KR20210057028A - 핵산의 다중 검출 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 올리고뉴클레오타이드 및 표적 핵산의 검출 및/또는 구별에서 이를 사용하는 방법을 제공한다. 올리고뉴클레오타이드 및 방법은 다수의 표적을 동시에 증폭, 검출, 및/또는 구별하는 데에서의 특정 용도를 발견한다.
Description
본 발명은 일반적으로 분자 생물학의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드 및 표적 핵산의 검출 및/또는 구별에서 이를 사용하는 방법을 제공한다. 올리고뉴클레오타이드 및 방법은 다수의 표적을 동시에 증폭, 검출, 및/또는 구별하는 데에서의 특정 용도를 발견한다.
교차 참조에 의한 포함
본 출원은 2018년 8월 9일에 출원된 호주 임시 출원 제2018902915호의 우선권을 주장하고, 이의 전체 내용은 본원에 교차 인용되어 포함된다.
유전 분석은 질환 위험의 평가, 질환의 진단, 치료에 대한 환자의 예후 또는 반응의 예측, 및 환자의 진행의 모니터링을 위해 임상에서의 일상적이 되고 있다. 이러한 유전적 시험의 도입은 유전적 변이를 구별하기 위한 단순하고 비싸지 않고 신속한 검정의 개발에 의존한다.
시험관내 핵산 증폭의 방법은 유전학 및 질환 진단학에서 광범위한 용도를 갖는다. 이러한 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 가닥 대체 증폭(SDA), 헬리카제 의존적 증폭(HDA), 재조합효소 중합효소 증폭(RPA), 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 회전 환 증폭(RCA), 전사 매개 증폭(TMA), 자가 유지 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 또는 역방향 전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 포함한다. 이들 표적 증폭 전략의 각각은 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 사용을 요한다. 증폭의 공정은 이의 5' 말단에서 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 혼입하고 프라이머 사이에 위치한 서열의 새로 합성된 카피를 함유하는 앰플리콘을 지수 증폭시킨다.
실시간으로 또는 증폭의 마무리 시 앰플리콘의 축적을 모니터링하기 위한 흔히 사용된 방법은 보편적 기질 프로브에 의한 MNAzyme을 사용한 검출; 표적 특이적 Molecular Beacon, TaqMan 프로브 또는 가수분해 프로브의 사용; Scorpion 프라이머/프로브; 및/또는 SybGreen과 같은 인터칼레이팅 염료(intercalating dye)의 사용을 포함한다. 상이한 서열을 갖는 앰플리콘이 융점 또는 Tm으로 공지된 상이한 온도에서 변성하므로 고해상 용융 곡선 분석은 추가의 정보를 얻기 위해 이들 프로토콜의 여럿의 마무리 동안 또는 마무리 시 수행될 수 있다. 이러한 프로토콜은 a) 인터칼레이팅 염료의 존재 하의 이중 가닥 앰플리콘의 2개의 가닥의 분리, 또는 b) 앰플리콘 및 형광단 및 켄쳐로 표지된 상보성 표적 특이적 프로브의 하나의 가닥의 분리 중 어느 하나로부터 생긴 용융 곡선을 측정한다. 용융 곡선 분석은 가열 동안 2개의 DNA 가닥의 해리 동역학에 관한 정보를 제공한다. 융점(Tm)은 DNA의 50%가 해리되는 온도이다. Tm은 쌍을 지은 뉴클레오타이드의 길이, 서열 조성 및 G-C 함량에 따라 달라진다. 용융 곡선 분석으로부터의 표적 DNA에 대한 정보의 설명은 종래에 전형적으로 넓은 온도 범위에 걸쳐 작은 간격으로 획득된 일련의 형광 측정을 수반한다. 융점은 염기 서열에 오직 의존하지는 않는다. 융점은 올리고뉴클레오타이드의 농도, 완충액에서의 양이온(1가(Na+) 및 2가(Mg2+) 염 둘 다), 및 우레아 또는 포름아미드와 같은 탈안정화제의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받을 수 있다.
일반적으로, 구별되는 파장을 모니터링할 수 있는 이용 가능한 형광 채널의 수는 실시간 장치에서 단일 반응에서 검출되고 특이적으로 확인될 수 있는 표적의 수를 제한한다. 현재, "태그화 올리고뉴클레오타이드 절단 및 연장"(TOCE: Tagging Oligonucleotide Cleavage and Extension)으로 공지된 프로토콜은 이 능력을 확장하여 다수의 표적이 단일 파장에서 분석되게 한다. TOCE 기술은 Pitcher 및 Catcher 올리고뉴클레오타이드를 사용한다. Pitcher는 표적에 상보성인 표적화 부분(Targeting Portion), 및 비상보성이고 5' 말단에 위치한 태깅 부분(Tagging portion)의 2개의 영역을 갖는다. Capture 올리고뉴클레오타이드는 이중 표지되고, Pitcher의 태그화 부분에 상보성인 이의 3' 말단에서의 영역을 갖는다. 증폭 동안, Pitcher는 앰플리콘에 결합하고, 프라이머가 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성을 확장할 때 Pitcher로부터 태깅 부분을 절단할 수 있다. 방출된 태깅 부분은 이후 Catcher 올리고뉴클레오타이드에 결합하고, 상보성 가닥을 합성하도록 프라이머로서 작용한다. 이중 가닥 Catcher 분자의 융점(Catcher-Tm)은 이후 원래의 주형에 대한 대리 마커로서 작용한다. 모두 상이한 온도에서 용융하는 상이한 서열 및 길이를 갖는 다수의 Catcher를 혼입할 수 있으므로, 일련의 표적을 나타내는 일련의 Catcher-Tm 값을 단일 파장에서 계속 측정하면서 얻을 수 있다. 이 접근법의 제한에는, 방출된 단편이 인공 표적에 대한 제2 연장을 개시시키고 완료시킬 것을 요하므로 고유의 복잡함이 포함된다.
헤어핀 프로브 또는 줄기-루프 프로브(Stem-Loop probe)는 또한 핵산의 검출 및/또는 표적 증폭의 모니터링에 유용한 도구를 입증하였다. 형광단 및 켄쳐 염료 쌍으로 이중 표지된 헤어핀 프로브는 Molecular Beacon으로서 당해 분야에 흔히 공지되어 있다. 일반적으로, 이 분자는 3가지 특징을 갖는다; 1) 올리고뉴클레오타이드의 상보성 5' 말단 및 3' 말단의 혼성화에 의해 형성된 줄기 구조; 2) 검출되는 표적, 또는 표적 앰플리콘에 상보성인 루프 영역; 및 3) Molecular Beacon의 말단에 부착된 형광단 켄쳐 염료 쌍. PCR 동안, 루프 영역이 상보성으로 인해 앰플리콘에 결합하고, 이것에 의해 줄기가 개방되고 따라서 형광단 켄쳐 염료 쌍이 분리된다. 온전한, 개방 Molecular Beacon의 말단에 부착된 염료 쌍의 분리는 형광을 변화시키고, 이는 표적의 존재를 나타낸다. 상기 방법은 단일 PCR 시험에서 다수의 표적의 다중화 분석에 흔히 사용된다. 다중화 반응에서, 각각의 Molecular Beacon은 상이한 표적 특이적 루프 영역 및 고유한 형광단을 가져서, 각각의 앰플리콘 종에 대한 각각의 상이한 Molecular Beacon의 혼성화는 별개의 채널에서, 즉 별개의 파장에서 모니터링될 수 있다.
Molecular Beacon의 개념은 Sloppy Beacon으로 공지된 전략에서 연장되었다. 이 프로토콜에서, 단일 Beacon의 루프 영역은 충분히 길기 때문에 미스매칭된 염기를 허용하고 이에 따라 하나 이상의 뉴클레오타이드만큼 상이한 다수의 밀접히 관련된 표적에 결합할 수 있다. 증폭 후에, 용융 곡선 분석이 수행되고, 상이한 표적 종은 Beacon의 루프 영역 및 표적 종이 분리(용융)하는 온도에 기초하여 구별될 수 있다. 이러한 방식으로 다수의 밀접히 관련된 종은 단일 파장에서 검출되고, 단일 Sloppy Beacon에 의한 특이적 표적의 용융 프로필을 규명함으로써 동시에 구별될 수 있다. Standard Molecular Beacon 및 Sloppy Beacon은 증폭 동안 분해 또는 절단되도록 의도되지 않는다는 점에서 TaqMan 및 가수분해 프로브와 상이하다. Sloppy beacons 및 TOCE와 같은 DNA 혼성화 기반 기술의 단점은 이들이 프로브와 비표적 핵산 서열 사이의 비특이적 혼성화로 인해 위양성 결과를 생성할 수 있다는 것이다.
많은 핵산 검출 검정은 주어진 샘플에서 특이적 표적 서열의 존재를 확인하도록 용융 곡선 분석을 이용한다. 용융 곡선 분석 프로토콜은 증분으로 증가하는 온도 범위에 걸쳐 다양한 온도에서의 형광의 측정을 수반한다. 이후 이 곡선의 기울기의 변화는 온도의 함수로 작도되어 용융 곡선을 얻는다. 이 공정은 대개 느리고, 전형적으로 완료하는 데 30분 내지 60분 내에 어느 정도가 걸린다. 더 나아가, 용융 곡선 분석은 숙련 직원에 의한 해석 및/또는 결과 해석을 위해 특수 소프트웨어의 사용을 요할 수 있다. 그러므로, 용융 곡선 분석을 위한 더 빠르고/빠르거나 더 단순한 대안에 대한 높은 요구가 있다.
PCR에 의해 또는 대안적인 표적 증폭 프로토콜에 의해 생성된 다수의 비(非)관련된 앰플리콘의 동시의 검출, 구별, 및/또는 정량화를 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 현재의 멀티플렉스 검출 검정에 존재하는 하나 이상의 결핍을 해결한다.
본원에서 LOCS(Loops Connected to Stems: 줄기에 연결된 루프)라 칭하는 올리고뉴클레오타이드 구조를 사용하여 증폭 프로토콜 동안 다중화에 대한 능력을 확장시키는 방법 및 조성물이 본원에 제공된다. 단일 형광단 및 켄쳐 쌍으로 표지된 일련의 LOCS는 줄기 부분이 표적의 존재에 반응하여 절단 또는 분해에 의해 LOCS의 개방 후 용융하는 온도 덕분에 단일 반응 내에 개별적으로 구별될 수 있다. 이에 따라 줄기 영역의 용점은 LOCS를 개방시키는 특정 표적에 대한 대리 마커로서 작용한다. 줄기-루프 구조를 혼입하는 다른 방법이 a) 염료 쌍 사이에 거리를 증가시키는 표적 앰플리콘(Molecular Beacon 및 Sloppy Beacon)에 대한 루프 영역의 혼성화, 또는 b) 염료(Cleavable Molecular Beacon)의 물리적 분리를 허용하는 절단 중 어느 하나 후에 형광에서 변화를 조사하면서, 본 발명은 기존의 다중화 검출 검정에 걸쳐 개선을 제공한다. 이 개선은 적어도 부분적으로 각각의 줄기가 상이한 온도에서 용융하도록 줄기의 길이 및/또는 서열 조성을 변화시켜 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 융점의 조작을 통해 생긴다.
본원에 기재된 바와 같이, 동일한 형광단으로 표지된 다수의 LOCS는 a) 동시에 다수의 표적의 직접적인 또는 간접적인 검출을 허용하는 상이한 루프 서열 및 b) 조사 중인 다수의 표적 내에 존재하는 특정 표적(들)을 확인하도록 사용될 수 있는 별개의 온도에서 용융하는 상이한 줄기 서열을 함유할 수 있다. 본 발명의 발명은 별개의 캐쳐(catcher) 분자가 필요하지 않아서 반응 혼합물의 성분의 수를 감소시키고 비용을 감소시킨다는 점에서 예를 들어 TOCE 프로토콜과 같은 분야 공지된 방법에 비해 하나 이상의 이점을 제공한다. 더 나아가, TOCE 방법은 방출된 단편이 합성 표적에 대한 제2 연장을 개시시키고 완료시킬 것을 요하므로 본 발명의 발명보다 본래 더 복합하다. 더 나아가, 일부 실시형태에서, LOCS 프로브는 보편적(표적 서열과 독립적)일 수 있고/있거나, 일련의 검출 기술과 조합될 수 있어서, 분자 진단학의 분야에 넓은 이용가능성을 전달한다. 추가적으로, 융점은 비전통적 증폭을 사용하고, 검출 기법은 표적 핵산에 의한 프로브의 혼성화 및 용융에 기초한다. 이는 프로브와 비표적 핵산 서열 사이의 비특이적 혼성화로 인해 증가된 위양성의 단점을 겪는다. 본 발명의 발명은 보편적 기질을 함유하는 LOCS 리포터 프로브가 표적 서열과 결합하지 않으므로 이 제한을 극복한다. 마지막으로, 분자내 결합이 분자내 결합보다 강하고, 이에 따라 비특이적 표적과 혼성화하고 위양성 신호를 생성하는 이 비절단된(폐쇄된) LOCS의 가능성이 유의미하게 더 낮다는 것이 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
분자내 결합이 분자간 결합보다 강하다는 것의 결과로서, 이중 표지된 LOCS는 온전할(폐쇄될) 때 하나의 온도에서 용융하지만, 표적 의존적 절단 또는 분해에 의해 루프 영역의 개방 후 더 낮은 온도에서 용융할 것이다. 핵산의 이 특성은 하나의 형광 채널과 같은 검출기의 단일 유형을 사용하여 다수의 표적을 구별하는 기기의 능력을 확장시키도록 본 발명에 이용된다.
본 발명의 LOCS 리포터에 의해 제조된 온도 의존적 형광 신호는 잘 정의되어 있고, 표적 DNA에 독립적이다. 따라서, 완전한 온도 구배보다는 선택된 온도에서 생성된 형광 신호의 측정으로부터 표적 DNA에 대한 정보를 설명할 수 있어서, 열 사이클링 장치(예를 들어, PCR 장치)에 대한 실행 시간의 감소에서 이점을 제공한다. 비제한적인 예로서, Bio-Rad CFX96 PCR 시스템에서, 0.5℃ 증분으로 20℃ 내지 90℃의 온도 및 5초 보유 시간에 대한 설정으로 전통적인 용융 분석의 수행은 141회의 형광 측정 사이클을 요하고, 대략 50분의 실행 시간을 요한다. LOCS 프로브의 사용에 의해, 표적 DNA에 대한 정보는 2회 내지 6회 형광 측정으로 동일한 장치로부터 얻어질 수 있고, 대략 2분 내지 5분의 실행 시간을 요한다. 임의의 특정 제한 없이, 실행 시간의 감소는 예를 들어 진단학을 포함하는 많은 분야에 유리할 수 있다.
본 발명의 LOCS 프로브는 또한 단일 형광 채널에서 다수의 표적을 동시에 검출하고/하거나, 구별하고/하거나 정량화하도록 사용될 수 있다. 종래의 qPCR에서, 표적 DNA의 정량화는 각각의 증폭 사이클에서 단일 온도에서 형광을 측정하여 얻은 증폭 곡선으로부터의 사이클 정량화(Cq) 값을 이용하여 결정된다. Cq 값은 표적 DNA의 농도의 음의 대수 값에 비례하고, 따라서 실험적으로 결정된 Cq 값으로부터의 농도를 결정할 수 있다. 그러나, 신호가 특이적 프로브로부터 생기는지를 확인하는 것이 어려우므로, 단일 채널에서 하나 초과의 표적 특이적 프로브가 있는 각각의 표적을 정확하게 그리고 특이적으로 정량화하는 것이 어렵다. 이 문제를 해결하여, LOCS는 단일 채널에서 하나 초과의 표적의 정확하고 특이적인 정량화가 가능하게 하고, 단 증폭 곡선은 증폭 동안 하나 초과의 온도에서 형광을 측정하여 얻어진다. 이는 상이한 LOCS가 상이한 온도에서 형광의 유의미하게 상이한 양을 생성할 수 있으므로 가능하다.
분석이 PCR, 예를 들어 후-PCR 내에 제한된 수의 시점에 형광 획득을 오직 요하는 일부 실시형태에서, LOCS 구조의 사용은 각각의 사이클에서 획득에 대한 필요성을 제거한다. 그러므로, 이 실시형태는 결과에 대한 시간을 감소시킬 수 있는 매우 신속한 사이클링 프로토콜에 잘 맞는다.
상기 기술된 바대로, 용융 곡선 분석 프로토콜은 증분으로 증가하는 온도 범위(예를 들어, 30℃ 내지 90℃)에 걸쳐 다양한 온도에서의 형광의 측정을 수반한다. 이 곡선의 기울기의 변화는 이후 용융 곡선을 얻도록 온도의 함수로 작도된다. 이 과정은 대개 느리고, 예를 들어 30분 내지 60분 내 어느 정도가 걸릴 수 있다. 용융 곡선 분석의 속도의 증가는 고도로 특수화된 기기장치에 대한 접근을 요하고, 표준 PCR 장치를 사용하여 달성될 수 없다. 따라서, 표준 기기장치를 사용하여 단일 형광 채널에서 다수의 표적의 동시의 검출을 제공할 수 있는 용융 곡선 분석에 대한 더 빠른 대안에 대한 높은 요구가 있다. 본 발명의 융점(Tm) LOCS 구조는 미리 결정되고 일정하고(즉, 표적 서열 또는 농도에 의해 영향을 받지 않음), 따라서 전체 온도 구배를 통해 상승을 요하지 않는다. 각각의 LOCS 구조는 오직 이의 특정 Tm에서 단일 형광 측정을 요하여, 완전 온도 구배의 실행의 필요성을 무효화하여, 결과에 대한 더 빠른 시간을 촉진하고 따라서 상기 제한을 극복한다.
더 나아가, 용융 곡선 분석은 전형적으로 숙련 직원에 의한 해석 또는 결과 해석을 위해 특수 소프트웨어의 사용을 요한다.
본 발명의 일부 실시형태에서, PCR의 완료 후 단일 온도 형광 측정의 사용은 용융 곡선의 주관적 해석에 대한 필요성을 제거하고, 표적의 존재 또는 부재의 객관적 결정을 수월하게 한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 분석은 PCR, 예를 들어 후-PCR 내에 제한된 수의 시점에 형광 획득을 오직 요할 수 있고, 이는 각각의 사이클에서 획득의 필요성을 제거한다. 그러므로, 이 실시형태는 결과에 대한 시간을 감소시킬 수 있는 매우 신속한 사이클링 프로토콜에 잘 맞는다.
완전히 일치된 프로브와 비일치된 프로브 사이의 구별을 수월하게 하기위한 2개의 온도 획득을 포함하는, PCR 동안의 다수의 온도에서의 형광 획득을 포함하는 여러 방법이 기재되어 있다. 추가적으로, 여러 프로토콜은 2개의 표적이 존재하고 단일 채널로부터 검출될 때 각각의 표적의 농도를 정량화하기 위해 각각의 PCR 사이클 후 다수의 획득 온도를 이용한다. 2개의 표적의 동시의 정량화를 위한 다른 방법은 각각의 PCR 사이클의 종료 시 완전한 용융 곡선을 수행하여 달성된다.
본 발명의 LOCS 구조는 대부분의 그리고 가능하게는 모든 이들 기존의 분석 방법과 적합할 수 있다.
본 발명은 적어도 부분적으로 하기 실시형태 1 내지 59에 관한 것이다:
실시형태 1. 샘플에서 제1 표적 및 제2 표적의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법:
- 반응 혼합물을 제조하는 단계로서, 제1 표적 및/또는 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함할 것으로 추정되는 샘플 또는 이의 유도체를
폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 각각은 비혼성화된 뉴클레오타이드의 폐쇄된 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하며,
제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 상이함, 및
이중 가닥 줄기 부분의 각각은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하는, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드; 및
오직 표적 또는 이의 앰플리콘과 접촉할 때만 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분을 절단하거나 분해할 수 있는 효소와 접촉시켜 반응 혼합물을 제조하는 단계;
- 반응 혼합물을 처리하는 단계로서,
효소가 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단 또는 분해를 유도하기에 적합한 조건 하에 처리하므로써 제1 및 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 단계;
- 상기 제1 개방 올리고뉴클레오타이드 및 제2 개방 올리고뉴클레오타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 단계로서, 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 가닥을 해리하므로써 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 형광단과 켄쳐 분자의 공간 분리를 수월하게 하고 제1 검출 가능한 신호를 제공하는 제1 온도에서, 그리고
제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 가닥을 해리하므로써 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 형광단과 켄쳐 분자의 공간 분리를 수월하게 하고 제2 검출 가능한 신호를 제공하는 제2 온도에서, 반응 혼합물 또는 이의 유도체를 처리하는 것에 의해 검출하는, 단계;
여기서:
제1 온도는 제2 온도와 다르고,
제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 및 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 가시 스펙트럼의 동일한 색상 영역에서 발광하고(emit),
제1 온도에서의 신호의 검출은 샘플에서의 제1 표적의 존재를 나타내고, 제1 온도에서의 신호를 검출하는 것의 실패는 샘플에서의 제1 표적의 부재를 나타내고;
제2 온도에서의 신호의 검출은 샘플에서의 제2 표적의 존재를 나타내고, 제2 온도에서의 신호를 검출하는 것의 실패는 샘플에서의 제2 표적의 부재를 나타냄.
실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 효소는 다성분 핵산 효소(MNAzyme)를 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는
제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제1 MNAzyme에 의한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위해 제1 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제1 다성분 핵산 효소(MNAzyme)의 결합 및 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 상기 제1 MNAzyme의 기질 아암의 혼성화에 적합한 조건 하에 반응 혼합물을 처리하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 3. 실시형태 2에 있어서, 표적은 제1 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제1 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 핵산 서열 또는 이의 앰플리콘인, 방법.
실시형태 4. 실시형태 1에 있어서,
- 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 효소는 제1 표적에 결합할 수 있는 압타머를 갖는 효소를 포함하고;
- 압타머에 대한 제1 표적의 결합은, 압타머를 갖는 효소가 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법.
실시형태 5. 실시형태 4에 있어서, 압타머를 갖는 효소는 apta-DNAzyme, apta-리보자임, apta-MNAzyme의 임의의 하나 이상을 포함하는, 방법.
실시형태 6. 실시형태 2, 4 또는 5 중 어느 하나에 있어서,
- 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 반응 혼합물은 제1 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제1 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고;
- 제1 MNAzyme은 제1 표적에 결합할 수 있는 압타머 서열을 포함하고;
- 압타머에 대한 표적의 결합은, 제1 MNAzyme이 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법.
실시형태 7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 효소는 제한 엔도뉴클레아제를 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는
제1 제한 엔도뉴클레아제가 회합하는 이중 가닥 서열을 형성하고 이로써 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위해 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제1 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화에 적합한 조건 하에 반응 혼합물을 처리하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 8. 실시형태 7에 있어서, 제한 엔도뉴클레아제는 제1 제한 엔도뉴클레아제에 대한 상기 이중 가닥 서열의 루프 가닥과 회합하고 절단할 수 있는 닉킹(nicking) 엔도뉴클레아제인, 방법.
실시형태 9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 효소(예를 들어, 중합효소 효소, 엑소뉴클레아제)는 엑소뉴클레아제 활성을 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는
반응 혼합물을 하기에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 것을 포함하는, 방법:
- 제1 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
- 제1 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열에 대한 상류 (5')에 위치한 제2 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제1 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 혼성화,
- 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소와 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 근처에서의 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분과의 회합, 및
- 제1 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소의 촉매 활성.
실시형태 10. 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 효소는 엑소뉴클레아제 활성을 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는
반응 혼합물을 하기에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 것을 포함하는, 방법:
- 제1 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
- 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소와 제1 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열과의 회합, 및
- 제1 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소의 촉매 활성.
실시형태 11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 효소는 촉매 활성에 제1 보인자(co-factor)를 요하는 DNAzyme 및/또는 리보자임을 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는 반응 혼합물을 하기에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 것을 포함하는, 방법:
- DNAzyme 및/또는 리보자임이 촉매적으로 활성이 되도록 하는, DNAzyme에 대한 상기 제1 보인자의 결합 및/또는 리보자임에 대한 상기 제1 보인자의 결합,
- 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 혼성화,
- 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단을 수월하게 하고 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 촉매 활성;
여기서:
제1 표적은 제1 보인자임.
실시형태 12. 실시형태 11에 있어서, 제1 보인자는 금속 이온(예를 들어, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+)인, 방법.
실시형태 13. 실시형태 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 처리 단계는 반응 혼합물을 하기 중 임의의 하나 이상에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 것을 추가로 포함하는 방법:
- 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제2 MNAzyme에 의한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제2 MNAzyme의 결합 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 상기 제2 MNAzyme의 기질 아암의 혼성화;
- 제2 제한 엔도뉴클레아제가 이중 가닥 서열과 회합하는 이중 가닥 서열을 형성하고 이로써 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화;
- 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열에 대한 상류 (5')에 위치한 제2 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 혼성화,
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소와 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 근처에서의 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분과의 회합, 및
제2 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소의 촉매 활성;
- 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소와 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열과의 회합, 및
제2 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소의 촉매 활성;
- DNAzyme 및/또는 리보자임이 촉매적으로 활성이 되도록 하는, DNAzyme에 대한 제2 보인자의 결합 및/또는 리보자임에 대한 제2 보인자의 결합,
제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 혼성화,
제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단을 수월하게 하고 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 촉매 활성;
여기서:
제2 표적은 제2 보인자임.
실시형태 14. 실시형태 13에 있어서, 제2 보인자는 금속 이온(예를 들어, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+)인, 방법.
실시형태 15. 실시형태 13에 있어서, 제2 제한 엔도뉴클레아제는 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 상기 이중 가닥 서열의 루프 가닥과 회합하고 절단할 수 있는 닉킹 엔도뉴클레아제인, 방법.
실시형태 16. 실시형태 15에 있어서, 제1 제한 엔도뉴클레아제 및 제2 제한 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제의 상이한 유형인, 방법.
실시형태 17. 실시형태 15에 있어서, 제1 제한 엔도뉴클레아제 및 제2 제한 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제의 동일한 유형인, 방법.
실시형태 18. 실시형태 13에 있어서, 제2 표적은 제2 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제2 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 핵산 서열 또는 이의 앰플리콘인, 방법.
실시형태 19. 실시형태 13에 있어서,
- 제2 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 효소는 제2 표적에 결합할 수 있는 압타머를 갖는 효소를 포함하고;
- 압타머에 대한 제2 표적의 결합은, 압타머를 갖는 효소가 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법.
실시형태 20. 실시형태 19에 있어서, 압타머를 갖는 효소는 apta-DNAzyme, apta-리보자임, apta-MNAzyme의 임의의 하나 이상을 포함하는, 방법.
실시형태 21. 실시형태 13, 19 또는 20에 있어서,
- 제2 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 반응 혼합물은 제2 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제2 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고;
- 제2 MNAzyme은 제2 표적에 결합할 수 있는 압타머 서열을 포함하고;
- 제2 MNAzyme의 압타머 서열에 대한 제2 표적의 결합은, 제2 MNAzyme의 압타머에 결합된 억제 분자의 제거를 수월하게 하는 것에 의해 제2 MNAzyme이 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법.
실시형태 22. 실시형태 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 동일한, 방법.
실시형태 23. 실시형태 13 내지 22 중 어느 하나에 있어서,
- 반응 혼합물은 상기 제1 MNAzyme 및 제2 MNAzyme을 포함하고;
- 제1 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열은 제2 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열과 상이한, 방법.
실시형태 24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 장치의 단일 형광 방출 채널에서 검출 가능한, 방법.
실시형태 25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 존재 또는 부재를 하기에 의해 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법:
- 샘플 또는 이의 유도체를 포함하는 반응 혼합물을
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 폐쇄된 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하며,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 것과 상이하고;
이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함함; 및
오직 표적 또는 이의 앰플리콘과 접촉할 때만 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분을 절단하거나 분해할 수 있는 효소와 접촉시키는 단계;
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해 효소가 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단 또는 분해를 유도하기에 적합한 조건 하에 반응 혼합물을 처리하는 단계;
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 형광단과 켄쳐 분자의 공간 분리를 수월하게 하고 제3 검출 가능한 신호를 제공하기 위해 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 가닥이 해리하는 제3 온도에서 반응 혼합물 또는 이의 유도체를 처리하여 제3 올리고뉴클레오타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 단계;
여기서:
제3 온도는 제1 온도 및 제2 온도와 상이하고,
제3 온도에서의 신호의 검출은 샘플에서의 제3 표적의 존재를 나타내고, 제3 온도에서의 신호를 검출하는 것의 실패는 샘플에서의 제3 표적의 부재를 나타냄.
실시형태 26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 존재 또는 부재를 하기에 의해 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법:
- 샘플 또는 이의 유도체를 포함하는 반응 혼합물을
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 폐쇄된 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하며,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 또는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 것과 동일하고;
이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고, 여기서 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드에 연결된 형광단 분자는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및/또는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단보다 가시 스펙트럼의 상이한 색상 영역에서 발광함; 및
오직 표적 또는 이의 앰플리콘과 접촉할 때만 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분을 절단하거나 분해할 수 있는 효소와 접촉시키는 단계;
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해 효소가 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단 또는 분해를 유도하기에 적합한 조건 하에 반응 혼합물을 처리하는 단계;
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 형광단과 켄쳐 분자의 공간 분리를 수월하게 하고 제3 검출 가능한 신호를 제공하기 위해 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 가닥이 해리하는 제3 온도에서 반응 혼합물 또는 이의 유도체를 처리하여 제3 올리고뉴클레오타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 단계;
여기서:
제3 온도에서의 신호의 검출은 샘플에서의 제3 표적의 존재를 나타내고, 제3 온도에서의 신호를 검출하는 것의 실패는 샘플에서의 제3 표적의 부재를 나타냄.
실시형태 27. 실시형태 26에 있어서, 제3 온도는 제1 온도 및/또는 제2 온도와 상이한, 방법.
실시형태 28. 실시형태 25 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 반응 혼합물을 하기 중 임의의 하나 이상에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 단계를 포함하는, 방법:
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제3 MNAzyme에 의한 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위해 제3 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제3 MNAzyme의 결합 및 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 상기 제3 MNAzyme의 기질 아암의 혼성화;
- 제3 제한 엔도뉴클레아제가 이중 가닥 서열과 회합하는 이중 가닥 서열을 형성하고 이로써 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위해 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화;
- 제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열에 대한 상류 (5')에 위치한 제3 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제3 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제3 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 혼성화, 제3 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 이의 인접한 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분을 갖는 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제3 효소의 회합, 및
제3 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제3 효소의 촉매 활성;
- 제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제3 효소와 제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열과의 회합, 및
제3 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제3 효소의 촉매 활성;
- DNAzyme 및/또는 리보자임이 촉매적으로 활성이 되도록 하는, DNAzyme에 대한 제3 보인자의 결합 및/또는 리보자임에 대한 제3 보인자의 결합,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 혼성화,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단을 수월하게 하고 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 촉매 활성,
여기서:
제3 표적은 제3 보인자임.
실시형태 29. 실시형태 28에 있어서, 보인자는 금속 이온(예를 들어, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+)인, 방법.
실시형태 30. 실시형태 28에 있어서, 제한 엔도뉴클레아제는 제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 상기 이중 가닥 서열의 루프 가닥과 회합하고 절단할 수 있는 닉킹 엔도뉴클레아제인, 방법.
실시형태 31. 실시형태 28에 있어서, 제3 표적은 제3 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제3 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 핵산 서열 또는 이의 앰플리콘인, 방법.
실시형태 32. 실시형태 28에 있어서,
- 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 효소는 제3 표적에 결합할 수 있는 압타머를 갖는 효소를 포함하고;
- 압타머에 대한 제3 표적의 결합은, 압타머를 갖는 효소가 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법.
실시형태 33. 실시형태 32에 있어서, 압타머를 갖는 효소는 apta-DNAzyme, apta-리보자임, apta-MNAzyme의 임의의 하나 이상을 포함하는, 방법.
실시형태 34. 실시형태 28에 있어서,
- 제3 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 반응 혼합물은 제3 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제3 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고;
- 제3 MNAzyme은 제3 표적에 결합할 수 있는 압타머 서열을 포함하고;
- 제3 MNAzyme의 압타머 서열에 대한 제3 표적의 결합은, 제3 MNAzyme의 압타머에 결합된 억제 분자의 제거를 수월하게 하는 것에 의해 제3 MNAzyme이 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법.
실시형태 35. 실시형태 28, 또는 30 내지 34 중 어느 하나에 있어서,
- 반응 혼합물은 상기 제3 MNAzyme 및 상기 제1 MNAzyme 및 제2 MNAzyme의 둘 다 중 어느 하나를 포함하고;
- 제3 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열은
제1 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열, 및/또는
제1 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열과 상이한, 방법.
실시형태 36. 실시형태 25 또는 실시형태 28 내지 35 중 어느 하나에 있어서,
- 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 것과 상이하고;
- 제3 온도는 제1 온도 및 제2 온도와 상이하고;
- 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제1 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 가시 스펙트럼과 동일한 색상 영역에서 발광하는, 방법.
실시형태 37. 실시형태 25 또는 실시형태 28 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제1 및/또는 제2 폐쇄 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 동일한, 방법.
실시형태 38. 실시형태 37에 있어서, 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 및 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 및/또는 제2 폐쇄 및 개방 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 장치의 동일한 형광 방출 채널을 사용하여 검출 가능한, 방법.
실시형태 39. 실시형태 25 내지 35 또는 36 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 가시 스펙트럼의 동일한 색상 영역에서 발광하고;
- 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제1 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 가시 스펙트럼의 상이한 색상 영역에서 발광하는, 방법.
실시형태 40. 실시형태 25 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 제3 온도는 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃ 초과만큼 제1 온도 및/또는 제2 온도와 상이한, 방법.
실시형태 41. 실시형태 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 용융 곡선 분석은 신호의 임의의 상기 검출 또는 신호를 검출하는 것의 임의의 상기 실패에 사용되는, 방법.
실시형태 42. 실시형태 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 제1 온도는 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃ 초과만큼 제2 온도와 상이한, 방법.
실시형태 43. 실시형태 1 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 이의 앰플리콘은 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction), 가닥 대체 증폭(SDA: strand displacement amplification), 헬리카제 의존적 증폭(HDA: helicase dependent amplification), 재조합효소 중합효소 증폭(RPA: Recombinase Polymerase Amplification), 루프 매개 등온 증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification), 회전 환 증폭(RCA: rolling circle amplification), 전사 매개 증폭(TMA: transcription-mediated amplification), 자가 유지 서열 복제(3SR: self-sustained sequence replication), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA: nucleic acid sequence based amplification), 및/또는 역방향 전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction) 중 하나 이상에 의해 제조되는, 방법.
실시형태 44. 실시형태 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 샘플은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플인, 방법.
실시형태 45. 실시형태 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 시험관내 수행되는, 방법.
실시형태 46. 실시형태 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 생체외 수행되는, 방법.
실시형태 47. 조성물로서,
상기 조성물은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 각각은 비혼성화된 뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하고,
제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 상이하고,
이중 가닥 줄기 부분의 각각은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고,
형광단 분자는 가시 스펙트럼의 동일한 색상 영역에서 발광하고, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 융점(Tm)은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 Tm과 상이한, 조성물.
실시형태 48. 실시형태 47에 있어서, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한, 조성물.
실시형태 49. 실시형태 47 또는 실시형태 48에 있어서,
제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 폐쇄된 단일 가닥 루프 부분에 혼성화할 수 있는 기질 아암을 포함하는 제1 MNAzyme; 및
제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 혼성화할 수 있는 기질 아암을 포함하는 제2 MNAzyme을 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 50. 실시형태 49에 있어서,
제1 MNAzyme의 기질 아암은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 혼성화되고;
제2 MNAzyme의 기질 아암은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 혼성화되는, 조성물.
실시형태 51. 실시형태 50에 있어서,
제1 MNAzyme 및/또는 제2 MNAzyme은 표적 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자에 결합된 압타머 서열 및 올리고뉴클레오타이드 서열에 혼성화된 센서 아암을 포함하고;
제1 MNAzyme은 제2 MNAzyme과 상이한 표적을 검출하도록 설계된, 조성물.
실시형태 52. 실시형태 50에 있어서,
제1 MNAzyme 및/또는 제2 MNAzyme은 표적 서열에 혼성화된 센서 아암을 포함하고, 제1 MNAzyme은 제2 MNAzyme과 상이한 표적을 검출하도록 설계된, 조성물.
실시형태 53. 실시형태 47 내지 52 중 어느 하나에 있어서,
상기 제1 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열을 형성하도록 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제1 올리고뉴클레오타이드 서열;
상기 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열을 형성하도록 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제2 올리고뉴클레오타이드 서열;
상기 제1 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열과 회합되거나 이를 절단할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제; 및/또는
상기 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열과 회합되거나 이를 절단할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 54. 실시형태 47 내지 53 중 어느 하나에 있어서,
상기 제1 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제1 이중 가닥 서열을 형성하도록 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제1 표적 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 서열;
상기 제2 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열을 형성하도록 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제2 표적 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 이중 가닥 서열;
상기 제1 이중 가닥 서열에 대해 상류(5')인 제1 표적 올리고뉴클레오타이드에 혼성화된 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드 및 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 말단에 인접한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분과 회합된 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소(예를 들어, 중합효소, 엑소뉴클레아제); 및/또는
상기 제2 이중 가닥 서열에 대해 상류(5')인 제2 표적 올리고뉴클레오타이드에 혼성화된 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드 및 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 말단에 인접한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분과 회합된 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소(예를 들어, 중합효소, 엑소뉴클레아제)를 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 55. 실시형태 47 내지 54 중 어느 하나에 있어서,
상기 제1 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제1 이중 가닥 서열을 형성하도록 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 폐쇄된 제1 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제1 표적 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 서열;
상기 제2 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제2 이중 가닥 서열을 형성하도록 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제2 표적 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 이중 가닥 서열;
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소는 제1 이중 가닥 서열과 회합되고, 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소는 제2 이중 가닥 서열과 회합되는, 조성물.
실시형태 56. 실시형태 47 내지 55 중 어느 하나에 있어서,
제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 혼성화된 제1 DNAzyme 및/또는 제1 리보자임,
제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 혼성화된 제2 DNAzyme 및/또는 제2 리보자임,
각각의 상기 DNAzyme이 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있고, 이로써 루프 부분에 혼성화된 임의의 상기 DNAzyme의 절단 활성을 유도하기 위한 각각의 상기 DNAzyme에 대한 보인자,
각각의 상기 리보자임이 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있고, 이로써 루프 부분에 혼성화된 임의의 상기 리보자임의 절단 활성을 유도하기 위한 각각의 상기 리보자임에 대한 보인자를 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 57. 실시형태 47 내지 56 중 어느 하나에 있어서,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 것과 상이하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자와 비교하여 가시 스펙트럼의 상이한 색상 영역에서 발광하는, 조성물.
실시형태 58. 실시형태 47 내지 56 중 어느 하나에 있어서,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 것과 상이하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자와 비교하여 가시 스펙트럼의 동일한 색상 영역에서 발광하는, 조성물.
실시형태 59. 실시형태 47 내지 56 중 어느 하나에 있어서,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 또는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 것과 동일하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자와 비교하여 가시 스펙트럼의 상이한 색상 영역에서 발광하는, 조성물.
본 발명은 또한 하기 기재된 실시형태 1 내지 81에 관한 것이다:
실시형태 1. 샘플에서 제1 표적 및 제2 표적의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법:
(a) 반응 혼합물을 제조하는 단계로서, 제1 표적 및/또는 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함할 것으로 추정되는 샘플 또는 이의 유도체를
제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드, 여기서 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 각각은 비혼성화된 뉴클레오타이드의 폐쇄된 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하며,
제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 상이함, 및
오직 표적 또는 이의 앰플리콘과 접촉할 때만 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분을 절단하거나 분해할 수 있는 효소와 접촉시켜 반응 혼합물을 제조하는 단계;
(b) 반응 혼합물을 처리하는 단계로서,
- 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해 효소가 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단 또는 분해를 유도하기에 적합한 조건 하에;
- 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 형광단과 켄쳐 분자의 공간 분리를 수월하게 하고 제1 검출 가능한 형광 신호를 제공하기 위해 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 가닥이 해리하는 제1 온도 이상에서, 그리고
- 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 형광단과 켄쳐 분자의 공간 분리를 수월하게 하고 제2 검출 가능한 형광 신호를 제공하기 위해 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 가닥이 해리하는 제2 온도 이상에서, 반응 혼합물을 처리하는 단계;
여기서:
제1 온도는 제2 온도보다 낮고,
제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 및 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 가시 스펙트럼의 동일한 색상 영역에서 발광함; 및
(c) 제2 온도 이상인 온도를 포함하거나 이것으로 이루어진 하나 이상의 온도에서 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호의 수준을 검출하므로써 샘플에서 상기 표적의 존재 또는 부재를 결정하는 단계.
실시형태 2. 실시형태 1에 있어서, 효소는 다성분 핵산 효소(MNAzyme)를 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는
제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제1 MNAzyme에 의한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위해 제1 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제1 다성분 핵산 효소(MNAzyme)의 결합 및 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 상기 제1 MNAzyme의 기질 아암의 혼성화에 적합한 조건 하에 반응 혼합물을 처리하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 3. 실시형태 2에 있어서, 제1 표적은 제1 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제1 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 핵산 서열 또는 이의 앰플리콘인, 방법.
실시형태 4. 실시형태 1에 있어서,
- 제1 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 효소는 제1 표적에 결합할 수 있는 압타머를 갖는 효소를 포함하고;
- 압타머에 대한 제1 표적의 결합은, 압타머를 갖는 효소가 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법.
실시형태 5. 실시형태 4에 있어서, 압타머를 갖는 효소는 apta-DNAzyme, apta-리보자임, apta-MNAzyme의 임의의 하나 이상을 포함하는, 방법.
실시형태 6. 실시형태 2, 4 또는 5 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 반응 혼합물은 제1 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제1 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고;
- 제1 MNAzyme은 제1 표적에 결합할 수 있는 압타머 서열을 포함하고;
- 압타머에 대한 표적의 결합은, 제1 MNAzyme이 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법.
실시형태 7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 효소에 의한 상기 절단 또는 분해 동안 상기 표적 또는 이의 앰플리콘에 혼성화되지 않는, 방법.
실시형태 8. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 효소는 제한 엔도뉴클레아제를 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는
제1 제한 엔도뉴클레아제가 회합하는 이중 가닥 서열을 형성하고 이로써 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위해 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제1 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화에 적합한 조건 하에 반응 혼합물을 처리하는 것을 포함하는, 방법.
실시형태 9. 실시형태 8에 있어서, 제한 엔도뉴클레아제는 제1 제한 엔도뉴클레아제에 대한 상기 이중 가닥 서열의 루프 가닥과 회합하고 절단할 수 있는 닉킹 엔도뉴클레아제인, 방법.
실시형태 10. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 효소(예를 들어, 중합효소 효소, 엑소뉴클레아제)는 엑소뉴클레아제 활성을 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는
반응 혼합물을 하기에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 것을 포함하는, 방법:
- 제1 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
- 제1 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열에 대한 상류 (5')에 위치한 제2 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제1 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 혼성화,
- 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소와 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 근처에서의 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분과의 회합, 및
- 제1 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소의 촉매 활성.
실시형태 11. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 효소는 엑소뉴클레아제 활성을 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는
반응 혼합물을 하기에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 것을 포함하는, 방법:
- 제1 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
- 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소와 제1 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열과의 회합, 및
- 제1 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소의 촉매 활성.
실시형태 12. 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 효소는 촉매 활성에 제1 보인자를 요하는 DNAzyme 및/또는 리보자임을 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는 반응 혼합물을 하기에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 것을 포함하는, 방법:
- DNAzyme 및/또는 리보자임이 촉매적으로 활성이 되도록 DNAzyme에 대한 상기 제1 보인자의 결합 및/또는 리보자임에 대한 상기 제1 보인자의 결합,
- 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 혼성화,
- 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단을 수월하게 하고 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 촉매 활성;
여기서:
제1 표적은 제1 보인자임.
실시형태 13. 실시형태 12에 있어서, 제1 보인자는 금속 이온(예를 들어, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+)인, 방법.
실시형태 14. 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 처리 단계는 반응 혼합물을 하기 중 임의의 하나 이상에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 것을 추가로 포함하는 방법:
- 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제2 MNAzyme에 의한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제2 MNAzyme의 결합 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 상기 제2 MNAzyme의 기질 아암의 혼성화;
- 제2 제한 엔도뉴클레아제가 이중 가닥 서열과 회합하는 이중 가닥 서열을 형성하고 이로써 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화;
- 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열에 대한 상류 (5')에 위치한 제2 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 혼성화,
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소와 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 근처에서의 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분과의 회합, 및
제2 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소의 촉매 활성;
- 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소와 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열과의 회합, 및
제2 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소의 촉매 활성;
- DNAzyme 및/또는 리보자임이 촉매적으로 활성이 되도록 DNAzyme에 대한 제2 보인자의 결합 및/또는 리보자임에 대한 제2 보인자의 결합,
제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 혼성화,
제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단을 수월하게 하고 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 촉매 활성;
여기서:
제2 표적은 제2 보인자임.
