며, 서로 상호교환적으로 본원에 사용된다.

본 발명에서 사용되는 소광자(Quencher)는 EBQ(Excellent Bioneer Quencher), Black Hole Quencher(BHQ), BHQ-1, BHQ-2, Dabcyl, TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), 그래핀, FRET 형광단, ZEN 퀀처 및 ATTO 퀀처를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

타겟 핵산(Target nucleic acid)

본 발명에서 사용되는 용어 "타겟 핵산(Target nucleic acid)"는 본 발명에서 검출하고자 하는 핵산 혼합물 또는 미지의 시료에 존재하는 임의의 핵산 분자 또는 핵산 물질을 지칭한다. 상기 용어 "타겟 핵산(Target nucleic acid)"는 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "nucleic acid", "염기서열" 및 "핵산"과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 단일 가닥 또는 이중 가닥을 포함한다.

본 발명에서 상기 "타겟 핵산(Target nucleic acid)"는 합성된 것, 바이러스, 고세균, 세균, 진균, 식물, 동물, 또는 이들의 조합에 포함되어 있거나 이들에서 유래하는 것 또는 변형된 것을 포함하며, DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, 상보성 DNA(cDNA), RNA, 메틸화 RNA, miRNA, pre-miRNA, pri-miRNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, rRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, 이들의 유도체 또는 이들의 조합을 포함하는 것 일 수 있다.

혼성화(Hybridizing)

본 발명에서 사용되는 용어 "혼성화(Hybridizing)"는 2 개의 상보적인 단일가닥 핵산이 이중가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 상기 혼성화는 2개의 핵산 이 완전히 상보적일 때 뿐만 아니라, 일부 상보적이지 않은 염기가 존재할 때도 일어날 수 있다. 본 발명에서는 2 개의 단일가닥 간의 상보성이 50% 이상, 바람직하게는 60%, 70% 또는 80% 이상이 되도록, 가장 바람직하게는 90% 이상이 되도록 설계할 수 있다.

또한, 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 이온 강도, 염기 구성, 핵산 단편의 길이, 미스매칭 정도 및 변성제의 존재 등 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 크게 조절될 수 있다.

본 발명에서는 PCR 증폭 과정에서 타겟 핵산과 LTP가 혼성되고, 융해 단계에서는 Q-태그와 R-태그가 혼성화될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

해리온도(Tm)

본 발명에서 사용되는 용어 "해리온도(Tm)"는 전체 이중가닥 핵산 분자의 50%가 단일가닥으로 전환될 때의 온도를 의미한다. 상기 해리온도(Tm)는 본 발명에서 "융해온도" 또는 "Tm" 이라고도 지칭할 수 있다.

이중가닥 핵산 분자를 포함하는 용액을 가열하면 이중가닥 DNA에서 수소 결합이 풀려 단일가닥 핵산 분자로 해리(융해)되고, 260 ㎚에서의 흡광도는 상승하게 된다. 이러한 성질을 이용하여 해리온도(Tm)는 보통 260 ㎚에서의 흡광도가 흡광도 전체 상승분의 50%에 달했을 때의 온도(℃)로 측정할 수 있다. 해리온도(Tm)는 이중가닥을 형성하는 핵산의 염기서열에 따라 차이가 발생하기 때문에, Tm 값의 차이를 이용하여 타겟 핵산의 검출, 표적 부위에서의 다형이나 변이를 검출하는데 이용할 수 있다.

본 발명에서는 이중가닥 DNA의 상동성이 높을수록 높고, 상동성이 낮을수록 낮아지는 해리온도(Tm)는 차이를 이용하여, 다중 타겟 핵산의 동시 검출을 위해서 다양한 해리온도(Tm) 값을 가지는 서로 다른 태그(tag)를 포함하는 LTP를 제작하였다. 또한, 상기 태그(tag)는 Q-태그와 상보적 결합하는데, Q-태그의 해리온도(Tm) 값은 태그(tag)의 해리온도와 3 ℃ 이하의 차이 값을 갖도록 설계하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 복수의 타겟 핵산에 대해 각각 서로 다른 해리온도(Tm) 값을 가지는 LTP를 이용하여, 하나의 형광 채널에서도 복수의 타겟 핵산의 존재 유무를 융해 곡선 분석(Melting Curve Analysis)을 통해서 확인할 수 있다.

융해 곡선 분석(Melting Curve Analysis)

본 발명에서 사용되는 용어 "융해 곡선 분석(Melting Curve Analysis)"은 핵산 복합체 시료의 융해 단계에서, 해리온도(Tm) 보다 상대적으로 높은 특정의 온도 범위 또는 상대적으로 낮은 특정의 온도 범위 중 적어도 한 쪽에 형광 신호 피크가 존재하는지의 여부를 해석하는 융해 곡선 분석 방법을 의미한다.

본 발명의 융해 곡선 분석은 PCR 증폭 단계에서 분리된 R-태그와 동일 반응 용기에 포함되어 있던 Q-태그가 융해 단계(melting stage)에 진입한 후에, 얻어지는 융해 곡선 해석을 목적으로 할 수 있다. 구체적으로, 상기 융해 단계(melting stage)에서는 처음에 10 ℃ 이하로 온도를 낮추어 R-태그와 Q-태그가 이중가닥 핵산 복합체를 형성하도록 하고, 60 ℃ 까지 온도를 상승시키는 과정에서 각 R-태그와 Q-태그의 핵산 복합체의 특정 해리온도(Tm) 직후에 Q-태그의 분리에 의해 급격히 증가하는 형광 신호를 분석함으로써 수행할 수 있다.

따라서, 본 발명의 상기 형광 신호 값은 R-태그에 부착되어 있는 형광 리포터 염료에 의해 이중가닥 핵산 복합체가 융해되면 증가하는 신호 값으로써, 상기 리포터 염료에 따른 광 여기시에 발생되는 형광의 강도임을 특징으로 한다.

이하, 본 발명에서 제공하는 프로브의 구조, 이의 제작 방법 및 이를 이용한 다중 타겟 핵산 검출 방법을 자세하게 설명한다.

<프로브의 구조 및 이의 제작>

본 발명에서는 단일 형광단으로 다수의 표적 핵산을 하나의 용기에서 동시에 검출할 수 있도록 상이한 해리온도(Tm)를 갖는 "표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)" 및 "Q-태그(Q-tag)"를 제작하였다.

도 1에 본 발명의 LTP 구조 및 Q-태그(Q-tag) 구조의 대표적인 모식도를 나타내었다.

상기 LTP는 올리고뉴클레오티드(oligo nucleotide)로 구성된 Tail probe 구조 또는 iFAM probe 구조일 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 LTP는 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting sequence); 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag sequence); 연결부(Linker); 형광 라벨부(R) 및 소광 라벨부(Q)를 포함하는 구조일 수 있고, 이는 Tail probe로 명명하였다.

