CN101241097B - 一种采用茎环结构检测探针的电化学dna检测方法及其试剂盒 - Google Patents
一种采用茎环结构检测探针的电化学dna检测方法及其试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101241097B CN101241097B CN2007100460908A CN200710046090A CN101241097B CN 101241097 B CN101241097 B CN 101241097B CN 2007100460908 A CN2007100460908 A CN 2007100460908A CN 200710046090 A CN200710046090 A CN 200710046090A CN 101241097 B CN101241097 B CN 101241097B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- detection probe
- detection
- electrochemical
- sulfydryl
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 90
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 74
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 18
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 36
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 23
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 21
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 21
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 19
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 9
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 2
- ZDPHROOEEOARMN-UHFFFAOYSA-N undecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC(O)=O ZDPHROOEEOARMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- KJIOQYGWTQBHNH-UHFFFAOYSA-N undecanol Chemical compound CCCCCCCCCCCO KJIOQYGWTQBHNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 claims 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims 1
- 229940057402 undecyl alcohol Drugs 0.000 claims 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 7
- 238000000840 electrochemical analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 65
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 24
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 21
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 21
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 16
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 16
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 15
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 14
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 13
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- 102100033072 DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Human genes 0.000 description 12
- 101000927313 Homo sapiens DNA replication ATP-dependent helicase DNA2 Proteins 0.000 description 12
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 8
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 7
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical group C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 4
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 4
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 3
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 3
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 3
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 3
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- -1 0.1 M PB Chemical compound 0.000 description 2
- GWOLZNVIRIHJHB-UHFFFAOYSA-N 11-mercaptoundecanoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCS GWOLZNVIRIHJHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMEBWCFMNYDCFP-UHFFFAOYSA-N 1-sulfanylundecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCC(O)S OMEBWCFMNYDCFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GIEMHYCMBGELGY-UHFFFAOYSA-N 10-undecen-1-ol Chemical compound OCCCCCCCCCC=C GIEMHYCMBGELGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ULGGZAVAARQJCS-UHFFFAOYSA-N 11-sulfanylundecan-1-ol Chemical compound OCCCCCCCCCCCS ULGGZAVAARQJCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 2,5-dioxo-1-oxoniopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O GVJXGCIPWAVXJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DYAOREPNYXXCOA-UHFFFAOYSA-N 2-sulfanylundecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(S)C(O)=O DYAOREPNYXXCOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- HLVXFWDLRHCZEI-UHFFFAOYSA-N chromotropic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(O)=C2C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=C1 HLVXFWDLRHCZEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001553 