실시형태 15. 실시형태 14에 있어서, 제2 보인자는 금속 이온(예를 들어, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+)인, 방법.
실시형태 16. 실시형태 14에 있어서, 제2 제한 엔도뉴클레아제는 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 상기 이중 가닥 서열의 루프 가닥과 회합하고 절단할 수 있는 닉킹 엔도뉴클레아제인, 방법.
실시형태 17. 실시형태 16에 있어서, 제1 제한 엔도뉴클레아제 및 제2 제한 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제의 상이한 유형인, 방법.
실시형태 18. 실시형태 16에 있어서, 제1 제한 엔도뉴클레아제 및 제2 제한 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제의 동일한 유형인, 방법.
실시형태 19. 실시형태 14에 있어서, 제2 표적은 제2 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위한 제2 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 핵산 서열 또는 이의 앰플리콘인, 방법.
실시형태 20. 실시형태 14에 있어서,
- 제2 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 효소는 제2 표적에 결합할 수 있는 압타머를 갖는 효소를 포함하고;
- 압타머에 대한 제2 표적의 결합은, 압타머를 갖는 효소가 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법.
실시형태 21. 실시형태 20에 있어서, 압타머를 갖는 효소는 apta-DNAzyme, apta-리보자임, apta-MNAzyme의 임의의 하나 이상을 포함하는, 방법.
실시형태 22. 실시형태 14, 20 또는 21에 있어서,
- 제2 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 반응 혼합물은 제2 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제2 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고;
- 제2 MNAzyme은 제2 표적에 결합할 수 있는 압타머 서열을 포함하고;
- 제2 MNAzyme의 압타머 서열에 대한 제2 표적의 결합은, 제2 MNAzyme의 압타머에 결합된 억제 분자의 제거를 수월하게 하는 것에 의해 제2 MNAzyme이 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법.
실시형태 23. 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 동일한, 방법.
실시형태 24. 실시형태 14 내지 23 중 어느 하나에 있어서,
- 반응 혼합물은 상기 제1 MNAzyme 및 제2 MNAzyme을 포함하고;
- 제1 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열은 제2 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열과 상이한, 방법.
실시형태 25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 장치의 단일 형광 방출 채널에서 검출 가능한, 방법.
실시형태 26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 임의의 상기 표적 또는 이의 앰플리콘의 절단 또는 분해를 유도하지 않는, 방법.
실시형태 27. 실시형태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 각각 상기 이중 가닥 줄기 부분 및 상기 단일 가닥 루프 부분으로 이루어지는, 방법.
실시형태 28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 존재 또는 부재를 하기에 의해 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법:
(d) 샘플 또는 이의 유도체를 포함하는 반응 혼합물을
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 폐쇄된 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하며,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 것과 상이하고;
이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함함; 및
오직 표적 또는 이의 앰플리콘과 접촉할 때만 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분을 절단하거나 분해할 수 있는 효소와 접촉시키는 단계;
(e) 반응 혼합물을 처리하는 단계로서,
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해 효소가 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단 또는 분해를 유도하기에 적합한 조건 하에;
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 형광단과 켄쳐 분자의 공간 분리를 수월하게 하고 제3 검출 가능한 형광 신호를 제공하기 위해 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 가닥이 해리하는 제3 온도 이상에서 처리하는 단계;
여기서:
제3 온도는 제1 온도 및 제2 온도보다 높음, 및
(f) 샘플에서 상기 표적의 존재 또는 부재를 결정하도록 제3 온도 이상인 온도를 포함하거나 이것으로 이루어진 하나 이상의 온도에서 상기 제1 형광 신호, 제2 형광 신호 및 제3 형광 신호의 수준을 검출하는 단계.
실시형태 29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 존재 또는 부재를 하기에 의해 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법:
(d) 샘플 또는 이의 유도체를 포함하는 반응 혼합물을
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 폐쇄된 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하며,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 또는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 것과 동일하고;
이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고, 여기서 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드에 연결된 형광단 분자는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및/또는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단보다 가시 스펙트럼의 상이한 색상 영역에서 발광함; 및
오직 표적 또는 이의 앰플리콘과 접촉할 때만 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분을 절단하거나 분해할 수 있는 효소와 접촉시키는 단계;
(e) 반응 혼합물을 처리하는 단계로서,
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해 효소가 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단 또는 분해를 유도하기에 적합한 조건 하에;
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 형광단과 켄쳐 분자의 공간 분리를 수월하게 하고 제3 검출 가능한 형광 신호를 제공하기 위해 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 가닥이 해리하는 제3 온도에서, 반응 혼합물을 처리하는 단계;
(f) 샘플에서 상기 표적의 존재 또는 부재를 결정하도록 제3 온도 이상인 온도를 포함하거나 이것으로 이루어진 하나 이상의 온도에서 상기 제1 형광 신호, 제2 형광 신호 및 제3 형광 신호의 수준을 검출하는 단계.
실시형태 30. 실시형태 29에 있어서, 제3 온도는 제1 온도 및/또는 제2 온도와 상이한, 방법.
실시형태 31. 실시형태 28 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 반응 혼합물을 하기 중 임의의 하나 이상에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 단계를 포함하는, 방법:
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제3 MNAzyme에 의한 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위해 제3 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제3 MNAzyme의 결합 및 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 상기 제3 MNAzyme의 기질 아암의 혼성화;
- 제3 제한 엔도뉴클레아제가 이중 가닥 서열과 회합하는 이중 가닥 서열을 형성하고 이로써 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위해 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화;
- 제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열에 대한 상류 (5')에 위치한 제3 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제3 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제3 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 혼성화, 제3 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 이의 인접한 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분을 갖는 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제3 효소의 회합, 및
제3 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제3 효소의 촉매 활성;
- 제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제3 효소와 제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열과의 회합, 및
제3 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제3 효소의 촉매 활성;
- DNAzyme 및/또는 리보자임이 촉매적으로 활성이 되도록 하는, DNAzyme에 대한 제3 보인자의 결합 및/또는 리보자임에 대한 제3 보인자의 결합,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 혼성화,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단을 수월하게 하고 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 촉매 활성,
여기서:
제3 표적은 제3 보인자임.
실시형태 32. 실시형태 31에 있어서, 보인자는 금속 이온(예를 들어, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+)인, 방법.
실시형태 33. 실시형태 31에 있어서, 제한 엔도뉴클레아제는 제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 상기 이중 가닥 서열의 루프 가닥과 회합하고 절단할 수 있는 닉킹 엔도뉴클레아제인, 방법.
실시형태 34. 실시형태 31에 있어서, 제3 표적은 제3 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제3 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 핵산 서열 또는 이의 앰플리콘인, 방법.
실시형태 35. 실시형태 31에 있어서,
- 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 효소는 제3 표적에 결합할 수 있는 압타머를 갖는 효소를 포함하고;
- 압타머에 대한 제3 표적의 결합은, 압타머를 갖는 효소가 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법.
실시형태 36. 실시형태 35에 있어서, 압타머를 갖는 효소는 apta-DNAzyme, apta-리보자임, apta-MNAzyme의 임의의 하나 이상을 포함하는, 방법.
실시형태 37. 실시형태 31에 있어서,
- 제3 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 반응 혼합물은 제3 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제3 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고;
- 제3 MNAzyme은 제3 표적에 결합할 수 있는 압타머 서열을 포함하고;
- 제3 MNAzyme의 압타머 서열에 대한 제3 표적의 결합은, 제3 MNAzyme의 압타머에 결합된 억제 분자의 제거를 수월하게 하는 것에 의해 제3 MNAzyme이가 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법.
실시형태 38. 실시형태 31, 또는 33 내지 37 중 어느 하나에 있어서,
- 반응 혼합물은 상기 제3 MNAzyme 및 상기 제1 MNAzyme 및 제2 MNAzyme의 둘 다 중 어느 하나를 포함하고;
- 제3 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열은
제1 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열, 및/또는
제1 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열과 상이한, 방법.
실시형태 39. 실시형태 28 또는 실시형태 31 내지 38 중 어느 하나에 있어서,
- 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 것과 상이하고;
- 제3 온도는 제1 온도 및 제2 온도와 상이하고;
- 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제1 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 가시 스펙트럼과 동일한 색상 영역에서 발광하는, 방법.
실시형태 40. 실시형태 28 또는 실시형태 31 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제1 및/또는 제2 폐쇄 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 동일한, 방법.
실시형태 41. 실시형태 40에 있어서, 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 및 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 및/또는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 장치의 동일한 형광 방출 채널을 사용하여 검출 가능한, 방법.
실시형태 42. 실시형태 28 내지 38 또는 39 중 어느 하나에 있어서,
- 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 가시 스펙트럼의 동일한 색상 영역에서 발광하고;
- 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제1 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 가시 스펙트럼의 상이한 색상 영역에서 발광하는, 방법.
실시형태 43. 실시형태 28 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 제3 온도는 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃ 초과만큼 제1 온도 및/또는 제2 온도와 상이한, 방법.
실시형태 44. 제28항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 온도에서의 제3 형광 신호의 검출은 샘플에서의 제3 표적의 존재를 나타내고, 제3 온도에서의 제3 형광 신호의 검출의 실패는 샘플에서의 제3 표적의 부재를 나타내는, 방법.
실시형태 45. 실시형태 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서,
(i) 제1 온도에서의 제1 형광 신호의 존재의 결정은 샘플에서의 제1 표적의 존재를 나타내고, 제1 형광 신호의 부재의 결정은 샘플에서의 제1 표적의 부재를 나타내고;
(ii) 제2 온도에서의 제2 형광 신호의 존재의 결정은 샘플에서의 제2 표적의 존재를 나타내고, 제2 형광 신호의 부재의 결정은 샘플에서의 제2 표적의 부재를 나타내는, 방법.
실시형태 46. 실시형태 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 제1 표적 및 제2 표적의 존재 또는 부재의 상기 결정은 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호를 사용한 용융 곡선 분석을 포함하는, 방법.
실시형태 47. 실시형태 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 파트 (c)는
- 제2 온도 이상의 온도; 및
- 제1 온도 이상 및 제2 온도 미만인 온도에서의 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 48. 실시형태 47에 있어서, 파트 (c)는 제2 온도보다 낮은 온도에서 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호의 수준을 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 49. 실시형태 47 또는 실시형태 48에 있어서, 파트 (c)는 핵산 증폭 반응 동안에 그리고/또는 반응의 완료 시 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 50. 실시형태 47 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 제1 표적의 공지된 농도 및/또는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 공지된 농도를 사용하여 제1 표적 양성 대조군 형광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 51. 실시형태 47 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 표적을 포함하는 별개의 대조군 샘플에 상기 방법을 반복하여 제1 표적 양성 대조군 형광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 52. 실시형태 51에 있어서, 제1 표적을 포함하는 대조군 샘플은 제1 표적의 공지된 농도를 포함하는, 방법.
실시형태 53. 실시형태 51 또는 실시형태 52에 있어서, 제1 표적을 포함하는 대조군 샘플은 상기 제2 표적을 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 54. 실시형태 46 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 표적을 포함하는 별개의 대조군 샘플에 상기 방법을 반복하여 제2 표적 양성 대조군 형광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 55. 실시형태 54에 있어서, 제2 표적을 포함하는 대조군 샘플은 제2 표적의 공지된 농도를 포함하는, 방법.
실시형태 56. 실시형태 54 또는 실시형태 55에 있어서, 상기 대조군 샘플은 상기 제1 표적을 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 57. 실시형태 46 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 표적 및 상기 제2 표적을 포함하는 별개의 대조군 샘플에 상기 방법을 반복하여 조합된 양성 대조군 형광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 58. 실시형태 57에 있어서, 조합된 대조군 샘플은 제1 표적의 공지된 농도 및/또는 제2 표적의 공지된 농도를 포함하는, 방법.
실시형태 59. 실시형태 50 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 임의의 상기 양성 대조군 형광 신호를 사용하여 상기 제1 형광 신호 및/또는 상기 제2 형광 신호를 정규화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 60. 실시형태 46 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 하기를 함유하지 않는 별개의 음성 대조군 샘플에서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법을 반복하여 음성 대조군 형광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법:
(i) 상기 제1 표적; 또는
(ii) 상기 제2 표적; 또는
(iii) 상기 제1 표적 또는 상기 제2 표적.
실시형태 61. 실시형태 60에 있어서, 상기 음성 대조군 형광 신호를 사용하여 상기 제1 형광 신호 및/또는 상기 제2 형광 신호를 정규화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
실시형태 62. 실시형태 46 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 형광 신호 및/또는 제2 형광 신호를 역치 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하고,
- 역치 값은, 샘플에서의 제1 표적 및 제2 표적의 상기 존재 또는 부재를 결정하도록, 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나의 방법에 따라 시험된 일련의 샘플로부터 유래된 형광 신호를 사용하여 생성되고, 하기 중 임의의 하나 이상을 포함하는, 방법:
(i) 무(no) 주형 대조군 및 제1 표적
(ii) 무 주형 대조군 및 제2 표적
(iii) 무 주형 대조군, 제1 표적, 및 제2 표적.
실시형태 63. 실시형태 62에 있어서, 일련의 샘플은 상기 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 공지된 농도 및/또는 상기 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 공지된 농도를 사용하여 시험되는, 방법.
실시형태 64. 실시형태 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 제1 온도는 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃ 초과만큼 제2 온도와 상이한, 방법.
실시형태 65. 실시형태 1 내지 64 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 이의 앰플리콘은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 가닥 대체 증폭(SDA), 헬리카제 의존적 증폭(HDA), 재조합효소 중합효소 증폭(RPA), 루프 매개 등온 증폭 (LAMP), 회전 환 증폭(RCA), 전사 매개 증폭 (TMA), 자가 유지 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA), 및/또는 역방향 전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 중 임의의 하나 이상에 의해 제조되는, 방법.
실시형태 66. 실시형태 1 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 샘플은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플인, 방법.
실시형태 67. 실시형태 1 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 시험관내 수행되는, 방법.
실시형태 68. 실시형태 1 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 생체외 수행되는, 방법.
실시형태 69. 조성물로서,
상기 조성물은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 각각은 비혼성화된 뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하고,
제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 상이하고,
이중 가닥 줄기 부분의 각각은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고,
형광단 분자는 가시 스펙트럼의 동일한 색상 영역에서 발광하고, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 융점(Tm)은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 Tm과 상이한, 조성물.
실시형태 70. 실시형태 69에 있어서, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한, 조성물.
실시형태 71. 실시형태 69 또는 실시형태 70에 있어서,
제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 폐쇄된 단일 가닥 루프 부분에 혼성화할 수 있는 기질 아암을 포함하는 제1 MNAzyme; 및
제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 혼성화할 수 있는 기질 아암을 포함하는 제2 MNAzyme을 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 72. 실시형태 71에 있어서,
제1 MNAzyme의 기질 아암은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 혼성화되고;
제2 MNAzyme의 기질 아암은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 혼성화되는, 조성물.
실시형태 73. 실시형태 72에 있어서,
제1 MNAzyme 및/또는 제2 MNAzyme은 표적 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자에 결합된 압타머 서열 및 올리고뉴클레오타이드 서열에 혼성화된 센서 아암을 포함하고;
제1 MNAzyme은 제2 MNAzyme과 상이한 표적을 검출하도록 설계된, 조성물.
실시형태 74. 실시형태 72에 있어서,
제1 MNAzyme 및/또는 제2 MNAzyme은 표적 서열에 혼성화된 센서 아암을 포함하고, 제1 MNAzyme은 제2 MNAzyme과 상이한 표적을 검출하도록 설계된, 조성물.
실시형태 75. 실시형태 69 내지 74 중 어느 하나에 있어서,
상기 제1 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열을 형성하도록 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제1 올리고뉴클레오타이드 서열;
상기 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열을 형성하도록 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제2 올리고뉴클레오타이드 서열;
상기 제1 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열과 회합되거나 이를 절단할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제; 및/또는
상기 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열과 회합되거나 이를 절단할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 76. 실시형태 69 내지 75 중 어느 하나에 있어서,
상기 제1 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제1 이중 가닥 서열을 형성하도록 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제1 표적 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 서열;
상기 제2 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열을 형성하도록 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제2 표적 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 이중 가닥 서열;
상기 제1 이중 가닥 서열에 대해 상류(5')인 제1 표적 올리고뉴클레오타이드에 혼성화된 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드 및 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 말단에 인접한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분과 회합된 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소(예를 들어, 중합효소, 엑소뉴클레아제); 및/또는
상기 제2 이중 가닥 서열에 대해 상류(5')인 제2 표적 올리고뉴클레오타이드에 혼성화된 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드 및 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 말단에 인접한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분과 회합된 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소(예를 들어, 중합효소, 엑소뉴클레아제)를 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 77. 실시형태 69 내지 76 중 어느 하나에 있어서,
상기 제1 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제1 이중 가닥 서열을 형성하도록 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 폐쇄된 제1 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제1 표적 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 서열;
상기 제2 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제2 이중 가닥 서열을 형성하도록 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제2 표적 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 이중 가닥 서열;
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소는 제1 이중 가닥 서열과 회합되고, 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소는 제2 이중 가닥 서열과 회합되는, 조성물.
실시형태 78. 실시형태 69 내지 77 중 어느 하나에 있어서,
제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 혼성화된 제1 DNAzyme 및/또는 제1 리보자임,
제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 혼성화된 제2 DNAzyme 및/또는 제2 리보자임,
각각의 상기 DNAzyme이 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있고, 이로써 루프 부분에 혼성화된 임의의 상기 DNAzyme의 절단 활성을 유도하기 위한 각각의 상기 DNAzyme에 대한 보인자,
각각의 상기 리보자임이 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있고, 이로써 루프 부분에 혼성화된 임의의 상기 리보자임의 절단 활성을 유도하기 위한 각각의 상기 리보자임에 대한 보인자를 추가로 포함하는, 조성물.
실시형태 79. 실시형태 69 내지 78 중 어느 하나에 있어서,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하는, 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 것과 상이하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자와 비교하여 가시 스펙트럼의 상이한 색상 영역에서 발광하는, 조성물.
실시형태 80. 실시형태 69 내지 78 중 어느 하나에 있어서,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하는, 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 것과 상이하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자와 비교하여 가시 스펙트럼의 동일한 색상 영역에서 발광하는, 조성물.
실시형태 81. 실시형태 69 내지 78 중 어느 하나에 있어서,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하는, 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 추가로 포함하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 또는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 것과 동일하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자와 비교하여 가시 스펙트럼의 상이한 색상 영역에서 발광하는, 조성물.
본 발명의 바람직한 실시형태는 하기 기재된 바와 같은 첨부한 도 1 내지 도 8을 참조하여 오직 예로서 이제 설명될 것이다.
도 1: 예시적인 LOCS 리포터 및 온전한 폐쇄된, 잠금 형태, 및 절단된 또는 분해된 개방 형태의 이의 융점(Tm)이 예시되어 있다. 예시적인 온전한(폐쇄된) LOCS(도 1의 A, LHS)는 루프 영역, 줄기 영역 및 형광단(F) 켄쳐 (Q) 염료 쌍을 갖는다. 루프 영역의 절단 또는 분해는 개방 LOCS 리포터 구조를 생성할 수 있다(도 1의 A RHS). 온전한 LOCS의 줄기 영역의 융점(Tm)은 개방 LOCS 구조에서의 줄기 영역의 Tm보다 높다. 그러므로 LOCS A의 줄기 A는 Tm 1에서 분리되거나 용융할 것이다. 이는 개방 LOCS 줄기 A'가 용융하는 온도인 Tm 2보다 높다(도 1의 B). 유사하게, 온전한 LOCS B의 줄기 B의 Tm은 Tm 3에서 용융할 것이다. 이는 개방 LOCS 줄기 B'가 용융하는 온도인 Tm 4보다 높다(도 1의 B). 개방 LOCS 구조의 Tm에 상응하는 온도에서의 음성 피크의 존재는 특이적 LOCS의 개방을 유도하는 표적의 존재를 나타낸다. 각각의 특정 개방된 LOCS 내의 각각의 줄기가 구별되는 온도에서 용융하므로, 동일한 형광단으로 표지화된 다수의 LOCS는 단일 반응에서 동시에 분석될 수 있다.
도 2는 보편적이고 임의의 표적을 검출하도록 사용될 수 있는 LOCS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 표적의 검출을 위한 예시적인 전략을 예시한다. 이 반응식에서 LOCS 올리고뉴클레오타이드는 줄기 영역, 형광단 켄쳐 염료 쌍 및 루프 영역을 함유한다. 루프 영역은 PlexZyme으로도 공지된 MNAzyme과 같은 촉매 핵산에 대한 보편적 기질을 포함한다. 성분 파트자임(partzyme)의 표적 센서 아암이 표적에 인접하게 정렬할 때 MNAzyme이 형성된다. LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역은 MNAzyme의 기질 결합 아암에 결합하고, 루프 내의 기질은 MNAzyme에 의해 절단되고, 형광 신호가 생성된다. 반응은 냉각될 수 있어서 개방된 LOCS의 줄기 영역이 재어닐링하게 하고, 반응은 이후 용융 곡선 분석으로 처리될 수 있고, 이에 의해 반응이 가열되면서 형광이 모니터링된다. 개방 LOCS의 Tm에 상응하는 용융 피크의 존재는 MNAzyme을 조립하는 표적의 존재를 나타낸다. 표적은 직접 검출될 수 있거나, 표적 증폭 프로토콜에 의해 생성된 표적 앰플리콘이 검출될 수 있다.
도 3은 표적에 특이적인 LOCS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 표적의 검출을 위한 예시적인 전략을 예시한다. LOCS 올리고뉴클레오타이드는 줄기 영역, 형광단 켄쳐 염료 쌍 및 표적 앰플리콘에 상보성 영역을 포함하는 루프 영역을 함유한다. 도 3의 A에 예시된 반응식에서, LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역은 증폭 동안 표적 앰플리콘에 결합한다. 프라이머의 연장 동안, 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성은 루프 영역을 분해하여 실시간으로 형광 신호를 생성하지만, 줄기 영역이 온전하게 한다. 줄기 영역은 이의 표적이 아니라 서로에 상보성이다. 증폭 후에, 분해된, 개방 LOCS 구조의 줄기가 재어닐링하도록 반응이 냉각될 수 있다. 후속하는 용융 곡선 분석은 개방 LOCS로부터 유래된 줄기 영역이 용융하고 형광을 생성하는 온도를 측정하도록 수행될 수 있다. 도 3의 B에 예시된 반응식에서, LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역은 표적 앰플리콘에 상보성인 영역을 포함하고, 제한 효소, 예를 들어 닉킹 효소에 대한 인식 부위를 추가로 함유한다. LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역은 표적에 결합하고, 닉킹 효소는 루프 영역을 절단하여, 표적 분자를 온전하게 둔다. 이는 LOCS를 개방하고 형광 신호를 생성한다. 반응은 이후 절단된, 개방 LOCS 구조의 줄기가 재어닐링할 수 있도록 냉각될 수 있고; 이후 용융 곡선 분석은 개방 LOCS로부터 유래된 줄기 영역이 용융하는 온도를 측정하도록 수행될 수 있다. 전략은 표적 서열을 직접 검출하도록 사용될 수 있거나, 표적 증폭 방법과 조합될 때 표적 앰플리콘을 검출할 수 있다.
도 4는 표적 MgPa(도 4의 A), 또는 TV-Btub(도 4의 C) 또는 MgPa 및 TV-Btub 둘 다(도 4의 E)의 10,000개의 카피(검정 선), 40개의 카피(회색 선) 또는 0개의 카피(점선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 PCR 증폭 도표를 예시한다. 10,000개의 카피(검정 선) 및 40개의 카피(회색 선)를 함유하는 반응으로부터 증폭 후 얻은 용융 곡선 서명은 표적 MgPa(도 4의 B), TV-Btub(도 4의 D) 또는 MgPa 및 TV-Btub 둘 다(도 4의 F)에 도시되어 있다. MgPa 유전자 표적의 존재 하에 LOCS-1을 개방시켜 생성된 용융 서명은 35℃ 및 41℃의 융점에서의 피크를 포함하고; TV-Btub 유전자 표적의 존재 하에 LOCS-2를 개방시켜 생성된 용융 서명은 50℃의 융점에 상응하는 피크를 포함하지만; MgPa 및 TV-Btub 유전자 표적 둘 다의 존재 하에 LOCS-1 및 LOCS-2 둘 다를 개방시켜 생성된 용융 서명은 35℃, 41℃ 및 50℃의 융점에서 3개의 피크를 포함하였다. MgPa의 존재 하의 LOCS 용융 서명(Tm = 35℃ 및 41℃)은 TV-Btub 유전자 표적의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명(Tm = 50℃)과 구별된다. 추가로, MgPa 및 TV-Btub 유전자 표적 둘 다의 존재 하의 LOCS 용융 서명은 상기 언급된 용융 서명(Tm = 35℃, 41℃ 및 50℃)과 구별되는데, 오직 단일 유전자 표적이 존재하고, 이는 표적 둘 다가 검출되었다는 것을 나타낸다.
도 5(상부 패널)는 MgPa(도 5의 A1), HMPV(도 5의 B1) 및 CT-ompA(도 5의 C1) 유전자 표적의 10,000개의 카피(검정 선), 40개의 카피(회색 선) 또는 0개의 카피(점선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 PCR 증폭 도표를 예시한다. 하부 패널에 도시된 결과는 MgPa(도 5의 A2), HMPV(도 5의 B2) 및 CT-ompA(도 5의 C2) 유전자 표적의 10,000개의 카피(검정 선) 및 40개의 카피(회색 선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 용융 곡선 서명이다. 3개의 표적은 3개의 상이한 MNAzyme을 사용하여 특이적으로 검출되었고; 이들의 각각은 동일한 기질 결합 아암이고, 표적 결합 아암만이 상이하다. 각각의 MNAzyme은 보편적 기질 및 보편적 줄기를 포함하는 동일한 보편적 LOCS-1 올리고뉴클레오타이드를 개방하였다. 각각의 표적은 보편적 줄기의 Tm에 상응하는 40℃에서의 피크를 갖는 용융 곡선 서명을 생성하였다.
도 6(상부 패널)은 TV-Btub(도 6의 A1), VZV(도 6의 B1) 및 rpoB(도 6의 C1) 표적의 10,000개의 카피(검정 선), 40개의 카피(회색 선) 또는 0개의 카피(점선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 PCR 증폭 도표를 예시한다. 하부 패널에 도시된 결과는 TV-Btub(도 6의 A2), VZV(도 6의 B2) 및 rpoB(도 6의 C2) 표적의 10,000개의 카피(검정 선) 및 40개의 카피(회색 선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 용융 곡선 서명이다. 3개의 표적은 3개의 상이한 MNAzyme에 의해 특이적으로 검출되었고; 이들의 각각은 동일한 기질 결합 아암이고, 표적 결합 아암만이 상이하다. 각각의 MNAzyme은 보편적 기질 및 보편적 줄기를 포함하는 동일한 보편적 LOCS-2를 개방하였다. 각각의 표적은 LOCS-2 내에 보편적 줄기의 Tm에 상응하는 50℃에서의 피크를 갖는 용융 곡선 서명을 생성하였다.
도 7은 LOCS-1(도 7의 A), LOCS-2(도 7의 B), LOCS-3(도 7의 C) 및 LOCS-4(도 7의 D)가 표적 CT-Cds(도 7의 A 및 도 7의 C) 또는 TFRC(도 7의 B 및 도 7의 D)의 증폭을 모니터링하도록 사용될 때 얻은 용융 곡선 서명을 보여준다. 표적의 부재 하에 얻은 용융 곡선 서명(점선)은 각각 폐쇄된, 온전한 LOCS-1, LOCS-2, LOCS-3 및 LOCS-4의 용점에 상응하는 65℃, 77℃, 66℃ 및 67℃의 Tm에서의 피크를 가졌다. CT-Cds 표적(검정 선; 도 7의 A 및 도 7의 C)의 존재 하에, 개방 LOCS-1 및 LOC-3 구조는 각각 30℃ 및 36℃의 융점을 생성시켰다. TFRC 표적(검정 선; 도 7의 B 및 도 7의 D)의 존재 하에, 개방 LOCS-2 및 LOC-4 구조는 각각 50℃ 및 32℃의 융점을 생성시켰다.
도 8은 BioRad® CFX96 유전자증폭기(도 8의 A) 또는 ABI 7500(도 8의 B) 또는 Light Cycler 480(패널 C), 또는 XXpress PCR(도 8의 D)에서 수행될 때 MgPa 표적의 증폭에 얻은 용융 곡선을 보여준다. 표적 둘 다는 모든 기계에서 FAM 채널에서 모니터링되었다.
도 9는 BioRad® CFX96 유전자증폭기(도 9의 A) 또는 ABI 7500(도 9의 B) 또는 Lightcycler 480(도 9의 C), 또는 XXpress PCR(도 9의 D)에서 수행될 때 TV-Btub 표적의 증폭에 얻은 용융 곡선을 보여준다. 표적 둘 다는 모든 기계에서 FAM 채널에서 모니터링되었다.
도 10은 듀플렉스 PCR 반응으로부터 얻은 용융 곡선 서명을 보여주고, 여기서 표적 MgPa(검정 곡선) 및 TV-Btub(회색 곡선)는 단일 채널에서 동시증폭되고 판독되었다. 실선 및 점선은 각각 10,000개의 카피 및 40개의 카피의 표적 농도를 나타낸다. 도 10의 A는 FAM 채널에서 LOCS-1 및 LOCS-2 판독을 사용하여 얻은 용융 곡선을 예시하고; 도 10의 B는 HEX 채널에서 LOC-5 및 LOCS-6 판독을 사용한 결과를 보여주고; 도 10의 C는 Texas Red 채널에서 LOCS-7 및 LOCS-8 판독을 사용한 결과를 보여주고; 도 10의 D는 Cy5 채널에서 LOCS-9 및 LOCS-10 판독을 사용한 결과를 보여준다.
도 11은 MgPa(도 11의 A), TV-Btub(도 11의 B), CTcry(도 11의 C), MgPa 및 TV-Btub 둘 다(도 11의 D), MgPa 및 CTcry 둘 다(도 11의 E) 또는 TV-Btub 및 CTcry 둘 다(도 11의 F) 유전자 표적의 10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터의 PCR 증폭 후 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. LOCS-1 및/또는 LOCS-2 및/또는 LOCS-11을 개방시켜 생성된 용융 서명은 피크를 생성하여 이 구조가 30℃ 내지 50℃의 범위의 Tm에서 용융한다는 것을 나타내는 반면, 온전한 폐쇄 LOCS는 64℃ 내지 74℃의 범위의 Tm에서 용융하였다. 각각의 시나리오에서, LOCS 용융 서명은 고유하고 다른 LOCS 용융 서명과 구별된다.
도 12는 각각의 MgPa, TV-Btub 및 CTcry 유전자 표적의 10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터의 PCR 증폭 후 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. MgPa, TV-Btub 및 CTcry 유전자 표적의 존재 하에 LOCS-1, LOCS-2 및 LOCS-11을 개방시켜 생성된 용융 서명은 30℃, 41℃ 및 49℃의 융점에서의 3개의 피크를 포함하였다. 모든 3개의 유전자 표적을 함유하는 반응은 오직 단일 유전자 표적을 함유하는 것(도 11의 A 내지 도 11의 C) 및 3개의 유전자 표적 중 2개를 함유하는 것(도 11의 D 내지 도 11의 E)으로부터 구별될 수 있다. 예를 들어, 모든 3개의 유전자 표적을 함유하는 반응은 개방 LOCS 1의 Tm(약 64℃)의 피크의 소실에 의해 TV-Btub 및 CTcry(도 11의 F)를 오직 함유하는 반응과 구별될 수 있다.
도 13은 MgPa, TV-Btub, NGopa 또는 gpd 유전자 표적 중 어느 하나의 10,000개의 카피를 함유하는 4-plex 반응으로부터의 PCR 증폭 후 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. 4개의 표적은 4개의 상이한 MNAzyme을 사용하여 특이적으로 검출되었고, 결국 이 MNAzyme은 4개의 상이한 LOCS 리포터를 절단하고 개방하였고, 이는 2개의 형광 채널에서 모니터링되었다. 각각의 LOCS 리포터는 상이한 보편적 기질을 함유하지만, 동일한 보편적 줄기(줄기-1 및 줄기-2)는 FAM 및 Texas Red 채널 둘 다에서 사용되었다. MgPa 또는 TV-Btub 유전자 중 어느 하나의 존재는 Texas Red 채널에서 신호의 증가에 의해 검출되었고; NGopa 또는 gpd 유전자 중 어느 하나의 존재는 FAM 채널에서 신호의 증가에 의해 검출되었다. Texas Red 채널에서의 MgPa 또는 TV-Btub, 및 FAM 채널에서의 NGopa 또는 gpd의 특이적 검출은 고유한 용융 곡선 서명의 존재에 기초하여 결정되었다. MgPa의 존재 하에 LOCS-7을 개방시키고 TV-Btub의 존재 하에 LOCS-8을 개방시켜 Texas Red 채널에서 생성된 용융 서명은 각각 43℃ 및 53℃의 융점에서의 피크를 포함하였다. NGopa의 존재 하에LOCS-12를 개방시키고 gpd의 존재 하에 LOCS-13을 개방시켜 FAM 채널에서 생성된 용융 서명은 각각 26℃ 및 42℃ 및 53℃의 융점에서의 피크를 포함하였다.
도 14는 Singleplex PCR 반응으로부터 얻은 용융 곡선 서명을 보여주고, 여기서 3개의 LOCS 리포터의 루프 영역의 각각은 상이한 MNAzyme에 대한 상이한 기질을 함유하지만, 모든 3개는 동일한 줄기 서열을 함유한다. 표적의 부재 하에 얻은 용융 서명(회색 선)은 각각 폐쇄된, 온전한 LOCS-2, LOCS-14 및 LOCS-15의 융점에 상응하는 74℃(도 14의 A), 75℃(도 14의 B) 및 75℃(도 14의 C)에서의 용융 피크를 보여준다. TFRC 표적(검정 선; 도 14의 A, 도 14의 B 및 도 14의 C)의 존재 하에, 개방 LOCS-2, LOCS-14 및 LOC-15 구조는 각각 49℃, 48℃ 및 49℃의 융점을 생성시켰다.
도 15는 LOCS-16(도 15의 A) 및 LOCS-17(도 15의 B)이 MNAzyme 절단에 대한 대안적인 방법으로서 닉킹 엔도뉴클레아제(Nt. AlwI)를 사용하여 2개의 상이한 표적(AF-NE-TV1 및 AF-NE-R5b)을 검출하고 확인하도록 사용될 때 얻은 용융 곡선 서명을 보여준다. 표적의 부재 하에 얻은 용융 곡선 서명(회색 선)은 각각 폐쇄된, 온전한 LOCS-16 및 LOCS-17의 용점에 상응하는 65℃ 및 76℃의 Tm에서 피크를 가졌다. 표적의 존재 하에 얻은 용융 곡선 서명(검정 선; AF-NE-TV1 및 AF-NE-R5b 각각)은 각각 절단된, 개방 LOCS-16 및 LOCS-17의 용점에 상응하는 29℃ 및 48℃의 Tm에서의 피크를 가졌다. 이 실시예로부터의 데이터는 LOCS 리포터가 닉킹 엔도뉴클레아제 효소를 사용하는 것과 같은 대안적인 표적 검출 방법과 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
도 16은 TaqMan/가수분해 신호 생성을 매개하는 것과 유사한 전략이 LOCS 프로브를 개방하도록 사용될 때 얻은 증폭 곡선(도 16의 A) 및 용융 곡선 서명(도 16의 B)을 보여주고, 즉 프로브(루프)의 표적 특이적 영역이 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 PCR 동안 분해된다. PCR 도표를 TV-btub 유전자 표적의 10,000개의 카피(검정 선) 또는 0개의 카피(회색 선)를 함유하는 반응으로부터 얻었다(도 16의 A). 표적의 부재 하에 얻은 용융 곡선 서명(회색 선)은 폐쇄된, 온전한 LOCS-18의 용점에 상응하는 61℃의 Tm에서의 용융 피크를 가졌다(도 16의 B). 표적의 존재 하에 얻은 용융 곡선 서명(검정 선)은 절단된, 개방 LOCS-18의 용점에 상응하는 40℃의 Tm에서의 용융 피크를 가졌다(도 16의 B). 이 실시예로부터의 데이터는 LOCS 리포터가 앰플리콘에 혼성화하는 프로브를 절단하도록 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 사용하는 TaqMan과 같은 대안적인 표적 검출 방법과 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
도 17은 39℃(도 17의 A) 및 72℃(도 17의 B)에서 표적 X/CTcry의 20,000개의 카피(검정 실선), 표적 Y/NGopa의 20,000개의 카피(검정 점선) 또는 표적 둘 다의 20,000개의 카피(회색 선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 PCR 증폭 도표를 예시한다. 역치 값 TX 및 TY는 각각 39℃ 및 72℃에서 얻은 증폭 도표에 표시된다. EX1, EX2, EY1 및 EY2로 지정된 종점 형광 값이 표시된다.
도 18은 39℃에서의 표적 Y/NGopa의 20,000개의 카피(도 18의 A)로, 72℃에서의 표적 Y/NGopa의 20,000개의 카피(도 18의 B)로, 72℃에서의 FAF에 의한 정규화 후 표적 Y/NGopa의 20,000개의 카피(도 18의 C)로, 39℃에서의 표적 Y/NGopa의 32개의 카피(도 18의 D)로, 72℃에서의 표적 Y/NGopa의 32개의 카피(도 18의 E)로, 72℃에서의 FAF에 의한 정규화 후 표적 Y/NGopa의 32개의 카피(도 18의 F)로, 39℃에서의 표적 Y/NGopa의 0개의 카피(도 18의 G)로, 72℃에서의 표적 Y/NGopa의 0개의 카피(도 18의 H)로, 72℃에서의 FAF에 의한 정규화 후 표적 Y/NGopa의 0개의 카피(도 18의 I)로, 표적 X/CTcry의 0개의 카피(검정 실선), 표적 X/CTcry의 32개의 카피(회색 선) 또는 표적 XCTcry 둘 다의 20,000개의 카피(검정 점선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 PCR 증폭 도표를 예시한다.
도 19는 In 표적 Y의 카피수(NGopa) - In 표적 X의 카피수(CTcry)에 대해 작도된 Cq 값에서의 상대 이동에 대한 비선형 로지스틱 회귀를 예시한다.
도 20은 gpd, gpd3 또는 porA 유전자 표적 중 어느 하나의 10,000개의 카피를 함유하는 단일 웰, 6-플렉스 반응으로부터 HEX 채널에서 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. 단일 웰을 사용하여, 6개의 표적은 2개의 형광 채널(채널당 3개의 표적)을 사용하여 특이적으로 검출되고 구별되었다. 이 표적은 6개의 상이한 MNAzyme을 사용하여 검출되었고, 이는 결국 6개의 상이한 LOCS 리포터를 절단하고 개방하였다. 도 20의 A: gpd의 존재 하의 LOCS-21(53℃, 68℃ 및 85℃), 도 20의 B: gpd3의 존재 하의 LOCS-22(30℃, 43℃, 77℃ 및 85℃), 도 20의 C: porA의 존재 하의 LOCS-23(68℃ 및 77℃), 도 20의 D: gpd 및 gpd3의 존재 하의 LOCS-21 및 LOCS-22(30℃, 43℃, 53℃ 및 85℃), 도 20의 E: gpd 및 porA의 존재 하의 LOCS-21 및 LOCS-23(53℃ 및 68℃), 도 20의 F: gpd3 및 porA의 존재 하의 LOCS-22 및 LOCS-23(30℃, 43℃, 68℃ 및 77℃).
도 21은 TV-Btub, MgPa 또는 LGV 유전자 표적 중 어느 하나의 10,000개의 카피를 함유하는 도 20의 동일한 단일 웰, 6-플렉스 반응으로부터 Texas Red 채널에서 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. 이 반응에서, 6개의 표적은 2개의 형광 채널(채널당 3개의 표적)을 사용하여 특이적으로 검출되고 구별되었다. 이 표적은 6개의 상이한 MNAzyme을 사용하여 검출되었고, 이는 결국 6개의 상이한 LOCS 리포터를 절단하고 개방하였고, 이는 HEX 및 Texas Red 채널에서 모니터링되었다. 도 21의 A: TV-Btub의 존재 하의 LOCS-24(30℃, 42℃, 66℃ 및 82℃), 도 21의 B: MgPa의 존재 하의 LOCS-25(53℃, 66℃ 및 82℃), 도 21의 C: LGV의 존재 하의 LOCS-26(68℃), 도 21의 D: TV-Btub 및 MgPa의 존재 하의 LOCS-24 및 LOCS-25(30℃, 42℃, 53℃ 및 82℃), 도 21의 E: TV-Btub 및 LGV의 존재 하의 LOCS-24 및 LOCS-26(30℃, 42℃ 및 68℃), 도 21의 F: MgPa 및 LGV의 존재 하의 LOCS-25 및 LOCS-26(30℃, 43℃, 53℃ 및 68℃)에 의해 생성된 용융 곡선 서명.
도 22는 gpd, gpd3 및 porA의 각각의 10,000개의 카피(도 22의 A) 또는 TV-Btub, MgPa 및 LGV 유전자 표적의 각각의 10,000개의 카피(도 22의 B)를 함유하는 도 20 및 도 21과 동일한 6-플렉스 반응으로부터의 PCR 증폭 후 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. 이 표적은 6개의 MNAzyme을 사용하여 검출되었고, 이는 결국 6개의 LOCS 리포터를 절단하고 개방하였고, 이는 2개의 형광 채널에서 모니터링되었다. 도 22의 A: gpd, gpd3 및 porA 유전자 표적의 존재 하에 LOCS-21, LOCS-22 및 LOCS-23에 의해 HEX 채널에 의해 생성된 용융 서명(30℃, 43℃, 53℃ 및 68℃). 도 22의 B: TV-Btub, MgPa 및 LGV의 존재 하에 LOCS-24, LOCS-25 및 LOCS-26에 의해 TEXAS RED 채널에서 생성된 용융 서명(30℃, 42℃, 53℃ 및 68℃).
도 23은 NGopa, porA, gpd, gpd3, TV-Btub, MgPa, CTcry, LGV, polA 또는 TFRC 유전자 표적 중 어느 하나의 10,000개의 카피를 함유하는 10-plex 반응으로부터의 PCR 증폭 후 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. 10개의 유전자 표적은 10개의 상이한 MNAzyme을 사용하여 특이적으로 검출되었고, 결국 이 MNAzyme은 10개의 상이한 LOCS 리포터를 절단하고 개방하였고, 이는 5개의 형광 채널(FAM, HEX, Texas Red, Cy5 및 Cy5.5)에서 모니터링되었다. FAM 채널 내의 표적의 차이가 도 23의 A에 도시되어 있다: NGopa(53℃)의 존재 하의 LOCS-15, 도 23의 B: porA(30℃ 및 76℃)의 존재 하의 LOCS-27 및 도 23의 C: NGopa 및 porA(30℃ 및 53℃) 둘 다의 존재 하의 LOCS-15 및 LOCS-27. HEX 채널 내의 표적의 차이가 도 23의 D에 도시되어 있다: gpd (53℃ 및 70℃)의 존재 하의 LOCS-21, 도 23의 E: gpd3(30℃, 43℃ 및 76℃)의 존재 하의 LOCS-22 및 도 23의 F: gpd 및 gpd3 유전자 표적(30℃, 43℃ 및 53℃) 둘 다의 존재 하의 LOCS-21 및 LOCS-22. Texas Red 채널 내의 표적의 차이가 도 23의 G에 도시되어 있다: TV-Btub(31℃, 41℃, 59℃ 및 83℃)의 존재 하의 LOCS-24, 도 23의 H: MgPa(63℃)의 존재 하의 LOCS-28 및 도 23의 I: TV-Btub 및 MgPa(31℃, 41℃ 및 63℃) 둘 다의 존재 하의 LOCS-24 및 LOCS-28. Cy5 채널 내의 표적의 차이가 도 23의 J에 도시되어 있다: CTcry(61℃ 및 79℃)존재 하의 LOCS-29, 도 23의 K: LGV(47℃ 및 80℃)의 존재 하의 LOCS-10 및 도 23의 l: CTcry 및 LVG(47℃ 및 61℃) 둘 다의 존재 하의 LOCS-29 및 LOCS-10. Cy5.5 채널 내의 표적의 차이가 도 23의 M에 도시되어 있다: polA 및 TFRC 유전자 표적(39℃ 및 59℃) 둘 다의 존재 하의 LOCS-30 및 LOCS-31 및 도 23의 N: TFRC 유전자(39℃ 및 80℃)의 존재 하의 LOCS-31.