상기 Tail probe는 프로브의 5'-말단 또는 3'-말단에 형광 표지자(Reporter dye)가 달린 태그부(Tag sequence)를 포함하고, 타겟 핵산 결정부의 5'-말단 또는 3'-말단에 소광자(Quencher)인 소광 라벨부 결합되어 있으며, 상기 태그부와 타겟 핵산 결정부는 링커로 연결된 구조이다(도 1a). 또한, 소광자(Quencher)의 위치는 타겟 핵산 결정부의 끝 쪽 말단이 아니라 타겟 핵산 결정부 서열의 중간에 존재하는 구조도 가능하며, 상기 소광자의 위치가 중복되어 2개 이상 복합적으로 존재할 수도 있다.

Tail probe 구조의 다양한 예시

Tail Probe	Sequence (5'-end -> 3'-end )
MPT001B	[Q] ACC AAT CAT AGA GTA GCG CGC CCA GTT TTC [linker] GAG AAG AA [R]
MPT004B	[R] GAG AAG AA [linker] A CCA ATC ATA GAG TAG CGC GCC CAG TTT TC [Q]
MPT007B	[R] GAG AAG AA [linker] [Q] A CCA ATC ATA GAG TAG CGC GCC CAG TTT TC
MPT008B	[R] GAG AAG AA [linker] A CCA A [Q] TC ATA GAG TAG CGC GCC
MPT009B	[R] GAG AAG AA [linker] A CCA ATC ATA [Q] GAG TAG CGC GCC
MPT009I	[R] GAG AAG AA [linker] A CCA ATC ATA [Q] GAG TAG CGC GCC
MPT012B	[R] GAG AAG AA [linker] A CCA A [Q] TC ATA [Q] GAG TAG CGC GCC
[R]: reporter dye, [Q]: quencher dye, [linker]: linker, 기울임꼴은 tag 서열, 밑줄부분은 타겟 핵산 결정부 서열임

또한, 본 발명의 LTP는 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting sequence); 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag sequence); 형광 라벨부(R) 및 소광 라벨부(Q)를 포함하는 구조일 수 있고, 이는 iFAM probe로 명명하였다.

상기 iFAM probe는 프로브의 5'-말단 또는 3'-말단에 태그부가 위치하고, 링커부의 연결없이 태그부에 결합된 형광 라벨부(R)에 타겟 핵산 결정부가 직접 결합되어 있고, 상기 타겟 핵산 결정부의 반대편 말단에 소광 라벨부(Q)가 부착되어 있는 구조일 수 있다(도 1b).

다음으로, 타겟 핵산에 따라 고유한 해리온도(Tm)를 가지는 상기 LTP의 태그부에 상보적 결합하여 융해 단계(Melt stage)에서 태그(tag)의 해리온도를 측정하기 위해, 즉 융해 곡선 분석(Melting curve analysis)을 위해 필요한 Q-태그(Q-tag)를 제작하였다.

본 발명의 Q-태그(Q-tag)는 LTP의 태그부 염기서열에 상보적인 염기서열을 포함하고, 이 염기서열의 5'-말단 혹은 3'-말단에 소광 라벨부(Q)가 부착되어 있는 구조일 수 있다(도 1c).

상기 Q-태그는 바람직하게 LTP의 타겟 핵산 결정부의 염기서열에는 혼성화되지 않는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 LTP는 태그부의 염기서열 및 링커의 염기서열을 타겟 핵산의 염기서열에 제한받지 않고 필요에 따라 적절히 선택될 수 있다. 상기 LTP는 리포터-태그(R-tag)와 Q-태그(Q-tag)의 해리온도(Tm)을 다양하게 나타낼 수 있도록 태그부의 염기서열을 설계하고, 이를 타겟 핵산 서열의 정보 또는 고려 없이 ready-made 방식으로 미리 제작할 수 있다. 바람직하게는, 다양한 Tm 값을 가지도록 제작된 리포터-태그(R-tag) pool을 미리 디자인하고, 타겟 핵산 서열의 정보에 따라 적절한 Tm 값을 가지는 리포터-태그(R-tag)를 선정하여, 다중 타겟 핵산 검출을 위한 LTP 제작에 이용한다.

<LTP를 이용한 다중 타겟 핵산의 동시 검출>

본 발명에 따른 LTP 및 Q-태그를 이용하여 하나의 반응 용기 내에서 다중 타겟 핵산을 동시에 검출가능하다.

다중 타겟 핵산 동시 검출을 위한 LTP는 표 2에 나타낸 Tail probe 또는 iFAM Probe가 이용될 수 있고, 그 검출 과정은 다음과 같이 수행된다.

Tail probe 및 iFAM Probe

Probe Name	Probe Structure	Probe Sequence(예시)
Tail probe		[FAM] GAG AAG AA [linker] A CCA ATC ATA GAG TAG CGC GCC [EBQ]
iFAM Probe		GAG AAG AA [iFAM] ACC AAT CAT AGA GTA GCG CGC CCA GTT TTC [BHQ1]

PCT 증폭(Amplification) 과정

두 가지 구조의 LTP(Tail probe 및 iFAM Probe) 모두 PCR 증폭 과정을 거치면서, 연장(elongation) 과정에서 Taq 중합효소(polymerase)에 의한 exonuclease 작용을 받는다.

다시 말해, Taq 중합효소(polymerase)에 의해 LTP는 타겟 핵산 결정부의 5'-말단부터 분해되면서 형광 표지자(reporter dye)가 결합된 태그부가 떨어져 나간다. 형광제어(Quenching)효과가 감소하여 tag reporter dye의 신호가 증가하면서, real-time PCR 과정에서 증폭 신호가 관찰된다.

도 2에 PCR 증폭 과정에서 형광 신호 증폭의 모식도를 나타냈다.

다음으로, 상기 real-time PCR 증폭 과정에서 얻어진 신호의 증폭 곡선을 software graph fitting을 통해서 획득하였다.

여기서, 해당 증폭 곡선은 한 개의 형광 채널(channel)에 7개의 LTP를 설계했다면, 7개의 증폭 곡선이 통합된 하나의 증폭 곡선으로 나타난다. 이를 Graph fitting을 통해서 각각의 분리된 증폭 곡선을 얻으면, 임의로 설정한 적절한 역치(threshold) 값을 기준으로, 증폭 곡선의 Ct(cycle of threshold) 값을 얻을 수 있다.

도 3에 통합된 PCR 증폭 곡선을 3개의 분리된 증폭 곡선으로 fitting한 결과를 나타냈다.