co-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000003487 electrochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical group O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 125000005581 pyrene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001725 pyrenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种采用茎环结构检测探针的电化学DNA检测方法，该方法依次包括以下步骤：1)将含茎环结构的DNA检测探针的一端结合于电化学装置的工作电极表面；2)将靶向DNA与上述的DNA检测探针进行杂交反应；3)加入能催化氧化还原反应的酶，使其连接于DNA检测探针的游离端；4)加入步骤3)所述的酶催化反应的底物，进行电化学检测分析。本发明还公开相应的试剂盒。本发明结合了酶催化的高灵敏和多通道电化学检测迅速、操作简便的特点，从而提供了一种无标记，高灵敏度，检测迅速，多样品同时检测的电化学DNA检测方法。
Description
技术领域
本发明属于基因杂交检测领域，具体涉及一种采用茎环结构检测探针的电化学DNA检测方法及其试剂盒。
背景技术
基因(DNA)检测和分析在很多方面都有巨大的潜在用途，例如：人类疾病诊断和食品中病原体检测。
分子信标(molecular beacon，MB)检测是1996年Tyagi等根据荧光共振能量转移现象，以定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)为基础而设计的分子生物学检测方法。分子信标是一段具有特殊结构的单链DNA探针，其两端分别含有一段特定长度的茎，两端的茎可以互补配对，而中间环结构与靶向DNA(脱氧核糖核苷酸)互补，当靶分子不存在或不能完全互补时，分子信标呈茎环结构。当有靶分子存在时，分子信标的环序列与靶分子特异性结合，形成更稳定的双链体。
美国专利US20050221329A1公开了Peter H.key等人的研究：他们设计了一段分子信标探针，在这种探针的一端修饰有荧光基团，另一端修饰有淬灭基团，当没有和中间环区域互补的靶向DNA存在时，分子信标探针两端的茎互补配对，自身形成环状的结构，使荧光基团和淬灭基团之间的距离足够小，荧光基团的荧光被淬灭基团淬灭；当有靶向DNA存在时，分子信标和靶向DNA杂交形成支链结构，荧光基团和淬灭基团之间的距离拉大，荧光基团发出可以被检测到的荧光。由于含有甲基化结构的靶向DNA和正常的DNA在分子信标杂交之后Tm值不同，通过改变杂交温度条件，就可以找到一个解链温度，使得正常DNA已经和分子信标分开， 而甲基化的靶向DNA仍然和分子信标保持杂交状态。
欧洲专利EP1669464公开了Inouye等人的研究：他们采用一种特殊的分子信标探针，在这种探针两端都修饰有芘基，当分子信标探针和靶杂交之后，形成支链结构，这时两端的荧光基团互相远离，发出的荧光是单体的荧光；当分子信标没有和靶向DNA杂交的时候，两端环区域互补形成环状结构，两端的芘基靠近形成激发态二聚体，这时荧光特性和单体明显不同，通过检测荧光的变化就可以检测靶向DNA的存在。作者还证明了用这种方法可以灵敏检测SNP(单碱基多态性)。
对于DNA检测，茎环结构的探针比直链探针在很多方面都有明显的优势，最明显的优势就是无需对靶向DNA进行任何标记，而且茎环探针可以用于灵敏的单碱基错配检测。因此茎环结构探针很早就被用于溶液相的DNA检测，例如：实时定量PCR(聚合酶链式反应)、单核苷酸多态性和突变的检测、病原体鉴定、原位荧光杂交。
也有科学家将茎环结构的探针固定在表面上应用于生物传感器的研发。但是表面固定化的茎环结构探针检测时的信噪比一直比在溶液中要低。
2003年PNAS报道了一个新的电化学DNA检测方法(Chunhai Fan，Kevin W.Plaxco，and Alan J.Heeger，PNAS(100)：9134-9137，August 5，2003)，他们将一端修饰二茂铁基团的茎环结构检测探针固定在电极表面，当没有和探针环序列互补的靶向DNA时，探针自身形成两端互补的环形结构，因此另一端的二茂铁基团被拉近工作电极表面并产生一个可以被感知的氧化还原电流，当有靶向DNA存在时，探针和靶向DNA杂交，形成直线状的双链结构，二茂铁基团和工作电极表面分离，从而增大了二茂铁和电极表面的距离，阻碍了电子传递，氧化还原电流明显减小，这种传感器成功的将DNA的检测限降低到30pM，在灵敏度方面有了很大的提高，但是这种传感器是“signal-off”传感器，这种传感器和“signal-on”传感器相比，更容易受假阳性信号的影响。