도 24는 무 주형 대조군의 삼중반복 반응으로부터의 평균에 의해 공제된 삼중반복 반응으로부터의 형광 수준의 평균으로 표현된 40.5℃, 56.5℃ 및 78.5℃에서 측정된 TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터 JOE 채널에서 얻은 증폭 전과 증폭 후 사이의 차등적 형광 수준의 비교용 분석을 예시한다. 오류 막대는 각각의 삼중반복의 표준 편차이다.
도 25는 32℃, 40.5℃, 56.5℃ 및 65.5℃에서 측정된 TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터 JOE 채널에서 얻은 비교용 차등적 증폭 후 형광 수준을 예시한다. 값은 삼중반복 반응으로부터 평균하여 (a) 32℃ 및 40.5℃; (b) 40.5℃ 및 56.5℃; 및 (c) 56.5℃ 및 65℃ 사이의 차등적 형광 수준으로 표현되었다. 오류 막대는 각각의 삼중반복의 표준 편차이다.
도 26은 39.5℃, 56.5℃ 및 65.5℃에서 측정된 TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터 JOE 채널에서 얻은 차등적 증폭 전 형광 수준 및 증폭 후 형광 수준의 비교용 분석을 예시한다. 값은 삼중반복 반응으로부터 평균하여 (i) 39.5℃에서의 증폭 전 형광 수준 및 증폭 후 형광 수준 사이의 차이, (ii) 39.5℃에서의 증폭 전 형광 수준 및 증폭 후 형광 수준의 차이와 56.5℃에서의 증폭 전 형광 수준 및 증폭 후 형광 수준의 차이 사이의 차이 및 (iii) 56.5℃에서의 증폭 전 형광 수준 및 증폭 후 형광 수준의 차이와 65.5℃에서의 증폭 전 형광 수준 및 증폭 후 형광 수준의 차이 사이의 차이로서 표현되었다. 오류 막대는 각각의 삼중반복의 표준 편차이다.
도 27은 삼중반복 반응으로부터 평균하여 TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터 JOE 채널에서 얻은 40℃, 51℃ 및 65℃에서의 비교용 용융 피크 높이를 예시한다. 오류 막대는 각각의 삼중반복의 표준 편차이다.
도 1: 예시적인 LOCS 리포터 및 온전한 폐쇄된, 잠금 형태, 및 절단된 또는 분해된 개방 형태의 이의 융점(Tm)이 예시되어 있다. 예시적인 온전한(폐쇄된) LOCS(도 1의 A, LHS)는 루프 영역, 줄기 영역 및 형광단(F) 켄쳐 (Q) 염료 쌍을 갖는다. 루프 영역의 절단 또는 분해는 개방 LOCS 리포터 구조를 생성할 수 있다(도 1의 A RHS). 온전한 LOCS의 줄기 영역의 융점(Tm)은 개방 LOCS 구조에서의 줄기 영역의 Tm보다 높다. 그러므로 LOCS A의 줄기 A는 Tm 1에서 분리되거나 용융할 것이다. 이는 개방 LOCS 줄기 A'가 용융하는 온도인 Tm 2보다 높다(도 1의 B). 유사하게, 온전한 LOCS B의 줄기 B의 Tm은 Tm 3에서 용융할 것이다. 이는 개방 LOCS 줄기 B'가 용융하는 온도인 Tm 4보다 높다(도 1의 B). 개방 LOCS 구조의 Tm에 상응하는 온도에서의 음성 피크의 존재는 특이적 LOCS의 개방을 유도하는 표적의 존재를 나타낸다. 각각의 특정 개방된 LOCS 내의 각각의 줄기가 구별되는 온도에서 용융하므로, 동일한 형광단으로 표지화된 다수의 LOCS는 단일 반응에서 동시에 분석될 수 있다.
도 2는 보편적이고 임의의 표적을 검출하도록 사용될 수 있는 LOCS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 표적의 검출을 위한 예시적인 전략을 예시한다. 이 반응식에서 LOCS 올리고뉴클레오타이드는 줄기 영역, 형광단 켄쳐 염료 쌍 및 루프 영역을 함유한다. 루프 영역은 PlexZyme으로도 공지된 MNAzyme과 같은 촉매 핵산에 대한 보편적 기질을 포함한다. 성분 파트자임(partzyme)의 표적 센서 아암이 표적에 인접하게 정렬할 때 MNAzyme이 형성된다. LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역은 MNAzyme의 기질 결합 아암에 결합하고, 루프 내의 기질은 MNAzyme에 의해 절단되고, 형광 신호가 생성된다. 반응은 냉각될 수 있어서 개방된 LOCS의 줄기 영역이 재어닐링하게 하고, 반응은 이후 용융 곡선 분석으로 처리될 수 있고, 이에 의해 반응이 가열되면서 형광이 모니터링된다. 개방 LOCS의 Tm에 상응하는 용융 피크의 존재는 MNAzyme을 조립하는 표적의 존재를 나타낸다. 표적은 직접 검출될 수 있거나, 표적 증폭 프로토콜에 의해 생성된 표적 앰플리콘이 검출될 수 있다.
도 3은 표적에 특이적인 LOCS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 표적의 검출을 위한 예시적인 전략을 예시한다. LOCS 올리고뉴클레오타이드는 줄기 영역, 형광단 켄쳐 염료 쌍 및 표적 앰플리콘에 상보성 영역을 포함하는 루프 영역을 함유한다. 도 3의 A에 예시된 반응식에서, LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역은 증폭 동안 표적 앰플리콘에 결합한다. 프라이머의 연장 동안, 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성은 루프 영역을 분해하여 실시간으로 형광 신호를 생성하지만, 줄기 영역이 온전하게 한다. 줄기 영역은 이의 표적이 아니라 서로에 상보성이다. 증폭 후에, 분해된, 개방 LOCS 구조의 줄기가 재어닐링하도록 반응이 냉각될 수 있다. 후속하는 용융 곡선 분석은 개방 LOCS로부터 유래된 줄기 영역이 용융하고 형광을 생성하는 온도를 측정하도록 수행될 수 있다. 도 3의 B에 예시된 반응식에서, LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역은 표적 앰플리콘에 상보성인 영역을 포함하고, 제한 효소, 예를 들어 닉킹 효소에 대한 인식 부위를 추가로 함유한다. LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역은 표적에 결합하고, 닉킹 효소는 루프 영역을 절단하여, 표적 분자를 온전하게 둔다. 이는 LOCS를 개방하고 형광 신호를 생성한다. 반응은 이후 절단된, 개방 LOCS 구조의 줄기가 재어닐링할 수 있도록 냉각될 수 있고; 이후 용융 곡선 분석은 개방 LOCS로부터 유래된 줄기 영역이 용융하는 온도를 측정하도록 수행될 수 있다. 전략은 표적 서열을 직접 검출하도록 사용될 수 있거나, 표적 증폭 방법과 조합될 때 표적 앰플리콘을 검출할 수 있다.
도 4는 표적 MgPa(도 4의 A), 또는 TV-Btub(도 4의 C) 또는 MgPa 및 TV-Btub 둘 다(도 4의 E)의 10,000개의 카피(검정 선), 40개의 카피(회색 선) 또는 0개의 카피(점선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 PCR 증폭 도표를 예시한다. 10,000개의 카피(검정 선) 및 40개의 카피(회색 선)를 함유하는 반응으로부터 증폭 후 얻은 용융 곡선 서명은 표적 MgPa(도 4의 B), TV-Btub(도 4의 D) 또는 MgPa 및 TV-Btub 둘 다(도 4의 F)에 도시되어 있다. MgPa 유전자 표적의 존재 하에 LOCS-1을 개방시켜 생성된 용융 서명은 35℃ 및 41℃의 융점에서의 피크를 포함하고; TV-Btub 유전자 표적의 존재 하에 LOCS-2를 개방시켜 생성된 용융 서명은 50℃의 융점에 상응하는 피크를 포함하지만; MgPa 및 TV-Btub 유전자 표적 둘 다의 존재 하에 LOCS-1 및 LOCS-2 둘 다를 개방시켜 생성된 용융 서명은 35℃, 41℃ 및 50℃의 융점에서 3개의 피크를 포함하였다. MgPa의 존재 하의 LOCS 용융 서명(Tm = 35℃ 및 41℃)은 TV-Btub 유전자 표적의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명(Tm = 50℃)과 구별된다. 추가로, MgPa 및 TV-Btub 유전자 표적 둘 다의 존재 하의 LOCS 용융 서명은 상기 언급된 용융 서명(Tm = 35℃, 41℃ 및 50℃)과 구별되는데, 오직 단일 유전자 표적이 존재하고, 이는 표적 둘 다가 검출되었다는 것을 나타낸다.
도 5(상부 패널)는 MgPa(도 5의 A1), HMPV(도 5의 B1) 및 CT-ompA(도 5의 C1) 유전자 표적의 10,000개의 카피(검정 선), 40개의 카피(회색 선) 또는 0개의 카피(점선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 PCR 증폭 도표를 예시한다. 하부 패널에 도시된 결과는 MgPa(도 5의 A2), HMPV(도 5의 B2) 및 CT-ompA(도 5의 C2) 유전자 표적의 10,000개의 카피(검정 선) 및 40개의 카피(회색 선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 용융 곡선 서명이다. 3개의 표적은 3개의 상이한 MNAzyme을 사용하여 특이적으로 검출되었고; 이들의 각각은 동일한 기질 결합 아암이고, 표적 결합 아암만이 상이하다. 각각의 MNAzyme은 보편적 기질 및 보편적 줄기를 포함하는 동일한 보편적 LOCS-1 올리고뉴클레오타이드를 개방하였다. 각각의 표적은 보편적 줄기의 Tm에 상응하는 40℃에서의 피크를 갖는 용융 곡선 서명을 생성하였다.
도 6(상부 패널)은 TV-Btub(도 6의 A1), VZV(도 6의 B1) 및 rpoB(도 6의 C1) 표적의 10,000개의 카피(검정 선), 40개의 카피(회색 선) 또는 0개의 카피(점선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 PCR 증폭 도표를 예시한다. 하부 패널에 도시된 결과는 TV-Btub(도 6의 A2), VZV(도 6의 B2) 및 rpoB(도 6의 C2) 표적의 10,000개의 카피(검정 선) 및 40개의 카피(회색 선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 용융 곡선 서명이다. 3개의 표적은 3개의 상이한 MNAzyme에 의해 특이적으로 검출되었고; 이들의 각각은 동일한 기질 결합 아암이고, 표적 결합 아암만이 상이하다. 각각의 MNAzyme은 보편적 기질 및 보편적 줄기를 포함하는 동일한 보편적 LOCS-2를 개방하였다. 각각의 표적은 LOCS-2 내에 보편적 줄기의 Tm에 상응하는 50℃에서의 피크를 갖는 용융 곡선 서명을 생성하였다.
도 7은 LOCS-1(도 7의 A), LOCS-2(도 7의 B), LOCS-3(도 7의 C) 및 LOCS-4(도 7의 D)가 표적 CT-Cds(도 7의 A 및 도 7의 C) 또는 TFRC(도 7의 B 및 도 7의 D)의 증폭을 모니터링하도록 사용될 때 얻은 용융 곡선 서명을 보여준다. 표적의 부재 하에 얻은 용융 곡선 서명(점선)은 각각 폐쇄된, 온전한 LOCS-1, LOCS-2, LOCS-3 및 LOCS-4의 용점에 상응하는 65℃, 77℃, 66℃ 및 67℃의 Tm에서의 피크를 가졌다. CT-Cds 표적(검정 선; 도 7의 A 및 도 7의 C)의 존재 하에, 개방 LOCS-1 및 LOC-3 구조는 각각 30℃ 및 36℃의 융점을 생성시켰다. TFRC 표적(검정 선; 도 7의 B 및 도 7의 D)의 존재 하에, 개방 LOCS-2 및 LOC-4 구조는 각각 50℃ 및 32℃의 융점을 생성시켰다.
도 8은 BioRad® CFX96 유전자증폭기(도 8의 A) 또는 ABI 7500(도 8의 B) 또는 Light Cycler 480(패널 C), 또는 XXpress PCR(도 8의 D)에서 수행될 때 MgPa 표적의 증폭에 얻은 용융 곡선을 보여준다. 표적 둘 다는 모든 기계에서 FAM 채널에서 모니터링되었다.
도 9는 BioRad® CFX96 유전자증폭기(도 9의 A) 또는 ABI 7500(도 9의 B) 또는 Lightcycler 480(도 9의 C), 또는 XXpress PCR(도 9의 D)에서 수행될 때 TV-Btub 표적의 증폭에 얻은 용융 곡선을 보여준다. 표적 둘 다는 모든 기계에서 FAM 채널에서 모니터링되었다.
도 10은 듀플렉스 PCR 반응으로부터 얻은 용융 곡선 서명을 보여주고, 여기서 표적 MgPa(검정 곡선) 및 TV-Btub(회색 곡선)는 단일 채널에서 동시증폭되고 판독되었다. 실선 및 점선은 각각 10,000개의 카피 및 40개의 카피의 표적 농도를 나타낸다. 도 10의 A는 FAM 채널에서 LOCS-1 및 LOCS-2 판독을 사용하여 얻은 용융 곡선을 예시하고; 도 10의 B는 HEX 채널에서 LOC-5 및 LOCS-6 판독을 사용한 결과를 보여주고; 도 10의 C는 Texas Red 채널에서 LOCS-7 및 LOCS-8 판독을 사용한 결과를 보여주고; 도 10의 D는 Cy5 채널에서 LOCS-9 및 LOCS-10 판독을 사용한 결과를 보여준다.
도 11은 MgPa(도 11의 A), TV-Btub(도 11의 B), CTcry(도 11의 C), MgPa 및 TV-Btub 둘 다(도 11의 D), MgPa 및 CTcry 둘 다(도 11의 E) 또는 TV-Btub 및 CTcry 둘 다(도 11의 F) 유전자 표적의 10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터의 PCR 증폭 후 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. LOCS-1 및/또는 LOCS-2 및/또는 LOCS-11을 개방시켜 생성된 용융 서명은 피크를 생성하여 이 구조가 30℃ 내지 50℃의 범위의 Tm에서 용융한다는 것을 나타내는 반면, 온전한 폐쇄 LOCS는 64℃ 내지 74℃의 범위의 Tm에서 용융하였다. 각각의 시나리오에서, LOCS 용융 서명은 고유하고 다른 LOCS 용융 서명과 구별된다.
도 12는 각각의 MgPa, TV-Btub 및 CTcry 유전자 표적의 10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터의 PCR 증폭 후 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. MgPa, TV-Btub 및 CTcry 유전자 표적의 존재 하에 LOCS-1, LOCS-2 및 LOCS-11을 개방시켜 생성된 용융 서명은 30℃, 41℃ 및 49℃의 융점에서의 3개의 피크를 포함하였다. 모든 3개의 유전자 표적을 함유하는 반응은 오직 단일 유전자 표적을 함유하는 것(도 11의 A 내지 도 11의 C) 및 3개의 유전자 표적 중 2개를 함유하는 것(도 11의 D 내지 도 11의 E)으로부터 구별될 수 있다. 예를 들어, 모든 3개의 유전자 표적을 함유하는 반응은 개방 LOCS 1의 Tm(약 64℃)의 피크의 소실에 의해 TV-Btub 및 CTcry(도 11의 F)를 오직 함유하는 반응과 구별될 수 있다.
도 13은 MgPa, TV-Btub, NGopa 또는 gpd 유전자 표적 중 어느 하나의 10,000개의 카피를 함유하는 4-plex 반응으로부터의 PCR 증폭 후 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. 4개의 표적은 4개의 상이한 MNAzyme을 사용하여 특이적으로 검출되었고, 결국 이 MNAzyme은 4개의 상이한 LOCS 리포터를 절단하고 개방하였고, 이는 2개의 형광 채널에서 모니터링되었다. 각각의 LOCS 리포터는 상이한 보편적 기질을 함유하지만, 동일한 보편적 줄기(줄기-1 및 줄기-2)는 FAM 및 Texas Red 채널 둘 다에서 사용되었다. MgPa 또는 TV-Btub 유전자 중 어느 하나의 존재는 Texas Red 채널에서 신호의 증가에 의해 검출되었고; NGopa 또는 gpd 유전자 중 어느 하나의 존재는 FAM 채널에서 신호의 증가에 의해 검출되었다. Texas Red 채널에서의 MgPa 또는 TV-Btub, 및 FAM 채널에서의 NGopa 또는 gpd의 특이적 검출은 고유한 용융 곡선 서명의 존재에 기초하여 결정되었다. MgPa의 존재 하에 LOCS-7을 개방시키고 TV-Btub의 존재 하에 LOCS-8을 개방시켜 Texas Red 채널에서 생성된 용융 서명은 각각 43℃ 및 53℃의 융점에서의 피크를 포함하였다. NGopa의 존재 하에LOCS-12를 개방시키고 gpd의 존재 하에 LOCS-13을 개방시켜 FAM 채널에서 생성된 용융 서명은 각각 26℃ 및 42℃ 및 53℃의 융점에서의 피크를 포함하였다.
도 14는 Singleplex PCR 반응으로부터 얻은 용융 곡선 서명을 보여주고, 여기서 3개의 LOCS 리포터의 루프 영역의 각각은 상이한 MNAzyme에 대한 상이한 기질을 함유하지만, 모든 3개는 동일한 줄기 서열을 함유한다. 표적의 부재 하에 얻은 용융 서명(회색 선)은 각각 폐쇄된, 온전한 LOCS-2, LOCS-14 및 LOCS-15의 융점에 상응하는 74℃(도 14의 A), 75℃(도 14의 B) 및 75℃(도 14의 C)에서의 용융 피크를 보여준다. TFRC 표적(검정 선; 도 14의 A, 도 14의 B 및 도 14의 C)의 존재 하에, 개방 LOCS-2, LOCS-14 및 LOC-15 구조는 각각 49℃, 48℃ 및 49℃의 융점을 생성시켰다.
도 15는 LOCS-16(도 15의 A) 및 LOCS-17(도 15의 B)이 MNAzyme 절단에 대한 대안적인 방법으로서 닉킹 엔도뉴클레아제(Nt. AlwI)를 사용하여 2개의 상이한 표적(AF-NE-TV1 및 AF-NE-R5b)을 검출하고 확인하도록 사용될 때 얻은 용융 곡선 서명을 보여준다. 표적의 부재 하에 얻은 용융 곡선 서명(회색 선)은 각각 폐쇄된, 온전한 LOCS-16 및 LOCS-17의 용점에 상응하는 65℃ 및 76℃의 Tm에서 피크를 가졌다. 표적의 존재 하에 얻은 용융 곡선 서명(검정 선; AF-NE-TV1 및 AF-NE-R5b 각각)은 각각 절단된, 개방 LOCS-16 및 LOCS-17의 용점에 상응하는 29℃ 및 48℃의 Tm에서의 피크를 가졌다. 이 실시예로부터의 데이터는 LOCS 리포터가 닉킹 엔도뉴클레아제 효소를 사용하는 것과 같은 대안적인 표적 검출 방법과 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
도 16은 TaqMan/가수분해 신호 생성을 매개하는 것과 유사한 전략이 LOCS 프로브를 개방하도록 사용될 때 얻은 증폭 곡선(도 16의 A) 및 용융 곡선 서명(도 16의 B)을 보여주고, 즉 프로브(루프)의 표적 특이적 영역이 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성에 의해 PCR 동안 분해된다. PCR 도표를 TV-btub 유전자 표적의 10,000개의 카피(검정 선) 또는 0개의 카피(회색 선)를 함유하는 반응으로부터 얻었다(도 16의 A). 표적의 부재 하에 얻은 용융 곡선 서명(회색 선)은 폐쇄된, 온전한 LOCS-18의 용점에 상응하는 61℃의 Tm에서의 용융 피크를 가졌다(도 16의 B). 표적의 존재 하에 얻은 용융 곡선 서명(검정 선)은 절단된, 개방 LOCS-18의 용점에 상응하는 40℃의 Tm에서의 용융 피크를 가졌다(도 16의 B). 이 실시예로부터의 데이터는 LOCS 리포터가 앰플리콘에 혼성화하는 프로브를 절단하도록 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 효소를 사용하는 TaqMan과 같은 대안적인 표적 검출 방법과 사용될 수 있다는 것을 입증한다.
도 17은 39℃(도 17의 A) 및 72℃(도 17의 B)에서 표적 X/CTcry의 20,000개의 카피(검정 실선), 표적 Y/NGopa의 20,000개의 카피(검정 점선) 또는 표적 둘 다의 20,000개의 카피(회색 선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 PCR 증폭 도표를 예시한다. 역치 값 TX 및 TY는 각각 39℃ 및 72℃에서 얻은 증폭 도표에 표시된다. EX1, EX2, EY1 및 EY2로 지정된 종점 형광 값이 표시된다.
도 18은 39℃에서의 표적 Y/NGopa의 20,000개의 카피(도 18의 A)로, 72℃에서의 표적 Y/NGopa의 20,000개의 카피(도 18의 B)로, 72℃에서의 FAF에 의한 정규화 후 표적 Y/NGopa의 20,000개의 카피(도 18의 C)로, 39℃에서의 표적 Y/NGopa의 32개의 카피(도 18의 D)로, 72℃에서의 표적 Y/NGopa의 32개의 카피(도 18의 E)로, 72℃에서의 FAF에 의한 정규화 후 표적 Y/NGopa의 32개의 카피(도 18의 F)로, 39℃에서의 표적 Y/NGopa의 0개의 카피(도 18의 G)로, 72℃에서의 표적 Y/NGopa의 0개의 카피(도 18의 H)로, 72℃에서의 FAF에 의한 정규화 후 표적 Y/NGopa의 0개의 카피(도 18의 I)로, 표적 X/CTcry의 0개의 카피(검정 실선), 표적 X/CTcry의 32개의 카피(회색 선) 또는 표적 XCTcry 둘 다의 20,000개의 카피(검정 점선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 PCR 증폭 도표를 예시한다.
도 19는 In 표적 Y의 카피수(NGopa) - In 표적 X의 카피수(CTcry)에 대해 작도된 Cq 값에서의 상대 이동에 대한 비선형 로지스틱 회귀를 예시한다.
도 20은 gpd, gpd3 또는 porA 유전자 표적 중 어느 하나의 10,000개의 카피를 함유하는 단일 웰, 6-플렉스 반응으로부터 HEX 채널에서 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. 단일 웰을 사용하여, 6개의 표적은 2개의 형광 채널(채널당 3개의 표적)을 사용하여 특이적으로 검출되고 구별되었다. 이 표적은 6개의 상이한 MNAzyme을 사용하여 검출되었고, 이는 결국 6개의 상이한 LOCS 리포터를 절단하고 개방하였다. 도 20의 A: gpd의 존재 하의 LOCS-21(53℃, 68℃ 및 85℃), 도 20의 B: gpd3의 존재 하의 LOCS-22(30℃, 43℃, 77℃ 및 85℃), 도 20의 C: porA의 존재 하의 LOCS-23(68℃ 및 77℃), 도 20의 D: gpd 및 gpd3의 존재 하의 LOCS-21 및 LOCS-22(30℃, 43℃, 53℃ 및 85℃), 도 20의 E: gpd 및 porA의 존재 하의 LOCS-21 및 LOCS-23(53℃ 및 68℃), 도 20의 F: gpd3 및 porA의 존재 하의 LOCS-22 및 LOCS-23(30℃, 43℃, 68℃ 및 77℃).
도 21은 TV-Btub, MgPa 또는 LGV 유전자 표적 중 어느 하나의 10,000개의 카피를 함유하는 도 20의 동일한 단일 웰, 6-플렉스 반응으로부터 Texas Red 채널에서 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. 이 반응에서, 6개의 표적은 2개의 형광 채널(채널당 3개의 표적)을 사용하여 특이적으로 검출되고 구별되었다. 이 표적은 6개의 상이한 MNAzyme을 사용하여 검출되었고, 이는 결국 6개의 상이한 LOCS 리포터를 절단하고 개방하였고, 이는 HEX 및 Texas Red 채널에서 모니터링되었다. 도 21의 A: TV-Btub의 존재 하의 LOCS-24(30℃, 42℃, 66℃ 및 82℃), 도 21의 B: MgPa의 존재 하의 LOCS-25(53℃, 66℃ 및 82℃), 도 21의 C: LGV의 존재 하의 LOCS-26(68℃), 도 21의 D: TV-Btub 및 MgPa의 존재 하의 LOCS-24 및 LOCS-25(30℃, 42℃, 53℃ 및 82℃), 도 21의 E: TV-Btub 및 LGV의 존재 하의 LOCS-24 및 LOCS-26(30℃, 42℃ 및 68℃), 도 21의 F: MgPa 및 LGV의 존재 하의 LOCS-25 및 LOCS-26(30℃, 43℃, 53℃ 및 68℃)에 의해 생성된 용융 곡선 서명.
도 22는 gpd, gpd3 및 porA의 각각의 10,000개의 카피(도 22의 A) 또는 TV-Btub, MgPa 및 LGV 유전자 표적의 각각의 10,000개의 카피(도 22의 B)를 함유하는 도 20 및 도 21과 동일한 6-플렉스 반응으로부터의 PCR 증폭 후 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. 이 표적은 6개의 MNAzyme을 사용하여 검출되었고, 이는 결국 6개의 LOCS 리포터를 절단하고 개방하였고, 이는 2개의 형광 채널에서 모니터링되었다. 도 22의 A: gpd, gpd3 및 porA 유전자 표적의 존재 하에 LOCS-21, LOCS-22 및 LOCS-23에 의해 HEX 채널에 의해 생성된 용융 서명(30℃, 43℃, 53℃ 및 68℃). 도 22의 B: TV-Btub, MgPa 및 LGV의 존재 하에 LOCS-24, LOCS-25 및 LOCS-26에 의해 TEXAS RED 채널에서 생성된 용융 서명(30℃, 42℃, 53℃ 및 68℃).
도 23은 NGopa, porA, gpd, gpd3, TV-Btub, MgPa, CTcry, LGV, polA 또는 TFRC 유전자 표적 중 어느 하나의 10,000개의 카피를 함유하는 10-plex 반응으로부터의 PCR 증폭 후 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. 10개의 유전자 표적은 10개의 상이한 MNAzyme을 사용하여 특이적으로 검출되었고, 결국 이 MNAzyme은 10개의 상이한 LOCS 리포터를 절단하고 개방하였고, 이는 5개의 형광 채널(FAM, HEX, Texas Red, Cy5 및 Cy5.5)에서 모니터링되었다. FAM 채널 내의 표적의 차이가 도 23의 A에 도시되어 있다: NGopa(53℃)의 존재 하의 LOCS-15, 도 23의 B: porA(30℃ 및 76℃)의 존재 하의 LOCS-27 및 도 23의 C: NGopa 및 porA(30℃ 및 53℃) 둘 다의 존재 하의 LOCS-15 및 LOCS-27. HEX 채널 내의 표적의 차이가 도 23의 D에 도시되어 있다: gpd (53℃ 및 70℃)의 존재 하의 LOCS-21, 도 23의 E: gpd3(30℃, 43℃ 및 76℃)의 존재 하의 LOCS-22 및 도 23의 F: gpd 및 gpd3 유전자 표적(30℃, 43℃ 및 53℃) 둘 다의 존재 하의 LOCS-21 및 LOCS-22. Texas Red 채널 내의 표적의 차이가 도 23의 G에 도시되어 있다: TV-Btub(31℃, 41℃, 59℃ 및 83℃)의 존재 하의 LOCS-24, 도 23의 H: MgPa(63℃)의 존재 하의 LOCS-28 및 도 23의 I: TV-Btub 및 MgPa(31℃, 41℃ 및 63℃) 둘 다의 존재 하의 LOCS-24 및 LOCS-28. Cy5 채널 내의 표적의 차이가 도 23의 J에 도시되어 있다: CTcry(61℃ 및 79℃)존재 하의 LOCS-29, 도 23의 K: LGV(47℃ 및 80℃)의 존재 하의 LOCS-10 및 도 23의 l: CTcry 및 LVG(47℃ 및 61℃) 둘 다의 존재 하의 LOCS-29 및 LOCS-10. Cy5.5 채널 내의 표적의 차이가 도 23의 M에 도시되어 있다: polA 및 TFRC 유전자 표적(39℃ 및 59℃) 둘 다의 존재 하의 LOCS-30 및 LOCS-31 및 도 23의 N: TFRC 유전자(39℃ 및 80℃)의 존재 하의 LOCS-31.
도 24는 무 주형 대조군의 삼중반복 반응으로부터의 평균에 의해 공제된 삼중반복 반응으로부터의 형광 수준의 평균으로 표현된 40.5℃, 56.5℃ 및 78.5℃에서 측정된 TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터 JOE 채널에서 얻은 증폭 전과 증폭 후 사이의 차등적 형광 수준의 비교용 분석을 예시한다. 오류 막대는 각각의 삼중반복의 표준 편차이다.
도 25는 32℃, 40.5℃, 56.5℃ 및 65.5℃에서 측정된 TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터 JOE 채널에서 얻은 비교용 차등적 증폭 후 형광 수준을 예시한다. 값은 삼중반복 반응으로부터 평균하여 (a) 32℃ 및 40.5℃; (b) 40.5℃ 및 56.5℃; 및 (c) 56.5℃ 및 65℃ 사이의 차등적 형광 수준으로 표현되었다. 오류 막대는 각각의 삼중반복의 표준 편차이다.
도 26은 39.5℃, 56.5℃ 및 65.5℃에서 측정된 TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터 JOE 채널에서 얻은 차등적 증폭 전 형광 수준 및 증폭 후 형광 수준의 비교용 분석을 예시한다. 값은 삼중반복 반응으로부터 평균하여 (i) 39.5℃에서의 증폭 전 형광 수준 및 증폭 후 형광 수준 사이의 차이, (ii) 39.5℃에서의 증폭 전 형광 수준 및 증폭 후 형광 수준의 차이와 56.5℃에서의 증폭 전 형광 수준 및 증폭 후 형광 수준의 차이 사이의 차이 및 (iii) 56.5℃에서의 증폭 전 형광 수준 및 증폭 후 형광 수준의 차이와 65.5℃에서의 증폭 전 형광 수준 및 증폭 후 형광 수준의 차이 사이의 차이로서 표현되었다. 오류 막대는 각각의 삼중반복의 표준 편차이다.
도 27은 삼중반복 반응으로부터 평균하여 TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터 JOE 채널에서 얻은 40℃, 51℃ 및 65℃에서의 비교용 용융 피크 높이를 예시한다. 오류 막대는 각각의 삼중반복의 표준 편차이다.
정의
본 출원에 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 명확히 달리 기술하지 않는 한 복수 지시어를 포함한다. 예를 들어, 구절 "폴리뉴클레오타이드"는 또한 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 "함유하는"을 의미한다. "포함한다" 및 "포함한"과 같은 단어 "포함하는"의 변형이 상응하게 변하는 의미를 갖는다. 따라서, 예를 들어 뉴클레오타이드의 서열을 "포함하는" 폴리뉴클레오타이드는 배타적으로 뉴클레오타이드의 그 서열로 이루어질 수 있거나 하나 이상의 추가의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "복수"는 하나 초과를 의미한다. 소정의 구체적인 양태 또는 실시형태에서, 복수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 또는 초과, 및 이것 내 도출 가능한 임의의 정수, 및 이것 내 도출 가능한 임의의 범위를 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 소, 말, 양, 영장류, 조류 및 설치류 종을 포함하는 경제적, 사회적 또는 조사 중요성의 임의의 동물을 포함한다. 그러므로, "대상체"는 예를 들어 인간 또는 비인간 포유류와 같은 포유류일 수 있다. 비제한적인 예로서, 박테리아, 바이러스, 진균/효모, 원생생물 및 선충을 포함하는 미생물 대상체가 또한 포함된다. 본 발명에 따른 "대상체"는 또한 프리온과 같은 감염성 물질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 비제한적인 예로서 DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, 상보성 DNA(cDNA), RNA, 메틸화 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pre- 및 pri-마이크로RNA, 다른 비암호화 RNA, 리보솜 RNA, 이들의 유도체, 이들의 앰플리콘 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 염기의 단일 가닥 또는 이중 가닥 중합체, 또는 이의 유사체, 유도체, 변이체, 단편 또는 조합을 지칭한다. 비제한적인 예로서, 핵산의 공급원은 합성, 포유류, 인간, 동물, 식물, 진균, 박테리아, 바이러스, 고세균 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산" "올리고뉴클레오타이드"는 달리 표시되지 않는 한 임의의 기재된 서열, 및 이에 상보성인 서열에 대한 지칭을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표적"은 본 발명의 방법이 검출하도록 사용될 수 있는 샘플에 존재하는 임의의 분자 또는 분석물질을 지칭한다. 용어 "표적"은 핵산 표적, 및 예를 들어 단백질, 펩타이드, 분석물질, 리간드 및 이온(예를 들어, 금속 이온)과 같은 비핵산 표적을 포함하도록 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 DNA의 분절 또는 DNA-함유 핵산 분자, 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자, 또는 이들의 조합을 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드의 예는 핵산 표적; 기질, 예를 들어 MNAzyme에 의해 변형될 수 있는 것; 프라이머, 예컨대 PCR과 같은 방법에 의한 시험관내 표적 증폭에 사용된 것; 및 MNAzyme의 성분을 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 달리 표시되지 않는 한 임의의 기재된 서열, 및 이에 상보성인 서열에 대한 지칭을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드는 비제한적인 예로서 4-아세틸시티딘, 5-(카복시하이드록실메틸)우리딘, 2'-O-메틸시티딘, 5-카복시메틸아미노메틸 티오우리딘, 디하이드로우리딘, 2'-O-메틸슈도우리딘, 베타 D-갈락토실쿠에오신, 2'-O-메틸구아노신, 이노신, N6-이소펜테닐아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 베타 D-만노실메틸우리딘, 5-메톡시카보닐메틸우리딘, 5-메톡시우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, N-((9-베타-리보푸라노실-2-메틸티오퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, N-((9-베타-리보푸라노실퓨린-6-일)N-메틸-카바모일)트레오닌, 우리딘-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우리딘-5-옥시아세트산(v), 위부톡소신, 슈도우리딘, 쿠에오신, 2-티오시티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, N-((9-베타-D-리보푸라노실퓨린-6-일)카바모일)트레오닌, 2'-O-메틸-5-메틸우리딘, 2'-O-메틸우리딘, 위부토신, 3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘, 베타 D-아라비노실 우리딘, 베타 D-아라비노실 티미딘을 포함하는 군을 포함하는 적어도 하나의 부가 또는 치환을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보성인", "상보성", "일치" 및 "일치된"은 Watson-Crick 염기-페어링 또는 우블 염기 페어링을 통해 서로에 혼성화하는 뉴클레오타이드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 또는 이들의 조합)의 능력을 지칭한다. 결합은 아데닌(A) 염기와 우라실 (U) 염기 사이, 아데닌 (A) 염기와 티민(T) 염기 사이, 사이토신(C) 염기와 구아닌 (G) 염기 사이의 Watson-Crick 염기-페어링을 통해 형성될 수 있다. 우블 염기 쌍은 폴리뉴클레오타이드 듀플렉스(예를 들어, 구아닌-우라실, 이노신-우라실, 이노신-아데닌, 및 이노신-사이토신)에서 2개의 뉴클레오타이드 사이에 비-Watson-Crick 염기 페어링이다. "상보성"이라 불리거나 서로의 "보체"인 뉴클레오타이드는 Watson-Crick 염기 페어링 또는 이들의 각각의 염기 사이의 우블 염기 페어링에 의해 함께 혼성화하는 능력을 갖는 뉴클레오타이드이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "비상보성", "상보성이 아닌", "미스매치" 및 "미스매치된"은 Watson-Crick 염기 페어링 또는 이들의 각각의 염기 사이의 우블 염기 페어링 중 어느 하나에 의해 함께 혼성화하는 능력이 결여된 뉴클레오타이드(예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 및 이들의 조합)를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "효소"는 화학 반응(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드의 증폭, 폴리뉴클레오타이드의 절단 등)을 촉매화할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 효소의 비제한적인 예는 핵산 효소 및 단백질 효소를 포함한다. 적합한 핵산 효소의 비제한적인 예는 RNAzyme, MNAzyme 및 DNAzyme을 포함한다. 적합한 단백질 효소의 비제한적인 예는 엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제를 포함한다. 효소는 일반적으로 본원에 기재된 방법 중 하나 이상의 실행을 돕는 촉매 활성을 제공할 것이다. 비제한적인 예로서, 엑소뉴클레아제 활성은 예를 들어 중합효소의 고유 촉매 활성일 수 있다. 비제한적인 예로서, 엔도뉴클레아제 활성은 예를 들어 닉킹 엔도뉴클레아제, 리보엔도뉴클레아제 또는 듀플렉스 특이적 뉴클레아제(DSN)를 포함하는 제한 효소의 고유한 촉매 활성일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "앰플리콘"은 비제한적인 예로서 PCR, RT-PCR, SDA, HDA, RPA, LAMP, RCA, TMA, 3SR 또는 NASBA를 포함하는 자연 또는 인공 핵산 증폭 또는 복제 사건의 산물인 핵산(예를 들어, DNA 또는 RNA, 또는 이들의 조합)을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "줄기-루프 올리고뉴클레오타이드"는 단일 가닥 루프 성분에 연결된 이중 가닥 줄기 성분을 포함하거나 이것으로 이루어진 DNA 또는 DNA-함유 분자, 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자, 또는 이들의 조합(즉, DNA-RNA 하이브리드 분자 또는 복합체)을 의미하도록 이해될 것이다. 이중 가닥 줄기 성분은 상보성 역방향 가닥에 대한 상보성 염기 페어링에 의해 혼성화된 정방향 가닥을 포함하고, 정방향 가닥의 3' 뉴클레오타이드는 단일 가닥 루프 성분의 5' 뉴클레오타이드에 연결되고, 역방향 가닥의 5' 뉴클레오타이드는 단일 가닥 루프 성분의 3' 뉴클레오타이드에 연결된다. 이중 가닥 줄기 성분은 하나의 가닥(예를 들어, 정방향 가닥)에서 하나 이상의 형광단, 및 반대의 가닥(예를 들어, 역방향 가닥)에서 하나 이상의 켄쳐를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "LOCS 올리고뉴클레오타이드", "LOCS 구조" "LOCS 리포터", "온전한 LOCS", "폐쇄 LOCS" 및 "LOCS 프로브"라고도 지칭되는 용어 "줄기-루프 올리고뉴클레오타이드" 및 "LOCS"는 상호교환적으로 본원에 사용되고, 단일 가닥 루프 성분(본원에서 "루프", "루프 영역" 및 "루프 부분"이라고도 칭함)에 연결된 이중 가닥 줄기 성분(본원에서 "줄기", "줄기 영역" 및 "줄기 부분"이라고도 칭함)을 포함하거나 이들로 이루어진 DNA 또는 DNA-함유 분자, 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자, 또는 이들의 조합(즉, DNA-RNA 하이브리드 분자 또는 복합체)을 의미하도록 이해될 것이다. 이중 가닥 줄기 성분은 상보성 역방향 가닥에 대한 상보성 염기 페어링에 의해 혼성화된 정방향 가닥을 포함하고, 정방향 가닥의 3' 뉴클레오타이드는 단일 가닥 루프 성분의 5' 뉴클레오타이드에 연결되고, 역방향 가닥의 5' 뉴클레오타이드는 단일 가닥 루프 성분의 3' 뉴클레오타이드에 연결된다.