증폭 곡선에서 역치 값을 넘기면 타겟 핵산 중 하나가 증폭되었음을 알 수 있으나, 어느 타겟 핵산이 증폭되었는지는 특정 해리온도(Tm) 값을 가지는 본 발명에 따른 LTP의 태그를 통해 확인할 수 있다.

이는 융해 곡선(melting curve) 분석을 통해 해리온도(Tm)를 확인함으로 알 수 있고, 해리온도(Tm)는 실시간 PCR 증폭 단계 중에 융해 단계(melt stage)를 포함시켜 실시간으로 확인하였다.

상기 해리온도(Tm) 확인은 다음의 융해 곡선(melting curve) 분석에서 상세히 설명한다.

Melting curve 분석

증폭 곡선에서 역치 값을 넘긴 증폭 신호가 어떤 타겟 핵산의 증폭과정에서 떨어져 나온 LTP의 태그부-형광 라벨부, 즉 리포터-태그(Reporter tag, R-tag)에 기인한 것인지는 타겟 핵산에 따라 고유한 해리온도(Tm) 값을 갖는 LTP의 태그 올리고 뉴크레오티드(oligonucleotide)와 Q-태그 이중가닥의 융해 곡선(melting curve) peak 값을 측정하여 확인할 수 있다.

먼저, 실시간 PCR 증폭 단계 중에 포함시킨 융해 단계(melt stage)에서 LTP에서 떨어져 나온 리포터-태그(Reporter tag, R-tag)와 Q-태그(Q-tag)의 해리온도를 측정하기 위해서는 Q-태그(Q-tag)를 실시간 PCR 반응 용기에 함께 포함시켜야 한다. 상기 태그와 Q-태그(Q-tag)의 상보적 결합 및 해리는 태그 올리고뉴크레오티드(oligonucleotide) 의 염기서열에 따른 Tm 값 부위의 온도에서 일어나고, 그 결과 융해 곡선(melting curve) 그래프 상에서 신호 크기가 급격히 바뀌는 온도 지점을 얻을 수 있다. 신호 크기를 온도로 미분한 도함수 융해 곡선(derivative melting curve)에서 해당 최소점을 peak라고 하고, 그 값을 "peak 값" 이라고 한다.

얻어진 Peak 값이 타겟 핵산에 상보적으로 결합한 LTP의 증폭곡선 Ct값 전후로 커졌다면, 해당 Tm 값을 갖는 LTP에 대한 타겟 핵산이 증폭되었음을 알 수 있다.

LTP에서 떨어져 나온 리포터-태그(R-tag)와 Q-태그(Q-tag) 이중가닥 핵산 복합체의 해리온도(Tm) 전후에서 결합 상태와 증폭된 형광 신호에 따른 해리온도(Tm)를 나타내는 융해 곡선을 도 4에 나타냈다.

다음으로, 기준 융해 곡선(Reference Melting Curve)을 측정하여 PCR 증폭이 일어나기 전에 LTP와 Q-태그의 결합에 의한 신호 제어 값은 제외시키도록 하였다.

여기서, 기준 융해 곡선(Reference Melting Curve)은 본 발명의 다중 타겟 핵산을 동시에 검출하는 과정에서는 첫번째 PCR 증폭 단계 전에 융해 곡선을 측정한 것을 의미한다. 상기 기준 융해 곡선의 측정이 필요한 이유는 PCT 증폭 반응이 일어나기 전에도 LTP의 태그부와 Q-태그가 하나의 반응 용기에 존재하고 있기 때문에 이 둘 간의 상호작용으로 형광 표지자의 신호를 추가적으로 감소시키기(quenching) 때문에 이 신호 값을 제외시켜 실질적으로 증폭된 Peak 값을 얻기 위해 수행되었다.

구체적으로, 도 5에서 나타내는 바와 같이, PCT 증폭 전에 반응 용기 내에 LTP와 Q-태그가 함께 존재하기 때문에 Q-태그는 LTP 내의 태그에 결합 가능하다.

또한, 본 발명의 LTP 내의 형광 라벨부(R)는 반대편에 연결되어 있는 소광 라벨부(Q)에 의해 이미 형광 신호가 제어(quenching)되어 있기 때문에, Q-태그와 LTP 내 태그부의 결합으로 인한 추가적인 형광 제어(quenching) 효과는 상대적으로 아주 적고, 융해 과정(melt stage)에서 도함수 융해 곡선(derivative melting curve)의 peak 값 크기도 작다.

그러나 기준 융해 곡선(Reference Melting Curve)을 측정함으로써 PCR 증폭 후에 수행되는 융해 과정(melt stage)에서의 peak값 크기 비교를 통해 해당 타겟 핵산이 증폭됨을 정확히 확인할 수 있다.

본 발명의 LTP에서 태그(Tag)의 해리온도(Tm)은 프라이머(primer)의 Tm 값보다 낮게 설계될 수 있다. 태그(Tag)의 Tm 값이 지나치게 높을 경우 PCR 증폭 단계에 관여될 수 있기 때문에, Tm 값 설정 가능 구간은 10 ℃ 내지 60 ℃ 구간에서 프라이머의 Tm 값 보다 낮게 설계되는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 LTP는 태그의 Tm 값 설정 가능 구간인 10 ℃ 내지 60 ℃ 구간 내에서 적어도 7 가지의 서로 다른 Tm 값을 갖는 태그를 포함하도록 설계할 수 있고, 그 결과 한 개의 형광 표지자(channel)에 대해서 적어도 7 가지의 서로 다른 LTP를 동시에 적용시켜 다중 타겟 핵산의 동시 검출이 가능하다. 예를 들면, 3개의 형광 채널에서는 각 채널 당 7개의 LTP를 동시에 이용하여 35개의 타겟 핵산을 검출할 수 있는 것으로 기대된다.

본 발명은 프로브 각각에 서로 다른 파장의 형광 표지자를 부착하여 각 파장의 증폭을 확인하여 타겟 핵산을 검출하는 방법이 아니다. 본 발명은 하나의 PCR 반응 용기 내에 포함되는 다수 LTP의 태그 Tm 값의 차이를 이용하여 복수의 타겟 핵산을 검출하고, 이에 더하여 복수의 형광 표지자 조합까지 가능하기 때문에 여러 개의 형광 채널을 사용하는 경우에는 사용된 형광 채널과 프로브의 조합 수 만큼의 다수의 타겟을 사용하는 형광 파장의 수적 한계나 간섭없이 검출할 수 있는 장점을 가진다. 이는 멀티플렉스 실시간 핵산 검출에서 검출 가능한 형광 표지자 수의 제한으로 인한 멀티플렉스의 구현의 한계를 극복하게 한다.