2005年Nucleic Acids Research报道了Benjamin Bockisch等科学家的研究成果(Nucleic Acids Research，2005，Vol.33，No.11)，他们在茎环结构探针的一端修饰特定基团，用于将探针固定在基底表面，而探针另一段修饰有亲和性的基团，用来捕获信号标记分子，杂交之前探针形成茎环结构，亲和基团被拉近到基底表面，使得亲和基团受到空间保护作用，不能捕获信号标记分子；当杂交之后探针形成支链构型的双链结构，亲和集团离开基底表面，从而可以特异性的捕获信号标记分子，可以提供可感知的比色分析信号。该方法可以检测到10pM目标DNA，并且有很好的区分单碱基错配的能力。这种方法是“signal on”体系，很好的避免了假阳性信号的影响，但是这种方法是采用酶催化之后的比色法检测，灵敏度受到一定的限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题就在于结合酶催化的高效、特异和电化学检测迅速、灵敏、操作简便的特点，提供一种以固定在电极表面的茎环结构DNA序列为检测探针，对目标DNA(靶向DNA)序列进行检测的方法，从而克服现有DNA检测技术的缺陷，实现无标记，高灵敏度，操作简便，检测迅速，多样品同时检测的电化学DNA检测。
本发明要解决的另一个技术问题在于提供一种相应的采用茎环结构检测探针的电化学DNA检测试剂盒，该试剂盒采用上述方法检测DNA。
表面固定茎环结构的检测探针在生物传感器领域得到很多的应用，但是检测限的提高却是急需解决的问题。本发明人利用生物素和亲和素之间亲和力强的优点，将修饰有生物素的茎环结构检测探针组装到固定有亲和素的电化学芯片的工作电极表面，发现这种电极具有表面检测探针密度高，本底电流小的特点，可大大提高检测信噪比。本发明人采用能催化氧化还原反应的酶，催化其底物发生氧化还原反应，例如采用辣根过氧化物酶 (HRP酶)催化TMB(邻二甲基对二氨基联苯)和双氧水之间的氧化反应，发现酶催化效率高，特异性好，有利于分析方法的提高。本发明人还发现电化学检测DNA的方法灵敏度高，成本低，操作简便，具有开发便携式检测仪器的潜力。
因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种采用茎环结构检测探针的电化学DNA检测方法，包括以下步骤：
1)将含茎环结构的DNA检测探针的一端结合于电化学装置的工作电极表面；
2)将靶向DNA与上述的DNA检测探针进行杂交反应；
3)加入能催化氧化还原反应的酶，使其连接于DNA检测探针的游离端；
4)加入步骤3)所述的酶催化反应的底物，进行电化学检测分析。
优选的，本发明步骤1)中所述的电化学装置可以是多通道的电化学芯片，较佳的是裸金(bare gold)芯片，更优选的可以为现有的16通道的裸金芯片。
通常，金电极上DNA检测探针的组装是使用巯基和金之间的金硫键，如采用修饰有巯基的DNA检测探针，与金电极结合。本发明为加强结合力，提高特异性，较佳地，所述的DNA检测探针的一端可以通过链霉亲和素与生物素的亲和作用结合于该裸金芯片的工作电极表面。
由于组装有生物素分子的DNA检测探针易购得，本发明可以相应地在该裸金芯片，特别是工作电极表面上组装链霉亲和素分子。
更佳的，本发明可以通过多步化学结合作用在所述的裸金芯片上组装链霉亲和素分子，步骤包括：a)在裸金芯片工作电极表面滴加巯基和羟基/羧基之间碳链长度相同的巯基C6-11醇和巯基C6-11酸的混合溶液，利用金和巯基之间的特异性结合，可以将巯基C6-11酸组装在工作电极表面，巯基C6-11醇共组装可以调控巯基C6-11酸的组装密度，更有利于后续组装步骤；
b)然后滴加EDC[1-Ethyl-3-(3-dimethyllaminopropyl)carbodiimidehydrochloride，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，EDC.HCl]和NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)的混合溶液，然后加入修饰有氨基的生物素，利用氨基和羧基在EDC和NHS活化的条件下的特异性结合，可以将修饰有氨基的生物素固定在电极表面，超纯水冲洗，氮气吹干；
c)最后加入链霉亲和素，利用生物素和亲和素的特异性结合，可以将亲和素固定在电极表面上，而且一个亲和素分子一共有4个可以结合生物素的活性位点，剩余的活性位点可以用来结合检测探针上的修饰的生物素。
当然，如果检测探针上修饰的生物素带有氨基，也可以将其与步骤a)中巯基修饰的电极直接结合，但是这种结合力不如亲和素和生物素的结合力；而且步骤a)的电极稳定性不如步骤c)中组装有亲和素的电极。
优选的，步骤a)中所述的巯基C6-11醇和巯基C6-11酸的终摩尔浓度可以是4∶1～2∶1。