이중 가닥 줄기 성분은 하나의 가닥(예를 들어, 정방향 가닥)에서 하나 이상의 형광단, 및 반대의 가닥(예를 들어, 역방향 가닥)에서 하나 이상의 켄쳐를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 형광단(들)은 정방향 가닥의 5' 말단에 또는 근처에 부착될 수 있고, 켄쳐(들)는 역방향 가닥의 3' 말단에 또는 근처에 부착될 수 있거나, 그 반대도 그렇다. 단일 가닥 루프 성분은 예를 들어 MNAzyme, DNAzyme, 리보자임, apta-MNAzyme 또는 aptazyme과 같은 촉매 핵산에 대한 기질로서 작용할 수 있는 영역을 포함할 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 단일 가닥 루프 성분은 표적 핵산(예를 들어, 검출, 정량화 등을 위한 표적), 및/또는 이로부터 유래된 앰플리콘에 상보성이고, 엑소뉴클레아제 효소에 대한 기질로서 추가로 작용할 수 있는 영역을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 엑소뉴클레아제는 중합효소 효소의 고유 활성일 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 단일 가닥 루프 성분 영역은 (i) 검출되는 표적에 상보성이고, (ii) 이중 가닥 제한 효소 인식 부위의 하나의 가닥을 포함하고; (iii) 제한 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있는 영역을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드", "개방 LOCS", "개방 LOCS 올리고뉴클레오타이드", "개방 LOCS 구조" "개방 LOCS 리포터", "개방 LOCS 프로브", "개방된 LOCS", "절단된 LOCS" 및 "분해된 LOCS"는 상호교환적으로 본원에 사용되고, 루프 내의 인접한 뉴클레오타이드 사이의 적어도 하나의 결합이 제거되어 루프 영역에서 개방 구조를 제공하도록 단일 가닥 루프 성분이 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 효소에 의해) 절단되고/되거나 분해되는 "줄기-루프 올리고뉴클레오타이드" 또는 "LOCS"에 대한 언급인 것으로 이해될 것이다. 개방 LOCS에서, 이중 가닥 줄기 부분의 정방향 가닥 및 역방향 가닥은 줄기를 형성하도록 서로에 혼성화하는 능력을 보유할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보편적 줄기"는 임의의 LOCS 구조로 혼입될 수 있는 이중 가닥 서열을 지칭한다. 동일한 "보편적 줄기"는 촉매 핵산 기질 또는 관심 표적에 상보성인 서열 중 어느 하나를 포함하는 루프를 함유하는 LOCS에 사용될 수 있다. 단일 보편적 줄기는 특이적 LOCS의 개방을 수월하게 할 수 있는 임의의 표적에 대한 대리 마커로서 사용될 수 있다. 일련의 보편적 줄기는 임의의 표적 세트의 분석에 설계된 일련의 LOCS로 혼입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "보편적 LOCS"는 MNAzyme 표적 센싱 아암의 서열과 무관하게 상보성 기질 결합 아암을 갖는 임의의 MNAzyme에 의해 절단될 수 있는 보편적 촉매 핵산 기질을 포함하는 "보편적 줄기" 및 "보편적 루프"를 함유하는 LOCS 구조를 지칭한다. 단일 보편적 LOCS는 특이적 LOCS의 개방을 수월하게 할 수 있는 임의의 표적에 대한 대리 마커로서 사용될 수 있다. 일련의 보편적 LOCS는 임의의 표적 세트를 분석하도록 설계된 임의의 다중화 검정으로 혼입될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 효소", "촉매 핵산", "촉매 활성을 갖는 핵산", 및 "촉매 핵산 효소"는 상호교환적으로 본원에 사용되고, 적어도 하나의 기질을 인식하고 적어도 하나의 기질의 변형(예컨대, 절단)을 촉매화할 수 있는 DNA 또는 DNA-함유 분자 또는 복합체, 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자 또는 복합체, 또는 이들의 조합(즉, DNA-RNA 하이브리드 분자 또는 복합체)을 의미해야 한다. 촉매 핵산에서의 뉴클레오타이드 잔기는 염기 A, C, G, T, 및 U, 및 이의 유도체 및 유사체를 포함할 수 있다. 상기 용어는 적어도 하나의 기질을 인식하고 적어도 하나의 기질의 변형(예컨대, 절단)을 촉매화할 수 있는 단일 DNA 또는 DNA-함유 분자(또한 "DNA 효소", "데옥시리보자임" 또는 "DNAzyme"으로 당해 분야에 공지됨) 또는 RNA 또는 RNA-함유 분자(또한 "리보자임"으로 당해 분야에 공지됨) 또는 DNA-RNA 하이브리드 분자인 이의 조합을 포함할 수 있는 단일분자 핵산 효소를 포함한다. 상기 용어는 적어도 하나의 기질을 인식하고 적어도 하나의 기질의 변형(예컨대, 절단)을 촉매화할 수 있는 DNA 또는 DNA-함유 복합체 또는 RNA 또는 RNA-함유 복합체 또는 DNA-RNA 하이브리드 복합체인 이의 조합을 포함하는 핵산 효소를 포함한다. 용어 "핵산 효소", "촉매 핵산", "촉매 활성을 갖는 핵산", 및 "촉매 핵산 효소"는 이의 의미 내에 MNAzyme을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "MNAzyme" 및 본원에 사용된 바와 같이 "다성분 핵산 효소"는 동일한 의미를 갖고, 오직 MNAzyme 어셈블리 촉진자(예를 들어, 표적)의 존재 하에 기질을 촉매로 변형시킬 수 있는 활성 핵산 효소를 형성하는 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 파트자임)을 지칭한다. "MNAzyme"은 또한 당해 분야에서 "PlexZyme"로 공지되어 있다. MNAzyme은 기질의 절단, 및 기질 또는 기질들의 다른 효소 변형을 포함하는 반응의 범위를 촉매화할 수 있다. 엔도뉴클레아제 또는 절단 활성을 갖는 MNAzyme은 "MNAzyme 절단제"로도 공지되어 있다. 성분 파트자임, 파트자임 A 및 B는 각각 Watson-Crick 염기 페어링을 통해 어셈블리 촉진자(예를 들어, 표적 DNA 또는 RNA 서열)에 결합한다. 파트자임 A 및 B의 센서 아암이 어셈블리 촉진자에서 서로에 인접하게 혼성화할 때 MNAzyme이 오직 형성된다. MNAzyme의 기질 아암은 기질을 사로잡고, 이의 변형(예를 들어, 절단)은 파트자임 A 및 B의 촉매 도메인의 상호작용에 의해 형성된 MNAzyme의 촉매 코어에 의해 촉매화된다. MNAzyme은 DNA/RNA 키메라 리포터 기질을 절단할 수 있다. 형광단과 켄쳐 염료 쌍 사이의 기질의MNAzyme 절단은 형광 신호를 생성할 수 있다. 용어 "다성분 핵산 효소" 및 "MNAzyme"은 2개의 분자로 구성된 2구획 구조, 또는 3개의 핵산 분자로 구성된 삼구획, 또는 다른 다구획 구조, 예를 들어 4개 이상의 핵산 분자에 의해 형성된 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "MNAzyme" 및 "다성분 핵산 효소"가 PCT 국제 공개 WO/2007/041774호, 국제 공개 WO/2008/040095호, 국제 공개 WO2008/122084호, 및 관련된 미국 특허출원공개 2007-0231810호, 미국 특허출원공개 2010-0136536호, 및 미국 특허출원공개 2011-0143338호(이들 문헌의 각각의 내용은 본원에 그 전체가 인용되어 포함됨) 중 임의의 하나 이상에 개시된 것을 포함하는 모든 공지된 MNAzyme 및 변형된 MNAzyme을 포함한다는 것이 이해될 것이다. 용어 "MNAzyme" 및 "다성분 핵산 효소"에 의해 포함된 MNAzyme 및 변형된 MNAzyme의 비제한적인 예는 절단 촉매 활성을 갖는 (본원에 예시된 바와 같은) MNAzyme, 하나 이상의 어셈블리 억제제를 포함하는 해체된 또는 부분 조립된 MNAzyme, 하나 이상의 압타머를 포함하는 MNAzyme("apta-MNAzyme"), 하나 이상의 절두된 센서 아암 및 선택적으로 하나 이상의 안정화 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 MNAzyme, 하나 이상의 활성 억제제를 포함하는 MNAzyme, 다성분 핵산 불활성 프로효소(MNAi)를 포함하고, 이들의 각각은 국제 공개 WO/2007/041774호, 국제 공개 WO/2008/040095호, 미국 특허출원공개 2007-0231810호, 미국 특허출원공개 2010-0136536호, 및/또는 미국 특허출원공개 2011-0143338호 중 하나 이상에 자세히 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "파트자임", "성분 파트자임" 및 "파트자임 성분"은 DNA-함유 또는 RNA-함유 또는 DNA-RNA-함유 올리고뉴클레오타이드를 지칭하고, 이들 중 2개 이상은 오직 본원에 정의된 바와 같은 MNAzyme 어셈블리 촉진자의 존재 하에 함께 "MNAzyme"을 형성할 수 있다. 소정의 바람직한 실시형태에서, 1개 이상, 및 바람직하게는 적어도 2개의 성분 파트자임은 변형을 촉진하는 촉매 코어의 부분을 형성하는 "촉매" 도메인; 어셈블리 촉진자와 회합하고/하거나 결합할 수 있는 "센서 아암" 도메인; 및 기질과 회합하고/하거나 결합할 수 있는 "기질 아암" 도메인의 3개의 영역 또는 도메인을 포함할 수 있다. 용어 "센서 아암", "표적 센서 아암" 또는 "표적 센싱 아암" 또는 "표적 아암"은 어셈블리 촉진자, 예를 들어 표적에 결합하는 파트자임의 도메인을 기재하도록 상호교환적으로 사용될 수 있다. 파트자임은 비제한적인 예로서 본원에서 "apta-파트자임"라 불리는 압타머를 포함하는 적어도 하나의 추가의 성분을 포함할 수 있다. 파트자임은 비제한적인 예로서 절두된 센서 아암 및 어셈블리 촉진자 또는 기질 중 어느 하나와 상호작용하여 MNAzyme 구조를 안정화시키는 안정화 아암 성분을 갖는 파트자임 성분을 포함하는 다수의 성분을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "어셈블리 촉진자 분자", "어셈블리 촉진자", "MNAzyme 어셈블리 촉진자 분자", 및 "MNAzyme 어셈블리 촉진자"는 MNAzyme의 센서 아암과의 상호작용에 의해 촉매적으로 활성인 MNAzyme을 형성하도록 성분 파트자임의 자가-어셈블리를 수월하게 할 수 있는 집합체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 어셈블리 촉진자는 절단 또는 다른 효소 활성을 갖는 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 어셈블리 촉진자는 MNAzyme의 자기-어셈블리에 필요하다. 어셈블리 촉진자는 하나의 분자에 포함될 수 있거나, 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 "파트자임"의 센서 아암과 페어링하거나 이에 결합할 수 있는 2개 이상의 "어셈블리 촉진자 성분"에 포함될 수 있다. 어셈블리 촉진자는 MNAzyme의 센서 아암/들과 상보성인 서열을 공유하지 않는 하나 이상의 뉴클레오타이드 성분을 포함할 수 있다. 어셈블리 촉진자는 표적일 수 있다. 표적은 DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, RNA, 메틸화 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, tRNA, mRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pre- 및 pri-마이크로RNA, 다른 비암호화 RNA, 리보솜 RNA, 이들의 유도체, 앰플리콘, 또는 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산일 수 있다. 핵산은 증폭될 수 있다. 증폭은 PCR, RT-PCR, SDA, HDA, RPA, LAMP, RCA, TMA, 3SR 또는 NASBA 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "검출 가능한 효과"는 LOCS 프로브/들의 절단이 발생한다는 표시로서 검출되거나 정량화될 수 있는 효과이다. 효과의 규모는 어셈블리 촉진자(예를 들어, 표적)와 같은 유입의 분량을 표시할 수 있다. 검출 가능한 효과는 형광 분광법, 표면 플라즈몬 공명, 질량 분광법, NMR, 전자 스핀 공명, 분극 형광 분광법, 원형 이색성, 면역검정, 크로마토그래피, 복사측정술, 광도측정법, 신티그래피, 전자 방법, 전기화학 방법, UV, 가시광선 또는 적외선 분광법, 효소 방법 또는 임의의 이들의 조합을 포함하는 다양한 방법에 의해 검출될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "폴리뉴클레오타이드 기질" 및 "기질"은 촉매 핵산 효소를 포함하는 효소에 의해 인식되거나 작용되거나 변형될 수 있는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 염기의 임의의 단일 가닥 또는 이중 가닥 중합체, 또는 이의 유사체, 유도체, 변이체, 단편 또는 조합을 포함한다. "폴리뉴클레오타이드 기질" 또는 "기질"은 비제한적인 예로서 절단을 포함하는 다양한 효소 활성에 의해 변형될 수 있다. "폴리뉴클레오타이드 기질" 또는 "기질"의 절단 또는 분해는 효소의 촉매 활성을 모니터링하기 위한 "검출 가능한 효과"를 제공할 수 있다. "폴리뉴클레오타이드 기질" 또는 "기질"은 비제한적인 예로서 촉매 핵산 효소, 예컨대 MNAzyme, AptaMNAzyme, DNAzyme, Aptazyme, 리보자임 및/또는 단백질 효소, 예컨대 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 포함하는 하나 이상의 효소에 의해 절단 또는 분해할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 "리포터 기질"은 촉매화된 반응과 연결되어 기질의 절단 또는 절단된 생성물의 외관의 측정을 수월하게 하기 위해 특히 적응된 기질이다. 리포터 기질은 용액 중 유리이거나, 예를 들어 표면 또는 다른 분자에 결합(또는 "테터링")될 수 있다. 리포터 기질은 예를 들어 형광단(하나 이상의 추가 성분, 예컨대 켄쳐와 함께 또는 이것 없이), 방사성 라벨, 비오틴(예를 들어, 비오틴화) 또는 화학발광 라벨을 포함하는 임의의 매우 다양한 수단에 의해 표지될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "보편적 기질"은 복수의 MNAzyme에 의해 인식되고 촉매로 작용되는 기질, 예를 들어 리포터 기질이고, 이들의 각각은 상이한 어셈블리 촉진자를 인식할 수 있다. 이러한 기질의 사용은 모두 보편적 기질을 인식하는 구조적으로 관련된 MNAzyme을 사용한 매우 다양한 어셈블리 촉진자의 검출, 확인 또는 정량화를 위한 별개의 검정의 개발을 수월하게 한다. 이 보편적 기질은 각각 독립적으로 하나 이상의 라벨로 표지될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 독립적으로 검출 가능한 라벨은 MNAzyme을 사용하여 다양한 어셈블리 촉진자를 독립적으로 또는 동시에 검출하기 위한 편리한 시스템의 생성을 허용하도록 하나 이상의 보편적 기질을 표지하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 기질은 보인자, 예를 들어 금속 이온 보인자, 예컨대 납 또는 수은의 존재 하에 촉매적으로 활성인 DNAzyme에 의한 촉매 변형을 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "프로브"는 표적 핵산의 검출에 사용된 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 프로브의 비제한적인 예는 TaqMan 프로브; Molecular Beacon 프로브; 및 핵산 효소에 의해 촉매 절단할 수 있는 루프 영역 내에 핵산 효소 기질을 포함하는 LOCS 프로브를 포함한다.
용어 "생성물"은 기질의 효소 변형의 결과로서 생성된 새로운 분자 또는 분자들을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "절단 산물"은 효소에 의한 절단 또는 엔도뉴클레아제 활성의 결과로서 생성된 새로운 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 온전한, 폐쇄 LOCS 구조의 효소 절단 또는 분해의 산물은 개방 LOCS 구조를 형성하도록 혼성화할 수 있는 2개의 올리고뉴클레오타이드 단편을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드의 맥락에서 용어 "융점" 및 "Tm"의 사용은 Wallace 규칙을 이용하여 계산될 때 융점(Tm)에 대한 언급인 것으로 이해될 것이고, 이로써 달리 기재되지 않는 한 Tm = 2℃(A+T) + 4℃(G+C)이다(문헌[Wallace et al., (1979) Nucleic Acids Res. 6, 3543] 참조). 융점에 대한 서열 조성의 효과는 하기 식에 의해 지배되는 가장 가까운 이웃하는 방법을 이용하여 이해될 수 있다: Tm (℃) = ΔH° / (ΔS° + R ln[올리고]) - 273.15. 줄기 길이 및 서열 조성 이외에, 융점에 영향을 미치는 것으로 공지된 다른 인자는 이온 강도 및 올리고뉴클레오타이드 농도를 포함한다. 더 높은 올리고뉴클레오타이드 및/또는 이온 농도는 융점을 증가시키는 듀플렉스 형성의 변화를 증가시킨다. 이와 반대로, 더 낮은 올리고뉴클레오타이드 및/또는 이온 농도는 융점을 감소시키는 줄기의 해리를 선호한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "켄쳐"는, 형광단과 밀접히 근접할 때, 형광단에 의해 생성된 방출 에너지를 흡수하고, 열로서 에너지를 소산시키거나 형광단의 방출 파장보다 더 긴 파장의 광을 방출하는 임의의 분자를 포함한다. 켄쳐의 비제한적인 예는 Dabcyl, TAMRA, 그래핀, FRET 형광단, ZEN 켄쳐, ATTO 켄쳐, Black Hole 켄쳐(BHQ) 및 Black Berry 켄쳐(BBQ)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산의 맥락에서 사용될 때 용어 "염기"는 용어 "뉴클레오타이드"와 동일한 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "키트"는 물질을 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 지칭한다. 이러한 전달 시스템은 한 위치에서 다른 위치로의 반응 시약(예를 들어, 적절한 용기에서 라벨, 기준 샘플, 지지 물질 등) 및/또는 지지 물질(예를 들어, 완충액, 검정을 수행하기 위한 설명서 등)의 저장, 수송 또는 전달을 허용하는 시스템을 포함한다. 예를 들어, 키트는 관련 반응 시약 및/또는 지지 물질을 함유하는 박스와 같은 하나 이상의 인클로져를 포함할 수 있다. 용어 "키트"는 단편화된 키트 및 조합된 키트 둘 다를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단편화된 키트"는 각각 전체 키트 성분의 하위부분을 함유하는 2개 이상의 별개의 용기를 포함하는 전달 시스템을 지칭한다. 용기는 함께 또는 별개로 의도된 수혜자에게 전달될 수 있다. 각각 전체 키트 성분의 하위부분을 함유하는 2개 이상의 별개의 용기를 포함하는 임의의 전달 시스템은 용어 "단편화된 키트"의 의미 내에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, "조합된 키트"는 단일 용기(예를 들어, 각각의 원하는 성분을 하우징하는 단일 박스)에서 반응 검정의 모든 성분을 함유하는 전달 시스템을 지칭한다.
인용된 수치 값과 관련하여 본원에서 사용 용어 "약"이 인용된 수치 값 및 인용된 값의 플러스 또는 마이너스 10% 내의 수치 값을 포함한다고 이해될 것이다.
수치 값의 범위를 언급할 때 본원에서 용어 "사이"의 사용이 그 범위의 각각의 종점에서의 수치 값을 포함한다고 이해될 것이다. 예를 들어, 10개의 잔기와 20개의 잔기 길이 사이의 폴리펩타이드는 10개의 잔기 길이의 폴리펩타이드 및 20개의 잔기 길이의 폴리펩타이드를 나타낸다.
본원에서의 선행 기술 문헌의 임의의 설명 또는 이 문헌으로부터 유래되거나 이에 기초한 본원에서의 서술은 문헌 또는 유래된 서술이 관련 기술의 일반 상식의 일부라는 인정이 아니다.
설명의 목적을 위해 본원에 언급된 모든 문헌은 달리 기술되지 않는 한 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
약어
하기 약어는 본원에서 및 본 명세서에 걸쳐 사용된다:
LOCS: 줄기에 연결된 루프
MNAzyme: 다성분 핵산 효소, 또는 다구획 핵산 효소;
파트자임: 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 부분 효소;
PCR: 중합효소 연쇄 반응;
gDNA: 게놈 DNA
NTC: 무 주형 대조군
qPCR: 실시간 정량적 PCR
Ct; 역치 주기
R 2 ; 보정 계수
nM; 나노몰
mM; 밀리몰
μL; 마이크로리터
dNTP; 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트
NF-H 2 O: 뉴클레아제 비함유 물;
LNA : 잠금 핵산;
F: 형광단;
Q: 켄쳐;
N = A, C, T, G, 또는 임의의 이의 유사체;
N' = N에 상보성이거나, N과 염기 쌍을 지을 수 있는 임의의 뉴클레오타이드;
(N) x : N의 임의의 수;
(N') x : N'의 임의의 수;
W: A 또는 T;
R: A, G 또는 AA;
rN: 임의의 리보뉴클레오타이드 염기;
(rN) x : rN의 임의의 수;
rR: A 또는 G;
rY: C 또는 U;
M: A 또는 C;
H: A, C 또는 T;
D: G, A 또는 T;
JOE 또는 6-JOE: 6-카복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레세인;
FAM 또는 6-FAM: 6-카복시플루오레세인.
BHQ1: 검정 홀 켄쳐 1
BHQ2: 검정 홀 켄쳐 2
RT-PCR: 역방향 전사 중합효소 연쇄 반응
SDA: 가닥 대체 증폭
HDA: 헬리카제 의존적 증폭
RPA: 재조합효소 중합효소 증폭
LAMP: 루프 매개 등온 증폭
RCA: 회전 환 증폭
TMA: 전사 매개 증폭
3SR: 자가 유지 서열 복제
NASBA: 핵산 서열 기반 증폭
IB: Iowa Black® FQ
IBR: Iowa Black® RQ
shRNA: 짧은 헤어핀 RNA
siRNA: 짧은 간섭 RNA
mRNA: 메신저 RNA
tRNA: 운반 RNA
snoRNA: 소형 핵소체 RNA
stRNA: 소형 시간적 RNA
smRNA: 소형 모듈식 RNA
pre-마이크로RNA: 전구 마이크로RNA
pri-마이크로RNA: 1차 마이크로RNA
LHS: 좌측
RHS: 우측
DSO: 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드
Tm: 융점
RFU: 상대 형광 단위
상세한 설명
하기 상세한 설명은 당업자가 본 발명을 실행하게 하기에 충분히 자세히 본 발명의 예시적인 실시형태를 전달한다. 기재된 다양한 실시형태의 특징 또는 제한은 본 발명의 다른 실시형태 또는 전체로서의 본 발명을 반드시 제한하지는 않는다. 그러므로, 하기 상세한 설명은 오직 청구항에 의해 한정된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
본 발명은 표적(예를 들어, 핵산, 단백질, 분석물질, 화합물, 분자 등)의 개선된 다중화 검출에 대한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 방법 및 조성물은 각각 LOCS 올리고뉴클레오타이드를 이용하고, 이는 다양한 다른 물질과 조합되어 사용될 수 있다.
- LOCS 올리고뉴클레오타이드
본 발명의 예시적인 LOCS 올리고뉴클레오타이드는 도 1에 예시되어 있다. 예시적인 온전한(폐쇄된) LOCS 올리고뉴클레오타이드(도 1의 A, LHS)는 루프 영역, 줄기 영역 및 형광단 (F)/켄쳐(Q) 염료 쌍을 갖는다. 도 1은 온전한 LOCS A 및 온전한 LOCS B라 표시된 2개의 예시적인 LOCS 올리고뉴클레오타이드를 예시한다. 이 LOCS 올리고뉴클레오타이드는 상이한 루프 서열 및 상이한 줄기 서열을 갖는다. 본 발명의 2개의 주어진 LOCS 올리고뉴클레오타이드는 조합으로 사용될 때 일반적으로 줄기의 서열 및/또는 길이가 상이할 것이다. 오직 비제한적인 예로서, 온전한 LOCS A의 줄기 A는 Tm 1로 표시된 제1 온도에서 용융하도록 설계될 수 있지만; 온전한 LOCS B의 줄기 B는 Tm 3으로 표시된 상이한 온도에서 용융하도록 설계될 수 있다. 온전한 LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역의 절단 또는 분해는 개방 LOCS 구조를 생성시킨다(도 1의 A, RHS).
분자내 결합이 분자간 결합보다 더 강하므로, 온전한 LOCS 구조의 줄기 영역은 일반적으로 개방, 절단된 또는 분해된 LOCS 올리고뉴클레오타이드 구조의 줄기보다 더 높은 온도에서 용융할 것이다. 예를 들어, 온전한 LOCS A의 줄기 A는 개방 LOCS 줄기 A'가 용융하는 온도인 Tm 2보다 높은 Tm 1에서 용융할 것이다(도 1의 B). 유사하게, 온전한 LOCS B의 줄기 B의 융점은 개방 LOCS 줄기 B'가 용융하는 온도인 Tm 4보다 높은 Tm 3에서 용융할 것이다(도 1의 B). 특이적 개방 LOCS 구조에 상응하는 온도에서의 (예를 들어, 회합된 형광 마커에 의해 검출된 바와 같은) 피크의 존재는 이 특이적 LOCS 구조의 개방을 지시하는 표적, 또는 표적 앰플리콘의 존재를 나타낸다. 개방 LOCS A의 줄기가 개방 LOCS B와 구별되는 온도에서 용융하므로(도 1의 B), 동일한 형광단으로 표지된 다수의 개방 LOCS 구조는 단일 반응에서 동시에 검출되고 분석될 수 있다. 추가로, 상이한 형광단으로 표지된 다수의 개방 LOCS 구조는 또한 단일 반응에서 동시에 검출되고 분석될 수 있다.
이제 도 2에 도시된 예시적인 실시형태를 참조하면, LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역의 서열은 예를 들어 MNAzyme 또는 다른 촉매 핵산/들에 대한 기질일 수 있다. 도 3의 A 및 도 3의 B에 예시된 추가의 실시형태에서, LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역은 검출되는 표적에 전부로 또는 부분적으로 상보성이고; 이중 가닥일 때 엑소뉴클레아제, 예를 들어 중합효소에 고유한 엑소뉴클레아제 활성에 의한 분해에 대한 기질로서 작용할 수 있는 표적 특이적 서열일 수 있다. 도 3의 B에 예시된 다른 추가의 예시적인 실시형태에서, 루프 내의 표적 특이적 서열은 이중 가닥 제한 효소 인식 부위의 하나의 가닥을 추가로 포함할 수 있다. 표적 서열에 대한 루프 서열의 혼성화는 기능적, 절단 가능한 제한 부위를 생성시킬 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 제한 효소는 표적을 온전하게 남기면서 LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 가닥을 절단할 수 있는 닉킹 효소이다.
소정의 실시형태에서, 본 발명의 LOCS 올리고뉴클레오타이드는 표적을 직접 검출하도록 사용될 수 있다. 다른 예시적인 실시형태에서, LOCS는 비제한적인 예로서 PCR, RT-PCR, SDA, HDA, RPA, LAMP, RCA, TMA, 3SR, 또는 NASBA를 포함하는 표적 증폭 기법에 의해 생성된 표적 앰플리콘을 검출하도록 사용될 수 있다. LOCS를 개방시키는 절단 또는 분해는 표적 증폭 동안 실시간으로 발생할 수 있거나, 반응의 종점에서 증폭 후 수행될 수 있다. 루프 영역은 비제한적인 예로서 MNAzyme, DNAzyme, 리보자임을 포함하는 촉매 핵산의 효소 활성에 의해; 또는 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 포함하는 단백질 효소의 효소 활성에 의해 매개된 표적 의존적 절단 또는 분해에 의해 개방될 수 있다. 비제한적인 예로서, 엑소뉴클레아제 활성은 예를 들어 중합효소의 고유 촉매 활성일 수 있다. 비제한적인 예로서, 엔도뉴클레아제 활성은 예를 들어 닉킹 엔도뉴클레아제, 리보엔도뉴클레아제 또는 듀플렉스 특이적 뉴클레아제(DSN)를 포함하는 제한 효소의 고유한 촉매 활성일 수 있다.
루프 영역이 촉매 핵산에 대한 기질을 포함하는 예시적인 전략은 도 2에 예시되어 있다. 이 전략에서 LOCS 올리고뉴클레오타이드는 임의의 표적을 검출하기 위해 사용될 수 있는 보편적 기질을 포함한다. LOCS 올리고뉴클레오타이드는 줄기 영역, 형광단 켄쳐/염료 쌍 및 MNAzyme과 같은 촉매 핵산에 대한 보편적 기질을 포함하는 개재 루프 영역을 함유한다. MNAzyme은 직접 표적을 검출할 수 있거나, 표적 증폭 동안 생성된 앰플리콘을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 파트자임의 표적 센서 아암이 표적 또는 표적 앰플리콘에 인접하게 정렬하여 활성 촉매 코어를 형성할 때 MNAzyme이 형성된다. LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역은 MNAzyme의 기질 결합 아암에 결합하고, 루프 내의 기질은 MNAzyme에 의해 절단되어서, LOCS를 개방하고 형광 신호를 생성한다. 개방 LOCS 구조의 줄기가 재어닐링하도록 반응이 이후 냉각될 수 있다. 반응은 이후 가열될 수 있고, 용융 곡선 분석은 개방 LOCS 줄기 영역이 용융하는 온도를 측정하도록 사용될 수 있다. 당업자는 표적이 실시간으로 또는 반응의 종료 시 검출될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
다수의 표적을 동시에 검출하도록 설계된 반응은 다수의 LOCS 올리고뉴클레오타이드를 함유할 수 있고; 이들의 각각은 루프 내의 상이한 보편적 기질 및 상이한 MNAzyme에 의한 기질/루프의 절단 후 상이한 온도에서 용융할 수 있는 상이한 줄기 영역을 포함한다. LOCS 올리고뉴클레오타이드는 추가로 동일한 형광단/켄쳐 염료 상을 포함할 수 있다. 예로서, MNAzyme 1은 표적 1의 존재 하에 형성되고, LOCS 올리고뉴클레오타이드 1 내에 기질 1을 절단할 수 있다. 이는 온도 1에서 용융하는 줄기 1을 함유하는 절단된, 이중 가닥, 개방 LOCS 구조 1을 생성시킨다. 동시에, MNAzyme 2는 표적 2의 존재 하에 형성되고, LOCS 올리고뉴클레오타이드 2 내에 기질 2를 절단하여 온도 2에서 용융하는 줄기 2를 함유하는 절단된, 이중 가닥 개방 LOCS 구조 2를 생성시킬 수 있다. 반응의 용융 프로필이 분석될 때 온도 1에서 피크의 존재는 표적 1의 존재를 나타내고; 온도 2에서 피크의 존재는 표적 2의 존재를 나타내고; 온도 1 및 온도 2에서 2개의 피크의 존재는 표적 1 및 표적 2 둘 다의 존재를 나타낸다. 그러므로 장치에서 단일 채널에서 판독된 단일 파장은 2개의 표적의 검출 및 구별을 허용한다.
반응 혼합물은 상이한 형광단 및 켄쳐 쌍으로 표지된 추가의 LOCS를 추가로 함유할 수 있다. 예로서, LOCS 올리고뉴클레오타이드 1 및 2는 형광단 A로 표지될 수 있고, LOCS 올리고뉴클레오타이드 3 및 4는 형광단 B로 표지될 수 있다. MNAzyme 1은 표적 1의 존재 하에 형성되고, LOCS 올리고뉴클레오타이드 1 내에 기질 1을 절단하여 온도 1에서 용융하는 줄기 1를 함유하는 절단된, 이중 가닥 개방 LOCS 구조 1을 생성시킬 수 있다. MNAzyme 2는 표적 2의 존재 하에 형성되고, LOCS 올리고뉴클레오타이드 2 내에 기질 2을 절단하여 온도 2에서 용융하는 줄기 2를 함유하는 절단된, 이중 가닥 개방 LOCS 구조 2를 생성시킬 수 있다. MNAzyme 3은 표적 3의 존재 하에 형성되고, LOCS 올리고뉴클레오타이드 3 내에 기질 3을 절단하여 온도 3에서 용융하는 줄기 3을 함유하는 절단된, 이중 가닥 개방 LOCS 구조 3을 생성시킬 수 있다. MNAzyme 4는 표적 4의 존재 하에 형성되고, LOCS 올리고뉴클레오타이드 4 내에 기질 4을 절단하여 온도 4에서 용융하는 줄기 4을 함유하는 절단된, 이중 가닥 개방 LOCS 구조 4를 생성시킬 수 있다. 반응의 용융 프로필이 형광단 A의 여기 파장에서 분석될 때, 온도 1에서의 피크의 존재는 표적 1의 존재를 나타내고; 온도 2에서의 피크의 존재는 표적 2의 존재를 나타내고; 온도 1 및 온도 2에서의 2개의 피크의 존재는 표적 1 및 표적 2 둘 다의 존재를 나타낸다. 반응의 용융 프로필이 형광단 B의 여기 파장에서 분석될 때, 온도 3에서의 피크의 존재는 표적 3의 존재를 나타내고; 온도 4에서의 피크의 존재는 표적 4의 존재를 나타내고; 온도 3 및 온도 4에서의 2개의 피크의 존재는 표적 3 및 표적 4 둘 다의 존재를 나타낸다. 그러므로 장치에서 2개의 채널에서 판독된 2개의 파장에서의 분석은 4개의 표적의 검출 및 구별을 허용한다. 숙련자는, 하나의 특정 파장에서 2개 초과의 표적의 절단을 모니터링하도록 전략이 확장될 수 있고, 추가로 분석되는 형광단의 수가 개별 파장을 구별하기 위해 이용 가능한 기기의 최대 역량에 의해 결정되는 것으로 증가할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
이제 도 3에 도시된 예시적인 실시형태를 참조하면 2개의 예시적인 전략은 표적 및/또는 앰플리콘에 특이적인 그리고 상보성인 루프 영역을 갖는 LOCS 올리고뉴클레오타이드를 사용한 표적의 검출에 대해 예시된다. 이제 도 3의 A에 예시된 실시형태를 참조하면, LOCS 올리고뉴클레오타이드는 줄기 영역, 형광단 켄쳐 염료 쌍 및 표적 앰플리콘에 상보성 영역을 포함하는 루프 영역을 함유한다. 증폭 동안, LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역은 표적 앰플리콘에 결합한다. 프라이머의 연장 동안, 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성은 루프 영역을 분해하여 줄기 영역이 온전하게 하고, 실시간으로 형광 신호를 생성한다. 증폭 후에, 분해된, 개방 LOCS 구조의 줄기가 재어닐링하도록 반응이 냉각될 수 있고; 이후 용융 곡선 분석은 분해된 개방 LOCS로부터 유래된 줄기 영역이 용융하는 온도를 측정하도록 수행될 수 있다. 당업자는 표적이 실시간으로 또는 반응의 종료 시 검출될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
도 3의 B에 도시된 추가로 예시적인 실시형태에서, LOCS 올리고뉴클레오타이드는 줄기 영역, 형광단/켄쳐 염료 쌍 및 표적에 상보성인 영역을 포함하고 제한 효소, 예를 들어 닉킹 효소에 대한 인식 부위를 추가로 포함하는 루프 영역을 함유한다. LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역이 표적에 결합할 때, 닉킹 효소는 LOCS의 루프 가닥을 절단하여서 표적을 온전하게 두고 형광 신호를 생성한다. 절단된, 개방 LOCS 구조의 온전한 줄기가 재어닐링하도록 반응이 냉각될 수 있고; 이후 용융 곡선 분석은 절단된 개방 LOCS로부터 유래된 줄기 영역이 용융하는 온도를 측정하도록 수행될 수 있다. 당업자는 표적이 이전의 증폭 없이 반응에서 직접 검출될 수 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 추가로, 당업자는 표적 증폭에 의해 생성된 표적 앰플리콘이 실시간으로 또는 반응의 종료 시 검출될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 바람직한 실시형태에서, 표적 증폭과 함께 사용된 제한 효소는 반응 온도 또는 온도들에서 활성이고 열안정일 수 있다.
추가의 예시적인 실시형태에서, LOCS 올리고뉴클레오타이드는 줄기 영역, 형광단/켄쳐 염료 쌍 및 DNAzyme 또는 리보자임, 예를 들어 오직 금속 이온의 존재 하에 촉매적으로 활성일 수 있는 DNAzyme 또는 리보자임에 대한 기질을 포함할 수 있는 루프 영역을 함유할 수 있다. 특이적 DNAzyme 및 리보자임은 금속 양이온 보인자가 촉매 활성이 가능하게 하도록 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 DNAzyme 및 리보자임은 오직 예를 들어 납 또는 수은의 존재 하에 촉매적으로 활성일 수 있다. 이러한 금속은 예를 들어 환경 샘플에 존재할 수 있다. LOCS 올리고뉴클레오타이드가 예를 들어 납 의존적인 DNAzyme 또는 리보자임에 대한 기질을 포함하는 루프를 함유하면, 샘플에서의 납의 존재는 LOCS를 절단시키고 형광 신호를 생성시킬 수 있다. 절단된, 개방 LOCS 구조의 온전한 줄기가 재어닐링하도록 반응이 냉각될 수 있고; 이후 용융 곡선 분석은 절단된 개방 LOCS로부터 유래된 줄기 영역이 용융하는 온도를 측정하도록 수행될 수 있다. 당업자는 각각이 특정 금속 보인자에 의존적인 다수의 DNAzyme 및/또는 리보자임이 다수의 표적, 예를 들어 납 및 수은을 표적하기 위해 설계된 단일 반응에서 조합될 수 있다고 용이하게 인식할 것이다. 추가로, 당업자는 표적이 실시간으로 또는 반응의 종료 시 검출될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본원에서 뉴클레오타이드의 다른 서열에 "실질적으로 상보성인" 뉴클레오타이드의 서열의 언급은 제1 서열이 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 초과의 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 제2 서열의 보체와 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다는 것을 의미할 수 있다.
본원에서 뉴클레오타이드의 다른 서열에 "상보성"인 뉴클레오타이드의 서열은 제1 서열이 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 초과의 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 제2 서열의 보체와 100% 동일하다는 것을 의미할 수 있다.
본원에서 뉴클레오타이드의 다른 서열에 "실질적으로 비상보성인" 뉴클레오타이드의 서열의 언급은 제1 서열이 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 또는 초과의 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 제2 서열의 보체와 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 미만 동일하다는 것을 의미할 수 있다.
본원에서 뉴클레오타이드의 다른 서열에 "비상보성"인 뉴클레오타이드의 서열은 제1 서열이 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개 이상의 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 제2 서열의 보체와 0% 동일하다는 것을 의미할 수 있다.
LOCS 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 검출될 수 있는 표적 핵산(즉, 폴리뉴클레오타이드)의 비제한적인 예는 DNA, 메틸화 DNA, 알킬화 DNA, 상보성 DNA(cDNA), RNA, 메틸화 RNA, 마이크로RNA, siRNA, shRNA, mRNA, tRNA, snoRNA, stRNA, smRNA, pre- 및 pri-마이크로RNA, 다른 비암호화 RNA, 리보솜 RNA, 이들의 유도체, 이들의 앰플리콘 또는 임의의 이들의 조합(데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드 염기의 혼합된 중합체 포함)을 포함할 수 있었다.
일부 실시형태에서, 온전한 LOCS 올리고뉴클레오타이드의 융점("Tm")은 개방 LOCS 구조의 Tm보다 높다.
형광 신호의 분석
개방 LOCS 구조의 해리에 의해 생성된 형광 신호는 본 발명의 발명에 따라 표적 분자를 검출하고/하거나, 구별하고/하거나, 정량화하도록 임의의 적합한 방식으로 분석될 수 있다.
표준 용융 곡선 분석이 사용될 수 있지만, 다양한 다른 접근법이 본원에 개시되고 예시되어 있고(실시예 참조), 이는 다양한 검정 형식의 분석에 용이하게 적응될 수 있다.
비제한적인 예로서, 단일 온도, 또는 다수의 온도에서의 형광 신호의 측정은 LOCS 올리고뉴클레오타이드의 루프 영역의 절단 또는 분해를 검출하기에 적합한 반응 내에 다양한 시점에 얻어질 수 있다. 비제한적인 예로서, 이 시점은 (i) 반응의 개시에서의 시점, 및/또는 (i) 반응의 과정 동안 단일 시점, 또는 다수의 시점; 및/또는 (iii) 반응의 마무리 또는 종점에서의 시점을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 형광 신호의 측정은 PCR 증폭 동안 각각의 사이클에서 2 이상의 온도에서 얻어질 수 있다. 분석은 제1 온도 및/또는 제2 온도에서 및 /또는 추가의 온도에서 얻은 형광의 수준을 비교하여 수행될 수 있다.
다른 실시형태에서, 형광 신호의 측정은 PCR 증폭 동안 각각의 사이클에서 2 이상의 온도에서 얻어질 수 있고, 증폭 곡선은 각각의 온도에서 얻은 일련의 측정 각각에 대해 작도될 수 있다. 역치 형광 값은 각각의 특정 온도에 대해 각각의 증폭 도포로 배정될 수 있고, Cq 값은 증폭 도표가 역치 값을 초과하는 사이클 수로서 측정될 수 있다. PCR 동안 각각의 사이클에서 2의 온도에서 형광 신호의 측정이 얻어지는 실시형태에서, 더 낮은 온도에서 형광 신호를 사용하여 측정된 Cq는 제1 표적의 출발 농도의 직접적인 정량화를 허용할 수 있고; 더 높은 온도에서 형광 신호를 사용하여 측정된 Cq는 실시예 12에 예시된 바대로 분석될 수 있어서, 제2 표적의 출발 농도의 정량화를 허용한다.
비제한적인 예로서, 제1 개방 LOCS의 융점 이상에 있고 제2 개방 LOCS의 융점 아래인 제1 온도; 및 제2 개방 LOCS의 융점 이상인 제2 온도를 포함하는 2의 온도에서 무 주형 대조군에 비해 형광의 증폭 후 측정은 제1 절단된, 개방 LOCS 및 제2 절단된, 개방 LOCS의 특정 검출을 허용한다. 실시예 15(분석 방법 A)에 입증된 것처럼, 제1 온도에서, 제1 LOCS의 절단은 무 주형 대조군 반응에 비해 유의미한 형광 신호를 생성하고, 미리 결정된 역치를 초과한다. 이 제1 온도에서, 온전한 폐쇄 제1 LOCS 및 제2 LOCS, 및/또는 절단된 개방 제2 LOCS는 폐쇄 제1 LOCS 및 제2 LOCS 및 개방 제2 LOCS의 더 높은 융점으로 인해 유의미한 형광 신호의 생성에 기여하지 않고, 미리 결정된 역치를 초과하지 않는다. 제1 온도보다 높은 제2 온도에서, 제2 LOCS의 절단은 무 주형 대조군에 비해 유의미한 형광 신호를 생성하고, 미리 결정된 역치를 초과하는 반면, 온전한, 폐쇄 제1 LOCS 및 제2 LOCS 및/또는 개방 제1 LOCS는 무 주형 대조군에 비해 유의미한 형광 신호의 생성에 기여하지 않고, 미리 결정된 역치를 초과하지 않는다. 각각의 절단된 LOCS 리포터의 검출은 샘플에서 상응하는 표적의 존재를 나타낸다.
비제한적인 예로서, 제1 폐쇄 LOCS의 융점 이상에 있고 제2 폐쇄 LOCS의 융점 아래인 제1 온도; 및 제2 폐쇄 LOCS의 융점 이상인 제2 온도를 포함하는 특정 온도 점에서 대조군 기준치 형광에 비해 형광의 증폭 후 측정은 제1 절단된 개방 LOCS 및 제2 절단된 개방 LOCS의 특정 검출을 허용한다.
실시예 15(분석 방법 B)에 입증된 것처럼, 대조군 기준치 형광은 개방 및/또는 폐쇄 LOCS가 유의미한 형광 신호를 생성하지 않는 온도 이하에서 형광을 측정하여 얻어질 수 있다(온도-0). 분석은 제1 온도 및/또는 제2 온도 및 온도-0에서 얻은 형광의 수준을 비교하고, 미리 결정된 역치에 비해 형광의 수준에 대해 이를 비교하여 수행될 수 있다. 실시예 15에 입증된 것처럼, 제1 온도에서, 제1 LOCS의 절단은 온도-0에서 신호에 대해 유의미한 형광 신호를 생성하고, 미리 결정된 역치를 초과한다. 이 제1 온도에서, 온전한 폐쇄 제1 LOCS 및 제2 LOCS, 및/또는 절단된 개방 제2 LOCS는 유의미한 형광 신호의 생성에 기여하지 않고, 신호는 미리 결정된 역치를 초과하지 않는다. 이는 폐쇄 제1 LOCS 및 제2 LOCS 및 개방 제2 LOCS의 더 높은 융점으로 인한다. 제1 온도보다 높은 제2 온도에서, 제2 LOCS의 절단은 온도-0에서 얻은 신호에 비해 및/또는 제1 온도에 비해 유의미한 형광 신호를 생성하고, 신호는 미리 결정된 역치를 초과한다. 제2 온도에서, 온전한, 폐쇄 제1 LOCS 및/또는 제2 LOCS 및 개방 제1 LOCS는 온도-0 및/또는 제1 온도에서의 신호에 비해 유의미한 형광 신호의 생성에 기여하지 않고, 미리 결정된 역치를 초과하지 않는다. 각각의 절단된 LOCS 리포터의 검출은 샘플에서 상응하는 표적의 존재를 나타낸다.
비제한적인 예로서, 대조군 기준치 형광은 또한 PCR-전과 같은 반응의 개시 시 추가의 시점에 제1 온도 및 제2 온도에서 형광을 측정하여 얻어질 수 있다. 이 추가의 시점에, 모든 LOCS는 온전하고(폐쇄되고), 유의미한 형광 신호를 생성하지 않고, 미리 결정된 역치를 초과하지 않을 것이다. 분석은 반응의 개시 시의 시점에 제1 온도 및 제2 온도에서 얻은 형광의 수준 및 반응 동안 및/또는 반응 후(예를 들어, PCR 또는 PCR-후 동안)의 시점에 제1 온도 및 제2 온도에서 얻은 형광의 수준을 비교하여 수행될 수 있다. 실시예 15(분석 방법 C)에 입증된 것처럼, 제1 온도에서 및 PCR-후 시점에, 제1 LOCS의 절단은 제1 온도에서 및 PCR-전 시점에서 측정된 온전한, 폐쇄 제1 LOCS의 신호에 비해 유의미한 형광 신호를 생성한다. 이 상대 신호는 미리 결정된 역치를 초과한다. 이 제1 온도에서, 온전한, 폐쇄 제1 LOCS 및 제2 LOCS 및/또는 절단된, 개방 제2 LOCS는 폐쇄 제1 및 제2 LOCS 및 개방 제2 LOCS의 더 높은 융점으로 인해 PCR-전 얻은 신호에 비해 유의미한 형광 신호의 생성에 기여하지 않는다. 제1 온도보다 높은 제2 온도에서, 그리고 PCR-후 시점에, 제2 LOCS의 절단은 PCR-전 시점에 제2 온도에서 얻은 신호에 비해 유의미한 형광 신호를 생성한다. 제2 온도에서 그리고 PCR-후 시점에, 온전한, 폐쇄 제1 LOCS 또는 제2 LOCS 및/또는 개방 제1 LOCS는 동일한 제2 온도에서 PCR-전 시점에 비해 유의미한 형광 신호의 생성에 기여하지 않고, 미리 결정된 역치를 초과하지 않는다. 대안적으로, 제2 온도에서 PCR-전 및 PCR-후 얻은 상대 신호와 제1 온도에서 PCR-전 및 PCR-후 얻은 상대 신호 사이의 차이는 절단된 제2 LOCS의 존재를 결정하기 위해 미리 결정된 역치와 비교될 수 있고; 여기서 개방 제2 LOCS의 존재 하에 차이 값은 미리 결정된 역치보다 높고, 부재 하에 차이 값은 실시예 15(분석 방법 C)에 입증된 것처럼 미리 결정된 역치보다 낮다. 각각의 절단된 LOCS 리포터의 검출은 샘플에서 상응하는 표적의 존재를 나타낸다.
비제한적인 예로서, 다른 대안적인 방법은 각각의 절단된 LOCS의 Tm에서 d형광/d온도(dF/dT) 값과 동등한 용융 서명에서 용융 피크의 높이를 측정하는 것이다. 그러나, 이 방법의 이용성은 절단된 LOCS의 Tm에서 dF/dT 값을 결정하기 위해 구속되지 않고, 또한 Tm을 포함하는 일련의 온도를 포함한다. 제1 온도 또는 제2 온도(A℃)에서의 dF/dT 값은 (A - N)℃ 및 (A + N)℃에 걸쳐 형광 수준의 구배에 등등하다. 실시예 15(분석 방법 D)에 입증된 것처럼, (제1 온도 + N)℃ 및 (제1 온도 - N)℃에서 형광 신호로부터 계산된 제1 온도에서의 dF/dT 값은 오직 개방 제1 LOCS의 존재 하에 미리 결정된 역치보다 높다. (제2 온도 + N)℃ 및 (제2 온도 - N)℃에서의 형광 신호로부터 계산된 제1 온도보다 높은 제2 온도에서의 dF/dT 값은 오직 개방 제2 LOCS의 존재 하에 미리 결정된 역치보다 높다. 각각의 절단된 LOCS 리포터의 검출은 샘플에서 상응하는 표적 유전자의 존재를 나타낸다. 제1 온도 및 제2 온도에서의 dF/dT는 비율로서 표현될 수 있는데, 이는 개방 및 LOCS의 각각의 가능한 조합에 고유하다. 이 정보는 그 비율이 미리 결정된 값의 범위에 해당하는지를 결정하여 특이적 개방 LOCS 및 따라서 상응하는 표적을 검출하도록 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 제1 온도, 제2 온도 및/또는 추가의 온도에서의 형광 신호, 또는 이의 도함수는 미리 결정된 역치에 대해 비교되고, 여기서 절단된, 개방 제1 LOCS로부터의 신호는 제1 온도에서 미리 결정된 역치를 초과하고, 절단된, 개방 LOCS는 제2 온도에서 미리 결정된 역치를 초과하고, 폐쇄 제1 LOCS 및 제2 LOCS는 제1 온도 및 제2 온도에서 미리 결정된 역치를 초과하지 않는다. 따라서, 제1 온도 및 제2 온도에서의 미리 결정된 역치의 이용성은 절단된, 개방 제1 LOCS 및 제2 LOCS를 검출하도록 사용될 수 있다. 절단된 개방 제1 LOCS 및 제2 LOCS의 검출은 샘플에서 제1 표적 및 제2 표적 유전자의 존재를 나타낸다. 다른 실시형태에서, 제1 온도, 제2 온도 및/또는 추가의 온도에서의 형광 신호, 또는 이의 도함수는 비율로 표현될 수 있고, 여기서 개방 및/또는 폐쇄 LOCS의 각각의 가능한 조합에 대한 고유한 비율 값이 있다. 이 고유한 비율 값은 절단된, 개방 제1 LOCS 및 제2 LOCS를 검출하도록 사용될 수 있고, 샘플에서의 제1 표적 및 제2 표적 유전자의 존재를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 단일 형광 채널에서의 제1 LOCS 및 제2 LOCS의 제1 표적 및 제2 표적의 검출, 구별 및/또는 정량화가 기재되어 있다. 그러나, 당업자는 상기 방법이 실시예 15에 입증된 바대로 2개 초과의 표적의 검출, 구별 및/또는 정량화에 적용 가능하다는 것을 인식할 것이다.