또한, 본 발명에 따른 LTP는 하나의 PCR 반응 용기에서 검출하고자 하는 샘플 수에 따라 태그(tag)의 염기서열을 쉽고 간단하게 조절함으로써 서로 다른 해리온도(Tm)를 가지는 복수 종류의 프로브 설계가 용이하다.

이와 같은 특징은 다양한 양상을 갖는 임상 샘플에서 동시 다중 타겟 핵산 검출 시 시그널 검출 반응 조건을 쉽고 간단하게 설정하고 위양성(false positive) 시그널을 방지할 수 있도록 하고, 실시간으로 다중 타겟 핵산의 존재를 확인할 수 있을 뿐만 아니라 융해 커브 분석을 통하여 다중 타겟 핵산의 존재를 검출할 수 있다.

나아가, PCR 증폭 과정에서 타겟 핵산과 결합한 후 연장(elogation)시 Taq 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성으로 LTP에서 떨어져 나온 리포터-태그(R-tag)와 Q-태그의 혼성화 결과물의 Tm 값은 리포터-태그의 태그 서열 및/또는 길이에 의하여 조절될 수 있으므로 상기 혼성화 결과물의 Tm 값은 임의로 미리 결정(pre-determined) 또는 예측 가능하다.

이러한 특징을 이용하면, 본 발명은 설계되거나 미리 측정된 Tm 값 이외의 온도에서 발생되는 형광 시그널은 위양성(false positive) 시그널로 판단할 수 있고, 상기 위양성 시그널은 실제 타겟 핵산의 증폭에 의한 형광 시그널과 구별하여 타겟 핵산을 정확하게 검출할 수 있다. 또한, 상기 혼성화 결과물에 대한 예측된 Tm 값은 적어도 2 종 이상의 다중 타겟 핵산에 대한 멀티플렉스 검출에 더욱 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통해 본 명세서가 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 제한 해석되지 않는 것은 이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

<실시예>

본 발명에 따라 제조된 다수의 LTP 및 각 LTP에 대응하는 Q-태그(Q-tag)를 이용하여 다중 타겟 핵산의 동시 검출 여부를 확인하고자 하였다.

실시예 1. 다중 타겟 핵산 동시 검출을 위한 각 구성요소의 제작

패혈증(sepsis)의 원인균 중 대표적인 Acinetobacter baumannii(A.bau), Pseudomonas aeruginosa(P.aer) 및 Klebsiella pnuemoniae(K.pne)가 혼합되어 있는 시료에서 하나의 형광 표지자(채널)를 이용하는 3개의 LTP를 통해 3 개의 타겟 핵산을 동시 검출하고자 하였다.

이를 위해, 먼저 동시 검출하고자 하는 3 종의 패혈증(sepsis) 원인균에 대한 타겟 핵산을 각각 Acinetobacter baumannii(A.bau) trpE 유전자, Pseudomonas aeruginosa(P.aer) lamB 유전자, Klebsiella pnuemoniae(K.pne) lamB 유전자로 선정하고, 각 유전자의 염기서열이 포함되어 있는 pBHA 벡터(vector)를 제작하였다.

상기 각 유전자의 염기서열 및 이들을 포함하는 pBHA 벡터(vector)의 염기서열은 표 3에 구체적으로 나타냈다.

Reagents	Sequence Information (5'-end to 3'-end 방향 )
A.bau trpE 202bp	TGCTCGTTTTAAGGATCAAACACAGGCTTACTTATTTGAGTCTGTTGAAGCGGGTGAAAACTGGGCGCGCTACTCTATGATTGGTTTAGGCGAATCCACAGTTTTTTCCTGTAACGCTGGTGTTTTATCTATACAACATGCTGACGGATCAGTAACACAGCAAAATTGTCTAGACCCATTCCAATATATCCGTGAATTCCAA
P.aer lamB 260bp	CCGCGATCCGCTGACTGGCGAACGCGTTTATGATCATCTGGTACCGAACGACGTCTTCGACGTGCGTTTAGCGCAGATGGAAACCAACCCGGGCGGTACGCTGGAGCTGGGCGTGGACTATGGTCACACCAACGTGCCGGATGACTACTACCTGCAGCCGGATGCATCGAAAGATGGCTGGATGTTCACCGCTGAACATACCCAGAGCATCCTGAAAGGCTACAACAATTTGTTCTGCAGTACGCGACCCTGACTGGCG
K.pne lamB 180bp	GTCAATCAGGTTTTTACCCTGTACGTTCACCTCACGGAAAGCGGGGTTAGTGGATTCCCAGTCGTTCTGTTGCGATACCGAGTAAGCGACGTTGGTGTCAAAGTAGAAGCTCTTATCGCCTTCTTTCCAGACTTCCTGGCCCAGTTTCAATTCGGCGTAAGTTTCACATTCGTTACCAAG
pBHA vector sequence 1987bp	GAATTCAGCCAGCAAGACAGCGAT/ATCACCTGTAAGTCGGACGAATTCGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACGTGA
Template의 sequence information. Gene sequence 경우 붉은색 글자 부분이 primer 서열이거나 상보적인 서열, 파란색 글자 부분이 probe의 결정부 서열이거나 이에 상보적인 서열이다. Vector sequence 같은 경우 circular DNA의 서열을 적은 것이며 붉은색 '/' 부분이 위의 target gene sequence가 삽입되는 부분이다.

상기 벡터 제작을 위해, A.bau trpE 유전자를 증폭하기 위한 정방향 프라이머(A.bau F primer) 및 역방향 프라이머(A.bau R primer), P.aer lamB 유전자를 증폭하기 위한 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer), K.pne lamB 유전자를 증폭하기 위한 정방향 프라이머(forward primer) 및 역방향 프라이머(reverse primer)를 제작하였고, 이들 프라이머는 모두 IDT에서 구입했다.

상기 프라이머의 염기서열은 표 4에 나타냈다.

다음으로, 각 타겟 핵산에 대한 LTP 및 이에 대응하는 Q-태그(Q-tag)를 제작하였다.

LTP의 경우, A.bau 및 P.aer을 검출하기 위해서 iFAM probe로써, 각각 A.bau iFAM probe 및 P.aer iFAM probe를 제작하였고, K.pne을 검출하기 위해서는 Tail probe인 K.pne MPT006B를 제작하였다. 상기 LTP는 Bioneer(한국, 대전)에서 구입하였다.

또한, 상기 A.bau iFAM probe, P.aer iFAM probe 및 K.pne MPT006B에 대응하는 Q-태그는 각각 MPT004T, MPT002T 및 MPT003T로 명명하여 제작하였고, Bioneer(한국, 대전)에서 구입하였다.

상기 LTP 및 Q-태그의 구체적인 염기서열은 표 4에 나타냈다.