更优选的，所述的巯基C6-11醇和巯基C6-11酸可分别是巯基十一醇(巯基C11醇)和巯基十一酸(巯基C11酸)，两者的终摩尔浓度是3∶1。
优选的，步骤b)中所述的EDC和NHS的终摩尔浓度比例可以是6∶1～2∶1，更优选的是4∶1。
如上所述的表面连接好链霉亲和素的芯片且称为链霉亲和素芯片。如果不马上使用，可选择地，本发明所述的链霉亲和素芯片，可在氮气(或者其他惰性气体)环境中保护，在低于4℃的干燥环境中可保存不超过一个月。
优选的，步骤3)中所述的DNA检测探针的游离端和能催化氧化还原反应的酶可以分别修饰能特异性结合的基团，通过该基团之间的特异性结合来连接。例如，DNA检测探针的游离端可修饰有地高辛(Digoxigenin)或荧光素分子，而酶可以连接抗地高辛或抗荧光素分子，通过地高辛分子与抗地高辛分子或者荧光素与抗荧光素分子的结合连接酶和DNA检测探 针的游离端。
根据本发明，步骤3)中所述的能催化氧化还原反应的酶可以包括辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶等氧化还原酶，但不限于此。本发明优选的是辣根过氧化物酶，而步骤4)中所述的催化反应的底物可以是TMB和双氧水，但不限于此；还可以是其他的底物，如ABTS[(2，2-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))]或变色酸2R(CT2R)等。高价态的TMB在电极表面得到电子被还原，从而产生可感知的电流信号。进而可以对待测样品中的目标DNA序列进行检测分析。
优选的，本发明可以使用含有0.1M～0.2M NaCl的低盐浓度的缓冲溶液配制抗地高辛分子标记的辣根过氧化物酶复合物溶液，并且加入0.5％～5％(w/v，g/ml)低浓度的小分子蛋白，如酪蛋白、胎牛血清或羊血清等封闭剂，以封闭抗地高辛标记的辣根过氧化物酶复合物在一些空白位点上的非特异性吸附。优选的，低盐浓度的缓冲溶液可以是低盐PBS缓冲溶液(100mM PBS)：100mM NaCl，0.1M PB，pH 7.0。
优选的，步骤1)中所述的检测探针可以用0.5M～1.5M NaCl的高盐浓度的缓冲液配制，如0.1 M PB，pH 7.0～7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；并在步骤2)中与靶向DNA杂交结合，杂交完成后在4℃～10℃下静置，使未和靶向DNA杂交的DNA检测探针形成茎环结构。高盐浓度和低温环境更加有利于使没有和靶向DNA杂交结合的检测探针形成茎环结构。检测探针的游离端修饰着能特异性结合酶的亲和基团，形成茎环结构后，亲和基团被拉近到基底表面，由于受到空间保护作用，不能与酶结合，从而可以降低检测本底值。
更优选的，所述的高盐浓度的缓冲液可以是1mol/LNaCl的上述磷酸盐缓冲液(PBS)。
优选的，在每一步反应结束后可以用洗液洗去反应体系中的游离物，所用的洗液在步骤2)中待测DNA溶液(靶向DNA)与检测探针杂交反 应后至步骤3)加酶之前为0.1M～0.2M NaCl的低盐浓度的洗液，在其余的反应中为超纯水，洗完后都用氮气吹干。因为用水冲洗可能会破坏DNA的杂交配对结合，更可能会破坏检测探针的茎环结构。所以杂交之前都用水清洗，而杂交后的步骤采用低盐浓度的洗液清洗以防止破坏杂交。但加酶之后可以用水清洗，因为这时候地高辛和抗地高辛的结合作用已经完成，溶液中游离的酶会被水冲洗掉，所以检测探针和靶DNA的杂交以及茎环结构是否被破坏都不会影响检测结果。
更优选的，所述的低盐浓度的洗液可以为100mM NaCl，0.1％(v/v)tween(吐温)，0.01M PB，pH7.0～7.4的PBS。
本发明还提供了一种采用茎环结构检测探针的电化学DNA检测试剂盒，该试剂盒包括：
1)工作电极上组装有链霉亲和素分子的电化学芯片，
2)两端分别标记有生物素和地高辛的茎环结构的DNA检测探针，
3)高盐浓度的磷酸盐缓冲液以及低盐浓度的洗液，
4)标记抗地高辛的辣根过氧化物酶，
5)辣根过氧化物酶催化反应的底物。
优选的，所述的电化学芯片可以是裸金芯片，该裸金芯片表面组装上链霉亲和素分子的方法可如上所述。优选的，该试剂盒中的辣根过氧化物酶催化反应的底物可以是TMB和双氧水；高盐浓度的磷酸盐缓冲液可以是0.5M～1.5M NaCl、优选1mol/L NaCl的0.1 M PB，pH 7.0～7.4的磷酸盐缓冲液；低盐浓度的洗液可以是加有0.1M～0.2M NaCl、优选为100mMNaCl，0.1％(v/v)tween，0.01M PB，pH7.0～7.4的磷酸盐缓冲液。
综上所述，本发明检测方法，或采用试剂盒工作的较佳实施例的技术原理如下：
首先通过金巯键、羧氨键以及生物素和亲和素的高特异性的结合作用，在裸金芯片上固定一层活性的亲和素。