LOCS 올리고뉴클레오타이드의 예시적인 적용
- 표적 증폭 동안 또는 후의 표적의 검출
본 발명의 LOCS 올리고뉴클레오타이드는 증폭된 표적 핵산 서열의 존재를 결정하도록 사용될 수 있다. LOCS 리포터가 이용될 수 있는 증폭 기법에 특정 제한이 존재하지 않는다. 다양한 반응에 의해 생성된 앰플리콘은 LOCS 리포터에 의해 검출될 수 있고, 단 표적 앰플리콘의 존재는 개방 LOCS 구조를 생성하도록 LOCS 리포터의 절단 또는 분해를 촉진할 수 있다. LOCS 구조 내에 함유된 루프 영역을 절단하거나 분해하는 데 유용한 방법의 비제한적인 예는 MNAzyme, DNAzyme, 리보자임, 제한 효소, 엔도뉴클레아제에 의한 절단 또는 비제한적인 예로서 중합효소의 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 엑소뉴클레아제에 의한 분해를 포함한다.
일반적으로, 핵산 증폭 기법은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머에 의해 특이적으로 결합된 표적 핵산의 카피를 생성하도록 효소(예를 들어, 중합효소)를 사용한다. LOCS 올리고뉴클레오타이드가 사용될 수 있는 증폭 기법의 비제한적인 예는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 역방향 전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 가닥 대체 증폭(SDA), 헬리카제 의존적 증폭(HDA), 재조합효소 중합효소 증폭(RPA), 루프 매개 등온 증폭(LAMP), 회전 환 증폭(RCA), 전사 매개 증폭 (TMA), 자가 유지 서열 복제(3SR), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 중 하나 이상을 포함한다.
숙련된 수신인은 상기 기재된 LOCS 올리고뉴클레오타이드의 분야가 오직 비제한적인 예시의 목적을 위해 제공된다고 용이하게 이해할 것이다. 개시된 LOCS 올리고뉴클레오타이드는 임의의 프라이머 기반 핵산 증폭 기법에 사용될 수 있고, 본 발명은 구체적으로 기재된 이 실시형태로 그렇게 제한되지 않는다.
- LOCS 리포터를 사용하여 생성된 앰플리콘의 검출
상기 기술된 바대로, 본 발명의 LOCS 리포터는 임의의 폴리뉴클레오타이드 증폭 기법에서 사용될 수 있고, 이의 비제한적인 예는 PCR, RT-PCR, SDA, HDA, RPA, LAMP, RCA, TMA, 3SR 또는 NASBA를 포함한다.
LOCS 리포터를 이용하는 기법에 의해 생성된 앰플리콘은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 절단되거나 분해될 수 있다. 비제한적인 예는 촉매 핵산, 엑소뉴클레아제(실시예 11 참조), 엔도뉴클레아제(실시예 10 참조) 등의 사용을 포함한다.
MNAzyme은 PCR, RT-PCR, SDA, HDA, RPA, TMA, LAMP, RCA, 3SR, 및 NASBA와 같은 방법을 통해 생성된 앰플리콘을 검출하여 LOCS 리포터를 개방하도록 사용될 수 있다. MNAzyme은 하나 이상의 파트자임(들)을 포함할 수 있다. MNAzyme은 조립된 다성분 핵산 효소이며, 오직 어셈블리 촉진자의 존재 하에 촉매 활성이며, 이 촉진자는 예를 들어 검출할 표적, 예컨대, 프라이머를 사용하여 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 생성된 앰플리콘일 수 있다. MNAzyme은 다중 부분-효소, 또는 파트자임으로 이루어지고, 이는 하나 이상의 어셈블리 촉진자의 존재 하에 자가 조립하고 기질을 효소 변형시키는 활성 MNAzyme을 형성한다. 기질 및 어셈블리 촉진자(표적)는 별개의 핵산 분자이다. 파트자임은 (i) 어셈블리 촉진자(예컨대, 표적 핵산)에 결합하는 센서 아암; (ii) 기질에 결합하는 기질 아암, 및 (iii) 어셈블리 시, 조합하여 완전한 촉매 코어를 제공하는 부분 촉매 코어 서열을 포함하는 다수의 도메인을 갖는다. MNAzyme은 예를 들어 상이한 표적 핵산 서열을 포함하는 어셈블리 촉진자의 넓은 범위를 인식하도록 설계될 수 있다. 어셈블리 촉진자의 존재에 반응하여, MNAzyme은 이의 기질을 변형시킨다. 이 기질 변형은 신호 생성에 연결될 수 있고, 이에 따라 MNAzyme은 효소로 증폭된 출력 신호를 생성할 수 있다. 어셈블리 촉진자는 생물학적 샘플은 환경적 샘플에 존재하는 표적 핵산(예를 들어, 프라이머를 사용하여 폴리뉴클레오타이드 표적으로부터 생성된 앰플리콘)일 수 있다. 이러한 경우에, MNAzyme 활성에 의한 기질의 변형의 검출은 표적의 존재를 나타낸다. 핵산 기질을 절단할 수 있는 여러 MNAzyme은 당해 분야에 공지되어 있다. MNAzyme 및 이의 변형된 형태는 당해 분야에 공지되고, PCT 국제공개 WO/2007/041774호, 국제공개 WO/2008/040095호, 국제공개 WO2008/122084호, 및 관련된 미국 특허출원공개 2007-0231810호, 미국 특허출원공개 2010-0136536호 및 미국 특허출원공개 2011-0143338호(이들 문헌의 각각의 내용은 본원에 그 전체가 인용되어 포함됨)에 개시되어 있다.
- 진단학적 분야
LOCS 올리고뉴클레오타이드는 본원에 기재된 방법에 따라 진단학적 목적 및/또는 예후적 목적에 사용될 수 있다. 진단학적 목적 및/또는 예후적 방법은 생체내 또는 시험관내 수행될 수 있다. 그러나, 본 발명의 발명은 진단학적 목적 및/또는 예후적 목적에 반드시 사용될 필요는 없고, 그러므로 진단학적 또는 예후적이 아닌 분야가 또한 고려된다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 대상체에서의 감염을 진단하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 대상체에서 박테리아, 바이러스, 진균/효모, 원생생물 및/또는 선충에 의한 감염을 진단하도록 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 바이러스는 엔테로바이러스일 수 있다. 대상체는 소, 말, 양, 영장류, 조류 또는 설치류의 종일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 포유류, 예컨대 인간, 개, 고양이, 말, 양, 염소 또는 소일 수 있다. 대상체는 감염으로 생긴 질환으로 고통받을 수 있다. 예를 들어, 대상체는 엔테로바이러스 감염에서 생긴 뇌수막염을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명의 발명은 소정의 실시형태에서 뇌수막염을 진단하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 발명은 샘플에서 수행될 수 있다. 샘플은 임의의 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 환경 공급원, 산업 공급원으로부터 또는 화학 합성에 의해 얻어질 수 있다.
본원에 고려된 바와 같은 "샘플"이 예를 들어 임의의 다른 성분 또는 성분의 정제, 희석 또는 첨가에 의해 이의 원래의 상태로부터 변형된 샘플을 포함한다고 이해될 것이다.
비제한적인 예로서 진단학적 방법 및/또는 예후적 방법을 포함하는 본 발명의 발명은 생물학적 샘플에서 수행될 수 있다. 생물학적 샘플은 대상체로부터 취해질 수 있다. 저장된 생물학적 샘플이 또한 사용될 수 있다. 적합한 생물학적 샘플의 비제한적인 예는 전혈 또는 이의 성분(예를 들어, 혈액 세포, 혈장, 혈청), 뇨, 대변, 타액, 림프, 담즙, 가래, 눈물, 뇌척수액, 기관지폐포세척액, 활액, 정액, 복수 종양 유체, 모유 및 고름을 포함한다.
키트
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 하나 이상의 제제를 포함하는 키트를 제공한다. 전형적으로, 본 발명의 발명을 수행하기 위한 키트는 상기 방법을 실행하기 위한 모든 필요한 시약을 함유한다.
일부 실시형태에서, 키트는 적절한 어셈블리 촉진자(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 앰플리콘)의 존재 하에 MNAzyme을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 적어도 제1 파트자임 및 제2 파트자임을 포함하는 제1 올리고뉴클레오타이드 성분 및 제2 올리고뉴클레오타이드 성분, 및 기질을 포함하는 제2 용기를 포함할 수 있고, 여기서 MNAzyme으로의 제1 파트자임 및 제2 파트자임, 및 기질의 자가 어셈블리는 시험 샘플에 존재하는 어셈블리 촉진자(예를 들어, 앰플리콘)의 회합을 요한다. 따라서, 이러한 실시형태에서, 제1 파트자임 및 제2 파트자임, 및 루프 영역 내에 기질을 함유하는 LOCS 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 표적 앰플리콘의 존재를 결정하기 위해 시험 샘플에 적용될 수 있다. 일반적으로, 키트는 본원에 제공된 적어도 하나의 LOCS 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 키트는 또한 본 발명의 방법, 예컨대 PCR 또는 다른 핵산 증폭 기법의 수행에 필요한 바와 같은 다른 시약, 세척 시약, 효소 및/또는 다른 시약을 포함할 것이다.
키트는 본원에 정의된 바와 같은 단편화된 키트 또는 조합된 키트일 수 있다.
단편화된 키트는 별개의 용기에 하우징된 시약을 포함하고, 작은 유리 용기, 플라스틱 용기 또는 플라스틱 또는 종이의 스트립을 포함할 수 있다. 이러한 용기는 샘플 및 시약의 교차 오염, 및 정량적 방식으로 하나의 구획으로부터 다른 구획으로의 각각의 용기의 물질 또는 용액의 첨가를 피하면서 하나의 구획으로부터 다른 구획으로의 시약의 효율적인 이동을 허용할 수 있다.
이러한 키트는 또한 시험 샘플을 수용하는 용기, 검정에 사용된 시약을 함유하는 용기, 세척 시약을 함유하는 용기, 및 검출 시약을 함유하는 용기를 포함할 수 있다.
조합된 키트는 단일 용기(예를 들어, 각각의 원하는 성분을 하우징하는 단일 박스)에서 반응 검정의 모든 성분을 포함한다.
본 발명의 키트는 적절한 방법을 수행하도록 키트 성분을 사용하기 위한 설명서를 또한 포함할 수 있다. 본 발명의 키트 및 방법은 예를 들어 비제한적인 예로서 실시간 PCR 기계를 포함하는 자동화 분석 장비 및 시스템과 함께 사용될 수 있다.
상이한 표적의 증폭, 검출, 확인 또는 정량화에 적용을 위해, 본 발명의 단일 키트가 적용 가능할 수 있거나, 대안적으로 예를 들어 각각의 표적에 특이적인 시약을 함유하는 상이한 키트가 필요할 수 있다. 본 발명의 방법 및 키트는 임의의 집합체를 검출하거나 확인하거나 정량화하는 것이 바람직한 임의의 상황에서 사용된다.
당업자에 의해 광범위하게 기재된 바와 같은 본 발명의 정신 또는 범위로부터 벗어나지 않으면서 구체적인 실시형태에 개시된 것으로 본 발명에 많은 변경 및/또는 변형이 이루어질 수 있다고 이해될 것이다. 본 실시형태는 따라서 예시적이고 비제한인 것으로 모든 면에서 여겨진다.
실시예
본 발명은 하기 구체적인 실시예를 참조하여 더 자세히 추가로 이제 기재될 것이고, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 임의의 방식으로 해석되지 않아야 한다.
실시예 1: 다중화 능력을 증가시키는 LOCS 리포터의 사용
하기 실시예에서, LOCS 리포터는 단일 형광 채널로부터 검출될 수 있는 표적의 수를 증가시키도록 사용된다. 이 실시예에서, 2개의 LOCS 리포터는 형광단(FAM)으로 5' 표지되고, 켄쳐로 3' 표지된다. LOCS 리포터의 루프 영역은 핵산 기질을 함유하고, 줄기 영역은 줄기-루프 구성에서 LOCS 리포터를 구속하는 일련의 상보성 염기-쌍을 함유한다. 이 구성에서, 형광단 및 켄쳐는 가깝게 근접하고, 형광은 표적의 부재 하에 켄칭된다.
올리고뉴클레오타이드
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-1(서열 번호 1), LOCS-2(서열 번호 2), 파트자임 A1(서열 번호 3), 파트자임 B1(서열 번호 4), 파트자임 A2(서열 번호 5), 파트자임 B2(서열 번호 6), 정방향 프라이머 1(서열 번호 7), 역방향 프라이머 1(서열 번호 8), 정방향 프라이머 2(서열 번호 9) 및 역방향 프라이머 2(서열 번호 10)를 포함한다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다. MgPa 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-1, 파트자임 A1, 파트자임 B1, 정방향 프라이머 1 및 역방향 프라이머 1이다. TV-Btub 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-2, 파트자임 A2, 파트자임 B2, 정방향 프라이머 2 및 역방향 프라이머 2이다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 BioRad® CFX96 유전자증폭기를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 사이클링 매개변수는 2분 동안 95℃, 5초 동안 95℃ 및 30초 동안 61℃의 10회 터치다운 사이클(사이클마다 0.5℃ 감분) 및 5초 동안 95℃ 및 40초 동안 52℃의 40회 사이클(데이터는 52℃ 단계에서 수집됨)이었다. 용융 곡선 매개변수는 5초 유지(유지 중 데이터 획득)로 20℃에서 90℃로 0.5℃ 증분이었다. 모든 반응은 이중반복 실행되었고, 40 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머, 200 nM의 각각의 파트자임 A, 200 nM의 각각의 파트자임 B, 200 nM의 각각의 LOCS 리포터, 2 mM MgCl2(Bioline) 및 1x SensiFAST 프로브 No-ROX Mix(Bioline)를 함유하였다. 반응은 MgPa 및/또는 TV-Btub 유전자에 상동성인 G-Block 주형(10,000개 또는 40개 카피), 또는 무 표적(뉴클레아제 비함유 H2O(NF H2O)) 중 어느 하나를 함유하였다.
결과
PCR로 공지된 시험관내 표적 증폭 방법을 이용하여, 2개의 MNAzyme(MNAzyme 1 및 MNAzyme 2)은 이의 상응하는 LOCS 리포터(각각 LOCS-1 및 LOCS-2)의 절단을 통해 실시간으로 표적 핵산의 증폭을 모니터링하도록 사용된다. MNAzyme 1은 MgPa 유전자(마이코플라스마 게니탈리움(Mycoplasma genitalium))에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-1을 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 2는 TV-Btub(트리초모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis))에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-2를 절단하고 개방하도록 설계되었다. 이 실험에서, 증폭 및 검출은 모든 MNAzyme, 프라이머 및 LOCS 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 단일 관(tube)에서 수행되었다. MgPa, 또는 TV-Btub 중 어느 하나, 또는 MgPa 및 TV-Btub 둘 다(동시감염을 갖는 샘플을 나타냄)의 존재는 FAM 채널에서의 신호의 증가에 의해 검출되었다.
도 4에 도시된 결과는 표적 MgPa(도 4의 A), TV-Btub(도 4의 C) 또는 MgPa 및 TV-Btub 둘 다(도 4의 E)의 10,000개의 카피(검정 선), 40개의 카피(회색 선) 또는 0개의 카피(점선)를 함유하는 반응으로부터의 각각의 PCR 증폭 도표를 예시한다. 10,000개의 카피(검정 선) 및 40개의 카피(회색 선)를 함유하는 반응으로부터 증폭 후 얻은 용융 곡선 서명은 표적 MgPa(도 4의 B), TV-Btub(도 4의 D) 또는 MgPa 및 TV-Btub 둘 다(도 4의 F)에 도시되어 있다. 결과는 마이크로소프트 엑셀(버전 14)을 사용하여 작도된 이중반복 반응으로부터의 평균이다. 이 실시예로부터의 데이터는 MgPa 유전자 표적의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명(Tm = 35℃ 및 41℃)이 TV-Btub 유전자 표적의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명(Tm = 50℃)과 구별된다는 것을 입증한다. 추가로, MgPa 및 TV-Btub 유전자 표적 둘 다의 존재 하의 LOCS 용융 서명은 또한 상기 언급된 용융 서명과 구별되는데, 오직 단일 유전자 표적이 존재한다. 표적 둘 다가 존재할 때, 용융 곡선 서명(Tm = 35℃, 41℃ 및 50℃)은 표적 둘 다가 검출되었다는 것을 나타냈다.
이 실험으로부터의 데이터는 또한 각각의 개방 LOCS의 용융 서명이 높은 표적 농도(10,000개의 유전자 카피) 및 낮은 표적 농도(40개의 유전자 카피)를 함유하는 반응에 재현 가능하다는 것을 입증한다. 이 실시예는 단일 형광 채널을 사용하여 단일 웰에서 동시증폭된 2개의 표적이 이의 고유한 LOCS 용융 서명에 기초하여 구별될 수 있다는 것을 입증한다. 이 실시예는 단일 형광 채널을 사용하여 단일 웰에서 다수의 표적을 검출하는 데 유용한 단순한 방법을 제공한다.
온전한, 폐쇄 LOCS 리포터의 융점(Tm)은 반응의 어닐링 온도(52'C)보다 높도록 설계되어서, 이 LOCS는 표적 증폭의 부재 하에 반응 동안 충분히 켄칭된 채이다. 줄기 영역의 Tm은 각각의 LOCS 리포터에 대해 고유하도록 설계되고, 이는 줄기를 형성하는 상보성 영역의 길이 및 뉴클레오타이드 조성을 변형시켜 달성된다. 이 실시예에서, 데이터는 MNAzyme을 사용한 루프 영역의 절단이 LOCS를 개방하여 2개의 단편으로의 분리를 허용한다는 시나리오와 일치한다. 폐쇄된, 온전한 LOCS 리포터와 개방 LOCs 리포터 사이의 Tm의 큰 차이로 인해 개방 LOCS 단편은 어닐링 및 데이터 획득 온도에서 듀플렉스 형성을 지속시키기에 충분히 안정하지 않아서, 형광 신호가 생성된다.
2개의 표적 유전자의 실시간 모니터링은 Ct(사이클 역치)로 공지될 수 있는 값을 생성하는 임의의 역치를 초과하는 형광 곡선을 생성하였다. 증폭 단계 동안 관찰된 형광 곡선은 표적 유전자의 하나 또는 둘 다가 주어진 샘플에 존재한다는 것을 나타낸다. 그러나, 특정 표적의 아이덴티티는 증폭 곡선 단독을 사용하여 구분될 수 없다. 이 상황에서, 용융 곡선 분석은 어떤 LOCS 리포터가 절단되는지를 결정하고 이로써 샘플 내에 존재하는 특정 유전자 표적(들)을 확인하도록 수행되었다. 증폭 단계 이후, 샘플은 온도 구배에 노출되고, 여기서 상이한 용융 곡선 서명은 상이한 보편적 줄기와 상응한다. 개방 LOCS 리포터와 온전한 LOCS 리포터 사이의 Tm 차이로 인해, 절단된 LOCS 리포터 줄기는 비절단된 폐쇄 LOCS와 비교하여 더 낮은 온도에서 해리할 것이다. 더 나아가, 상이한 줄기 길이 및 염기-쌍 조성으로 인해, LOCS-1 및 LOCS-2 내의 상이한 줄기(줄기-1 및 줄기-2)는 고유한 형광 용융 곡선 서명을 생성하였다.
실시예 2: 다양한 유전자 표적의 검출을 위한 동일한 LOCS 리포터의 적용
이 실시예에서, 2개의 LOCS 리포터(LOCS-1 및 LOCS-2)는 임의의 관심 표적의 분석에 대한 이의 보편성 및 이용가능성을 나타내도록 다양한 상이한 유전적 표적을 구별하도록 사용된다. PCR 증폭을 이용하여, 몇몇 MNAzyme(MNAzyme 1 - 6)은 이의 특이적 유전자 표적을 검출하고 이의 상응하는 LOCS 리포터(LOCS-1 및 LOCS-2)를 절단하도록 사용되었다. MNAzyme 1, 3 및 4는 각각 이의 상응하는 유전자 표적의 존재 하에 LOCS-1을 절단하는 능력을 갖는다. MNAzyme은 2, 5 및 6은 각각 이의 상응하는 유전자 표적의 존재 하에 LOCS-2를 절단하는 능력을 갖는다. 이 실시예에서, 표 1에 요약된 듀플렉스 조합이 입증되는데, 여기서 증폭 및 검출이 단일 관에서 동시에 수행된다.
올리고뉴클레오타이드
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-1(서열 번호 1), LOCS-2(서열 번호 2), 파트자임 A1(서열 번호 3), 파트자임 B1(서열 번호 4), 파트자임 A2(서열 번호 5), 파트자임 B2(서열 번호 6), 정방향 프라이머 1(서열 번호 7), 역방향 프라이머 1(서열 번호 8), 정방향 프라이머 2(서열 번호 9), 역방향 프라이머 2(서열 번호 10), 파트자임 A3(서열 번호 11), 파트자임 B3(서열 번호 12), 파트자임 A4(서열 번호 13), 파트자임 B4(서열 번호 14), 정방향 프라이머 3(서열 번호 15), 역방향 프라이머 3(서열 번호 16), 정방향 프라이머 4(서열 번호 17), 역방향 프라이머 4(서열 번호 18), 파트자임 A5(서열 번호 19), 파트자임 B5(서열 번호 20), 파트자임 A6(서열 번호 21), 파트자임 B6(서열 번호 22), 정방향 프라이머 5(서열 번호 23), 역방향 프라이머 5(서열 번호 24), 정방향 프라이머 6(서열 번호 25) 및 역방향 프라이머 6(서열 번호 26)을 포함한다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다.
반응 성분 및 조건.
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 BioRad® CFX96 유전자증폭기를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 사이클링 매개변수는 2분 동안 95℃, 5초 동안 95℃ 및 30초 동안 61℃의 10회 터치다운 사이클(사이클마다 0.5℃ 감분) 및 5초 동안 95℃ 및 40초 동안 52℃의 40회 사이클(데이터는 52℃ 단계에서 수집됨)이었다. 용융 곡선 매개변수는 5초 유지(유지 중 데이터 획득)로 20℃에서 90℃로 0.5℃ 증분이었다. 모든 반응은 표 1에 기재된 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 듀플렉스 반응으로 수행되었다. 각각의 반응은 40 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머, 200 nM의 각각의 파트자임 A, 200 nM의 각각의 파트자임 B, 200 nM의 각각의 LOCS 리포터, 2 mM MgCl2(Bioline) 및 1x SensiFAST 프로브 No-ROX Mix(Bioline)를 함유하였다. 반응은 G-Block 주형(10,000개 또는 40개의 카피) 중 어느 하나 또는 무 표적(NF H2O)을 함유하였다. 도 5 및 도 6에 제시된 결과는 마이크로소프트 엑셀(버전 14)을 사용하여 작도된 이중반복으로부터의 평균이다.
결과
도 5(상부 패널)에 도시된 결과는 MgPa(도 5의 A1), HMPV(도 5의 B1) 및 CT-ompA(도 5의 C1)의 10,000개의 카피(검정 선), 40개의 카피(회색 선) 또는 0개의 카피(점선)를 함유하는 반응에 얻은 PCR 증폭 도표를 예시한다. 하부 패널에 도시된 결과는 MgPa(도 5의 A2), HMPV(도 5의 B2) 및 CT-ompA(도 5의 C2) 유전자 표적의 10,000개의 카피(검정 선) 및 40개의 카피(회색 선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 용융 곡선 서명이다. 3개의 표적은 MNAzyme 1, 3 및 5에 의해 특이적으로 검출되었고; 이들의 각각은 표적 특이적 센서 아암을 갖지만 이들의 모두는 동일한 기질 결합 아암을 가졌다. 각각의 MNAzyme은, 이의 표적 어셈블리 촉진자의 존재 하에 형성되면, 제1 보편적 기질 및 제1 보편적 줄기를 포함하는 동일한 보편적 LOCS-1에 결합하고 이를 절단하고 개방할 수 있었다. 그러므로, 각각의 표적의 존재는 제1 보편적 줄기의 Tm에 상응하는 40℃에서의 피크를 갖는 용융 곡선을 생성하였다.
도 6(상부 패널)에 도시된 결과는 표적 TV-Btub(도 6의 A1), VZV(도 6의 B1) 및 rpoB(도 6의 C1)의 10,000개의 카피(검정 선), 40개의 카피(회색 선) 또는 0개의 카피(점선)를 함유하는 반응에 얻은 PCR 증폭 도표를 예시한다. 하부 패널에 도시된 결과는 TV-Btub(도 6의 A2), VZV(도 6의 B2) 및 rpoB(도 6의 C2) 유전자 표적의 10,000개의 카피(검정 선) 및 40개의 카피(회색 선)를 함유하는 반응으로부터 얻은 용융 곡선 서명이다. 3개의 표적은 MNAzyme 2, 4 및 6에 의해 특이적으로 검출되었고; 이들의 각각은 표적 특이적 센서 아암을 갖지만 이들의 모두는 동일한 기질 결합 아암을 가졌다. 각각의 MNAzyme은, 이의 표적 어셈블리 촉진자의 존재 하에 형성되면, 제2 보편적 기질 및 제2 보편적 줄기를 포함하는 동일한 보편적 LOCS-2에 결합하고 이를 절단하고 개방할 수 있었다. 그러므로, 각각의 표적의 존재는 제2 보편적 줄기의 Tm에 상응하는 50℃에서의 피크를 갖는 용융 곡선을 생성하였다.
이 실시예로부터의 데이터는 필적하는 용융 서명이 상이한 표적 유전자의 검출을 위해 동일한 보편적 LOCS 리포터를 사용하여 제조된다는 것을 입증한다. LOCS 용융 서명은 표적 서열에 독립적인 것으로 입증되고, 따라서 임의의 검정으로 용이하게 실행될 수 있다. 이 실시예는 LOCS 리포터가 보편적이고 임의의 원하는 표적 유전자 또는 전사체의 검출에 적용될 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 3: 다중화 능력을 증가시키는 상이한 융점을 갖는 LOCS 리포터를 생성하기 위한 상이한 줄기의 사용
이 실시예에서, 상이한 줄기 조성물을 포함하는 LOCS 리포터는 최종 용융 서명에서 줄기 길이 및 염기-쌍 조성의 효과를 입증하도록 사용된다. 현재의 실시예에서, 4개의 LOCS 리포터는 형광단(FAM)으로 5' 표지되고, 켄쳐로 3' 표지된다. LOCS-1 및 LOCS-3은 기질 1을 함유하는 동일한 루프 영역을 함유하지만; LOCS-3(줄기 3)의 줄기 영역은 단일 염기 쌍만큼 LOCS-1(줄기 1)의 줄기 영역보다 길어서, 온전한(폐쇄된) 상태 및 개방 상태 둘 다에서 약간 더 높은 예측된 Tm을 갖는 구조를 생성시킨다. 표적 어셈블리 촉진자(AF-CT-Cds)의 존재 하에 어셈블리를 지시할 수 있는 표적 센서 아암 및 LOCS-1 또는 LOCS-3 중 어느 하나의 루프 내에 기질 1에 결합하고 절단할 수 있는 기질 아암을 갖는 MNAzyme은 등온 신호 검출을 모니터링하도록 사용되었다.
유사하게, LOCS-2 및 LOCS-4는 기질 2를 함유하는 동일한 루프 영역을 함유하지만; LOCS-2(줄기 2)의 줄기 영역은 2개의 염기 쌍만큼 LOCS-4(줄기 4)의 줄기 영역보다 길어서, 온전한(폐쇄된) 상태 및 개방 상태 둘 다에서 약간 더 높은 예측된 Tm을 갖는 구조를 생성시킨다. 표적 어셈블리 촉진자(AF-TFRC)의 존재 하에 어셈블리를 지시할 수 있는 표적 센서 아암 및 LOCS-2 또는 LOCS-4 중 어느 하나의 루프 내에 기질 2에 결합하고 절단할 수 있는 기질 아암을 갖는 MNAzyme은 PCR 증폭을 모니터링하도록 사용되었다.
- 반응 성분 및 조건
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-1(서열 번호 1), LOCS-2(서열 번호 2), LOCS-3(서열 번호 27), LOCS-4(서열 번호 28), 파트자임 A7(서열 번호 29), 파트자임 B7(서열 번호 30), 파트자임 A8(서열 번호 31), 파트자임 B8(서열 번호 32), AF-CT-Cds(서열 번호 33) 및 AF-TFRC(서열 번호 38)를 포함한다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다.
표적 서열의 실시간 검출은 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 각각의 반응은 1x NH4 완충액(Bioline), 8 mM MgCl2(Bioline), 200 nM의 각각의 파트자임 및 200 nM의 LOCS 리포터를 함유한다. 반응은 10 nM의 최종 농도에서 표적 어셈블리 촉진자를 함유하거나, 표적이 결여되었다(무 DNA 대조군). 반응은 52'C에서 BioRad® CFX96 유전자증폭기에서 항온처리되고, 총 150회 사이클 동안 10초마다 취한 획득을 취했다. 다음에, 샘플을 0.5℃ 증분 및 5초 보유 시간(각각의 보유에서 획득)으로 20℃ 내지 90℃의 증가하는 온도 구배로 처리하였다. 도 7에 제시된 결과는 마이크로소프트 엑셀(버전 14)을 사용하여 작도된 이중반복으로부터의 평균이다.
결과
표 2 및 도 7에 도시된 결과는 표적이 결여된 반응에 존재하는 폐쇄된, 온전한 LOCS 리포터에 대해 얻은 용융 곡선 서명(점선), 및 특이적 LOCS 리포터를 절단하고 개방할 수 있는 MNAzyme의 어셈블리를 지시한 표적을 함유하는 반응에서 개방 LOCS 리포터와 일치하는 것(검정 선)에서의 차이를 예시한다.
추가로, 이 실시예로부터의 데이터는 줄기 영역의 서열 및 또는 길이가 변할 때 얻은 용융 서명의 차이를 나타낸다. 데이터는 개방 LOCS-1이 개방 LOCS-3의 것(36℃)과 비교하여 더 낮은 Tm(30℃)을 갖는 용융 서명을 생성한다는 것을 입증한다. 유사하게, 개방 LOCS-4는 개방 LOCS-2의 것(50℃)과 비교하여 더 낮은 Tm(32℃)을 갖는 용융 서명을 생성한다. 이 결과는 LOCS-1 및 LOCS-4가 각각 LOCS-3 및 LOCS-2보다 더 짧은 줄기를 갖는다는 사실과 일치한다. 더 나아가, 각각의 LOCS는 다른 LOCS 리포터와 구별되는 고유한 용융 서명을 생성한다. 이 실험은 상이한 용융 서명이 줄기 영역의 길이 및 조성을 변형시켜 생성될 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, 몇개의 LOCS-리포터는 단일 채널로부터 다수의 표적의 검출을 달성하도록 동시에 사용될 수 있었다. 더 나아가, 이 실험에서 생성된 데이터는 등온 표적 검출을 이용하여 달성되어서, LOCS 리포터가 일련의 상이한 바이오센싱 기법에 의해 사용될 수 있다는 것을 예시한다.
실시예 4: 몇몇 플랫폼에 걸친 LOCS 리포터 적합가능성
이 실시예에서, 2개의 LOCS 리포터는 몇몇 흔히 사용된 PCR 플랫폼에 걸쳐 이의 적합가능성에 대해 시험된다. 2개의 MNAzyme(MNAzyme 1 및 MNAzyme 2)은 이의 상응하는 LOCS 리포터(각각 LOCS-1 및 LOCS-2)의 절단을 통해 실시간으로 표적 핵산의 증폭을 모니터링하도록 사용된다. 이 실시예에서, 2개의 상이한 유전자, 즉 MgPa 유전자(마이코플라스마 게니탈리움) 및 TV-Btub(트리초모나스 바기날리스)의 증폭 및 검출은 단일 관에서 동시에 수행되고, 여기서 둘 다는 FAM 채널에서 신호를 생성할 수 있다.
반응 성분 및 조건
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-1(서열 번호 1), LOCS-2(서열 번호 2), 파트자임 A1(서열 번호 3), 파트자임 B1(서열 번호 4), 파트자임 A2(서열 번호 5), 파트자임 B2(서열 번호 6), 정방향 프라이머 1(서열 번호 7), 정방향 프라이머 2(서열 번호 8), 역방향 프라이머 1(서열 번호 9) 및 역방향 프라이머 2(서열 번호 10)를 포함한다. MgPa 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-1, 파트자임 A1, 파트자임 B1, 정방향 프라이머 1 및 역방향 프라이머 1이다.
TV-Btub 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-2, 파트자임 A2, 파트자임 B2, 정방향 프라이머 2 역방향 프라이머 1 및 역방향 프라이머 2이다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다.
사이클링 매개변수는 2분 동안 95℃, 5초 동안 95℃ 및 30초 동안 61℃의 10회 터치다운 사이클(사이클마다 0.5℃ 감분) 및 5초 동안 95℃ 및 40초 동안 52℃의 40회 사이클(데이터는 52℃ 단계에서 수집됨)이었다. BioRad® CFX96 유전자증폭기에 대한 용융 곡선 매개변수는 5초 유지(유지 중 데이터 획득)로 20℃에서 90℃로 0.5℃ 증분이었다. Lightcycler 480 유전자증폭기에 대한 용융 곡선 매개변수는 각각의 온도에서 1초 유지로 20℃ 내지 90℃의 범위당 0.02℃의 상승 속도로 연속 획득 모드로 설정되었다. ABI 7500 유전자증폭기에 대한 용융 곡선 매개변수는 5초 유지(유지 중 데이터 획득)로 20℃에서 90℃로 1% 상승 속도로 설정되었다. Xxpress PCR 유전자증폭기에 대한 용융 곡선 매개변수는 0.5초 유지(유지 중 데이터 획득)로 30℃에서 90℃로 0.5℃ 증분이었다. 모든 반응은 이중반복 실행되었고, 40 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머, 200 nM의 각각의 파트자임 A, 200 nM의 각각의 파트자임 B, 200 nM의 각각의 LOCS 리포터, 2 mM MgCl2(Bioline) 및 1x SensiFAST 프로브 No-ROX Mix(Bioline)를 함유하였다. 표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 반응이 15 μL 부피에서 수행된 XXpress PCR 유전자증폭기에서 실행됨을 제외하고는 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 반응은 G-Block 주형(10,000개 또는 40개의 카피) 중 어느 하나 또는 무 표적(NF H2O)을 함유하였다. 표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 BioRad® CFX96 유전자증폭기, Lightcycler 480 유전자증폭기, ABI 7500 유전자증폭기 및 XXpress PCR 유전자증폭기를 사용하여 수행되었다.
- 결과
도 8 및 도 9에서의 결과는 BioRad® CFX96 유전자증폭기(패널 A) 또는 Lightcycler 480 유전자증폭기(패널 B), 또는 ABI 7500 유전자증폭기(패널 C), 또는 XXpress PCR 유전자증폭기(패널 D)에서 증폭을 수행할 때 각각 MgPa 및 TV-Btub 표적의 증폭 후 얻은 용융 곡선을 보여준다. 표적 둘 다는 모든 기계에서 FAM 채널에서 모니터링되었다. 도 8의 D 및 도 9의 D에 예시된 결과는 3분 용융 곡선 프로토콜을 이용하여 얻어져서, LOCS 리포터를 사용한 용융 곡선 차이가 신속한 조건을 사용하여 달성될 수 있다는 것을 입증한다. 데이터는 2개의 상이한 LOCS 리포터를 사용하여 상이한 플랫폼에 걸쳐 얻은 필적하는 용융 곡선 서명을 생성하는 능력을 입증한다. 추가로, 데이터는 필적하는 용융 곡선 서명을 생성하는 능력이 변하는 용융 곡선 매개변수를 사용하여 얻어진다고 것을 입증한다.
실시예 5: 몇몇 형광 채널에 걸친 LOCS 리포터 적합가능성
이 실시예에서, 10개의 LOCS 리포터는 몇몇 흔히 사용된 형광 채널에 걸쳐 이의 적합가능성에 대해 시험된다. 2개의 MNAzyme(MNAzyme 1 및 MNAzyme 2)은 이의 상응하는 LOCS 리포터의 절단을 통해 실시간으로 표적 핵산의 증폭을 모니터링하도록 사용된다. 이 실시예에서, 동일한 LOCS 리포터 서열이 사용되지만, LOCS는 상이한 형광단 및 켄쳐 쌍으로 표지된다. 이 예에서, 2개의 상이한 유전자, 즉 MgPa 유전자(마이코플라스마 게니탈리움) 및 TV-Btub(트리초모나스 바기날리스)의 증폭 및 검출은 단일 관에서 동시에 수행되고, 여기서 둘 다는 동일한 채널에서 신호를 생성할 수 있다. FAM, HEX, Texas Red 및 Cy5를 포함하여 여러 형광 채널이 시험되었다.
반응 성분 및 조건
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-1(서열 번호 1), LOCS-2(서열 번호 2), 파트자임 A1(서열 번호 3), 파트자임 B1(서열 번호 4), 파트자임 A2(서열 번호 5), 파트자임 B2(서열 번호 6), 정방향 프라이머 1(서열 번호 7), 정방향 프라이머 2(서열 번호 8), 역방향 프라이머 1(서열 번호 9), 역방향 프라이머 2(서열 번호 10), LOCS-5(서열 번호 35) LOCS-6(서열 번호 36), LOCS-7(서열 번호 37) LOCS-8(서열 번호 38), LOCS-9(서열 번호 39) 및 LOCS-10(서열 번호 40)을 포함한다. MgPa 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 파트자임 A1, 파트자임 B1, 정방향 프라이머 1, 역방향 프라이머 1 및 LOCS-1, LOCS-5, LOCS-7 또는 LOCS-9 중 어느 하나이다. TV-Btub 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 파트자임 A2, 파트자임 B2, 정방향 프라이머 2, 역방향 프라이머 2 및 LOCS-2, LOCS-6, LOCS-8 또는 LOCS-10 중 어느 하나이다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다.
사이클링 매개변수는 2분 동안 95℃, 5초 동안 95℃ 및 30초 동안 61℃의 10회 터치다운 사이클(사이클마다 0.5℃ 감분) 및 5초 동안 95℃ 및 40초 동안 52℃의 40회 사이클(데이터는 52℃ 단계에서 수집됨)이었다. BioRad® CFX96 유전자증폭기에 대한 용융 곡선 매개변수는 5초 유지(유지 중 데이터 획득)로 20℃에서 90℃로 0.5℃ 증분이었다. 모든 반응은 이중반복 실행되었고, 40 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머, 200 nM의 각각의 파트자임 A, 200 nM의 각각의 파트자임 B, 200 nM의 각각의 LOCS 리포터, 2 mM MgCl2(Bioline) 및 1x SensiFAST 프로브 No-ROX Mix(Bioline)를 함유하였다. 표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 BioRad® CFX96 유전자증폭기를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 반응은 G-Block 주형(10,000개 또는 40개의 카피) 중 어느 하나 또는 무 표적(NF H2O)을 함유하였다.
- 결과
도 10에서의 결과는 BioRad® CFX96 유전자증폭기에서 증폭을 수행할 때 각각 MgPa 및 TV-Btub 표적의 증폭 후 얻은 용융 곡선을 보여준다. 표적 둘 다는 단일 형광 채널에서 동시에 모니터링되었다. 검정색으로 기재된 결과는 MgPa 유전자의 존재 하에 얻은 용융 곡선을 예시하고, 회색으로 기재된 결과는 TV-Btub 표적의 존재 하에 얻은 용융 곡선 서명을 예시한다. 실선은 10,000개의 카피의 표적 농도를 나타내고, 점선은 40개의 카피의 표적 농도를 나타낸다. 도 10의 A에 예시된 결과는 FAM 채널에서 LOCS-1 및 LOCS-2를 사용하여 얻은 용융 곡선을 예시한다. 도 10의 B에 예시된 용융 곡선은 HEX 채널에서 LOCS-5 및 LOCS-6을 사용하여 얻었다. 도 10의 C에 예시된 용융 곡선은 Texas Red 채널에서 LOCS-7 및 LOCS-8을 사용하여 얻었고, 도 10의 D에 예시된 용융 곡선은 Cy5 채널에서 LOCS-9 및 LOCS-10을 사용하여 얻었다. 데이터는 동일한 2개의 LOCS 줄기 및 기질을 사용하여, 그러나 단순히 형광단-켄쳐 쌍을 변화시켜 상이한 형광 채널에 걸쳐 얻은 필적하는 용융 곡선 서명을 생성하는 능력을 입증한다.
실시예 6: LOCS 리포터를 사용한 단일 형광 채널에서 3개의 표적의 동시 검출
하기 실시예에서, LOCS 리포터는 단일 형광 채널로부터 검출될 수 있는 표적의 수를 증가시키도록 사용된다. 이 예에서, 3개의 LOCS 리포터는 형광단(FAM)으로 5' 표지되고, 켄쳐로 3' 표지된다. LOCS 리포터의 루프 영역은 핵산 기질을 함유하고, 줄기 영역은 루프-줄기 구성에서 LOCS 리포터를 구속하는 일련의 상보성 염기-쌍을 함유한다. 이 구성에서, 형광단 및 켄쳐는 가깝게 근접하고, 형광은 표적의 부재 하에 켄칭된다.
올리고뉴클레오타이드
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-1(서열 번호 1), LOCS-2(서열 번호 2), 파트자임 A1(서열 번호 3), 파트자임 B1(서열 번호 4), 파트자임 A2(서열 번호 5), 파트자임 B2(서열 번호 6), 정방향 프라이머 1(서열 번호 7), 역방향 프라이머 1(서열 번호 8), 정방향 프라이머 2(서열 번호 9), 역방향 프라이머 2(서열 번호 10), LOCS-11(서열 번호 45), 파트자임 A9(서열 번호 43), 파트자임 B9(서열 번호 44), 정방향 프라이머 7(서열 번호 41) 및 역방향 프라이머 7(서열 번호 42)을 포함한다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다. MgPa 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-1, 파트자임 A1, 파트자임 B1, 정방향 프라이머 1 및 역방향 프라이머 1이다. TV-Btub 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-2, 파트자임 A2, 파트자임 B2, 정방향 프라이머 2 및 역방향 프라이머 2이다. CTcry 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-11, 파트자임 A9, 파트자임 B9, 정방향 프라이머 7 및 역방향 프라이머 7이다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 BioRad® CFX96 유전자증폭기를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 사이클링 매개변수는 2분 동안 95℃, 5초 동안 95℃ 및 30초 동안 61℃의 10회 터치다운 사이클(사이클마다 0.5℃ 감분) 및 5초 동안 95℃ 및 40초 동안 52℃의 35 사이클(데이터는 52℃ 단계에서 수집됨)이었다. 용융 곡선 매개변수는 5초 유지(유지 중 데이터 획득)로 20℃에서 90℃로 0.5℃ 증분이었다. 모든 반응은 이중반복 실행되었고, 40 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머, 200 nM의 각각의 파트자임 A, 200 nM의 각각의 파트자임 B, 200 nM의 각각의 LOCS 리포터, 2 mM MgCl2(Bioline) 및 1x SensiFAST 프로브 No-ROX Mix(Bioline)를 함유하였다. 반응은 MgPa 및/또는 TV-Btub 및/또는 CTcry 유전자에 상동성인 G-Block 주형(10,000개의 카피) 중 어느 하나, 또는 무 표적 (NF H2O)을 함유하였다.
결과
PCR로 공지된 시험관내 표적 증폭 방법을 이용하여, 3개의 MNAzyme(MNAzyme 1, MNAzyme 2 및 MNAzyme 9)은 이의 상응하는 LOCS 리포터(각각 LOCS-1, LOCS-2 및 LOCS-11)의 절단을 통해 실시간으로 표적 핵산의 증폭을 모니터링하도록 사용된다. MNAzyme 1은 MgPa 유전자(마이코플라스마 게니탈리움)에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-1을 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 2는 TV-Btub(트리초모나스 바기날리스)에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-2를 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 9는 CTcry(클라미디아 트라초마티스)에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-11을 절단하고 개방하도록 설계되었다. 이 실험에서, 증폭 및 검출은 모든 MNAzyme, 프라이머 및 LOCS 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 단일 관에서 수행되었다. MgPa, TV-Btub, CTcry 중 어느 하나 또는 3개의 다양한 조합(다중 감염을 갖는 샘플을 나타냄)의 존재는 FAM 채널에서의 신호의 증가에 의해 검출되었다.