Reagents	Sequence Information (5'-end to 3'-end 방향 )
A.bau F primer	5'- AAG GAT CAA ACA CAG GCT TAC -3'
A.bau R primer	5'- CGG ATA TAT TGG AAT GGG TCT A -3'
MPT004T	5'- [EBQ] TTC TTC TC -3'
A.bau iFAM probe	5'- GAG AAG AA [Serinol FAM] ACC AAT CAT AGA GTA GCG CGC CCA GTT TTC [BHQ1] -3'
P.aer F primer	5'- CTG ACT GGC GAA CGC GTT TAT -3'
P.aer R primer	5'- GGT CGC GTA CTG CAG AAC AAA T -3'
MPT002T	5'- AAT CCT AAA ATA [EBQ] -3'
P.aer iFAM probe	5'- TAT TTT AGG ATT [Serinol FAM] CAA CGT GCC GGA TGA CTA CTA CCT GCA G [EBQ] -3'
K.pne F primer	5'- CGA ATG TGA AAC TTA CGC CGA ATT -3'
K.pne R primer	5'- GGT TTT TAC CCT GTA CGT TCA CCT -3'
MPT003T	5'- ACA CCA CAC CAA [EBQ] -3'
K.pne MPT006B	5'- [FAM] TTG GTG TGG TGT [18 atom spacer] AAT CCA CTA ACC CCG CTT TCC GTG [EBQ] -3'
Reagents의 sequence information. 기울임꼴 부분이 tag sequence이다.

PCR 증폭 반응에 요구되는 Taq polymerase, dNTP, MgCl2, buffer 등이 함유된 Master Mix(2X)는 IDT사의 PrimeTime®Gene Expression Master Mix (cat.1055772 Vol 5mL)를 사용했다.

또한, 본 발명에서 사용된 리포터(Reporter)는 FAM(5'-Fluorescein, 6-FAM) 또는 iFAM(internal FAM, serinol FAM)이다. FAM(5'-Fluorescein, 6-FAM)은 약 492nm 파장의 빛을 흡수하여, 517nm 파장의 빛을 방출한다.

소광자(Quencher)는 BHQ-1(Black Hole Quencher1,3') 또는 EBQ(Excellent Bioneer Quencher)를 사용하였다. BHQ-1는 480-580nm(최대 지점 534nm) 파장의 빛을 형광제어(quenching)하며, EBQ는 400-700nm(최대 지점 700nm) 파장의 빛을 형광제어(quenching)한다.

링커는 18 atom spacer를 사용하였다.

상기 리포터, 소광자 및 링커의 각 구조는 표 5에 그림으로 나타냈다.

구성 성분	구조
FAM
EBQ
HHQ-1
18 atom spacer
iFAM

실시예 2. 다중 타겟 핵산의 동시 검출 확인

본 발명에 따라 제작된 A.bau 및 P.aer를 타겟으로 하는 iFAM probe 및 K.pne를 타겟으로 하는 tail probe와 각 LTP의 태그에 상보적인 Q-태그를 사용하여 melt stage에서의 derivative graph의 peak 크기를 비교하며 다중 타겟 핵산이 동시에 검출 가능한지 확인하였다.

qPCR 반응 및 융해 곡선(Melt Curve)은 Applied Biosystems사의 QuantStudio5 Real-Time PCR Instrument에서 진행되었고 QuantStudio™ Design and Analysis Software(QuantStudio Software)에서 protocol이 제작되었다.

본 실험에서 형광 표지자(reporter dye)로 사용된 FAM(6-fluorescein amidite, 6-FAM)은 약 492nm 파장의 빛을 흡수하여, 517nm 파장의 빛을 방출한다. 본 QuantStudio Software 흡수 파장을 x1(470±15nm)으로, 방출 파장을 m1(520±15nm)으로 설정하여 관찰하였다.

하나의 PCR 반응 용기에서 다중 타겟 핵산을 동시에 검출하기 위한 PCR 조성 (하나의 반응 용기 당 20μl)은 아래 표 6과 같았다.

구체적인 확인 과정은 다음과 같다.

먼저, 하나의 PCR 반응 용기 안에서 3 종의 타겟 핵산에 대한 3 쌍의 프라이머 쌍과 3 종의 LTP 사이에서 증폭 신호를 검출하기 위해서 PCR 반응을 수행하였다.

qPCR 진행 중 융해 곡선(Melt Curve)을 확인하기 위해서, qPCR 15 cycle 실행한 후부터 qPCR cycle 1회와 Melt Curve 측정을 차례로 반복하였다. qPCR을 40 cycle까지 진행하므로 Melt Curve는 26회 진행하였고, 추가로 첫번째 qPCR cycle 전에 기준 융해 곡선(Ref. Melt Curve)을 측정했다.

qPCR 진행 중 신호 크기가 역치 값을 넘겨 증폭된 것이 확인되면, 해당 PCR cycle 끝나고 melting curve를 측정하는 방식도 가능하지만, Quantstudio5 software를 이용하기 위해, PCR cycle 15회부터 모든 PCR cycle이 끝날 때마다 melting curve를 측정하는 방식을 채택했다.

복수 개의 타겟 핵산이 존재하는 경우, 이를 검출하기 위한 qPCR 진행 및 융해 곡선(Melt Curve)을 확인 과정을 도 6에 대표적인 모식도로써 나타냈다.

PCR Stage의 조건은 95.0 ℃에서 20초, 온도 승강속도는 1.6 ℃/s, 60.0 ℃에서 40초이며, Melt Curve Stage 조건은 10.0 ℃에서 60 ℃까지 온도 승강속도를 0.25 ℃/s로 하여 측정하였다. qPCR 진행 시, 어닐링(Annealing)과 연장(Elogation)을 동시에 60 ℃에서 40초 간 수행하여 빠르게 qPCR을 진행하였다.

또한, Ref. Melt Curve 전에 95.0 ℃에서 6 분간 전 열처리(pre-heat) 과정을 거쳤다.

표 7에 qPCR cycle의 상세한 조건을 나타냈다.

본 발명에 따른 LTP의 태그부에 결합된 형광 표지자(Reporter dye)는 PCR cycle 초기에는 소광자(quencher)에 의해 형광 신호가 제어된 상태이지만, cycle이 수 회 진행되면서 Taq 중합효소(Taq polymerase)의 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성에 의하여 LTP의 타겟 핵산 결정부가 분해되면서 LTP의 리포터-태그(Reporter-tag) 부분이 떨어져 나간다.

그 결과, 리포터-태그(Reporter-tag)의 형광 표지자(reporter dye)는 LTP의 소광자에 의한 형광 제어(quenching) 효과가 감소하면서 형광 신호 크기가 증폭되었으며, 이 증폭 신호를 통해 타겟 핵산이 존재함을 알 수 있었다.