然后，再在亲和素上固定生物素标记的检测探针，并在高盐、低温的条件下使检测探针形成茎环结构，从而使检测探针另一端标记的地高辛被拉近到裸金芯片表面，处于空间构型的保护作用之下，失去反应的活性。加入检测样品(靶向DNA)之后，杂交条件下，只有靶向DNA才能和检测探针互补配对结合，形成直线型的双链，标记在检测探针游离端的地高辛失去了空间保护作用，具有了和抗地高辛修饰的辣根过氧化物酶结合能力。这时加入抗地高辛修饰的辣根过氧化物酶，检测探针就可以特异性的捕获抗地高辛修饰的辣根过氧化物酶，而游离的酶则被洗去。
最后，滴加TMB和双氧水底物，辣根过氧化物酶可以催化TMB和双氧水的电化学反应，产生电流信号，可使用现有的电化学检测或分析仪进行电化学检测或分析。
为进一步理解上述原理，可参见图1。
本发明采用茎环结构检测探针和多通道的电化学检测方法，实现对靶向DNA的定量检测。相对于现有技术，本发明具有如下的优点：1、灵敏度高。本发明对DNA的检测限是10fM，比现有技术中的检测限是10pM，大大提高了检测的灵敏度，有望达到靶基因无需扩增即可得到检测的目的；2、多通道的电化学检测方法，操作简便、迅速，通量高，成本低；3、特异性高，可用于单碱基错配的检测；4、是“signal on”体系，不易受假阳性信号影响。
附图说明
图1是本发明方法的技术原理图。
图2是待测DNA与对应的电化学电流信号大小图。图中的待测DNA依次分别为人工合成的浓度为10pM、1pM、0.1pM、10fM的靶向DNA2，1nM错配DNA3和1nM非互补任意DNA4。
图3是人工合成的1nM靶向DNA2和1nM非互补任意DNA4对应的 TMB氧化还原反应的循环伏安图。
图4是用含有0.1M KCl的0.5mM K3Fe(CN)6溶液标定裸金芯片及修饰好链霉亲和素的裸金芯片的结果对比图。
图5是本发明使用的16通道裸金芯片的结构示意图。
具体实施方式
下面用实施例进一步说明本发明的工作流程和功效，但本发明并不受其限制。
实施例1
试剂盒包括：
试验用16通道电化学裸金芯片，购自Genefluidics公司，型号：SC1000-16-B，共16组3电极系统，每一组都可以同时进行组装和检测，其中中间的圆形电极是工作电极1，最外面环形电极是对电极2，最小的方形电极是参比电极3，参照图5；
检测探针DNA1：
5′-Digoxigenin-ggccgt TACTCCCTTCCTCCCCGC acggcc-biotin-3′；
低盐PBS缓冲溶液(100mM PBS)：100mM NaCl，0.1M PB，pH 7.0；
高盐PBS缓冲溶液(1M PBS)：1M NaCl，0.1M PB，pH 7.0；
0.1M MES(2-(N-morpholine)-ethane sulphonic acid，2-(N-吗啉)乙磺酸)缓冲溶液：0.1M MES，pH 5.0；
低盐浓度的洗液：100mM NaCl，0.1％(v/v)tween，0.01M PB，pH7.0～7.4；
链霉亲和素(streptavidin)，购自Promega公司，参考产品说明书使用前用100mM PBS配置成0.5mg/L溶液；
EZ-biotin(Biotin-PEO-Amine)，即带氨基的生物素，购自PIECE公司，使用前用0.1M MES缓冲液配成5mg/mL溶液；
抗地高辛修饰的辣根过氧化物酶(anti-digoxigenin-POD)，购自Roche公司，参考产品说明书使用前用100mM PBS稀释成500mU/mLanti-digoxigenin-POD，并添加0.5％(w/v)酪蛋白(casein)封闭非特异性位点；
TMB底物(TMB substrate Low activity)，购自NEOGEN公司，其中含有TMB和双氧水。
待检测的目的DNA为靶向DNA2：
GTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATA。
本发明的检测步骤如下，其流程如图1所示。
第一步：制备链霉亲和素芯片。
试验前以无水乙醇为溶剂配制2mM的11-巯基十一酸和6mM的11-巯基十一醇溶液。组装前分别取11-巯基十一酸和11-巯基十一醇两种溶液各160μl混合均匀，配成组装液。在16通道电化学裸金芯片的每个工作电极上滴加20μl组装液，4℃过夜组装。试验前配制400mM的EDC和100mM的NHS，各取40μl混匀后取4μl滴加在每个工作电极上，室温放置10分钟后用超纯水冲洗然后用氮气吹干。接着在每个工作电极滴加4μlEZ-biotin溶液，室温放置15分钟后用超纯水冲洗之后用氮气吹干。然后在每组电极上滴加25μl乙醇胺(1M ethanolamine)，保证溶液覆盖包括圆形对电极以内的整组电极，室温放置10分钟，以封闭剩余的羧基位点，超纯水冲洗之后用氮气吹干。最后在每个工作电极上滴加4μl链霉亲和素(0.5mg/L链霉亲和素)，室温放置30分钟后超纯水冲洗，然后用氮气吹干。这样制好的链霉亲和素芯片可以在氮气干燥的条件下暂时保存。