도 11 및 도 12에 도시된 결과는 표적 MgPa(도 11의 A), TV-Btub(도 11의 B), CTcry(도 11의 C), MgPa 및 TV-Btub 둘 다(도 11의 D), MgPa 및 CTcry 둘 다(도 11의 E), TV-Btub 및 CTcry 둘 다(도 11의 F), 또는 MgPa, TV-Btub 및 CTcry의 모든 3개(도 12)의10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터의 증폭 후 얻은 각각의 용융 곡선 서명을 예시한다. 결과는 마이크로소프트 엑셀(버전 14)을 사용하여 작도된 이중반복 반응으로부터의 평균이다.
표 3에 요약된 이 실시예로부터의 데이터는 MgPa 유전자 표적(Tm = 39℃ 및 66℃)의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명이 TV-Btub(Tm = 49℃ 및 64℃) 및 CTcry(Tm = 30℃, 41℃ 및 64℃) 유전자 표적의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명과 구별된다는 것을 입증한다. 추가로, 2개 이상의 유전자 표적의 존재 하의 LOCS 용융 서명은 또한 상기 언급된 용융 서명과 구별되는데, 오직 단일 유전자 표적이 존재한다. MgPa 및 TV-Btub 표적이 단일 반응 내에 존재할 때, 고유한 용융 곡선 서명(Tm = 39℃, 49℃ 및 66℃)은 표적 둘 다가 검출되었다는 것을 나타냈다. 유사하게, MgPa 및 CTcry 또는 TV-Btub 및 CTcry가 단일 반응 내에 존재할 때, 고유한 용융 곡선 서명(각각 (Tm = 31℃, 41℃ 및 74℃) 및 (Tm = 30℃, 41℃, 49℃ 및 66℃))은 2개의 표적이 검출되었다는 것을 나타냈다. MgPa, TV-Btub 및 CTcry 표적이 모두 단일 반응 내에 존재할 때, 고유한 용융 곡선 서명(Tm = 30℃, 41℃ 및 49℃)은 모든 3개의 표적이 검출되었다는 것을 나타냈다.
이 실시예는 단일 형광 채널을 사용하여 단일 웰에서 동시증폭된 3개의 표적이 이의 고유한 LOCS 용융 서명에 기초하여 구별될 수 있다는 것을 입증한다. 이 실시예는 단일 형광 채널을 사용하여 단일 웰에서 다수의 표적을 검출하는 데 유용한 단순한 방법을 제공한다. 상이한 줄기 길이 및 염기-쌍 조성으로 인해, LOCS-1, LOCS-2 및 LOCS-11 내의 상이한 줄기(줄기-1, 줄기-2 및 줄기-3)는 고유한 형광 용융 곡선 서명을 생성하였다.
이 구체적인 실시예에서 개방 LOCS 1(MgPa를 나타내는 약 39℃에서의 하나의 피크) 및 개방 LOCS 3(CTcry를 나타내는 약 30/31℃ 및 약 41℃에서의 2개의 피크)의 Tm은 MgPa 및 CTcry 표적 둘 다가 존재할 때 병합 피크를 생성시킨다. 그럼에도 불구하고 MgPa, TV-Btub 및 CTcry(도 12)를 함유하는 반응은 개방 LOCS 1의 Tm(약 64℃)의 피크의 소실에 의해 TV-Btub 및 CTcry(도 11의 F)를 오직 함유하는 것과 구별될 수 있다. 병합 피크가 상기 방법에 이상적이지 않지만, 더 명확한 구별된 피크를 생성하는 대안적인 줄기 서열은 실시예 7에 기재된 줄기 스크리닝 검정을 이용하여 용이하게 확인될 수 있다.
실시예 7: LOCS 리포터 올리고뉴클레오타이드로 혼입될 수 있는 보편적 줄기로서 사용하기에 적합한 서열을 스크리닝하는 방법
하기 실시예에서, 일련의 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드(DSO)는 보편적 줄기로서의 사용에 대한 적합성에 대해 스크리닝되었다. 루프에 의해 연결되지 않은 이 DSO는 SYBR green I 인터칼레이팅 염료의 존재 하에 점진적으로 증가하는 온도로 처리되었다. 이 용융 곡선 스크리닝 검정은 구별되는 온도에서 용융하는 시리즈 DSO를 확인하기 위해 다양한 서열 길이 및 조성을 시험하도록 사용될 수 있고, 후속하여 LOCS 리포터 올리고뉴클레오타이드 내에 보편적 줄기로 혼입될 수 있다. SYBR green I은 이중 가닥 DNA 구조에 결합할 때 형광 신호를 생성하는 인터칼레이팅 염료이다. 증가하는 온도 구배에 노출 시, DSO의 2개의 올리고뉴클레오타이드 가닥은 해리하고, 형광이 감소한다. 하기 실시예는 2개의 올리고뉴클레오타이드가 해리하는 온도(Tm)가 다양한 줄기 길이 및 조성에 의해 조절될 수 있다는 것을 입증한다. 더 나아가, DSO는 어떻게 Tm이 올리고뉴클레오타이드 농도를 변형시켜 추가로 조작될 수 있는지를 나타내도록 다양한 농도에서 시험되었다.
올리고뉴클레오타이드
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 DSO-1A(서열 번호 56), DSO-1B(서열 번호 57), DSO-2A(서열 번호 58), DSO-2B(서열 번호 59), DSO-3A(서열 번호 60), DSO-3B(서열 번호 61), DSO-4A(서열 번호 62), DSO-4B(서열 번호 63), DSO-5A(서열 번호 64), DSO-5B(서열 번호 65), DSO-6A(서열 번호 66), DSO-6B(서열 번호 67), DSO-7A(서열 번호 68), DSO-7B(서열 번호 69), DSO-8A(서열 번호 70) 및 DSO-8B(서열 번호 71)를 포함한다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다.
반응 조건
용융 곡선 분석은 BioRad® CFX96 유전자증폭기를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 용융 곡선 매개변수는 5초 유지(유지 중 데이터 획득)로 15℃에서 70℃로 0.5℃ 증분이었다. 모든 반응은 이중반복 실행되었고, 100 nM, 200 nM 또는 300 nM의 DSO-A 및 DSO-B 올리고뉴클레오타이드, 1 μM의 SYBR green I, 8 mM MgCl2 (Bioline) 및 1x NH4 완충액(Bioline)을 함유하였다.
결과
표 4에 예시된 결과는 DSO가 증가하는 온도 구배로 처리될 때 얻어진 용융 온도(Tm)을 예시한다. 결과는 마이크로소프트 엑셀(버전 14)을 사용하여 작도된 이중반복 반응으로부터의 평균이다.
이 실시예는 증가하는 줄기 길이 및 GC 함량이 더 높은 Tm을 생성시킨다는 것을 입증한다. 게다가, 올리고뉴클레오타이드 농도의 증가는 또한 약간 더 높은 Tm으로 이어지고, 농도가 100 nM에서 200 nM으로 증가할 때 가장 큰 차이가 관찰되었다. 이 실시예에서 기재된 방법은 더 명확하게 구별되는 피크를 생성하는 대안적인 줄기 서열을 더 잘 확인하기 위한 스크리닝 방법으로서 사용될 수 있다.
상기 방법은 또한 비제한적인 예로서 염 농도, Mg 농도, 완충액, dNTP 농도 및 다른 첨가제를 포함하는 반응 혼합물의 다른 성분의 효과를 검사하도록 사용될 수 있다. 잘 분리된 Tm의 래더를 생성시키는 일련의 DSO는 LOCS로 혼입될 때 이 스크리닝 방법을 이용하여 확인될 수 있었다. 대안적인 형식에서, DSO는 상이한 염료 조합이 특정 DSO의 Tm에 영향을 미칠 수 있는지 또는 아닌지를 조사하기 위해 상이한 형광단 및 켄쳐 염료 쌍으로 표지될 수 있었다.
실시예 8: 2개의 형광 채널을 사용한 단일 웰에서의 4개의 표적 및 오직 2개의 줄기를 사용한 4개의 LOCS 리포터의 동시 검출
하기 실시예에서, 동일한 줄기 조성물을 함유하고 상이한 기질(루프)에 연결된 다수의 LOCS 리포터는 단일 반응 용기에 조합되어서 동일한 줄기 영역이 단일 반응에서 동시에 다수의 표적을 검출하고 구별하기 위해 수회 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 현재의 실시예에서, 2개의 줄기(줄기-1 및 줄기-2)는 2개의 형광 채널에 걸쳐 4개의 상이한 표적을 구별하도록 사용된다. 이 실시예에서, 2개의 LOCS 리포터는 FAM 형광단(LOCS-12 및 LOCS-13)으로 5' 표지되고, 다른 2개는 Texas Red 형광단(LOCS-7 및 LOCS-8)으로 5' 표지된다. 모든 4개의 LOCS 리포터는 켄쳐로 3' 표지된다. 4개의 LOCS 리포터의 루프 영역의 각각은 상이한 핵산 기질(Sub1, Sub2, Sub3 및 Sub4)을 함유한다. 각각의 형광단에 대해 1개인 2개의 LOCS 리포터는 줄기-1(LOCS-7 및 LOCS-12)을 함유하고, 다른 2개의 LOCS 리포터는 줄기-2(LOCS-8 및 LOCS-13)를 함유한다. 줄기 영역은 루프-줄기 구성에서 LOCS 리포터를 구속하는 일련의 상보성 염기-쌍을 함유한다. 이 구성에서, 형광단 및 켄쳐는 가깝게 근접하고, 형광은 표적의 부재 하에 켄칭된다. 줄기-1은 줄기-2보다 더 낮은 용융 온도를 갖고, 제1 검출 온도(40℃)에서의 표적 MgPa 및 NGopa의 검출을 위해 루프 1 및 3에 연결되는 반면, 줄기-2는 제2 검출 온도(50℃)에서의 표적 TV-Btub 및 gpd의 검출을 위해 루프 2 및 4에 연결된다.
올리고뉴클레오타이드
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-7(서열 번호 37), LOCS-8(서열 번호 38), 파트자임 A1(서열 번호 3), 파트자임 B1(서열 번호 4), 파트자임 A2(서열 번호 5), 파트자임 B2(서열 번호 6), 정방향 프라이머 1(서열 번호 7), 역방향 프라이머 1(서열 번호 8), 정방향 프라이머 2(서열 번호 9), 역방향 프라이머 2(서열 번호 10), LOCS-12(서열 번호 46), LOCS-13(서열 번호 47), 파트자임 A10(서열 번호 48), 파트자임 B10(서열 번호 49), 파트자임 A11(서열 번호 50), 파트자임 B11(서열 번호 51), 정방향 프라이머 8(서열 번호 52), 역방향 프라이머 8(서열 번호 53), 정방향 프라이머 9(서열 번호 54) 및 역방향 프라이머 9(서열 번호 55)를 포함한다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다. MgPa 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-7, 파트자임 A1, 파트자임 B1, 정방향 프라이머 1 및 역방향 프라이머 1이다. TV-Btub 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-8, 파트자임 A2, 파트자임 B2, 정방향 프라이머 2 및 역방향 프라이머 2이다. NGopa 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-12, 파트자임 A10, 파트자임 B10, 정방향 프라이머 8 및 역방향 프라이머 8이다. gpd 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-13, 파트자임 A11, 파트자임 B11, 정방향 프라이머 9 및 역방향 프라이머 9이다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 BioRad® CFX96 유전자증폭기를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 사이클링 매개변수는 2분 동안 95℃, 5초 동안 95℃ 및 30초 동안 61℃의 10회 터치다운 사이클(사이클마다 0.5℃ 감분) 및 5초 동안 95℃ 및 40초 동안 52℃의 35 사이클(데이터는 52℃ 단계에서 수집됨)이었다. 용융 곡선 매개변수는 5초 유지(유지 중 데이터 획득)로 20℃에서 90℃로 0.5℃ 증분이었다. 모든 반응은 이중반복 실행되었고, 40 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머, 200 nM의 각각의 파트자임 A, 200 nM의 각각의 파트자임 B, 200 nM의 각각의 LOCS 리포터, 2 mM MgCl2(Bioline) 및 1x SensiFAST 프로브 No-ROX Mix(Bioline)를 함유하였다. 반응은 MgPa, TV-Btub, NGopa 또는 gpd 유전자 중 어느 하나에 상동성인 G-Block 주형(10,000개의 카피)을 함유하거나, 표적(NF H2O)을 함유하지 않았다.
결과
PCR로 공지된 시험관내 표적 증폭 방법을 이용하여, 4개의 MNAzyme(MNAzyme 1, MNAzyme 2, MNAzyme 10 및 MNAzyme 11)은 이의 상응하는 LOCS 리포터(각각 LOCS-7, LOCS-8, LOCS-12 및 LOCS-13)의 절단을 통해 실시간으로 표적 핵산의 증폭을 모니터링하도록 사용된다. MNAzyme 1은 MgPa 유전자(마이코플라스마 게니탈리움)에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-7을 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 2는 TV-Btub 유전자(트리초모나스 바기날리스)에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-8을 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 10은 NGopa 유전자(나이세리아 고노레아)에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-12를 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 11은 gpd 유전자(단순 포진 바이러스 유형 2)에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-13을 절단하고 개방하도록 설계되었다. 이 실험에서, 증폭 및 검출은 모든 MNAzyme, 프라이머 및 LOCS 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 단일 관에서 수행되었다.
MgPa 또는 TV-Btub 유전자 중 어느 하나의 존재는 Texas Red 채널에서 신호의 증가에 의해 검출되었고; NGopa 또는 gpd 유전자 중 어느 하나의 존재는 FAM 채널에서 신호의 증가에 의해 검출되었다. Texas Red 채널에서의 MgPa 또는 TV-Btub, 및 FAM 채널에서의 NGopa 또는 gpd의 구별은 고유한 용융 곡선 서명의 존재에 기초하여 결정되었다. 도 13의 A에 도시된 결과는 MgPa(검정 선) 또는 TV-Btub(회색 선) 유전자 표적의 10,000개의 카피 중 어느 하나를 함유하는 반응으로부터의 증폭 후 Texas Red 채널에서 얻은 각각의 용융 곡선 서명을 예시한다.
도 13의 B에 도시된 결과는 NGopa(검정 선) 또는 gpd(회색 선) 유전자 표적의 10,000개의 카피 중 어느 하나를 함유하는 반응으로부터의 증폭 후 FAM 채널에서 얻은 각각의 용융 곡선 서명을 예시한다. 결과는 마이크로소프트 엑셀(버전 14)을 사용하여 작도된 이중반복 반응으로부터의 평균이다. MgPa의 존재는 Texas Red 신호에서의 증가 및 Texas Red 채널에서의 고유한 용융 서명(Tm = 43℃) 둘 다에 의해 결정되었다. TV-Btub의 존재는 Texas Red 신호에서의 증가 및 Texas Red 채널에서의 고유한 용융 서명(Tm = 54℃) 둘 다에 의해 결정되었다. NGopa의 존재는 FAM 신호에서의 증가 및 FAM 채널에서의 고유한 용융 서명(Tm = 26℃ 및 42℃) 둘 다에 의해 결정되었다. gpd의 존재는 FAM 신호에서의 증가 및 FAM 채널에서의 고유한 용융 서명(Tm = 49℃) 둘 다에 의해 결정되었다.
표 5에 요약된 바와 같은 이 실시예로부터의 데이터는 동일한 보편적 줄기 영역이 이들을 상이한 기질(루프)에 연결하고 상이한 형광 채널에 걸쳐 이들을 검출하여 단일 반응에서 수회 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 더 나아가, 데이터는 단일 웰에서 동시증폭되고 2개의 형광 채널을 사용하여 모니터링된 4개의 표적이 이의 고유한 LOCS 용융 온도에 기초하여 구별될 수 있다는 것을 입증한다. 이 실시예는 단일 웰에서 다수의 표적을 검출하는 데 유용한 단순한 방법을 제공한다. 단일 반응에서 다수의 표적을 구별하기 위한 동일한 줄기 서열의 사용은 고도로 다중화된 검정의 간단한 설계를 수월하게 하고, 임의의 선택 유전자 표적의 검출을 위한 LOCS 프로브의 신속하고 쉬운 적응을 허용한다.
실시예 9 - 동일한 줄기 서열은 재현 가능한 융점을 생성하기 위해 LOCS 리포터 내에 상이한 기질과 조합될 수 있다
하기 실시예에서, 3개의 LOCS 리포터는 동일한 줄기가 상이한 루프 서열(기질)과 페어링하여, 필적하는 용융 서명을 생성할 수 있다는 것을 나타내도록 사용된다. 이 실시예에서, 모든 3개의 LOCS 리포터는 FAM 형광단으로 5' 표지되고, 켄쳐로 3' 표지된다. 3개의 LOCS 리포터의 루프 영역의 각각은 핵산 효소에 대한 상이한 기질(MNAzyme)을 함유하지만, 모든 3개는 동일한 줄기 서열(줄기-2)을 함유한다.
올리고뉴클레오타이드
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 정방향 프라이머 10(서열 번호 72), 역방향 프라이머 10(서열 번호 73), LOCS-2(서열 번호 2), LOCS-14(서열 번호 78), LOCS-15(서열 번호 79), 파트자임 A8(서열 번호 31), 파트자임 B8(서열 번호 32), 파트자임 A12(서열 번호 74), 파트자임 B12(서열 번호 75), 파트자임 A13(서열 번호 76) 및 파트자임 B13(서열 번호 77)을 포함한다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다. TFRC 유전자의 증폭에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 정방향 프라이머 10(서열 번호 72) 및 역방향 프라이머 10(서열 번호 73)이다. TFRC 앰플리콘의 검출 및 LOCS-2의 절단에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 파트자임 A8(서열 번호 31) 및 파트자임 B8(서열 번호 32)이다. TFRC 앰플리콘의 검출 및 LOCS-14의 절단에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 파트자임 A12(서열 번호 74) 및 파트자임 B12(서열 번호 75)이다. TFRC 앰플리콘의 검출 및 LOCS-15의 절단에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 파트자임 A13(서열 번호 76) 및 파트자임 B13(서열 번호 77)이다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 BioRad® CFX96 유전자증폭기를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 사이클링 매개변수는 2분 동안 95℃, 5초 동안 95℃ 및 30초 동안 61℃의 10회 터치다운 사이클(사이클마다 0.5℃ 감분) 및 5초 동안 95℃ 및 40초 동안 52℃의 35 사이클(데이터는 52℃ 단계에서 수집됨)이었다. 용융 곡선 매개변수는 5초 유지(유지 중 데이터 획득)로 20℃에서 90℃로 0.5℃ 증분이었다. 모든 반응은 이중반복 실행되었고, 40 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머, 200 nM의 각각의 파트자임 A, 200 nM의 각각의 파트자임 B, 200 nM의 각각의 LOCS 리포터, 2 mM MgCl2(Bioline) 및 1x SensiFAST 프로브 No-ROX Mix(Bioline)를 함유하였다. 반응은 인간 트랜스페린 수용체(TFRC) 유전자에 상동성인 G-Block 주형(10,000개의 카피)을 함유하거나, 무 표적(NF H2O)을 함유하였다.
결과
이 실험에서, PCR 증폭, 신호 검출 및 용융 곡선 차이는 단일-플렉스 반응으로서 단일 관에서 수행되었다. PCR 동안, 3개의 MNAzyme(MNAzyme 8, MNAzyme 12 및 MNAzyme 13)은 이의 상응하는 LOCS 리포터(각각 LOCS-2, LOCS-14 및 LOCS-15)의 절단을 통해 실시간으로 표적 핵산의 증폭을 모니터링하도록 사용되었다. 모든 3개의 MNAzyme은 동일한 표적 서열(TFRC 유전자)을 검출하도록 설계되었지만, 각각의 MNAzyme은 상이한 기질 서열(루프)을 혼성화하고 절단할 수 있어서; 상이한 LOCS 리포터를 개방한다.
도 14에 도시된 결과는 TFRC 유전자 표적(검정 선) 또는 무 표적(회색 선)의 10,000개의 카피 중 어느 하나를 함유하는 반응으로부터 PCR 증폭 후 FAM 채널에서 얻은 각각의 용융 곡선 서명을 예시한다. TFRC 유전자의 존재는 역치 값(데이터 비기재)을 초과하는 PCR 증폭 곡선 및 각각 절단된 LOCS-2, LOCS-14 및 LOCS-15에 상관되는 49℃, 48℃ 및 49℃(각각 도 14의 A, 도 14의 B 및 도14의 C)의 Tm에서의 용융 피크의 존재에 의해 입증되었다. TFRC 유전자의 부재는 역치 값을 초과하는 PCR 증폭 곡선의 부재(데이터 비기재) 및 각각 비절단된 LOCS-2, LOCS-14 및 LOCS-15에 상관하는 74℃, 75℃ 및 75℃의 Tm에서 용융 피크의 존재에 의해 결정되었다(각각 도 14의 A, 도 14의 B 및 도 14의 C). 결과는 마이크로소프트 엑셀(버전 14)을 사용하여 작도된 이중반복 반응으로부터의 평균이다. 이 실시예로부터의 데이터는 동일한 보편적 줄기 영역이 필적하는 용융 곡선 서명을 생성하도록 상이한 기질(루프)과 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 상이한 기질을 갖는 LOCS 리포터를 조작하기 위한 동일한 줄기 서열의 사용은 고도로 다중화된 검정의 간단한 설계를 수월하게 하고, 임의의 선택 유전자 표적의 검출을 위한 LOCS 프로브의 신속하고 쉬운 적응을 허용한다.
실시예 10 - LOCS 리포터의 개방을 위한 대안적인 방법으로서의 닉킹 엔도뉴클레아제의 사용
하기 실시예에서, 닉킹 엔도뉴클레아제(Nt. AlwI)는 LOCS 리포터의 루프 부분이 MNAzyme 절단에 대한 대안적인 방법으로서 닉킹 엔도뉴클레아제에 의한 절단 후 개방될 때 필적하는 용융 서명이 생성된다는 것을 나타내도록 사용된다. 일반 절략은 도 3의 B에 예시되어 있다. 이 실시예에서, 이중 표지된 LOCS 리포터는 표적 서열에 상보성인 루프 영역 및 표적에 상보성이 아닌 줄기 영역을 함유한다. LOCS 리포터의 루프 영역과 표적과의 혼성화는 닉킹 엔도뉴클레아제 인식 부위를 완전하게 하여, 닉킹 엔도뉴클레아제에 의한 LOCS 리포터의 절단을 수월하게 하고 표적을 온전하게 둔다. 분자내 결합이 분자간 결합보다 더 강하므로, 온전한 LOCS 구조의 줄기 영역은 개방, 절단된 LOCS 구조의 줄기보다 더 높은 온도에서 용융할 것이다.
올리고뉴클레오타이드
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 AF-NE-TV1(서열 번호 82), LOCS-16(서열 번호 80), AF-NE-R5b(서열 번호 83) 및 LOCS-17(서열 번호 81)을 포함한다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 검출은 BioRad® CFX96 유전자증폭기를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 반응은 52℃의 일정한 온도에서 항온처리되고, 총 200 데이터 수집에 대해 20초마다 데이터가 수집되었다. 용융 곡선 매개변수는 5초 유지(유지 중 데이터 획득)로 20℃에서 90℃로 0.5℃ 증분이었다. 모든 반응은 중복반복 실행되었고, 5 mM MgCl2(Ambion), 1x PCR 완충액 II(ABI), Nt. AlwI의 4 단위(NEB) 및 200 nM의 LOCS(LOCS-16 또는 LOCS-17 중 어느 하나)를 함유하였다. 반응은 AF-NE-TV1 또는 AF-NE-R5b(200 nM) 중 어느 하나를 함유하거나 무 표적(NF H2O)을 함유하였다.
결과
신호 검출 및 용융 곡선 구별은 단일 관에서 수행되었다. 도 15의 A 및 도 15의 B에 도시된 결과는 200 nM의 표적(검정 선; 각각 AF-NE-TV1 또는 AF-NE-R5b) 또는 무 표적 (회색 선; NF H2O)을 함유하는 반응으로부터 FAM 채널에서 얻은 LOCS-16 및 LOCS-17에 대한 각각의 용융 곡선 서명을 예시한다. 결과는 마이크로소프트 엑셀(버전 14)을 사용하여 작도된 이중반복 반응으로부터의 평균이다. 표적 AF-NE-TV1의 존재는 시간에 따른 형광의 신속한 증가 및 절단된 LOCS-16에 상응하는 29℃에서의 용융 피크의 존재 둘 다에 의해 검출되었다. 표적 AF-NE-TV1의 부재는 (i) 시간에 따른 형광 증가의 결여, (ii) 29℃에서의 용융 피크의 부재 및 (iii) 비절단된 LOCS-16에 상응하는 65℃에서의 용융 피크의 존재에 의해 결정되었다(도 15의 A). 표적 AF-NE-R5b의 존재는 시간에 따른 형광의 신속한 증가 및 절단된 LOCS-17에 상응하는 48℃에서의 용융 피크의 존재 둘 다에 의해 검출되었다. 표적 AF-NE-R5b의 부재는 (i) 시간에 따른 형광 증가의 결여, (ii) 48℃에서의 용융 피크의 부재 및 (iii) 비절단된 LOCS-17에 상응하는 76℃에서의 용융 피크의 존재에 의해 결정되었다(도 15의 B).
이 실시예로부터의 데이터는 LOCS 리포터가 닉킹 엔도뉴클레아제 효소를 사용하는 것과 같은 대안적인 표적 검출 방법과 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 더 나아가, 데이터는 또한 동일한 줄기(줄기-2)를 함유하는 LOCS 리포터가 닉킹 효소 중 어느 하나에 의한 또는 MNAzyme에 의한 루프 분해 기전, 예를 들어 절단과 무관하게 동일한 융점(약 50℃)에서 피크를 생성한다는 것을 나타낸다. 현재의 실시예에서, 줄기-2를 함유하는 온전한 LOCS 리포터 및 개방 LOCS 리포터는 각각 48℃ 및 76℃에서 용융 피크를 생성하였다. 이 용융 피크는 도 4의 D에 입증된 것처럼 MNAzyme을 갖는 줄기-2를 사용하여 생성된 용융 피크와 필적하다. 상이한 프로토콜, 예를 들어 MNAzyme에 의한 루프의 절단에 대한 닉킹 효소에 의한 루프의 절단에 동일한 줄기를 함유하는 LOCS에 1-2℃의 작은 이동이 사용될 때 관찰될 수 있지만, 이 이동은 아마도 반응 환경에서의 차이를 반영하고, 여기서 염, 글리세롤 또는 다른 성분의 농도는 줄기의 Tm에 영향을 미칠 수 있다.
실시예 11 - LOCS 리포터의 개방을 위한 대안적인 방법으로서의 TaqMan 엑소뉴클레아제의 사용
하기 실시예에서, TaqMan/가수분해 프로브-유사 방법은 루프의 MNAzyme 절단에 대한 대안적인 방법으로서 엑소뉴클레아제 분해 후 LOCS 리포터의 줄기 부분이 개방될 때 필적하는 용융 서명이 생성된다는 것을 나타내도록 사용된다. 이 실시예에 대한 일반 전략은 도 3의 A에 예시되어 있다. 이 실시예에서, 이중 표지된 LOCS 리포터는 표적 서열에 상보성인 루프 영역 및 표적에 상보성이 아닌 줄기 영역을 함유한다. PCR 증폭 동안, LOCS 리포터의 루프 영역은 표적 및/또는 앰플리콘 서열과 혼성화할 수 있다. PCR의 프라이머 연장 단계 동안, 상류 프라이머는 LOCS 리포터가 표적과 혼성화된 영역으로 연장되고, 중합효소는 LOCS 리포터의 루프 영역의 5' 말단을 점진적으로 절단하지만 줄기 영역을 온전하게 둔다. 2개의 LOCS 줄기 단편 사이의 분자간 힘이 폐쇄 LOCS 분자 내에 이들 사이에 발생하는 분자내 힘보다 유의미하게 더 약하므로, 루프 영역의 분해는 LOCS 줄기의 융점을 감소시킨다.
올리고뉴클레오타이드
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 정방향 프라이머 2(서열 번호 9), 역방향 프라이머 2(서열 번호 10) 및 LOCS-18(서열 번호 84)을 포함한다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 BioRad® CFX96 유전자증폭기를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 사이클링 매개변수는 2분 동안 95℃ 및 5초 동안 95℃ 및 40초 동안 52℃의 50회 사이클(데이터는 52℃ 단계에서 수집됨)이었다. 용융 곡선 매개변수는 5초 유지(유지 중 데이터 획득)로 20℃에서 90℃로 0.5℃ 증분이었다. 모든 반응은 이중반복 실행되었고, 400 nM의 각각의 프라이머, 200 nM의 LOCS-16, 2 mM MgCl2(Bioline) 및 1x SensiFAST 프로브 No-ROX Mix(Bioline)를 함유하였다. 반응은 합성 G-Block 주형(10,000개의 카피)을 함유하거나, 무 표적(NF H2O)을 함유하였다.
결과
이 실험에서, PCR 증폭, 신호 검출 및 용융 곡선 차이는 단일 관에서 수행되었다. 표적 유전자(TV-btub)의 존재는 PCR 증폭 곡선 및 분해된, 개방 LOCS-18에 상응하는 40°의 Tm에서의 용융 피크의 존재에 의해 검출되었다. 표적 유전자의 부재는 PCR 증폭 곡선의 부재, 40℃의 Tm에서의 용융 피크의 부재 및 비절단된, 폐쇄 LOCS-18에 상응하는 61℃의 Tm에서의 용융 피크의 존재에 의해 결정되었다. 도 16의 A 및 도 16의 B에 도시된 결과는 유전자 표적(검정 선) 또는 무 표적(회색 선)의 10,000개의 카피 중 어느 하나를 함유하는 반응으로부터 FAM 채널에서 얻은 각각의 증폭 곡선 및 용융 곡선 서명을 예시한다. 결과는 마이크로소프트 엑셀(버전 14)을 사용하여 작도된 이중반복 반응으로부터의 평균이다.
이 실시예로부터의 데이터는 LOCS 리포터가 TaqMan/가수분해 프로브에 유사한 기전을 이용하는 대안적인 표적 검출 방법과 사용될 수 있다는 것을 입증하고, 즉 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합효소 효소는 앰플리콘에 혼성화하는 서열을 분해한다. 본질적으로 이 실시예에서 LOCS 프로브는 표준 TaqMan 프로브 서열과 유사한 기능을 하는 루프 부분으로 이루어지지만, "TaqMan-유사 프로브 서열"은 그 자체가 표적에 상보성이 아니지만 서로에 상보성인 혼성화 영역의 5' 및 3에 부착된 상보성 줄기 서열을 갖는다. 더 나아가, 데이터는 또한 동일한 줄기(줄기-1)를 함유하는 LOCS 리포터가 MNAzyme 절단에 대한 루프 분해, 예를 들어 엑소뉴클레아제 분해의 기전과 무관하게 동일한 융점에서 피크를 생성한다는 것을 나타낸다. 현재의 실시예에서, 줄기-1을 함유하는 폐쇄 LOCS 리포터 및 개방 LOCS 리포터는 각각 61℃ 및 40℃에서 용융 피크를 생성하였다. 이 용융 피크는 도 5의 A2, 도 5의 B2 및 도 5의 C2에 입증된 것처럼 MNAzyme을 갖는 줄기-1을 사용하여 생성된 용융 피크와 필적하다. 현재의 방법은 방출된 표지된 프로브 단편이 후속하여 표적 서열의 존재를 검출하도록 포획 프로브와 혼성화할 필요가 없고, 형광단 및 켄쳐가 가까이 근접하므로 LOCS 리포터가 초기에 더 양호하게 켄칭될 수 있다는 점에서 TOCE와 같은 다른 엑소뉴클레아제 기반 용융 곡선 방법과 비교하여 이점을 갖는다.
실시예 12: 증폭 동안 2의 획득 온도를 사용한 단일 형광 채널에서 다수의 표적의 동시 검출 및 정량화를 위한 방법
하기 실시예는 LOCS 리포터가 PCR 동안 실시간으로 2의 구별되는 온도에서 형광 판독을 획득하여 단일 형광 채널에서 다수의 표적의 동시의 검출 및 정량화를 허용하는 접근법을 나타낸다. 그 전략은 상기 다양한 실시예에서 입증된 PCR 후 용융 곡선 분석에 대한 요건을 제거한다. 추가로, 이 실시예는 샘플에 존재하면 표적 중 어느 하나의 양의 정량화를 수월하게 하는 데이터의 분석에 대한 2개의 대안적인 방법을 기재한다.
이 실시예에서, 상이한 줄기 길이, 조성 및 융점을 함유하는 2개의 LOCS 리포터는 각각의 PCR 사이클 동안 2의 상이한 온도(TL 및 TH)에서 실시간으로 형광을 측정하여 단일 형광 채널에서 2개의 표적 X 및 표적 Y를 동시에 검출하고 구별하고 정량화하도록 사용되었다. 검정은 표적 X가 LOCS-X(오직 표적 X의 존재 하에 MNAzyme X에 의해 절단 가능)를 사용하여 모니터링되고, 표적 Y가 LOCS-Y(오직 표적 Y의 존재 하에 MNAzyme Y에 의해 절단 가능)를 사용하여 모니터링되도록 설계된다. 추가로, 검정은 개방 LOCS-X가 개방 LOCS-Y보다 더 낮은 Tm을 갖도록 설계된다.
개방 LOCS-X의 줄기가 용융되어(해리하여) 형광을 증가시키지만 폐쇄 LOCS-X의 줄기, 및 개방 LOCS-Y 및 폐쇄 LOCS-Y 둘 다의 줄기가 회합된 채 있고 켄칭되도록 더 낮은 검출 온도(TL)가 선택된다. 개방 LOCS-Y의 줄기가 용융(해리하여)되어 형광을 증가시키지만 폐쇄 LOCS-Y의 줄기가 회합된 채 있고 켄칭되도록 더 높은 온도(TH)가 선택된다. LOCS-X의 줄기가 더 낮은 Tm을 가지므로, 이것은 이 더 높은 온도에서 용융(해리)하여서, 이것이 이의 개방 구성 또는 폐쇄 구성에 있는지와 무관하게 형광을 증가시키지만; 폐쇄 LOCS-X로부터 생긴 형광이 증가된 배경/기준치에 오직 기인할 것이다.
2개의 PCR 증폭 곡선은 TL에서 및 TH 온도에서 취한 형광 측정을 이용하여 작도될 수 있다. 표적 X 및/또는 표적 Y의 존재의 결정을 위한 역치 값은 TL 도표(역치 X; TX) 및 TH 도표(역치 Y; TY) 둘 다에 대한 세트이다. 역치(TX 및 TY), 및 반응이 평탄상태(plateau)로 공지된 다양한 종점은 이전의 실험에 기초하여 미리 결정될 수 있고, 여기서 오직 표적 X를 함유하는 반응은 TL에서의 종점 EX1에서 또는 TH에서의 종점 EX2에서 평탄상태이고; 오직 표적 Y를 함유하는 반응은 TH에서의 종점 EY1에서 평탄상태이고, 표적 X 및 표적 Y 둘 다를 함유하는 반응은 TH에서의 종점 EY2에서 평탄상태이다. 선택적으로, 종점 EX1, EX2, EY1 및 EY2는 실험적 샘플과 동시에 실행되는 양성 대조군으로부터 유래될 수 있다.
TL 증폭 도표와 관련하여, PCR이 TX를 초과하고 종점 EX1에서 평탄상태인 증폭 곡선을 생성하면, 이 결과는 표적 X와 연관된 절단된 LOCS-X의 존재를 나타낼 것이다. 표적 Y가 또한 존재하면, 절단된 LOCS-Y가 TL에서 형광을 생성하지 않으므로 증폭 곡선은 영향을 받지 않아야 한다. 따라서, TX를 초과하는 증폭 곡선으로부터 얻은 Cq 값은 샘플에서 표적 X의 정량화를 허용한다.
TH 증폭 도표와 관련하여, PCR이 TY를 초과하고 EY1 또는 EY2 중 어느 하나에서 평탄상태인 증폭 곡선을 생성하면, 이는 표적 Y의 존재를 나타낸다. 역치 TY는 값 EX2보다 높게 설정되어서, 오직 표적 X를 함유하는 반응으로부터의 증폭 곡선은 이 역치를 초과하지 않는다. 표적 X 및 표적 Y 둘 다가 존재할 때, LOCS-X 및 LOCS-Y의 절단은 TY를 초과하고 오직 표적 Y의 존재 하에 절단된 LOCS-Y와 연관된 EY1보다 높은 EY2에서 평탄상태인 증폭 곡선을 생성할 것이다. EX2 < TY < EY1 < EY2 및 EX2 ≠ TY ≠ EY1 ≠ EY2이므로, 증폭 곡선이 평탄상태인 종점은 표적 X, 표적 Y 또는 둘 다의 존재를 나타낼 수 있다. 그러나, TY를 초과하는 TH 증폭 곡선으로부터 얻은 Cq 값은 표적 X 및 표적 Y 둘 다의 양에 의해 영향을 받을 것이고, 따라서 표적 Y에 오직 반(semi)정량적이다. 표적 Y의 양의 정확한 정량화를 허용하기 위한 Cq 값의 조정을 위한 다양한 분석 방법은 하기 기재되어 있다(정량화 방법 1 및 2).
표적 Y 정량화 방법 1
TL 39℃ 및 TH 72℃에서 LOCS-X 단독의 절단된 종에서 생긴 2개의 증폭 곡선은 동일한 효능 및 Cq를 갖지만, 각각 상이한 종점 EX1 및 EX2에서 평탄상태이다. 따라서, 72℃에서의 증폭 곡선에서의 LOCS-X의 절단된 종에서 생긴 형광 신호(F-LOCS-XFAF)는 형광 조정 인자(FAF)를 적용하여 39℃에서 증폭 곡선으로부터 외삽될 수 있다. FAF는 종점 EX1 및 EX2의 비이다. 72℃에서의 증폭 곡선에서의 총 형광 신호(F-총)는 LOCS-X (F-LOCS-XFAF) 및 LOCS-Y (F-LOCS-Y) 둘 다의 절단된 종에서 생긴 형광 신호로부터 생긴다. 이로부터, LOCS-Y로부터 생긴 72℃에서의 증폭 곡선은 하기에 의해 외삽될 수 있다:
TY를 사용하여 LOCS-Y로부터 생긴 TH 72℃에서의 증폭 곡선으로부터 얻은 Cq 값은 표적 Y에 완전히 정량적이다. 샘플에 표적 X, 표적 Y 또는 둘 다가 포함되는지에 상관없이, 식을 적용하여 정확한 정량화를 결정할 수 있다.
표적 Y 정량화 방법 2
표적 X 및 표적 Y 둘 다의 존재 하에, 72℃에서의 실험적으로 결정된 Cq 값(Cq관찰된)은 표적 X 없이 표적 Y의 동일한 농도를 함유하는 샘플에 대한 Cq 값으로부터 이동한다. 72℃에서의 표적 X의 부재 하에 표적 Y에 대한 표준 곡선으로부터 결정된 예상된 Cq 값(Cq표준 곡선 표적 Y)과 Cq관찰된 사이의 관계는 하기 기재되어 있다:
Cq표적 Y의 표준 곡선 및 Cq에서의 상대 이동 둘 다가 표적 Y의 카피수의 함수 둘 다이므로, 표적 Y의 카피수는 실험적으로 결정된 Cq 값(Cq관찰된)으로부터 계산될 수 있다. Cq 값에서의 이 상대 이동은 (표적 Y의 카피수 / 표적 X의 카피수)의 자연 log로 수학 관계식(로지스틱)을 갖는다. Cq 값이 72℃에서 측정된 폭 곡선에서 최대 형광 수준의 절반인 역치로 결정되면, 로지스틱 관계가 하기 식으로 표현될 수 있다:
여기서, y = Cq에서의 상대 이동, L = Cq에서의 최대 가능한 이동, k = 경사도 인자, x = ln(표적 Y의 카피수/표적 X의 카피수); 표적 X의 카피수가 39℃에서의 증폭 곡선으로부터 결정됨에 유의한다.
표적 X의 부재에서 결정된 표적 Y에 대한 표준 곡선 식으로의 Cq 값에서의 이동 인자의 도입은 표적 X의 존재 하에 Cq 값의 보정이 가능하게 하고, 후속하여 표적 Y의 정확한 정량화로 이어진다.
상기 기재된 전략은 임의의 표적을 검출하도록 적응될 수 있지만, 이 구체적인 실시예에서 표적 X는 CTcry 유전자이고, 표적 Y는 NGopa 유전자이고; 각각의 표적으로부터의 앰플리콘의 축적은 LOCS-X(LOCS-19) 및 LOCS-Y(LOCS-20)와 연관된 형광 변화에 의해 PCR 동안 낮은 온도(TL 39℃) 및 더 높은 온도(TH 72℃)에서 모니터링되고; LOCS 둘 다는 동일한 형광단(JOE)으로 표지되었다.
올리고뉴클레오타이드
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-19, LOCS-20, 파트자임 A9, 파트자임 B9, 파트자임 A10, 파트자임 B10, 정방향 프라이머 7, 역방향 프라이머 7, 정방향 프라이머 8 및 역방향 프라이머 11을 포함한다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다. CTcry 증폭 및 정량화에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-19, 파트자임 A9, 파트자임 B9, 정방향 프라이머 7 및 역방향 프라이머 7이다. NGopa 증폭 및 정량화에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-20, 파트자임 A10, 파트자임 B10, 정방향 프라이머 8 및 역방향 프라이머 11이다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 검출은 BioRad® CFX96 유전자증폭기를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 사이클링 매개변수는 2분 동안 95℃, 이어서 5초 동안 95℃ 및 30초 동안 61℃의 10회 터치다운 사이클(사이클마다 0.5℃ 감분) 및 5초 동안 95℃, 40초 동안 52℃, 1초 동안 39℃ 및 1초 동안 72℃의 40회 사이클(데이터는 39℃ 및 72℃ 단계 둘 다에서 수집됨)이었다. 각각의 반응은 40 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머, 200 nM의 각각의 파트자임, 100 nM의 LOCS-19 리포터, 200 nM의 LOCS-20 리포터 및 1x PlexMastermix(Bioline)를 함유하였다. 반응은 무 표적(NF H2O), 합성 G-Block X(20,000개, 4,000개, 800개, 160개 또는 32개의 카피), NGopa 유전자의 합성 G-Block(20,000개, 4,000개, 800개, 160개 또는 32개의 카피), CTcry 유전자의 합성 G-Block(20,000개, 4,000개, 800개, 160개 또는 32개의 카피)의 배경에서의 CTcry 유전자의 합성 G-Block(20,000개, 4,000개, 800개, 160개 또는 32개의 카피)의 다양한 농도 또는 CTcry 유전자의 합성 G-Block(20,000개, 4,000개, 800개, 160개 또는 32개의 카피)의 배경에서의 NGopa 유전자의 합성 G-Block(20,000개, 4,000개, 800개, 160개 또는 32개의 카피)의 다양한 농도 중 어느 하나를 함유하였다.
결과
PCR 동안, 2개의 MNAzyme(MNAzyme 9 및 MNAzyme 10)는 이의 상응하는 LOCS 리포터(각각 LOCS-19 및 LOCS-20)의 절단을 통해 실시간으로 표적 핵산의 증폭을 모니터링하도록 사용된다. MNAzyme 9는 클라미디아 트라초마티스의 검출을 위한 CTcry에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-19를 절단하고 개방하도록 설계되었다. MNAzyme 10은 나이세리아 고노레아의 검출을 위한 NGopa에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-20을 절단하고 개방하도록 설계되었다.
도 17의 A 및 도 17의 B에 도시된 결과는 각각 39℃ 및 72℃에서 측정된 CTcry 또는 NGopa의 20,000개의 카피 중 어느 하나 또는 유전자 표적 둘 다의 20,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터 JOE 채널에서 얻은 비교용 증폭 곡선을 예시한다. 결과는 이중반복 반응으로부터 평균으로 작도된다. 39℃에서, CTcry 주형(검정 실선)의 20,000개의 카피를 함유하는 샘플은 TX(TX로 나타낸 검정 수평 선)를 초과하고 EX1(EX1로 나타낸 검정 수평 선)에 도달한 형광 수준을 갖는 증폭 곡선을 보여준다. 39℃에서, CTcry 및 NGopa 주형 둘 다의 20,000개의 카피를 함유하는 샘플(회색 실선)은 TX를 초과하고 EX1에 도달하는 형광 수준을 갖는 증폭 곡선을 보여주는 반면, CTcry 주형을 함유하지 않는 샘플(검정 파선)은 TX를 초과하지 않고 EX1에 도달하지 않는다. 따라서, EX1에서 평탄상태인 39℃에서의 증폭 곡선은 샘플에서 CTcry의 존재를 확인시켜준다. 그래프는 오직 CTcry의 20,000개의 카피(검정 실선) 및 CTcry 및 NGopa 둘 다의 20,000개의 카피(회색 실선)를 함유하는 샘플이 유사한 Cq 값을 갖는다는 것을 보여준다.