다음으로, 상기 qPCR 증폭 단계에서 얻어진 증폭 신호 데이터(data)를 수렴하도록 처리하여 증폭 곡선을 얻었다. 상기 얻어진 증폭 곡선은 소프트웨어(software)를 통해서 smoothing과 graph fitting을 통해서 보정하였다(도 7).

서로 다른 농도와 염기서열을 가지고 있는 다중 타겟 핵산들은 PCR cycle이 진행되면서 다른 모양의 증폭 곡선을 그리지만, 1 종류의 형광 표지자(reporter dye)에서 나온 형광 신호는 1개의 채널(channel)을 통해 관찰된다.

따라서, 본 발명의 다중 타겟 핵산에 대한 qPCR 증폭 단계에서 얻어진 증폭 신호는 도 7에서 나타낸 바와 같이, 1개 내지 3개의 그래프가 통합되어 하나의 곡선 모양으로 나타났다.

이에, 상기 통합된 하나의 곡선 그래프를 software를 통해 분리하여, 몇 개의 타겟 핵산이 증폭되어 나타난 곡선인지 확인하였다.

추가적인 smoothing과 graph fitting을 통해 상기 증폭 곡선의 그래프를 분리한 결과, 3개의 분리된 증폭 곡선 그래프로 fitting 되었다(도 8). 도 8에서 보는 바와 같이, 3개의 분리된 증폭 곡선 그래프는 각각 고유한 타겟 핵산에 대한 증폭 곡선을 의미한다.

이는 본 발명의 LTP를 이용하여 하나의 PCR 반응 용기에 포함되어 있는 3 개의 다중 타겟 핵산이 형광 간섭없이 효율적으로 동시에 검출됨을 의미하는 것이다.

다만, 상기 3개의 분리된 증폭 곡선 그래프는 1개의 형광 채널에서 분리했기 때문에 각 증폭 곡선 그래프가 어느 LTP에 의해 얻어진 결과인지, 다시 말해 타겟 핵산이 무엇인지는 특정할 수 없었다.

상기 3개의 분리된 증폭 곡선 그래프가 각각 어떤 타겟 핵산의 검출 결과인지를 확인하기 위해서 융해 곡선 분석(melting curve analysis)를 수행하였다.

이를 위해, 상기 분리한 3개의 증폭 곡선에 대해서 4,000을 역치(threshold) 값으로 설정하여 Ct 값을 측정하였고, 그 결과 각 그래프의 Ct 값이 각각 24, 27, 29임을 확인하였다(도 9).

여기서 얻어진 상기 각 그래프의 Ct 값은 다음의 melting curve을 측정하고, melting curve stage data를 derivative graph로 처리하기 위한 PCR stage로 결정하였다. 또한, 상기 역치 값의 설정에 따라 Ct 값이 변경될 수 있으므로, 증폭 구간에 따라 적정한 값의 역치 값을 설정할 수 있으며, 필요에 따라 임의의 값으로 변경될 수도 있다.

다음으로, Melting Curve Stage data를 획득하였다.

qPCR 증폭 단계에서 신호 검출 후 동일한 반응 용기에서 LTP로부터 분리된 리포터-태그인 A.bau iFAM probe, P.aer iFAM probe 및 K.pne MPT006B와 이에 각각 상보적인 Q-태그 MPT004T, MPT002T, MPT003T의 melting curve을 측정했다.

이 때, A.bau, P.aer 및 K.pne의 증폭 곡선 Ct 값이 각각 24, 27, 29임을 확인하였고(도 9), 각 타겟 핵산의 melting curve peak 수치는 Ct 값을 전후로 하여 급격하게 증가할 수 있는 것이다. 이에, 각 타겟 핵산의 증폭 곡선 Ct 값이 24, 27 및 29임을 고려하여, 확실한 차이를 얻기 위해 각각 26번째(Stage 26), 29번째(Stage 29), 33번째(Stage 33)의 PCR stage(cycle)가 끝난 후에 melting curve stage data를 derivative graph로 처리했다.

상기 3가지 융해 곡선(melting curve)에 더하여, 추가로 기준 융해 곡선(Reference Melt Curve)과 마지막 40번째 PCR stage(Stage 40)가 끝난 후에 측정한 융해 곡선을 포함하여 총 5개의 melting curve를 비교했다.

상기 5개의 그래프는 모두 3개의 리포터-태그와 이에 상보적인 Q-태그의 melting curve 3 가지가 합쳐진 모양이다. 이를 3개의 독립된 Melt Curve로 분리하는 fitting을 하여 각 타겟 핵산의 peak 값을 비교했다.

그 결과, 도 10a에서 나타낸 바와 같이, 기준 융해 곡선 및 26번째(Stage 26), 29번째(Stage 29), 33번째(Stage 33)의 PCR stage(cycle)가 끝난 후에 3개의 그래프가 합쳐진 통합된 융해 곡선(Integrated Melting Curve)을 얻었다.

또한, 상기 그래프를 Multi-peak graph fitting을 통해서 3개의 melting curve로 분리하였고, 그 결과는 도 10b에 나타냈다.

상기 융해 곡선 분석을 통해서, 각 Melt stage에서 각 타겟 핵산에 대한 태그(tag)의 해리온도(Tm)는 0 내지 3.1 ℃의 편차를 보였다(표 8). 그러나 이는 graph fitting 방식이나 실험 편차로 발생할 수 있는 정도의 편차로써, 이를 사전에 고려하여 각 타겟 핵산에 대한 태그의 Tm 값을 설계하였기 때문에 본 발명의 타겟 핵산의 동시 검출에는 무리가 없는 수준임을 확인하였다.

구체적으로, 본 발명에서 사용된 A.bau의 trpE 유전자를 타겟 핵산으로 하는 LTP의 태그(tag)의 Tm 설계값은 20 ℃이고, P.aer의 lamB 유전자를 타겟 핵산으로 하는 LTP의 태그(tag)의 Tm 설계값은 32 ℃ 이며, K.pne의 lamB 유전자를 타겟 핵산으로 하는 LTP의 태그(tag)의 Tm 설계값은 50 ℃였다. 또한, 상기 3 종류의 LTP 모두 6-FAM을 형광 표지자(reporter dye)로 사용했는데, 이 경우에 각 타겟 핵산이 간섭현상 없이 효과적으로 검출되었다.

이는 실험 편차로 발생할 수 있는 정도의 해리온도 편차를 고려하여 각 타겟 핵산에 대한 LTP의 태그(tag)의 Tm을 설계하고 상기 설계된 Tm 값을 갖는 LTP를 사용하는 경우에, 하나의 형광 채널을 이용하여 3개 이상의 다중 타겟 핵산을 동시 검출할 수 있음을 의미한다.

최종적으로, 각 Stage에서의 3종의 tag의 Tm 값, derivative의 peak 값 및 peak 값 차이를 계산하여 Melt Stage Data 분석을 수행하였다.

이를 위해, 도함수 그래프(Derivative graph)의 fitting data를 기준으로 같은 타겟 핵산의 기준 융해 곡선(ref. melting curve)의 peak값과 해당 stage에서의 peak 값 차이를 delta peak(ΔPeak)라고 명명하고, 상기 3종의 tag에 대한 ΔPeak 값을 측정하였다. 그 결과는 도 11에 나타냈다.

도 11에 개시한 바와 같이, 각 타겟 핵산에 대한 peak 값은 A.bau의 tag는 역치 값을 넘어선 Stage 24 이후의 peak값이 1,000 이상 증가했고, 증폭이 완전히 이루어진 상황, 즉 Stage 29 이후에서는 3,000 정도의 peak 값 차이를 보였다. P.aer의 tag의 경우에는, 역치 값을 넘어선 Stage 29 이후 peak 값이 800 정도 커졌고, 증폭이 완전히 이루어진 상황, Stage 33 이후에서는 2,500 정도의 peak값 차이를 보였다. K.pne의 tag의 경우에는, 다른 2 가지 tag 만큼의 차이를 보이지는 않지만 증폭이 검출 가능한 수준의 데이터 차이는 보였다. 역치 값을 넘어선 Stage 33 이후 peak 값이 약 700 정도 커졌고, 증폭이 완전히 이루어진 Stage 40에서는 약 1,500 정도의 peak값 차이를 보였다.

나아가, 5개의 stage에서의 A.bau tag의 melting curve를 비교한 결과, 증폭이 된 이후에 peak값이 더 깊어지면서 차이가 커지는 것을 확인할 수 있었다(도 12). P.aer tag의 melting curve를 비교를 통해서는 증폭이 된 이후에 peak값이 더 깊어지면서 차이가 커지는 것을 확인할 수 있었다(도 13).

또한, 도 14에서 보는 바와 같이, 5개의 stage에서의 K.pne tag의 melting curve를 비교한 결과는 증폭이 된 이후에 peak값이 더 깊어지면서 차이가 커지는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통해서, 상기 3가지 타겟 핵산에 대한 tag의 melting curve를 stage에 따라 비교분석함으로써 역치 값을 넘긴 이후(Ct) melting curve의 peak 값을 통해서 어떤 타겟 핵산이 증폭되었는지 확인 가능함을 알 수 있었다.

이는 melting curve 분석 단계에서 특정 해리온도(Tm)의 peak가 나타난다면, 미리 설계된 LTP의 태그 값에 해당하는 특정 해리온도(Tm)를 갖는 타겟 핵산이 존재함을 의미한다.

따라서, 본 발명에 따른 LTP는 각 타겟 핵산에 대해 상이하게 설계된 Tm 값을 가지기 때문에, 이를 사용하여 여러 핵산이 포함되어 있는 하나의 시료 내에서 실시간으로 동시에 다중 타겟 핵산을 검출할 수 있음을 의미한다.