39℃에서의 Cq 값이 NGopa의 존재에 의해 영향을 받지 않으므로, 이것은 샘플에서 CTcry의 정량화에 사용될 수 있다. CTcry의 0, 32개, 160개, 800개, 4,000개 및 20,000개의 카피 및 NGopa 유전자 표적의 0개, 32개, 160개, 800개, 4,000개 및 20,000개의 카피의 모든 조합의 샘플에서의 CTcry에서의 정량화에 대한 결과는 표 6에 요약되어 있다. NULL은 39℃에서 결정된 Cq 값이 없고 따라서 샘플에 CTcry가 존재하지 않는다는 것을 의미한다.
도 17의 B는 TY(TY로 나타난 검정 수평 선)를 초과하고 EY1(EY1로 나타낸 검정 수평 선)에서 평탄상태인 형광 수준을 갖는 NGopa 주형(검정 점선)의 20,000개의 카피를 함유하는 샘플에 대한 72℃에서의 증폭 곡선을 보여준다. 72℃에서, CTcry 및 NGopa 주형 둘 다의 20,000개의 카피를 함유하는 샘플(회색 실선)은 TY를 초과하고 EY2(EY2로 표시된 검정 수평선)에서 평탄상태인 형광 수준을 갖는 증폭 곡선을 보여주는 반면, 표적 NGopa 주형을 함유하지 않는 샘플(검정 실선)은 TY를 초과하지 않고 EY1 및 EY2에 도달하지 않지만, 오직 종점 EX2(종점 EX2로 표시된 검정 수평선)에서 평탄상태이다. 따라서, EX2에서 평탄상태인 72℃에서의 증폭 곡선은 샘플에서의 NGopa가 아니라 표적 CTcry의 존재를 확인시켜주고; EY1에서 평탄상태는 샘플에서의 CTcry가 아니라 NGopa의 존재를 확인시켜주고; EY2에서의 평탄상태는 샘플에서의 CTcry 및 NGopa 둘 다의 존재를 확인시켜준다.
72℃에서, CTcry 및 NGopa 둘 다의 20,000개의 카피를 함유하는 샘플(회색 실선)의 Cq 값은 오직 NGopa 주형의 20,000개의 카피를 함유하는 샘플(검정 파선)의 Cq 값과 동일하지 않다. 샘플에서의 CTcry의 존재는 이 실시예에서 최대 대략 -4.77만큼 72℃에서 NGopa에 대한 Cq 값을 이동시킬 수 있다. 따라서, 정규화 없이 72℃에서의 Cq 값의 사용은 PCR 증폭에서의 100% 효율을 가정하여 기대된 값의 24.77배 이하 내에 NGopa의 농도를 결정한다. 임의의 정규화 없이 CTcry의 0개, 32개, 160개, 800개, 4,000개 및 20,000개의 카피 및 NGopa 유전자 표적의 0개, 32개, 160개, 800개, 4,000개 및 20,000개의 카피의 모든 조합의 샘플의 72℃에서의 증폭의 분석은 Cq 값에 대해 표 7 및 NGopa의 정량화에 대해 표 8에 요약되어 있다. NULL은 72℃에서 결정된 Cq 값이 없고 따라서 샘플에 NGopa가 존재하지 않는 경우이다. 이 결과는 정규화 없이 방법론이 CTcry에 대해 완전히 정량적이고 NGopa에 대해 반정량적이라는 것을 보여준다.
도 18에 도시된 결과는 각각 39℃ 및 72℃에서 측정된 CTcry의 0개, 32개 및 20,000개의 카피 및 NGopa 유전자 표적의 0개, 32개 및 20,000개의 카피의 모든 가능한 조합을 함유하는 반응으로부터 JOE 채널에서 얻은 비교용 증폭 곡선을 예시한다. 결과는 이중반복 반응으로부터 평균으로 작도된다. 그래프에 제시된 샘플은 그래프의 좌측에 규정된 양의 NGopa를 함유한다. CTcry의 20,000개의 카피를 함유하는 샘플은 검정 점선으로 제시되고, CTcry의 32개의 카피를 함유하는 샘플은 회색 실선으로 제시되고, CTcry의 0개의 카피를 함유하는 샘플은 검정 실선으로 제시된다. 도 18의 B 및 도 18의 E에서 72℃에서 취한 비정규화된 증폭 곡선으로부터, 샘플에서의 CTcry의 존재가 Cq 값을 이동시킨다는 것이 관찰된다. 결과는 정량화 방법 1을 이용하여 추가로 분석되었다. (F-LOCS-Y = F-총 - F-LOCS-XFAF이므로) 72℃에서의 증폭 곡선으로부터 FAF를 곱해 39℃에서의 증폭 곡선의 공제는 절단된 LOCS-19로부터의 기여 없이 LOCS-20의 절단된 종으로부터의 형광 신호에 상응하는 외삽된 증폭 곡선을 생성한다(도 18의 C 및 18의 F). 72℃에서의 모든 외삽된 증폭 곡선은 유사한 Cq 값을 나타내고, 여기서 동일한 수의 NGopa 주형은 샘플에서의 CTcry의 양과 관련 없이 존재한다. 도 18의 I는 72℃에서의 외삽된 증폭 곡선이 임의의 상당한 증폭을 보이지 않는다는 것을 나타내고, 여기서 샘플은 임의의 NGopa 주형을 함유하지 않는다. F-LOCS-XFAF 신호에 의한 공제에 의한 정규화의 효과는 표 9(F-LOCS-XFAF 정규화된 Cq 값) 및 표 10(F-LOCS-XFAF 정규화 후 NGopa의 정량화)에 추가로 입증되었고, 이들은 F-LOCS-XFAF 신호에 의한 공제에 의한 정규화 후 CTcry의 0개, 32개, 160개, 800개, 4,000개 및 20,000개의 카피 및 NGopa 유전자 표적의 0개, 32개, 160개, 800개, 4,000개 및 20,000개의 카피의 모든 조합의 샘플의 72℃에서의 증폭의 분석이다. NULL은 72℃에서 결정된 Cq 값이 없고 따라서 샘플에 표적 Y가 존재하지 않는 경우이다.
72℃에서 획득된 데이터로부터의 증폭 곡선에 대해, CTcry 및 NGopa 둘 다를 함유하는 샘플에 대한 Cq 값은 오직 NGopa를 함유하는 샘플에 대해 이동된다. 결과는 정량화 방법 2를 이용하여 추가로 분석되었다. 도 19는 Cq에서의 상대 이동에 대해 작도된 (NGopa의 카피수 / CTcry의 카피수)의 자연 log의 로지스틱 회귀를 나타내고, 여기서 Cq 역치는 하기 식에 의해 지배되는 증폭 곡선에서의 최대 형광 수준의 절반에서 설정된다:
상기 식은 하기한 바대로 72℃에서 CTcry의 부재에서 결정된 NGopa의 표준 곡선 식으로 도입될 수 있다:
CTcry의 카피수가 39℃에서 획득된 데이터로부터 결정되므로, 상기 식은 수학 해법 프로그램으로 72℃에서 실험적 Cq(Cq관찰된)로부터의 샘플에서 NGopa의 카피수를 결정하도록 사용될 수 있다. 표 11은 반복실험의 평균으로 제시된 CTcry의 0개, 32개, 160개, 800개, 4,000개 및 20,000개의 카피 및 NGopa 유전자 표적의 0개, 32개, 160개, 800개, 4,000개 및 20,000개의 카피의 모든 조합의 샘플에 대해 계산된 Cq에서의 상대 이동 인자에 의한 72℃에서의 관찰된 Cq를 보여준다. 표 12는 동일한 샘플에 대한 상대 이동 인자로 정규화된 Cq 값을 사용한 카피수의 결정을 나타낸다.
실시예 13: 6개의 LOCS 리포터를 사용한 2개의 형광 채널에서의 6개의 표적의 동시 검출
하기 실시예에서, LOCS 리포터는 2개의 형광 채널에 걸쳐 검출될 수 있는 표적의 수를 증가시키도록 사용된다. 이 실시예에서, 3개의 표적은 2개의 형광 채널의 각각에서 검출된다. 이 실시예에서, 모든 6개의 LOCS 리포터는 형광단(JOE 또는 Atto101)으로 5' 표지되고, 켄쳐(각각 3IABkFQ 또는 3IAbRQSp)로 3' 표지된다. LOCS 리포터의 루프 영역은 각각 상이한 핵산 기질을 함유하고, 줄기 영역은 루프-줄기 구성에서 LOCS 리포터를 구속하는 일련의 상보성 염기-쌍을 함유한다. 이 구성에서, 형광단 및 켄쳐는 가깝게 근접하고, 형광은 표적의 부재 하에 켄칭된다.
올리고뉴클레오타이드
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-21(서열 번호 88), LOCS-22(서열 번호 89), LOCS-23(서열 번호 90), LOCS-24(서열 번호 91), LOCS-25(서열 번호 92), LOCS-26(서열 번호 93), 파트자임 A14(서열 번호 94), 파트자임 B14(서열 번호 95), 파트자임 A15(서열 번호 96), 파트자임 B15(서열 번호 97), 파트자임 A16(서열 번호 98), 파트자임 B16(서열 번호 99), 파트자임 A17(서열 번호 100), 파트자임 B17(서열 번호 101), 파트자임 A18(서열 번호 102), 파트자임 B18(서열 번호 103), 파트자임 A19(서열 번호 104), 파트자임 B19(서열 번호 105), 정방향 프라이머 12(서열 번호 106), 역방향 프라이머 12(서열 번호 107), 정방향 프라이머 9(서열 번호 54), 역방향 프라이머 9(서열 번호 55), 정방향 프라이머 13(서열 번호 108), 역방향 프라이머 13(서열 번호 109), 정방향 프라이머 14(서열 번호 110), 역방향 프라이머 2(서열 번호 10), 정방향 프라이머 1(서열 번호 7), 역방향 프라이머 1(서열 번호 8), 정방향 프라이머 15(서열 번호 111), 역방향 프라이머 15(서열 번호 112)를 포함한다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다. gpd 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-21, 파트자임 A14, 파트자임 B14, 정방향 프라이머 12 및 역방향 프라이머 12이다. gpd3 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-22, 파트자임 A15, 파트자임 B15, 정방향 프라이머 9 및 역방향 프라이머 12이다. porA 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-23, 파트자임 A16, 파트자임 B16, 정방향 프라이머 13 및 역방향 프라이머 13이다. TV-Btub 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-24, 파트자임 A17, 파트자임 B17, 정방향 프라이머 14 및 역방향 프라이머 2이다. MgPa 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-25, 파트자임 A18, 파트자임 B18, 정방향 프라이머 1 및 역방향 프라이머 1이다. LGV 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-26, 파트자임 A19, 파트자임 B19, 정방향 프라이머 15 및 역방향 프라이머 15이다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 BioRad® CFX96 유전자증폭기를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 사이클링 매개변수는 1초 동안 40℃, 1초 동안 70℃, 1초 동안 85℃, 2분 동안 95℃, 5초 동안 95℃ 및 30초 동안 61℃의 10회 터치다운 사이클(사이클마다 0.5℃ 감분) 및 5초 동안 95℃, 40초 동안 52℃ 및 1초 동안 65℃의 40회 사이클(데이터는 65℃ 단계에서 수집됨), 이어서 1초 동안 40℃, 1초 동안 70℃ 및 1초 동안 85℃였다. 용융 곡선 매개변수는 5초 유지(유지 중 데이터 획득)로 20℃에서 95℃로 0.5℃ 증분이었다. 모든 반응은 이중반복 실행되었고, 40 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머, 200 nM의 각각의 파트자임 A, 200 nM의 각각의 파트자임 B, 200 nM의 각각의 LOCS-21, LOCS-22, LOCS-24 및 LOCS-25 및 150 nM의 각각의 LOCS-23 및 LOCS-26, 8 mM MgCl2(Bioline), 0.2 mM dNTP(Bioline), 2 단위 MyTaq 중합효소(Bioline) 및 1x NH4 완충액(Bioline)을 함유하였다. 반응은 gpd 및/또는 gpd3 및/또는 porA 또는 TV-Btub 및/또는 MgPa 및/또는 LGV 유전자에 상동성인 G-Block 주형(10,000개의 카피) 중 어느 하나, 또는 무 표적(NF H2O)을 함유하였다.
결과
PCR로 공지된 시험관내 표적 증폭 방법을 이용하여, 6개의 MNAzyme (MNAzyme 14, MNAzyme 15, MNAzyme 16, MNAzyme 17, MNAzyme 18 및 MNAzyme 19)은 이의 상응하는 LOCS 리포터(각각 LOCS-21, LOCS-22, LOCS-23, LOCS-24, LOCS-25 및 LOCS-26)의 절단을 통해 실시간으로 표적 핵산의 증폭을 모니터링하도록 사용된다. 각각의 채널(JOE 및 Texas Red)에 대한 임의의 또는 모든 표적의 존재는 PCR의 증폭 단계에서 형광의 증가에 의해 결정되고(데이터 비기재); 이것에 고유한 LOCS 용융 서명에 기초하여 개별 표적의 고찰이 뒤따른다. MNAzyme 14는 gpd 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-21을 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 15는 gpd3 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-22를 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 16은 porA 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-23을 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 17은 TV-Btub 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-24를 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 18은 MgPa 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-25를 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 19는 LGV 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-26을 절단하고 개방하도록 설계되었다. 이 실험에서, 증폭 및 검출은 모든 MNAzyme, 프라이머 및 LOCS 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 단일 관에서 수행되었다. gpd, gpd3, porA, TV-Btub, MgPa, LGV 유전자 중 어느 하나 또는 6개의 유전자의 다양한 조합(다중 감염을 갖는 샘플을 나타냄)의 존재는 JOE 및 Texas Red 채널 중 어느 하나 또는 둘 다에서 신호의 증가에 의해 검출되었다(데이터 비기재).
도 20 - 도 22에 도시된 결과는 표적 gpd(도 20의 A), gpd3(도 20의 B), porA(도 20의 C), gpd 및 gpd3 둘 다(도 20의 D), gpd 및 porA 둘 다(도 20의 E), gpd3 및 porA 둘 다(도 20의 F), 또는 gpd, gpd3 및 porA의 모든 3개(도 22의 A), TV-Btub(도 21의 A), MgPa(도 21의 B), LGV (도 21의 C), TV-Btub 및 MgPa 둘 다(도 21의 D), TV-Btub 및 LGV 둘 다(도 21의 E), MgPa 및 LGV 둘 다(도 21의 F), 또는 TV-Btub, MgPa 및 LGV의 모든 3개(도 22의 B)의10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터의 증폭 후 얻은 각각의 용융 곡선 서명을 예시한다. 결과는 마이크로소프트 엑셀(버전 14)을 사용하여 작도된 이중반복 반응으로부터의 평균이다.
표 13에 요약된 이 실시예로부터의 데이터는 gpd 유전자 표적(Tm = 53℃, 68℃ 및 85℃)의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명이 gpd3(Tm = 30℃, 43℃, 77℃ 및 85℃) 및 porA(Tm = 68℃ 및 77℃) 유전자 표적의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명과 구별된다는 것을 입증한다. 이 실시예는 TV-Btub, MgPa 및/또는 LGV 유전자 표적의 동시의 검출이 gpd, gpd3 및/또는 porA의 검출 이외에 제2 채널에서 달성될 수 있다는 것을 나타낸다. TV-Btub 유전자 표적의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명(Tm = 30℃, 42℃, 66℃ 및 82℃)은 MgPa(53℃, 66℃ 및 82℃) 및 LGV(Tm = 68℃) 유전자 표적의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명과 구별된다. 추가로, 단일 채널로부터 판독하는 2개 이상의 유전자 표적의 존재 하의 LOCS 용융 서명은 또한 상기 언급된 용융 서명과 구별되는데, 여기서 오직 단일 유전자 표적이 존재한다. JOE 채널에서, gpd 및 gpd3 유전자 표적이 단일 반응에 존재할 때, 고유한 LOCS 용융 서명(Tm = 30℃, 43℃, 53℃ 및 85℃)은 표적 둘 다가 검출된다는 것을 나타낸다. 유사하게, gpd 및 porA 또는 gpd3 및 porA가 단일 반응에 존재할 때, 고유한 용융 곡선 서명(각각 Tm = 53℃ 및 68℃ 및 Tm = 30℃, 43℃, 68℃ 및 77℃)은 어떠한 2개의 표적이 검출되는지를 구체적으로 나타낸다. 마찬가지로, Texas Red 채널에서, LOCS 용융 서명은 표적의 각각의 조합에 고유하였다: TV-Btub 및 MgPa(Tm = 30℃, 42℃, 53℃ 및 82℃), TV-Btub 및 LGV(Tm = 30℃, 42℃ 및 68℃) 또는 MgPa 및 LGV(Tm = 53℃ 및 68℃). gpd, gpd3 및 porA 유전자 표적이 단일 반응 내에 모두 존재할 때, JOE 채널 내의 고유한 LOCS 용융 서명(Tm = 30℃, 43℃, 53℃ 및 68℃)은 모든 3개의 표적이 검출된다는 것을 나타냈다. 마찬가지로, Texas Red 채널에서, 단일에서의 TV-Btub, MgPa 및 LGV 표적의 존재는 고유한 LOCS 용융 서명(Tm = 30℃, 42℃, 53℃ 및 68℃)을 생성하였다.
이 실시예는 2개의 형광 채널(각각의 채널에서 검출된 3개의 표적)을 사용하여 단일 웰에서 동시증폭된 6개의 표적이 이의 고유한 LOCS 용융 서명에 기초하여 구별될 수 있다는 것을 입증한다. 이 실시예는 오직 2개의 형광 채널을 사용하여 단일 웰에서 다수의 표적을 검출하기 위한 단순한 방법을 제공한다. 상이한 줄기 길이 및 염기-쌍 조성으로 인해, LOCS-21, LOCS-22, LOCS-23, LOCS-24, LOCS-25 및 LOCS-26 내의 상이한 줄기(줄기-5, 줄기-6, 줄기-7, 줄기-8, 줄기-9 및 줄기-10)는 고유한 형광 용융 곡선 서명을 생성하였다.
실시예 14: 5개의 형광 채널 및 10개의 LOCS 리포터를 사용한 단일 웰에서의 10개의 표적의 동시 검출 및 식별
하기 실시예에서, LOCS 리포터는 각각의 채널 내에 검출될 수 있는 표적의 수를 증가시켜 5개의 형광 채널을 사용하여 단일 웰에서 동시에 검출될 수 있는 표적의 수를 증가시키도록 사용된다. 이 실시예에서, 2개의 표적은 5개의 형광 채널의 각각에서 검출된다. 이 실시예에서, 모든 10개의 LOCS 리포터는 형광단(FAM, JOE, AttoRho101, Cy5 또는 Cy5.5)으로 5' 표지되고, 켄쳐(3IABkFQ 또는 3IAbRQSp 중 어느 하나)로 3' 표지된다. LOCS 리포터의 루프 영역은 핵산 기질을 함유하고, 줄기 영역은 루프-줄기 구성에서 LOCS 리포터를 구속하는 일련의 상보성 염기-쌍을 함유한다. 이 구성에서, 형광단 및 켄쳐는 가깝게 근접하고, 형광은 표적의 부재 하에 켄칭된다.
올리고뉴클레오타이드
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-10(서열 번호 40), LOCS-15(서열 번호 79), LOCS-21(서열 번호 88), LOCS-22(서열 번호 89), LOCS-24(서열 번호 91), LOCS-27(서열 번호 113), LOCS-28(서열 번호 114), LOCS-29(서열 번호 115), LOCS-30(서열 번호 116), LOCS-31(서열 번호 117), 파트자임 A9(서열 번호 43), 파트자임 B9(서열 번호 44), 파트자임 A10(서열 번호 48), 파트자임 B10(서열 번호 49), 파트자임 A14(서열 번호 94), 파트자임 B14(서열 번호 95), 파트자임 A15(서열 번호 97), 파트자임 B15(서열 번호 98), 파트자임 A16(서열 번호 98), 파트자임 B16(서열 번호 99), 파트자임 A17(서열 번호 100), 파트자임 B17(서열 번호 101), 파트자임 A18(서열 번호 102), 파트자임 B18(서열 번호 103), 파트자임 A19(서열 번호 104), 파트자임 B19(서열 번호 105), 파트자임 A20(서열 번호 118), 파트자임 B20(서열 번호 119), 파트자임 A21(서열 번호 120), 파트자임 B21(서열 번호 121), 정방향 프라이머 1(서열 번호 7), 역방향 프라이머 1(서열 번호 8), 역방향 프라이머 2(서열 번호 10), 정방향 프라이머 7(서열 번호 41), 역방향 프라이머 7(서열 번호 42), 정방향 프라이머 8(서열 번호 52), 정방향 프라이머 9(서열 번호 54), 역방향 프라이머 9(서열 번호 55), 정방향 프라이머 10(서열 번호 72), 역방향 프라이머 10(서열 번호 73), 역방향 프라이머 11(서열 번호 85), 정방향 프라이머 12(서열 번호 106), 역방향 프라이머 12(서열 번호 107), 정방향 프라이머 13(서열 번호 108), 역방향 프라이머 13(서열 번호 109), 정방향 프라이머 14(서열 번호 110), 정방향 프라이머 15(서열 번호 111), 역방향 프라이머 15(서열 번호 112), 정방향 프라이머 16(서열 번호 122) 및 역방향 프라이머 16(서열 번호 123)을 포함한다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다.
CTcry 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-29, 파트자임 A9, 파트자임 B9, 정방향 프라이머 7 및 역방향 프라이머 7이다. NGopa 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-15, 파트자임 A10, 파트자임 B10, 정방향 프라이머 8 및 역방향 프라이머 11이다. gpd 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-21, 파트자임 A14, 파트자임 B14, 정방향 프라이머 12 및 역방향 프라이머 12이다. gpd3 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-22, 파트자임 A15, 파트자임 B15, 정방향 프라이머 9 및 역방향 프라이머 9이다. porA 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-27, 파트자임 A16, 파트자임 B16, 정방향 프라이머 13 및 역방향 프라이머 13이다. TV-Btub 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-24, 파트자임 A17, 파트자임 B17, 정방향 프라이머 14 및 역방향 프라이머 2이다. MgPa 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-28, 파트자임 A18, 파트자임 B18, 정방향 프라이머 1 및 역방향 프라이머 1이다. LGV 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-10, 파트자임 A19, 파트자임 B19, 정방향 프라이머 15 및 역방향 프라이머 15이다. polA 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-30, 파트자임 A20, 파트자임 B20, 정방향 프라이머 16 및 역방향 프라이머 16이다. TFRC 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-31, 파트자임 A21, 파트자임 B21, 정방향 프라이머 10 및 역방향 프라이머 10이다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 증폭 및 검출은 BioRad® CFX96 유전자증폭기를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 사이클링 매개변수는 1초 동안 31℃, 1초 동안 42℃, 1초 동안 53℃, 1초 동안 60℃, 2분 동안 95℃, 5초 동안 95℃ 및 30초 동안 61℃의 10회 터치다운 사이클(사이클마다 0.5℃ 감분) 및 5초 동안 95℃ 및 40초 동안 52℃ 및 5초 동안 65℃의 40회 사이클(데이터는 65℃ 단계에서 수집됨), 이어서 1초 동안 31℃, 1초 동안 42℃, 1초 동안 53℃ 및 1초 동안 60℃였다. 용융 곡선 매개변수는 5초 유지(유지 중 데이터 획득)로 20℃에서 95℃로 0.5℃ 증분이었다. 모든 반응은 이중반복 실행되었고, 40 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머, 200 nM의 각각의 파트자임 A, 200 nM의 각각의 파트자임 B, 200 nM의 각각의 LOCS-10, LOCS-15, LOCS-21, LOCS-22, LOCS-24, LOCS-27, LOCS-29 및 LOCS-31 리포터 및 150 nM의 각각의 LOCS-28 및 LOCS-30, 8 mM MgCl2(Bioline), 0.2 mM dNTP(Bioline), MyTaq 중합효소의 2 단위(Bioline) 및 1x NH4 완충액(Bioline)을 함유하였다. 반응은 NGopa 및/또는 porA, gpd 및/또는 gpd3, TV-Btub 및/또는 MgPa, CTcry 및/또는 LGV 또는 polA 유전자에 상동성인 G-Block 주형(10,000개의 카피) 중 어느 하나, 또는 무 표적(NF H2O)을 함유하였다. 모든 반응은 내인성 대조군으로서 작용하는 TFRC 유전자 표적을 함유하는 인간 게놈 DNA의 10,000개의 카피의 배경을 함유하였다. TFRC 유전자의 검출은 Cy5.5 채널에서의 형광의 증가에 의해 내부 표준품으로서 모든 반응에서 모니터링되었다(데이터 비기재).
결과
PCR로 공지된 시험관내 표적 증폭 방법을 이용하여, 10개의 MNAzyme(MNAzyme 9, MNAzyme 10 및 MNAzyme 14-21)은 이의 상응하는 LOCS 리포터(각각 LOCS-29, LOCS-15, LOCS-21, LOCS-22, LOCS-27, LOCS-24, LOCS-28, LOCS-10, LOCS-30 및 LOCS-31)의 절단을 통해 실시간으로 표적 핵산의 증폭을 모니터링하도록 사용된다. 각각의 채널(FAM, HEX, Texas Red, Cy5 및 Cy5.5) 내의 표적의 하나 또는 둘 다의 존재는 PCR의 증폭 단계에서 형광의 증가에 의해 결정되었고, 이것에 LOCS 용융 서명을 사용한 개별 표적의 고찰이 뒤따른다.
MNAzyme 10은 NGopa 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-15를 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 16은 porA 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-27을 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 14는 gpd 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-21을 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 15는 gpd3 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-22를 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 17은 TV-Btub에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-24를 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 18은 MgPa 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-28을 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 9는 CTcry 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-29를 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 19는 LGV pmpH 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-10을 절단하고 개방하도록 설계되고, MNAzyme 20은 polA 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-30을 절단하고 개방하도록 설계되고; MNAzyme 21은 인간 TFRC 유전자에 상동성인 서열을 검출하고 LOCS-31을 절단하고 개방하도록 설계되었다.
이 실험에서, 증폭 및 검출은 모든 MNAzyme, 모든 프라이머 및 모든 LOCS 올리고뉴클레오타이드에 대한 모든 파트자임을 함유하는 단일 관에서 수행되었다. 임의의 NGopa, porA, gpd, gpd3, TV-Btub, MgPa, CTcry, LGV, polA, TFRC, 또는 이들의 10개의 유전자 표적의 다양한 조합의 존재(다수의 감염을 갖는 샘플을 나타냄)는 FAM, HEX, Texas Red, Cy5 또는 Cy5.5 채널 중 어느 하나에서 신호의 증가에 의해 검출되었다(데이터 비기재).
도 23에 도시된 결과는 표적 NGopa(도 23의 A), porA(도 23의 B), NGopa 및 porA 둘 다(도 23의 C), gpd(도 23의 D), gpd3(도 23의 E), gpd 및 gpd3 둘 다(도 23의 F), TV-Btub(도 23의 G), MgPa(도 23의 H), TV-Btub 및 MgPa 둘 다(도 23의 I), CTcry(도 23의 J), LGV(도 23의 K), CTcry 및 LGV 둘 다(도 23의 l), polA(도 23의 M) 또는 TFRC(도 23의 N)의10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터의 증폭 후 얻은 각각의 용융 곡선 서명을 예시한다. 결과는 마이크로소프트 엑셀(버전 14)을 사용하여 작도된 이중반복 반응으로부터의 평균이다.
표 14에 요약된 이 실시예로부터의 데이터는 단일 표적의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명이 동일한 채널에서 형광하는 제2 표적의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명과 구별된다는 것을 입증한다. 추가적으로, 단일 채널 내에 표적 둘 다의 존재에 의해 생성된 LOCS 용융 서명은 특정 파장에서 검출된 2개의 단일 표적 중 어느 하나에 의해 생성된 LOCS 용융 서명과 구별된다. 이 결과는 이 실시예에서 모든 5개의 채널에 걸쳐 일치한다. FAM 채널에서, NGopa(Tm = 53℃), porA(Tm = 30℃ 및 76℃) 및 NGopa 및 porA 둘 다(Tm = 30℃ 및 53℃) 유전자 표적의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명은 모든 구별되었다. HEX 채널에서, gpd(53℃ 및 70℃), gpd3(30℃, 43℃ 및 76℃) 및 gpd 및 gpd3 둘 다(30℃, 43℃ 및 53℃) 유전자 표적의 존재에서 생성된 LOCS 용융 서명은 모두 구별되었다. Texas Red 채널에서, TV-Btub(31℃, 41℃, 59℃ 및 83℃), MgPa(63℃) 및 TV-Btub 및 MgPa 둘 다(31℃, 41℃ 및 63℃) 유전자 표적의 존재에서 생성된 LOCS 용융 서명은 모두 구별되었다. Cy5 채널에서, CTcry(61℃ 및 79℃), LGV(47℃ 및 80℃) 및 CTcry 및 LGV 둘 다(47℃ 및 61℃) 유전자 표적의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명은 모든 구별되었다. 이 실시예에서, 인간 게놈 DNA(TFRC)는 모든 반응에서 Cy5.5 채널에서 검출되어서, 내인성 대조군으로 작용한다. 결과적으로, polA를 동시에 검출하는 반응은 각각 TFRC 및 polA 유전자 표적에 상응하는 2개의 피크(39℃ 및 59℃)에 의해 LOCS 용융 서명에서 나타난 TFRC를 검출한다. Cy5.5 채널에서, polA 및 TFRC의 존재 하에 생성된 LOCS 용융 서명(39℃ 및 59℃)은 TFRC(39℃ 및 80℃) 단독의 존재에 의해 생성된 LOCS 용융 서명과 구별되어, polA를 함유하는 반응(polA 및 TFRC 용융 서명)과 polA가 결여된 반응(오직 TFRC LOCS 용융 서명) 사이의 구별을 허용한다.
이 실시예는 5개의 형광 채널(각각의 웰에서 검출된 2개의 표적)을 사용하여 단일 웰에서 동시증폭된 10개의 유전자 표적이 이의 고유한 LOCS 용융 서명에 기초하여 구별될 수 있다는 것을 입증한다. 이 실시예는 5개의 형광 채널을 사용하여 단일 웰에서 다수의 표적을 검출하기 위한 단순한 방법을 제공하여서 단일 PCR 기계의 다중화 능력을 배가시킨다.
실시예 15: 한정된 온도 점에서 형광을 측정하여 단일 채널, 단일 웰 다중화에 대한 방법
하기 실시예는 이전에 실시예 1 내지 6에 예시된 것처럼 넓은 온도 범위에 걸쳐 전체 용융 곡선 분석에 대한 요건 없이 단일 파장에서 다수의 표적을 검출하고 구별하기 위한 대안적인 프로토콜을 제공한다. 본 실시예에서, 단일 파장에서 3개의 표적을 검출하고 확인하는 몇몇 방법은 분석 전략의 선택과 커플링된 변형된 LOCS 프로토콜의 이용을 통해 입증된다. 표적 X, 표적 Y 및 표적 Z는 3개의 LOCS 리포터 X, 리포터 Y 및 리포터 Z를 사용하여 검출될 수 있는데, 이들 모두는 동일한 형광단으로 표지될 수 있다. 3개의 LOCS 리포터의 각각은 LOCS-X의 Tm < LOCS-Y의 Tm < LOCS-Z의 Tm인 상이한 융점을 갖는 상이한 줄기 영역을 포함한다. 또한, 각각의 LOCS 리포터는 각각 MNAzyme X, MNAzyme Y 또는 MNAzyme Z에 특이적인 기질을 포함하는 상이한 루프 영역을 함유한다. MNAzyme X, MNAzyme Y 또는 MNAzyme Z는 각각 표적 X, 표적 Y 및 표적 Z를 인식하고 검출하고, 각각 LOCS 리포터 X, 리포터 Y 및 리포터 Z를 절단하도록 설계된다. 제한된 수의 형광 측정(총 6개 미만)은 표적의 PCR 증폭 전 및/또는 후에 얻어질 수 있다. 분석의 다양한 방법은 특정 온도 및 시점에 취해진 측정을 이용할 수 있다. 이는 표 15에 요약되어 있다.
이 실시예에서 개략된 기재된 전략은 임의의 표적을 검출하도록 적응될 수 있지만, 이 구체적인 실시예에서 표적 X는 TFRC 유전자이고, 표적 Y는 rpoB 유전자이고, 표적 Z는 pss 유전자이고, 이들은 각각 동일한 형광단(JOE)으로 표지된 프로브 LOCS-X(LOCS-22), LOCS-Y(LOCS-21) 및 LOCS-Z(LOCS-23)에 의해 검출된다. 사용된 다양한 검출 온도는 TXa = 40.5℃; TXb = 56.5℃; TXc = 78.5℃; T0b = 32℃; TXb = 40.5℃; TYb = 56.5℃; TZb = 65.5℃; TXc = 39.5℃; TYc = 56.5℃; TZc = 65.5℃; TXd = 40℃; TYd = 51℃; 및 TZd = 65℃이다. 추가로, 하기 분석에서 N = 0.5℃의 값이 배정되었다.
분석 프로토콜 A1
제1 특정 온도 TXa에서, LOCS-X의 절단은 무 주형 대조군에 비해 유의미한 형광 신호를 생성하고, 이는 역치 FXa를 초과할 것이다. 동일한 온도에서 절단된 LOCS-Y 및/또는 LOCS-Z의 존재는 무 주형 대조군에 비해 이 LOCS의 줄기의 더 높은 Tm 및 결과적으로 형광 수준으로 인해 유의미한 형광 신호의 생성에 기여하지 않고, 역치 FXa 아래에 있다. 온도 TXa에서의 형광의 증폭 후 측정은 절단된 LOCS-X의 특이적 검출을 허용한다.
온도 TXa보다 높은 제2 특정 온도 TYa에서, 절단된 LOCS-Y는 역치 FYa보다 유의미하게 더 높은 상대 형광 신호를 생성한다. 온도 TYa에서, 절단된 LOCS-X 및/또는 LOCS-Z에 의해 생성된 상대 형광 신호는 역치 FYa보다 유의미하게 낮을 것이다. 따라서, 온도 TYa에서의 형광의 증폭 후 측정은 절단된 LOCS-Y의 특이적 검출을 허용한다.
온도 TXa 및 TYa보다 높은 제3 특정 온도 TZa에서, 절단된 LOCS-Z는 역치 FZa보다 유의미하게 더 높은 상대 형광 신호를 생성한다. 온도 TZa에서, 절단된 LOCS-X 및/또는 LOCS-Y에 의해 생성된 상대 형광 신호는 역치 FZa보다 유의미하게 낮을 것이다. 따라서, 온도 TZa에서의 형광의 증폭 후 측정은 절단된 LOCS-Z의 특이적 검출을 허용한다. 각각의 절단된 LOCS 리포터의 검출은 샘플에서 상응하는 표적의 존재를 나타낸다.
분석 프로토콜 A2
알고리즘은 역치 값을 사용하는 것 대신에 하나 이상의 LOCS 종이 샘플에서 절단될 때 절단된 LOCS 종을 결정하도록 사용될 수 있다. 이 알고리즘은 3개의 검출 온도(온도 TXa, TYa 및 TZa)의 각각에서 측정된 무 주형 대조군의 것에 대해 형광 수준의 비율을 이용한다. 상기 언급된 3개의 온도에서 측정된 상대 형광 수준의 비율은 절단된 LOCS 종의 가능한 조합의 각각에 고유하고, 핑거프린트로서 작용하여서, 샘플에서 상응하는 표적 유전자/들의 존재를 나타낸다. 알고리즘은 일련의 7개의 논리 시험을 포함한다; 하나의 논리 시험은 하나 이상의 절단된 LOCS 종의 존재를 결정하기 위해 절단된 LOCS 및 비절단된 LOCS의 각각의 가능한 조합에 배정된다. 가능한 조합은 (X 단독), (Y 단독), (Z 단독), (X 및 Y 단독), (X 및 Z 단독), (Y 및 Z 단독) 또는 (X, Y 및 Z)이다. 표적의 특정 조합에 양성인 것으로 결정된 샘플에 대해, 이것은 특정 논리 시험에 대해 참(TRUE)으로 결정될 필요가 있다. 논리 시험은 (1) 3개의 상이한 온도에서 측정된 형광 신호의 비율이 미리 결정된 값 범위 내에 해당하고, (2) 형광 신호는 무 주형 대조군보다 유의미하게 더 높은지를 결정한다. 샘플은 논리 시험의 하나의 세트의 최대에 대해 참으로 결정될 수 있고, 이는 LOCS-X, LOCS-Y 및 LOCS-Z의 절단된 종의 특정 조합을 나타내고, 따라서 상응하는 표적/들의 존재를 확인한다. 샘플이 모든 논리 시험에 대해 거짓(FALSE)으로 결정되면, 샘플은 음성 결정될 것이고, LOCS의 임의의 절단된 종을 함유하지 않아서, 샘플이 임의의 3개의 표적을 함유하지 않는다는 것을 나타낸다.
분석 프로토콜 B1
제1 특정 온도 T0b에서, LOCS-X, LOCS-Y 또는 LOCS-Z의 절단된 종은 무 주형 대조군의 것보다 유의미하게 더 높은 형광 신호를 생성하지 않는다. T0b보다 높은 제2 특정 온도 TXb에서, 절단된 LOCS-X는 유의미한 형광 신호를 생성하는 반면, 절단된 LOCS-Y 및/또는 LOCS-Z는 이들 LOCS의 줄기의 더 높은 Tm으로 인해 유의미한 형광 신호의 생성에 기인하지 않는다. 온도 T0b 및 TXb에서의 증폭 후 형광 신호 사이의 차이는 절단된 LOCS-X의 존재 하에 역치 FXb보다 더 높고 절단된 LOCS-X의 부재 하에 더 낮고, 따라서 이는 절단된 LOCS-X의 특정 검출을 허용한다. TXb보다 높은 제3 특정 온도 TYb에서, 절단된 LOCS-Y는 상당한 형광 신호를 생성한다. 다른 한편, 절단된 LOCS-Z는 이의 줄기의 더 높은 Tm으로 인해 온도 TYb에서 유의미한 형광 신호의 생성에 기여하지 않는다. 절단된 LOCS-X는 온도 TXb와 비교하여 온도 TYb에서 유의미한 형광의 증가된 생성에 추가로 기인하지 않는다. 온도 TXb 및 TYb에서의 증폭 후 형광 신호 사이의 차이는 절단된 LOCS-Y의 존재 하에 역치 FYb보다 더 높고 절단된 LOCS-Y의 부재 하에 더 낮고, 따라서 이는 절단된 LOCS-Y의 특정 검출을 허용한다. TYb보다 높은 제4 특정 온도 TZb에서, 절단된 LOCS-Z는 상당한 형광 신호를 생성한다. 절단된 LOCS-X 및/또는 LOCS-Y는 온도 TZb에서 유의미한 형광의 증가된 생성에 추가로 기인하지 않는다. 온도 TYb 및 TZb에서의 증폭 후 형광 신호 사이의 차이는 절단된 LOCS-Z의 존재 하에 역치 FZb보다 더 높고 절단된 LOCS-Z의 부재 하에 더 낮고, 따라서 이는 절단된 LOCS-Z의 특정 검출을 허용한다.
상기 언급된 계산은 하기 식을 이용하여 기재되어 있다:
절단된 LOCS-X의 존재의 결정을 위해, 온도 T
Xb
에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 T
0b
에서의 증폭 후 형광 수준 > 역치 FXb이면, LOCS-X는 샘플에 존재한다.
절단된 LOCS-Y의 존재의 결정을 위해, 온도 T
Yb
에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 T
Xb
에서의 증폭 후 형광 수준 > 역치 FYb이면, LOCS-Y는 샘플에 존재한다.
절단된 LOCS-Z의 존재의 결정을 위해, 온도 T
Zb
에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 T
Yb
에서의 증폭 후 형광 수준
> 역치 FZb이면, LOCS-Z는 샘플에 존재한다.
각각의 절단된 LOCS 리포터의 검출은 샘플에서 상응하는 표적 유전자의 존재를 나타낸다.
분석 프로토콜 B2
알고리즘은 역치 값을 사용하는 것 대신에 T0b, TXb, TYb 및 TZb에서 측정된 증폭 후 형광 수준 사이에 차이로부터 계산된 값의 비율을 사용하여 하나 이상의 LOCS 종이 샘플에서 절단될 때 절단된 LOCS 종을 결정하도록 대안적으로 사용될 수 있다. 값의 비율 (a)(온도 TXb에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 T0b에서의 증폭 후 형광 수준), (b) (온도 TYb에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 TXb에서의 증폭 후 형광 수준) 및 (c) (온도 TZb에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 TYc에서의 증폭 후 형광 수준)는 절단된 LOCS 종의 가능한 조합의 각각에 고유하고, 샘플에서 상응하는 표적/들의 존재를 나타내는 핑거프린트로서 작용한다. 알고리즘은 일련의 8개의 논리 시험을 포함한다; 하나의 논리 시험은 하나 이상의 절단된 LOCS 종의 존재를 결정하기 위한 절단된 LOCS 및 비절단된 LOCS의 각각의 가능한 조합에 배정된다. 가능한 조합은 (무 표적), (X 단독), (Y 단독), (Z 단독), (X 및 Y 단독), (X 및 Z 단독), (Y 및 Z 단독) 또는 (X, Y 및 Z)이다. 표적의 특정 조합에 양성인 것으로 결정된 샘플에 대해, 이것은 논리 시험에 대해 참으로 결정될 필요가 있다. 논리 시험은 3개의 상기 언급된 값 사이의 차이의 비율이 미리 결정된 값 범위 내에 있는지를 결정한다. 샘플은 하나의 논리 시험의 최대에 대해 참으로 결정될 수 있고, 이는 LOCS-X, LOCS-Y 및 LOCS-Z의 절단된 종의 특정 조합을 나타내고, 상응하는 표적/들의 존재를 나타내거나, (무 표적) 논리 시험에 대해 참으로 결정될 때 이것은 임의의 표적/들의 부재를 나타낸다.
분석 프로토콜 C1
규정된 온도에서의 절단된 LOCS 종의 증폭 후 검출은 특정 온도에서 증폭 전 형광 측정과 증폭 후 형광 측정 사이의 차이로부터 얻은 정보를 사용하여 또한 결정될 수 있다. 이 방법은 각각 프로토콜 A 및 B에서 상기 기재된 바대로 무 주형 대조군 또는 기준 온도(T0b)에 대한 상대 증폭 후 형광 수준을 결정하기 위한 대안이다. 제1 특정 온도 TXc에서, 절단된 LOCS-X는 유의미한 형광 신호를 생성하고, 온도 TXc에서의 형광의 증폭 전 측정과 증폭 후 측정 사이의 차이는 역치 FXc보다 높다. 다른 한편, 절단된 LOCS-Y 및/또는 LOCS-Z의 존재는 줄기의 더 높은 Tm으로 인해 온도 TXc에서 유의미한 형광 신호를 생성하지 않고, 온도 TXc에서의 형광의 증폭 전 측정과 증폭 후 측정 사이의 차이는 역치 FXc보다 낮다. 따라서, 온도 TXc에서의 형광의 증폭 전 측정과 증폭 후 측정은 LOCS-X의 절단된 종의 특이적 검출을 허용한다. 온도 TXc에 걸쳐 제2 온도 TYc(여기서 TYc > TXc)에서 절단된 LOCS-Y에 의해 생성된 증분 형광 신호는 역치 FYc보다 유의미하게 더 높다. 다른 한편, 온도 TXc에 걸쳐 온도 TYc에서 절단된 LOCS-X 및/또는 LOCS-Z에 의해 생성된 증분 형광 신호는 역치 FYc보다 유의미하게 더 낮다. 온도 TXc에 걸쳐 온도 TYc에서 증분 형광 신호는 온도 TYc에서 증폭 전 형광 수준과 증폭 후 형광 수준 사이의 차이와 온도 TXc에서 증폭 전 형광 수준과 증폭 후 형광 수준 사이의 차이의 차이를 계산하여 결정된다. 따라서, 온도 TXc 및 TYc에서의 형광 수준의 증폭 전 측정 및 증폭 후 측정으로부터의 정보는 절단된 LOCS-Y의 특이적 검출을 허용한다. 온도 TYc(여기서, TZc > TYc)에 대한 제3 온도 TZc에서의 절단된 LOCS-Z에 의해 생성된 증분 형광 신호는 역치 FZc보다 상당히 더 높다. 다른 한편, 온도 TYc에 걸쳐 온도 TZc에서 절단된 LOCS-X 및/또는 LOCS-Y에 의해 생성된 증분 형광 신호는 역치 FZc보다 유의미하게 더 낮다. 온도 TYc에 걸쳐 온도 TZc에서 증분 형광 신호는 온도 TYc에서 증폭 전 형광 수준과 증폭 후 형광 수준 사이의 차이와 온도 TXc에서 증폭 전 형광 수준과 증폭 후 형광 수준 사이의 차이의 차이를 계산하여 결정된다. 따라서, 온도 TYc 및 TZc에서의 형광 수준의 증폭 전 측정 및 증폭 후 측정으로부터의 정보는 절단된 LOCS-Z의 특이적 검출을 허용한다.