Claims

타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region);
특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region);
형광 라벨부(Reporter label, R); 및
소광 라벨부(Quencher label, Q);를 포함하며,
상기 태그부는 상기 형광 라벨부(R)에 결합되고, 상기 타겟 핵산 결정부는 상기 소광 라벨부(Q)에 결합되는 것을 특징으로 하는, 표지자가 결합된 태그 프로브.
제1항에 있어서, 상기 프로브는 연결부(Linker)가 더 포함되고, 상기 연결부는 형광 라벨부(R)가 결합된 태그부(Tag region)와 소광 라벨부(Q)가 결합된 타겟 핵산 결정부(Targeting region)를 연결하는 것을 특징으로 하는, 표지자가 결합된 태그 프로브.
제1항에 있어서, 상기 프로브는 프로브 내의 상기 태그부에 상보적으로 결합하는 Q-태그(Q-tag)와 함께 타겟 핵산의 존재 여부를 구분하는 것으로, 상기 Q-태그(Q-tag)는 올리고뉴클레오티드(Oligo nucleotide) 및 소광자(Quencher)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 표지자가 결합된 태그 프로브.
제1항 또는 제2항의 표지자가 결합된 태그 프로브를 유효성분으로 포함하며 핵산 혼합물 또는 시료로부터 하나 이상의 타겟 핵산을 동시에 검출하기 위한, 핵산 검출용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 핵산 검출용 조성물은 상기 프로브의 태그부에 상보적으로 결합하는 Q-태그(Q-tag)를 더 포함하고, 상기 Q-태그(Q-tag)는 올리고뉴클레오티드(Oligo nucleotide) 및 소광자(Quencher)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 검출용 조성물.
제1항 또는 제2항의 표지자가 결합된 태그 프로브를 유효성분으로 포함하며 핵산 혼합물 또는 시료로부터 하나 이상의 타겟 핵산을 동시에 검출하기 위한, 다중 핵산 동시 검출용 키트.
제6항에 있어서, 상기 키트는 상기 프로브의 태그부에 상보적으로 결합하는 Q-태그(Q-tag)를 더 포함하고, 상기 Q-태그(Q-tag)는 올리고뉴클레오티드(Oligo nucleotide) 및 소광자(Quencher)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다중 핵산 동시 검출용 키트.
제7항에 있어서, 상기 Q-태그(Q-tag)는, 상기 프로브의 타겟 핵산 결정부(Targeting region)와는 혼성화되지 않는 것을 특징으로 하는, 다중 핵산 동시 검출용 키트.
제7항에 있어서, 상기 키트는 검출하고자 하는 타겟 핵산의 수 만큼의 표지자가 결합된 태그 프로브 및 이에 상보적으로 결합하는 Q-태그(Q-tag)를 포함하고, 상기 프로브는 각 타겟 핵산에 따라 서로 다른 해리온도(Tm)를 가지는 태그부를 포함하는 것을 특징으로 하는, 다중 핵산 동시 검출용 키트.
제7항에 있어서, 상기 키트는 융해 곡선(melting curve) 분석으로 타겟 핵산을 검출하는 것을 특징으로 하는, 다중 핵산 동시 검출용 키트.
제7항에 있어서, Q-태그(Q-tag)는 상보적으로 결합하는 상기 프로브의 태그부 해리온도(Tm)와 0 ℃ 내지 3 ℃의 해리온도(Tm) 값 차이를 가지는 것을 특징으로 하는, 다중 핵산 동시 검출용 키트.
제6항에 있어서, 상기 키트는 핵산 말단 가수분해 효소(exonucelease) 활성을 가지는 중합효소(Polymerase)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 다중 핵산 동시 검출용 키트.
제12항에 있어서, 상기 중합효소(Polymerase)는 PCR 증폭 반응 후에 상기 프로브에서 리포터-태그(Reporter-tag)를 분리시키는 것을 특징으로 하는, 다중 핵산 동시 검출용 키트.
다음의 단계를 포함하며, 표지자가 결합된 태그 프로브 및 이에 상보적으로 결합하는 Q-태그(Q-tag)를 이용하여 하나의 반응 용기에서 핵산 혼합물로부터 다중 타겟 핵산을 동시에 검출하는 방법:
(a) 타겟 핵산에 상보적인 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)를 타겟 핵산과 혼성화하는 단계;
여기서, 상기 LTP는 형광 라벨부(R)가 결합된 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region) 및 소광 라벨부(Q)가 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region)가 포함되거나, 형광 라벨부(R)가 결합된 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region) 및 소광 라벨부(Q)가 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region)가 연결부(Linker)로 연결되어 포함되고, 상기 LTP의 타겟 핵산과의 혼성화 부위는 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 타겟 핵산과의 혼성화 위치 사이에 존재함
(b) 중합효소(polymerase)의 중합 반응으로 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로부터 타겟 핵산의 적어도 일부를 증폭하면서, 중합효소(polymerase)의 5'-말단 엑소뉴클레아제(exonuclease) 작용으로 혼성화 되어있는 LTP의 타겟 핵산 결정부 서열이 분해되고 리포터-태그(Reporter-tag)가 분리되는 단계;
여기서, 상기 리포터-태그(Reporter-tag)는 LTP 내의 형광 라벨부(R)가 결합된 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region)이고, 타겟 핵산이나 상기 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머와는 상보적으로 결합하지 않음
(c) 상기 (b) 단계에서 분리된 리포터-태그(Reporter-tag)에서 발생한 형광 신호를 측정하고, 측정된 형광 신호의 크기가 역치(threshold) 값을 넘기는지 확인하는 단계;
여기서, 상기 역치(threshold) 값은 미리 정해둔 특정의 값으로, 이 역치 값을 넘기면, 타겟 핵산이 증폭되었다고 판단함
(d) 상기 (c) 단계에서 형광 신호 크기가 역치 값을 넘긴 PCR cycle을 끝내고, 융해 단계(melt stage)로 진입하여 동일한 반응 용기에 포함되어 있는 상기 리포터-태그(Reporter-tag)와 Q-태그(Q-tag)의 해리온도(Tm)를 측정하는 융해 곡선 분석(melting curve analysis) 단계;
여기서, 상기 리포터-태그(Reporter-tag)는 타겟 핵산에 따라 고유한 특정 해리온도(Tm)을 갖도록 설계되고, 상기 리포터-태그(Reporter-tag)와 Q-태그(Q-tag)는 혼성화되도록 설계하며, 상기 융해 단계(melt stage)에서 반응 용기의 온도는 10 ℃부터 서서히 증가시켜 60 ℃에 도달하게 함, 그리고
(e) 융해 곡선 분석(melting curve analysis) 결과로부터 타겟 핵산의 존재 여부를 결정하는 단계.
제14항에 있어서, 상기 (a) 단계 이전에,
PCR 증폭 반응 전에, 하나의 반응 용기 내에 존재하는 표지자가 결합된 태그 프로브(Label-conjugated Tag Probe, LTP)와 Q-태그(Q-tag)의 해리온도를 측정하는 기준 융해 곡선(Reference melting curve) 측정 단계;를 더 포함하고,
여기서, 상기 LTP는 형광 라벨부(R)가 결합된 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region) 및 소광 라벨부(Q)가 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region)가 포함되거나, 형광 라벨부(R)가 결합된 특정 해리온도(Tm) 값을 갖는 태그부(Tag region) 및 소광 라벨부(Q)가 타겟 핵산과 상보적으로 결합하는 타겟 핵산 결정부(Targeting region)가 연결부(Linker)로 연결되어포함되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제15항에 있어서, 상기 (e) 단계는 상기 융해 곡선 분석(melting curve analysis) 결과에 상기 (a) 단계에서 이전에 얻은 기준 융해 곡선(Reference melting curve) 측정 결과를 비교하여 타겟 핵산의 존재 여부를 결정하는 단계인 것을 특징으로 하는, 방법.
제14항에 있어서, 상기 방법은 한 개의 반응 용기에서 다수의 형광 채널이 이용되고, 각 동일 형광 채널(channel)에는 다수의 LTP가 각각 조합됨으로써 수 십 개의 타겟 핵산 검출이 가능한, 방법.
제15항에 있어서, 상기 LTP 및 이에 상보적인 Q-태그가 각각 5 종류 이상 이용되고, 각 LTP는 3 종류 이상의 서로 다른 형광 채널에 조합되어, 적어도 15 종류 이상의 타겟 핵산을 동시에 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
제14항에 있어서, 상기 융해 곡선(Melting curve) 분석은 중합효소(polymerase)의 5'-말단 엑소뉴클레아제 효소 반응에 의해 PCR 증폭 반응 후에 LTP에서 절단된 리포터-태그와 Q-태그(Q-tag)의 혼성화 반응 및 이 혼성화된 복합체의 융해 곡선(Melting curve) 분석을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제14항에 있어서, 상기 융해 단계(Melt stage)에서 반응 용기의 온도를 적어도 10 ℃로 낮춰 상기 반응 용기에 포함된 적어도 하나의 리포터-태그와 이에 상보적인 Q-태그의 결합을 유도하는 안정화 단계;를 더 포함하는, 방법.
제14항에 있어서, 상기 (b) 단계의 타겟 핵산의 적어도 일부를 증폭시키는 과정은, 열변성(Denaturation)하는 단계; 및 어닐링(annealing)과 연장(elogation)이 통합된 단계;로 구성되는 2 단계 과정인 것을 특징으로 하는, 방법.
제14항에 있어서, 상기 다중 타겟 핵산은 실시간 방식, 엔드-포인트(end-point) 방식 또는 지정 시간 간격(predetermined time interval) 방식으로 검출되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제14항에 있어서, 상기 타겟 핵산은 적어도 2 종 이상의 핵산을 포함하고, 이에 대응하는 상기 프로브 및 상기 Q-태그(Q-tag)도 각각 적어도 2 종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제14항에 있어서, 상기 타겟 핵산은 DNA (deoxyribonucleic acid), LNA(Locked nucleic acid), PNA(Peptide nucleic acid), HNA(Hexose nucleic acid), RNA(Ribonucleic acid), 핵산(nucleic acid)의 유사체 또는 이들의 조합으로 부터 선택된 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.