상기 언급된 계산은 하기에 기재되어 있다:
LOCS-X의 존재의 결정을 위해, 온도 T
Xc
에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 T
Xc
에서의 증폭 전 형광 수준 > 역치 FXc이면, LOCS-X는 샘플에 존재한다.
LOCS-Y의 존재의 결정을 위해, (온도 T
Yc
에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 T
Yc
에서의 증폭 전 형광 수준) - (온도 T
Xc
에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 T
Xc
에서의 증폭 전 형광 수준) > 역치 FYc이면, LOCS-Y는 샘플에 존재한다.
LOCS-Z의 존재의 결정을 위해, (온도 T
Zc
에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 T
Zc
에서의 증폭 전 형광 수준) - (온도 T
Yc
에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 T
Yc
에서의 증폭 전 형광 수준) > 역치 FZc이면, LOCS-Z는 샘플에 존재한다.
각각의 절단된 LOCS 리포터의 검출은 샘플에서 상응하는 표적의 존재를 나타낸다. 이 방법은 6개의 형광 측정을 요한다.
분석 프로토콜 C2
알고리즘은 역치 값을 사용하는 것 대신에 3개의 검출 온도 TXc, TYc 및 TZc의 각각에서 측정된 증폭 전 형광 수준과 증폭 후 형광 수준 사이의 차이로부터 계산된 값의 비율을 사용하여 하나 이상의 LOCS 종이 샘플에서 절단될 때 절단된 LOCS 종을 결정하도록 사용될 수 있다. 값의 비율 (i) 온도 TXC에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 TXc에서의 증폭 전 형광 수준, (ii) (온도 TYc에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 TYc에서의 증폭 전 형광 수준) - (온도 TXc에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 TXc에서의 증폭 전 형광 수준) 및 (iii) (온도 TZc에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 TZc에서의 증폭 전 형광 수준) - (온도 TYc에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 TYc에서의 증폭 전 형광 수준)은 절단된 LOCS 및 비절단된 LOCS 종의 가능한 조합의 각각에 고유하고, 샘플에서 상응하는 표적 유전자/들의 존재를 나타내는 핑거프린트로서 작용할 수 있다. 알고리즘은 일련의 8개의 논리 시험을 포함한다; 하나의 논리 시험은 하나 이상의 절단된 LOCS 종의 존재를 결정하기 위한 절단된 LOCS 및 비절단된 LOCS의 각각의 가능한 조합에 배정된다. 가능한 조합은 (무 표적), (X 단독), (Y 단독), (Z 단독), (X 및 Y 단독), (X 및 Z 단독), (Y 및 Z 단독) 또는 (X, Y 및 Z)이다. 표적의 특정 조합에 양성인 것으로 결정된 샘플에 대해, 이것은 논리 시험에 대해 참으로 결정될 필요가 있다. 논리 시험은 (i), (ii)와 (iii) 사이의 차이의 비율이 미리 결정된 값 범위 내에 있는지를 결정한다. 샘플은 하나의 논리 시험의 최대에 대해 참으로 결정될 수 있고, 이는 LOCS-X, LOCS-Y 및 LOCS-Z의 절단된 종의 특정 조합을 나타내고, 따라서 상응하는 표적/들을 함유하거나, (무 표적) 논리 시험에 대해 참으로 결정될 때 임의의 표적을 함유하지 않는다.
분석 프로토콜 D1
다른 대안적인 방법은 각각의 절단된 LOCS의 Tm에서 d형광/d온도 값과 동등한 용융 서명에서 용융 피크의 높이를 측정하는 것이다. 그러나, 이 방법의 이용성은 그러나 또한 Tm을 포함하는 일련의 온도를 포함하는 절단된 LOCS의 Tm에서 d형광/d온도 값을 결정하기 위해 구속되지 않는다. 특정 온도 A℃에서의 d형광/d온도 값은 (A - N)℃ 및 (A + N)℃에 걸쳐 형광 수준의 구배에 등등하다. 수학적으로, 이것은 하기 식으로 표현될 수 있다:
상기 식에 보이는 것처럼, A℃에서의 d형광/d온도 값의 계산은 온도 (A - N)℃ 및 (A + N)℃에서의 형광의 2개의 측정을 요한다. 삼중화에 대해, 3개의 d형광/d온도 값이 필요하고, 따라서 6개의 증폭 후 형광 측정이 필요하다. LOCS-X의 절단된 종의 존재 하에, 온도 TXd에서의 d형광/d온도 값은 역치 FXd보다 높지만, LOCS-X의 절단된 종의 부재 하에, 온도 TXd에서의 d형광/d온도 값은 역치 FXd보다 낮다. LOCS-Y의 절단된 종의 존재 하에, 온도 TYd에서의 d형광/d온도 값은 역치 FYd보다 높지만, LOCS-Y의 절단된 종의 부재 하에, 온도 TYd에서의 d형광/d온도 값은 역치 FYd보다 낮다. LOCS-Z의 절단된 종의 존재 하에, 온도 TZd에서의 d형광/d온도 값은 역치 FZd보다 높지만, LOCS-Z의 절단된 종의 부재 하에, 온도 TZd에서의 d형광/d온도 값은 역치 FZd보다 낮다. 각각의 절단된 LOCS 리포터의 검출은 샘플에서 상응하는 표적 유전자의 존재를 나타낸다.
분석 프로토콜 D2
알고리즘은 역치 값을 사용하는 것 대신에 3개의 검출 온도 TXd, TYd 및 TZd에서 d형광/d온도 값의 비율을 사용하여 하나 이상의 LOCS 종이 샘플에서 절단될 때 절단된 LOCS 종을 결정하도록 사용될 수 있다. 상기 언급된 3개의 온도에서의 d형광/d온도 값의 비율은 절단된 LOCS 종의 가능한 조합의 각각에 고유하고, 샘플에서 상응하는 표적/들의 존재를 나타내는 핑거프린트로서 작용한다. 알고리즘은 일련의 8개의 논리 시험을 포함한다; 하나의 논리 시험은 하나 이상의 절단된 LOCS 종의 존재를 결정하기 위한 절단된 LOCS 및 비절단된 LOCS의 각각의 가능한 조합에 배정된다. 가능한 조합은 (무 표적), (X 단독), (Y 단독), (Z 단독), (X 및 Y 단독), (X 및 Z 단독), (Y 및 Z 단독) 또는 (X, Y 및 Z)이다. 표적의 특정 조합에 양성인 것으로 결정된 샘플에 대해, 이것은 논리 시험에 대해 참으로 결정될 필요가 있다. 논리 시험은 상기 언급된 3개의 온도에서의 d형광/d온도 값의 비율이 미리 결정된 값 범위 내에 있는지를 결정한다. 샘플은 하나의 논리 시험의 최대에 대해 참으로 결정될 수 있고, 이는 LOCS-X, LOCS-Y 및 LOCS-Z의 절단된 종의 특정 조합, 따라서 상응하는 표적/들을 나타내거나, (무 표적) 논리 시험에 대해 참으로 결정될 때 임의의 표적을 함유하지 않는 것으로 결정된다.
올리고뉴클레오타이드
이 실험에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-22(서열 번호 89), LOCS-21(서열 번호 88), LOCS-23(서열 번호 90), 파트자임 A22(서열 번호 124), 파트자임 B22(서열 번호 125), 파트자임 A23(서열 번호 126), 파트자임 B23(서열 번호 127), 파트자임 A24(서열 번호 130), 파트자임 B24(서열 번호 131), 정방향 프라이머 10(서열 번호 72), 역방향 프라이머 10(서열 번호 73), 정방향 프라이머 6(서열 번호 25), 역방향 프라이머 6(서열 번호 26), 정방향 프라이머 17(서열 번호 128) 및 역방향 프라이머 17(서열 번호 129)을 포함한다. 서열은 서열 목록에 기재되어 있다. TFRC 유전자의 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-22, 파트자임 A22, 파트자임 B22, 정방향 프라이머 10 및 역방향 프라이머 10이다. rpoB 유전자의 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-21, 파트자임 A23, 파트자임 B23, 정방향 프라이머 6 및 역방향 프라이머 6이다. pss 유전자의 증폭 및 검출에 특이적인 올리고뉴클레오타이드는 LOCS-23, 파트자임 A24, 파트자임 B24, 정방향 프라이머 17 및 역방향 프라이머 17이다.
반응 조건
표적 서열의 실시간 검출은 BioRad® CFX96 유전자증폭기를 사용하여 20 μL의 총 반응 부피에서 수행되었다. 사이클링 매개변수는 데이터 획득으로 30초 동안 39.5℃, 데이터 획득으로 30초 동안 56.5℃, 데이터 획득으로 30초 동안 65.5℃, 5초 동안 95℃ 및 30초 동안 61℃의 2분 10회 터치다운 사이클 동안 95℃(사이클마다 0.5℃ 감분) 및 5초 동안 95℃ 및 40초 동안 52℃의 40회 사이클(데이터는 52℃ 단계에서 수집됨), 이어서 데이터 획득으로 30초 동안 39.5℃, 데이터 획득으로 30초 동안 40.5℃, 데이터 획득으로 30초 동안 50.5℃, 데이터 획득으로 30초 동안 51.5℃, 데이터 획득으로 30초 동안 56.5℃, 데이터 획득으로 30초 동안 64.5℃, 데이터 획득으로 30초 동안 65.5℃ 및 데이터 획득으로 30초 동안 78.5°C였다. 각각의 반응은 40 nM의 각각의 정방향 프라이머, 200 nM의 각각의 역방향 프라이머, 200 nM의 각각의 파트자임, 80 nM의 LOCS-22 리포터, 210 nM의 LOCS-21 리포터, 300 nM의 LOCS-23 리포터, 2 mM MgCl2(Bioline) 및 1x SensiFAST 프로브 No-ROX Mix(Bioline)를 함유하였다. 반응은 표적 유전자의 게놈 DNA 또는 합성 G-Block 주형(NF H2O에서의 10,000개의 카피) 중 어느 하나 또는 무 표적(NF H2O)을 함유하였다.
결과
PCR 동안, 3개의 MNAzyme(MNAzyme 22, MNAzyme 23 및 MNAzyme 24)은 이의 상응하는 LOCS 리포터(각각 LOCS-22, LOCS-21 및 LOCS-23)의 절단을 통해 실시간으로 표적 핵산의 증폭을 모니터링하도록 사용된다. MNAzyme 22는 TFRC 유전자(호모 사피엔스) 서열을 검출하고 LOCS-22를 절단하도록 설계되었다. MNAzyme 23은 rpoB 유전자(클레브시엘라 뉴모니아에) 서열을 검출하고 LOCS-21을 절단하도록 설계되었다. MNAzyme 24는 pss 유전자(스트렙토코커스 뉴모니아에) 서열을 검출하고 LOCS-23을 절단하도록 설계되었다. 표적 유전자 TFRC, rpoB 또는 pss 중 어느 하나의 존재는 PCR 사이클의 증폭 전 단계 또는 증폭 후 단계에서 몇몇 온도에서 측정된 JOE 채널에서 형광 신호에 의해 검출되었다.
도 24에 도시된 결과는 40.5℃, 56.5℃ 및 78.5℃에서 측정된 TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터 JOE 채널에서 얻은 비교용 증폭 후 형광 수준을 예시한다. 결과는 무 주형 대조군의 삼중반복 반응으로부터의 평균에 의해 공제된 삼중반복 반응으로부터의 형광 수준의 평균이다. 40.5℃에서, TFRC를 함유하지 않는 샘플이 아니라 TFRC를 함유하는 샘플은 역치 FXa보다 (무 주형 대조군에 비해) 더 높은 형광 수준을 갖는다. 56.5℃에서, rpoB를 함유하지 않는 샘플이 아니라 rpoB를 함유하는 샘플은 역치 FYa보다 (무 주형 대조군에 비해) 더 높은 형광 수준을 갖는다. 78.5℃에서, pss를 함유하지 않는 샘플이 아니라 pss를 함유하는 샘플은 역치 FZa보다 (무 주형 대조군에 비해) 더 높은 형광 수준을 갖는다.
표 16은 7개의 논리 시험에 증폭 후 형광 수준(TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 각각의 샘플로부터 40.5℃, 56.5℃ 및 78.5℃에서 측정됨)을 처리한 후 얻은 결과를 보여준다. 7개의 논리 시험의 각각은 샘플이 (TFRC 단독), (rpoB 단독), (pss 단독), (TFRC 및 rpoB 단독), (TFRC 및 pss 단독), (rpoB 및 pss 단독) 또는 (TFRC, rpoB 및 pss)을 함유하는지를 결정하는 3개의 기준(표 16의 제2 행)을 포함한다. 처음의 2개의 기준은 동일한 온도에서 무 주형 대조군으로부터의 평균 형광 수준에 의해 공제된 상이한 온도(40.5℃, 56.5℃ 또는 78.5℃)에서 측정된 2개의 형광 수준 사이의 비율이 미리 정의된 값보다 크거나 낮거나 미리 정의된 범위 사이에 해당하는지를 결정한다. 최종 기준은 관찰된 형광 신호가 무 주형 대조군의 것보다 유의미하게 더 높다는 것을 결정한다. 각각의 샘플은 오직 이것이 논리 시험의 모든 3개의 기준에 참이면 논리 시험에 참으로 간주된다. 실험은 중복반복으로 샘플의 8개의 유형을 사용하여 수행되었고, 이들은 3개의 표적 주형의 0개 또는 10000개의 카피의 모든 조합(무 주형 대조군은 모든 3개의 주형의 0개의 카피를 가짐)이다. 모든 시험된 샘플은 최대 하나의 논리 시험에 대해 참으로 결정되고, 다른 모든 논리 시험에 대해서는 거짓인 채로 하여, 표적 유전자의 존재를 정확히 결정하였다. 무 주형 대조군 샘플은 모든 논리 시험에 대해 거짓인 채이다.
도 25는 TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 삼중반복 반응으로부터 JOE 채널에서 32℃, 40.5℃, 56.5℃ 및 65.5℃에서 취한 차등적 증폭 후 형광 측정의 평균의 비교를 보여준다. (a)로 표시된 32℃ 및 40.5℃에서 측정된 형광 수준 사이의 차이는 오직 TFRC를 함유하는 샘플에서 역치 FXb보다 더 높았다. (b)로 표시된 40.5℃ 및 56.5℃에서 측정된 형광 수준 사이의 차이는 오직 rpoB를 함유하는 샘플에서 역치 FYb보다 더 높았다. (c)로 표시된 56.5℃ 및 65.5℃에서 측정된 형광 수준 사이의 차이는 오직 pss를 함유하는 샘플에서 역치 FZb보다 더 높았다.
표 17은 8개의 논리 시험에 TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 각각의 샘플로부터 32℃, 40.5℃, 56.5℃ 및 65.5℃ 사이에 차등적 증폭 후 형광 값으로부터 처리된 후 얻은 결과를 보여준다. 이 차등적 값은 32℃ 및 39.5℃; 40.5℃ 및 56.5℃; 및 56.5℃ 및 65.5℃에서 측정된 형광 수준의 차이로 계산되었다. 8개의 논리 시험의 각각은 샘플이 (무 표적), (TFRC 단독), (rpoB 단독), (pss 단독), (TFRC 및 rpoB 단독), (TFRC 및 pss 단독), (rpoB 및 pss 단독) 또는 (TFRC, rpoB 및 pss)을 함유하는지를 결정하는 2개의 기준(표 17의 제2 행)을 포함한다. 2개의 기준은 2개의 차등적 형광 값 사이의 비율이 미리 한정된 값보다 크거나 작거나 미리 한정된 범위 사이에 있는지를 결정한다. 모든 시험된 샘플은, 오직 하나의 논리 시험에 대해서만 참으로 결정되고, 다른 모든 논리 시험에 대해 거짓인 채로 하여, 표적 유전자의 존재를 정확히 결정하였다.
도 26에 도시된 결과는 TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 반응으로부터 JOE 채널에서 39.5℃, 56.5℃ 및 65.5℃에서의 증폭 전 형광 측정 및 증폭 후 형광 측정으로부터 얻은 값의 비교를 예시한다. 결과는 값 (i) 39.5℃에서의 증폭 후 형광 수준 - 39.5℃에서의 증폭 전 형광 수준, (ii) (56.5℃에서의 증폭 후 형광 수준 - 56.5℃에서의 증폭 전 형광 수준) - (39.5℃에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 39.5℃에서의 증폭 전 형광 수준) 및 (iii) (온도 65.5℃에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 65.5℃에서의 증폭 전 형광 수준) - (온도 56.5℃에서의 증폭 후 형광 수준 - 온도 56.5℃에서의 증폭 전 형광 수준)에 대한 삼중반복 반응의 평균이다. TFRC를 함유하지 않는 샘플이 아니라 TFRC를 함유하는 샘플에 대해, 정규화된 형광 값(i)은 역치 FXc보다 높다. rpoB를 함유하지 않는 샘플이 아니라 rpoB를 함유하는 샘플에 대해, 정규화된 형광 값(ii)은 역치 FYc보다 높다. pss를 함유하는 샘플이 아니라 pss를 함유하는 샘플에 대해, 정규화된 형광 값(iii)은 역치 FZc보다 높다.
표 18은 8개의 논리 시험에 대한 상기 언급된 값 (i), (ii) 및 (iii)을 처리한 후 얻은 결과를 보여준다. 8개의 논리 시험의 각각은 샘플이 (무 표적), (TFRC 단독), (rpoB 단독), (pss 단독), (TFRC 및 rpoB 단독), (TFRC 및 pss 단독), (rpoB 및 pss 단독) 또는 (TFRC, rpoB 및 pss)을 함유하는지를 결정하는 2개의 기준(표 18의 제2 행)을 포함한다. 2개의 기준의 각각은 값 (i), (ii) 및 (iii)의 2개 사이의 비율이 미리 한정된 값보다 크거나 작거나 미리 한정된 범위 사이에 있는지를 결정한다. 모든 시험된 샘플은, 오직 하나의 논리 시험에 대해서만 참으로 결정되고, 다른 모든 논리 시험에 대해 거짓인 채로 하여, 표적 유전자의 존재를 정확히 결정하였다.
도 27은 37℃, 50℃ 및 65℃에서의 TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 삼중반복 반응으로부터 JOE 채널에서 얻은 비교용 평균 증폭 후 d형광/d온도 값을 보여준다. 이 값은 36.5℃, 37.5℃, 49.5℃, 50.5℃, 64.5℃ 및 65.5℃에서 취한 증폭 후 형광 측정으로부터 계산되었다. 37℃에서의 d형광/d온도 값은 TFRC를 함유하는 샘플에서만 역치 FXd보다 더 높았다. 50℃에서의 d형광/d온도 값은 rpoB를 함유하는 샘플에서만 역치 FYd보다 더 높았다. 65℃에서의 d형광/d온도 값은 pss를 함유하는 샘플에서만 역치 FZd보다 더 높았다.
표 19는 8개의 논리 시험에 TFRC, rpoB, pss 또는 2개 이상의 유전자 표적의 모든 조합의 10,000개의 카피를 함유하는 각각의 샘플로부터 37℃, 50℃ 및 65.5℃에서 d형광/d온도 값을 처리한 후 얻은 결과를 보여준다. 이 값은 36.5℃, 37.5℃, 49.5℃, 50.5℃, 64.5℃ 및 65.5℃에서 취한 증폭 후 형광 측정으로부터 계산되었다. 8개의 논리 시험의 각각은 샘플이 (무 표적), (TFRC 단독), (rpoB 단독), (pss 단독), (TFRC 및 rpoB 단독), (TFRC 및 pss 단독), (rpoB 및 pss 단독) 또는 (TFRC, rpoB 및 pss)을 함유하는지를 결정하는 2개의 기준(표 19의 제2 행)을 포함한다. 2개의 기준은 2개의 d형광/d온도 값 사이의 비율이 미리 한정된 값보다 크거나 작거나 미리 한정된 범위 사이에 있는지를 결정한다. 모든 시험된 샘플은, 오직 하나의 논리 시험에 대해서만 참으로 결정되고, 다른 모든 논리 시험에 대해 거짓인 채로 하여, 표적 유전자의 존재를 정확히 결정하였다.
Claims (81)
- 샘플에서 제1 표적 및 제2 표적의 존재 또는 부재를 결정하는 방법으로서, 하기 단계들을 포함하는 방법:
(a) 반응 혼합물을 제조하는 단계로서, 제1 표적 및/또는 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함할 것으로 추정되는 샘플 또는 이의 유도체를
제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드, 여기서 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 각각은 비혼성화된 뉴클레오타이드의 폐쇄된 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하며,
제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 상이함, 및
오직 표적 또는 이의 앰플리콘과 접촉할 때만 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분을 절단하거나 분해할 수 있는 효소와 접촉시켜 반응 혼합물을 제조하는 단계;
(b) 반응 혼합물을 처리하는 단계로서,
- 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해, 효소가 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단 또는 분해를 유도하기에 적합한 조건 하에;
- 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 형광단과 켄쳐 분자의 공간 분리를 수월하게 하고 제1 검출 가능한 형광 신호를 제공하기 위해 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 가닥이 해리하는 제1 온도 이상에서, 그리고
- 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 형광단과 켄쳐 분자의 공간 분리를 수월하게 하고 제2 검출 가능한 형광 신호를 제공하기 위해 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 가닥이 해리하는 제2 온도 이상에서, 반응 혼합물을 처리하는 단계;
여기서,
제1 온도는 제2 온도보다 낮고,
제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 및 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 가시 스펙트럼의 동일한 색상 영역에서 발광함(emit); 및
(c) 제2 온도 이상인 온도를 포함하거나 이것으로 이루어진 하나 이상의 온도에서 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호의 수준을 검출하므로써 샘플에서 상기 표적의 존재 또는 부재를 결정하는 단계. - 제1항에 있어서, 효소는 다성분 핵산 효소(MNAzyme)를 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는
제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제1 MNAzyme에 의한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위해, 제1 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제1 다성분 핵산 효소(MNAzyme)의 결합 및 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 상기 제1 MNAzyme의 기질 아암의 혼성화에 적합한 조건 하에 반응 혼합물을 처리하는 것을 포함하는, 방법. - 제2항에 있어서, 제1 표적은 제1 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제1 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 핵산 서열 또는 이의 앰플리콘인, 방법.
- 제1항에 있어서,
- 제1 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 효소는 제1 표적에 결합할 수 있는 압타머를 갖는 효소를 포함하고;
- 압타머에 대한 제1 표적의 결합은, 압타머를 갖는 효소가 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법. - 제4항에 있어서, 압타머를 갖는 효소는 apta-DNAzyme, apta-리보자임, apta-MNAzyme의 임의의 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 제2항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
- 제1 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 반응 혼합물은 제1 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제1 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고;
- 제1 MNAzyme은 제1 표적에 결합할 수 있는 압타머 서열을 포함하고;
- 압타머에 대한 표적의 결합은 제1 MNAzyme이 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 효소에 의한 상기 절단 또는 분해 동안 상기 표적 또는 이의 앰플리콘에 혼성화되지 않는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 효소는 제한 엔도뉴클레아제를 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는
제1 제한 엔도뉴클레아제가 회합하는 이중 가닥 서열을 형성하고 이로써 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위해 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제1 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화에 적합한 조건 하에 반응 혼합물을 처리하는 것을 포함하는, 방법. - 제8항에 있어서, 제한 엔도뉴클레아제는 제1 제한 엔도뉴클레아제에 대한 상기 이중 가닥 서열의 루프 가닥과 회합하고 이를 절단할 수 있는 닉킹(nicking) 엔도뉴클레아제인, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 효소(예를 들어, 중합효소 효소, 엑소뉴클레아제)는 엑소뉴클레아제 활성을 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는
반응 혼합물을 하기에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 것을 포함하는, 방법:
- 제1 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
- 제1 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열에 대한 상류 (5')에 위치한 제2 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제1 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 혼성화,
- 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소와 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 근처에서의 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분과의 회합, 및
- 제1 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소의 촉매 활성. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 효소는 엑소뉴클레아제 활성을 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는
반응 혼합물을 하기에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 것을 포함하는, 방법:
- 제1 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
- 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소와 제1 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열과의 회합, 및
- 제1 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제1 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소의 촉매 활성. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 효소는 촉매 활성에 제1 보인자(co-factor)를 요하는 DNAzyme 및/또는 리보자임을 포함하고, 상기 반응 혼합물을 처리하는 단계는 반응 혼합물을 하기에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 것을 포함하는, 방법:
- DNAzyme 및/또는 리보자임이 촉매적으로 활성이 되도록 하는, DNAzyme에 대한 상기 제1 보인자의 결합 및/또는 리보자임에 대한 상기 제1 보인자의 결합,
- 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 혼성화,
- 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단을 수월하게 하고 제1 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 촉매 활성,
여기서:
제1 표적은 제1 보인자임. - 제12항에 있어서, 제1 보인자는 금속 이온(예를 들어, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+)인, 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 처리 단계는 반응 혼합물을 하기 중 임의의 하나 이상에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 것을 추가로 포함하는 방법:
- 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제2 MNAzyme에 의한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제2 MNAzyme의 결합 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 상기 제2 MNAzyme의 기질 아암의 혼성화;
- 제2 제한 엔도뉴클레아제가 이중 가닥 서열과 회합하는 이중 가닥 서열을 형성하고 이로써 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화;
- 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열에 대한 상류 (5')에 위치한 제2 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 혼성화,
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소와 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 근처에서의 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분과의 회합, 및
제2 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소의 촉매 활성;
- 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제2 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소와 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열과의 회합, 및
제2 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제2 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소의 촉매 활성;
- DNAzyme 및/또는 리보자임이 촉매적으로 활성이 되도록 하는, DNAzyme에 대한 제2 보인자의 결합 및/또는 리보자임에 대한 제2 보인자의 결합,
제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 혼성화,
제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단을 수월하게 하고 제2 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 촉매 활성,
여기서:
제2 표적은 제2 보인자임. - 제14항에 있어서, 제2 보인자는 금속 이온(예를 들어, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+)인, 방법.
- 제14항에 있어서, 제2 제한 엔도뉴클레아제는 제2 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 상기 이중 가닥 서열의 루프 가닥과 회합하고 절단할 수 있는 닉킹 엔도뉴클레아제인, 방법.
- 제16항에 있어서, 제1 제한 엔도뉴클레아제 및 제2 제한 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제의 상이한 유형인, 방법.
- 제16항에 있어서, 제1 제한 엔도뉴클레아제 및 제2 제한 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제의 동일한 유형인, 방법.
- 제14항에 있어서, 제2 표적은 제2 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제2 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 핵산 서열 또는 이의 앰플리콘인, 방법.
- 제14항에 있어서,
- 제2 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 효소는 제2 표적에 결합할 수 있는 압타머를 갖는 효소를 포함하고;
- 압타머에 대한 제2 표적의 결합은, 압타머를 갖는 효소가 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법. - 제20항에 있어서, 압타머를 갖는 효소는 apta-DNAzyme, apta-리보자임, apta-MNAzyme의 임의의 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 제14항, 제20항 및 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
- 제2 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 반응 혼합물은 제2 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제2 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고;
- 제2 MNAzyme은 제2 표적에 결합할 수 있는 압타머 서열을 포함하고;
- 제2 MNAzyme의 압타머 서열에 대한 제2 표적의 결합은, 제2 MNAzyme의 압타머에 결합된 억제 분자의 제거를 수월하게 하는 것에 의해 제2 MNAzyme이 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법. - 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 동일한, 방법.
- 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
- 반응 혼합물은 상기 제1 MNAzyme 및 제2 MNAzyme을 포함하고;
- 제1 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열은 제2 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열과 상이한, 방법. - 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 장치의 단일 형광 방출 채널에서 검출 가능한, 방법.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소는 임의의 상기 표적 또는 이의 앰플리콘의 절단 또는 분해를 유도하지 않는, 방법.
- 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 각각 상기 이중 가닥 줄기 부분 및 상기 단일 가닥 루프 부분으로 이루어지는, 방법.
- 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 존재 또는 부재를 하기에 의해 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법:
(d) 샘플 또는 이의 유도체를 포함하는 반응 혼합물을
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 폐쇄된 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하며,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 것과 상이하고;
이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함함; 및
오직 표적 또는 이의 앰플리콘과 접촉할 때만 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분을 절단하거나 분해할 수 있는 효소와 접촉시키는 단계;
(e) 반응 혼합물을 처리하는 단계로서,
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해 효소가 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단 또는 분해를 유도하기에 적합한 조건 하에;
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 형광단과 켄쳐 분자의 공간 분리를 수월하게 하고 제3 검출 가능한 형광 신호를 제공하기 위해 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 가닥이 해리하는 제3 온도 이상에서 처리하는 단계;
여기서:
제3 온도는 제1 온도 및 제2 온도보다 높음, 및
(f) 샘플에서 상기 표적의 존재 또는 부재를 결정하도록, 제3 온도 이상인 온도를 포함하거나 이것으로 이루어진 하나 이상의 온도에서 상기 제1 형광 신호, 제2 형광 신호 및 제3 형광 신호의 수준을 검출하는 단계. - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플에서 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 존재 또는 부재를 하기에 의해 결정하는 것을 추가로 포함하는, 방법:
(d) 샘플 또는 이의 유도체를 포함하는 반응 혼합물을
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 폐쇄된 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하며,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 또는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 것과 동일하고;
이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고, 여기서 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드에 연결된 형광단 분자는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및/또는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단보다 가시 스펙트럼의 상이한 색상 영역에서 발광함; 및
오직 표적 또는 이의 앰플리콘과 접촉할 때만 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분을 절단하거나 분해할 수 있는 효소와 접촉시키는 단계;
(e) 반응 혼합물을 처리하는 단계로서,
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해 효소가 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단 또는 분해를 유도하기에 적합한 조건 하에;
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 형광단과 켄쳐 분자의 공간 분리를 수월하게 하고 제3 검출 가능한 형광 신호를 제공하기 위해 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 가닥이 해리하는 제3 온도에서, 반응 혼합물을 처리하는 단계;
(f) 샘플에서 상기 표적의 존재 또는 부재를 결정하도록, 제3 온도 이상인 온도를 포함하거나 이것으로 이루어진 하나 이상의 온도에서 상기 제1 형광 신호, 제2 형광 신호 및 제3 형광 신호의 수준을 검출하는 단계. - 제29항에 있어서, 제3 온도는 제1 온도 및/또는 제2 온도와 상이한, 방법.
- 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 반응 혼합물을 하기 중 임의의 하나 이상에 대해 적합한 조건 하에 처리하는 단계를 포함하는, 방법:
- 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제3 MNAzyme에 의한 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위해 제3 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제3 MNAzyme의 결합 및 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 상기 제3 MNAzyme의 기질 아암의 혼성화;
- 제3 제한 엔도뉴클레아제가 이중 가닥 서열과 회합하는 이중 가닥 서열을 형성하고 이로써 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하는 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 상기 절단을 수월하게 하기 위해 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화;
- 제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열에 대한 상류 (5')에 위치한 제3 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제3 표적 또는 이의 앰플리콘에 대한 제3 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 혼성화, 제3 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 이의 인접한 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분을 갖는 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제3 효소의 회합, 및
제3 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제3 효소의 촉매 활성;
- 제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열을 형성하기 위한 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 제3 표적 또는 이의 앰플리콘의 혼성화,
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제3 효소와 제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열과의 회합, 및
제3 표적 또는 앰플리콘을 포함하는 제3 이중 가닥 서열의 루프 부분의 분해를 수월하게 하고 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제3 효소의 촉매 활성;
- DNAzyme 및/또는 리보자임이 촉매적으로 활성이 되도록 DNAzyme에 대한 제3 보인자의 결합 및/또는 리보자임에 대한 제3 보인자의 결합,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 대한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 혼성화,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 절단을 수월하게 하고 제3 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 형성하기 위한 DNAzyme 및/또는 리보자임의 촉매 활성,
여기서:
제3 표적은 제3 보인자임. - 제31항에 있어서, 보인자는 금속 이온(예를 들어, Mg2+, Mn2+, Ca2+, Pb2+)인, 방법.
- 제31항에 있어서, 제한 엔도뉴클레아제는 제3 표적 또는 이의 앰플리콘을 포함하는 상기 이중 가닥 서열의 루프 가닥과 회합하고 절단할 수 있는 닉킹 엔도뉴클레아제인, 방법.
- 제31항에 있어서, 제3 표적은 제3 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제3 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 핵산 서열 또는 이의 앰플리콘인, 방법.
- 제31항에 있어서,
- 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 효소는 제3 표적에 결합할 수 있는 압타머를 갖는 효소를 포함하고;
- 압타머에 대한 제3 표적의 결합은, 압타머를 갖는 효소가 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법. - 제35항에 있어서, 압타머를 갖는 효소는 apta-DNAzyme, apta-리보자임, apta-MNAzyme의 임의의 하나 이상을 포함하는, 방법.
- 제31항에 있어서,
- 제3 표적은 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자이고;
- 반응 혼합물은 제3 MNAzyme의 어셈블리를 수월하게 하기 위해 제3 MNAzyme의 센서 아암에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고;
- 제3 MNAzyme은 제3 표적에 결합할 수 있는 압타머 서열을 포함하고;
- 제3 MNAzyme의 압타머 서열에 대한 제3 표적의 결합은, 제3 MNAzyme의 압타머에 결합된 억제 분자의 제거를 수월하게 하는 것에 의해 제3 MNAzyme이 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있는, 방법. - 제31항 및 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
- 반응 혼합물은 상기 제3 MNAzyme 및 상기 제1 MNAzyme 및 제2 MNAzyme의 둘 다 중 어느 하나를 포함하고;
- 제3 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열은
제1 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열, 및/또는
제1 MNAzyme의 기질 아암에 혼성화할 수 있는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분의 서열과 상이한, 방법. - 제28항 및 제31항 또는 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
- 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분의 것과 상이하고;
- 제3 온도는 제1 온도 및 제2 온도와 상이하고;
- 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제1 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 가시 스펙트럼과 동일한 색상 영역에서 발광하는, 방법. - 제28항 및 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제1 및/또는 제2 폐쇄 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 동일한, 방법.
- 제40항에 있어서, 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 및 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 및/또는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 장치의 동일한 형광 방출 채널을 사용하여 검출 가능한, 방법.
- 제28항 내지 제38항 및 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
- 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 가시 스펙트럼의 동일한 색상 영역에서 발광하고;
- 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단은 제1 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 개방 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단과 가시 스펙트럼의 상이한 색상 영역에서 발광하는, 방법. - 제28항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 온도는 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃ 초과만큼 제1 온도 및/또는 제2 온도와 상이한, 방법.
- 제28항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 온도에서의 제3 형광 신호의 검출은 샘플에서의 제3 표적의 존재를 나타내고, 제3 온도에서의 제3 형광 신호의 검출의 실패는 샘플에서의 제3 표적의 부재를 나타내는, 방법.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 제1 온도에서의 제1 형광 신호의 존재의 결정은 샘플에서의 제1 표적의 존재를 나타내고, 제1 형광 신호의 부재의 결정은 샘플에서의 제1 표적의 부재를 나타내고;
(ii) 제2 온도에서의 제2 형광 신호의 존재의 결정은 샘플에서의 제2 표적의 존재를 나타내고, 제2 형광 신호의 부재의 결정은 샘플에서의 제2 표적의 부재를 나타내는, 방법. - 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적 및 제2 표적의 존재 또는 부재의 상기 결정은 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호를 사용한 용융 곡선 분석을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 파트 (c)는
- 제2 온도 이상의 온도에서; 그리고
- 제1 온도 이상 및 제2 온도 미만인 온도에서, 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법. - 제47항에 있어서, 파트 (c)는 제2 온도보다 낮은 온도에서 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호의 수준을 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제47항 또는 제48항에 있어서, 파트 (c)는 핵산 증폭 반응 동안에 그리고/또는 반응의 완료 시 상기 제1 형광 신호 및 제2 형광 신호의 수준을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 표적의 공지된 농도 및/또는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 공지된 농도를 사용하여 제1 표적 양성 대조군 형광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적을 포함하는 별개의 대조군 샘플에 상기 방법을 반복하여 제1 표적 양성 대조군 형광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제51항에 있어서, 제1 표적을 포함하는 대조군 샘플은 제1 표적의 공지된 농도를 포함하는, 방법.
- 제51항 또는 제52항에 있어서, 제1 표적을 포함하는 대조군 샘플은 상기 제2 표적을 추가로 포함하는, 방법.
- 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 표적을 포함하는 별개의 대조군 샘플에 상기 방법을 반복하여 제2 표적 양성 대조군 형광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제54항에 있어서, 제2 표적을 포함하는 대조군 샘플은 제2 표적의 공지된 농도를 포함하는, 방법.
- 제54항 또는 제55항에 있어서, 상기 대조군 샘플은 상기 제1 표적을 추가로 포함하는, 방법.
- 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 표적 및 상기 제2 표적을 포함하는 별개의 대조군 샘플에 상기 방법을 반복하여 조합된 양성 대조군 형광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제57항에 있어서, 조합된 대조군 샘플은 제1 표적의 공지된 농도 및/또는 제2 표적의 공지된 농도를 포함하는, 방법.
- 제50항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 양성 대조군 형광 신호를 사용하여 상기 제1 형광 신호 및/또는 상기 제2 형광 신호를 정규화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제46항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 함유하지 않는 별개의 음성 대조군 샘플에서 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법을 반복하여 음성 대조군 형광 신호를 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법:
(i) 상기 제1 표적; 또는
(ii) 상기 제2 표적; 또는
(iii) 상기 제1 표적 또는 상기 제2 표적. - 제60항에 있어서, 상기 음성 대조군 형광 신호를 사용하여 상기 제1 형광 신호 및/또는 상기 제2 형광 신호를 정규화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제46항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 형광 신호 및/또는 제2 형광 신호를 역치 값과 비교하는 단계를 추가로 포함하고,
- 역치 값은, 샘플에서의 제1 표적 및 제2 표적의 상기 존재 또는 부재를 결정하도록, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 따라 시험된 일련의 샘플로부터 유래된 형광 신호를 사용하여 생성되고, 하기 중 임의의 하나 이상을 포함하는, 방법:
(i) 무(no) 주형 대조군 및 제1 표적
(ii) 무 주형 대조군 및 제2 표적
(iii) 무 주형 대조군, 제1 표적 및 제2 표적. - 제62항에 있어서, 일련의 샘플은 상기 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 공지된 농도 및/또는 상기 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 공지된 농도를 사용하여 시험되는, 방법.
- 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 온도는 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃, 40℃, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃ 초과만큼 제2 온도와 상이한, 방법.
- 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 상기 이의 앰플리콘은 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction), 가닥 대체 증폭(SDA: strand displacement amplification), 헬리카제 의존적 증폭(HDA: helicase dependent amplification), 재조합효소 중합효소 증폭(RPA: Recombinase Polymerase Amplification), 루프 매개 등온 증폭(LAMP: loop-mediated isothermal amplification), 회전 환 증폭(RCA: rolling circle amplification), 전사 매개 증폭(TMA: transcription-mediated amplification), 자가 유지 서열 복제(3SR: self-sustained sequence replication), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA: nucleic acid sequence based amplification), 및/또는 역방향 전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction) 중 임의의 하나 이상에 의해 제조되는, 방법.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플인, 방법.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 시험관내 수행되는, 방법.
- 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 생체외 수행되는, 방법.
- 조성물로서,
상기 조성물은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 각각은 비혼성화된 뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하고,
제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 상이하고,
이중 가닥 줄기 부분의 각각은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고,
형광단 분자는 가시 스펙트럼의 동일한 색상 영역에서 발광하고, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 융점(Tm)은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분의 Tm과 상이한, 조성물. - 제69항에 있어서, 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한, 조성물.
- 제69항 또는 제70항에 있어서,
제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 폐쇄된 단일 가닥 루프 부분에 혼성화할 수 있는 기질 아암을 포함하는 제1 MNAzyme; 및
제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 혼성화할 수 있는 기질 아암을 포함하는 제2 MNAzyme을 추가로 포함하는, 조성물. - 제71항에 있어서,
제1 MNAzyme의 기질 아암은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 혼성화되고;
제2 MNAzyme의 기질 아암은 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 혼성화되는, 조성물. - 제72항에 있어서,
제1 MNAzyme 및/또는 제2 MNAzyme은 표적 분석물질, 단백질, 화합물 또는 분자에 결합된 압타머 서열 및 올리고뉴클레오타이드 서열에 혼성화된 센서 아암을 포함하고;
제1 MNAzyme은 제2 MNAzyme과 상이한 표적을 검출하도록 설계된, 조성물. - 제72항에 있어서,
제1 MNAzyme 및/또는 제2 MNAzyme은 표적 서열에 혼성화된 센서 아암을 포함하고, 제1 MNAzyme은 제2 MNAzyme과 상이한 표적을 검출하도록 설계된, 조성물. - 제69항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열을 형성하도록 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제1 올리고뉴클레오타이드 서열;
상기 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열을 형성하도록 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제2 올리고뉴클레오타이드 서열;
상기 제1 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열과 회합되거나 이를 절단할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제; 및/또는
상기 제2 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열과 회합되거나 이를 절단할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제를 추가로 포함하는, 조성물. - 제69항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제1 이중 가닥 서열을 형성하도록 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제1 표적 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 서열;
상기 제2 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 서열을 형성하도록 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제2 표적 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 이중 가닥 서열;
상기 제1 이중 가닥 서열에 대해 상류(5')인 제1 표적 올리고뉴클레오타이드에 혼성화된 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드 및 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 말단에 인접한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분과 회합된 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소(예를 들어, 중합효소, 엑소뉴클레아제); 및/또는
상기 제2 이중 가닥 서열에 대해 상류(5')인 제2 표적 올리고뉴클레오타이드에 혼성화된 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드 및 제2 프라이머 올리고뉴클레오타이드의 말단에서의 또는 말단에 인접한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분과 회합된 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소(예를 들어, 중합효소, 엑소뉴클레아제)를 추가로 포함하는, 조성물. - 제69항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제1 이중 가닥 서열을 형성하도록 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 폐쇄된 제1 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제1 표적 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1 이중 가닥 서열;
상기 제2 표적 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 제2 이중 가닥 서열을 형성하도록 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 상기 단일 가닥 루프 부분에 혼성화된 제2 표적 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 이중 가닥 서열을 추가로 포함하고;
엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제1 효소는 제1 이중 가닥 서열과 회합되고, 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 제2 효소는 제2 이중 가닥 서열과 회합되는, 조성물. - 제69항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서,
제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 혼성화된 제1 DNAzyme 및/또는 제1 리보자임,
제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분의 서열과 상이한 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 루프 부분에 혼성화된 제2 DNAzyme 및/또는 제2 리보자임,
각각의 상기 DNAzyme이 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있고, 이로써 루프 부분에 혼성화된 임의의 상기 DNAzyme의 절단 활성을 유도하기 위한 각각의 상기 DNAzyme에 대한 보인자,
각각의 상기 리보자임이 촉매적으로 활성이 되도록 할 수 있고, 이로써 루프 부분에 혼성화된 임의의 상기 리보자임의 절단 활성을 유도하기 위한 각각의 상기 리보자임에 대한 보인자를 추가로 포함하는, 조성물. - 제69항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 것과 상이하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자와 비교하여 가시 스펙트럼의 상이한 색상 영역에서 발광하는, 조성물. - 제69항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 것과 상이하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자와 비교하여 가시 스펙트럼의 동일한 색상 영역에서 발광하는, 조성물. - 제69항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드는 비혼성화된 뉴클레오타이드의 단일 가닥 루프 부분에 연결된 혼성화된 뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분을 포함하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 줄기 부분에서의 혼성화된 뉴클레오타이드의 수 및/또는 혼성화된 뉴클레오타이드의 서열은 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 또는 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 것과 동일하고,
제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 이중 가닥 줄기 부분은 하나의 가닥에 연결된 형광단 분자 및 반대의 가닥에 연결된 켄쳐 분자를 포함하고, 여기서 제3 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자는 제1 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드 및 제2 폐쇄 줄기-루프 올리고뉴클레오타이드의 형광단 분자와 비교하여 가시 스펙트럼의 상이한 색상 영역에서 발광하는, 조성물.
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