经过含有0.1M KCl的0.5mM K3Fe(CN)6溶液标定，发现结合了链霉亲和素的电极表面的本底值变小，和裸金电极表面的电化学特性明显不同，结果见图4。
第二步，用链霉亲和素芯片进行靶向DNA检测。
在链霉亲和素芯片的每个工作电极上滴加4μl 1M PBS配制的1μM检测探针DNA1，4℃过夜反应，利用生物素和链霉亲和素的特异性结合，将检测探针固定在芯片的工作电极上。超纯水冲洗然后氮气吹干。在工作电极上滴加10pM到10fM靶向DNA2，37℃杂交反应30分钟。然后冷却到4℃反应10分钟，使没有和靶向DNA2杂交的检测探针DNA1在高盐浓度及低温的条件下恢复茎环结构，以减少本底。然后用低盐浓度的洗液冲洗后氮气吹干。接着在每组电极上滴加25μl PEG(polyethylene glycol，聚乙二醇)溶液(0.05w/v％PEG溶液，使用1M PBS配制)，反应10分钟，封闭杂交层表面非特异性位点，确保溶液覆盖圆形对电极以内的整组三电极区域。在每个工作电极表面滴加4μl 0.5U/mL anti-digoxigenin-POD，当检测探针DNA1和靶向DNA2杂交形成直链时，抗地高辛辣根过氧化物酶就可以和检测探针DNA1另一端修饰的地高辛结合，从而被捕获。最后用超纯水冲洗、用氮气吹干之后，在每组电极上滴加25μl的TMB底物(含双氧水)，使用PM3000电化学分析仪检测。
所检测的靶向DNA2的浓度分别为：10pM，1pM，0.1pM，10fM。结果见图2。从图2可以看出，靶向DNA2的浓度和得到的电化学信号有比较好的对应关系，所以可以用这种方法对靶向DNA进行定量。
实施例2
试剂盒同实施例1。
将待检测的目的DNA换成含有一个错配碱基的DNA3：
GTACTTTCA GCGGGGAGGAAGGCAGAAGAGTTAATA。
将实施例1第二步中不同浓度的靶向DNA2换成1nM错配DNA3重复实验。结果见图2。从图2可以看出，错配DNA即使浓度很高也几乎检测不到电流信号。
实施例3
试剂盒同实施例1。
待检测的目的DNA为任意非互补DNA4：
GCAAATCCTACAAAACGAACATCAT。
将实施例1第二步中不同浓度的靶向DNA2换成1nM任意非互补DNA4重复实验。结果见图2。从图2可以看出，任意非互补DNA即使浓度很高也几乎检测不到电流信号。
实施例4
将实施例1第二步中不同浓度的靶向DNA2换成1nM靶向DNA2和1nM任意非互补DNA4，最后使用循环伏安法检测。结果因为含有目的DNA的检测过程中特异性的捕获了HRP酶，所以催化了TMB与双氧水的反应，导致氧化峰减小，还原峰增大。而同样的试验过程，只将目的DNA换成任意非互补DNA却没有发现还原电流变大的现象。结果见图3。
本发明上述实施例中所用的各种DNA序列都是人工合成的，均购自上海生工生物工程有限公司。其它未特殊说明的条件按照常规条件或按照药品或以其制造厂商所建议的条件。
Claims (7)
1.一种采用茎环结构检测探针的电化学DNA检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
1)将含茎环结构的DNA检测探针的一端结合于电化学装置的工作电极表面；
2)将靶向DNA与上述的DNA检测探针进行杂交反应；
3)加入能催化氧化还原反应的酶，使其连接于DNA检测探针的游离端；
4)加入步骤3)所述的酶催化反应的底物，进行电化学检测分析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中所述的电化学装置为裸金芯片。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的DNA检测探针的一端通过链霉亲和素与生物素的亲和作用结合于该裸金芯片的工作电极上。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的DNA检测探针上组装有生物素分子，相应地在裸金芯片的工作电极上组装链霉亲和素分子，该组装步骤包括：
a)在裸金芯片工作电极表面滴加碳链长度相同的巯基C6～11醇和巯基C6～11酸的混合溶液；
b)然后滴加EDC和NHS的混合溶液、以及修饰有氨基的生物素，将生物素固定在电极表面；
c)最后加入链霉亲和素。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤a)中所述的巯基C6～11醇和巯基C6～11酸的终摩尔浓度比是4∶1～2∶1。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述的巯基C6～11醇和巯基C6～11酸分别是巯基十一醇和巯基十一酸，两者的终摩尔浓度比是3∶1。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤b)中所述的EDC和NHS的终摩尔浓度比例是6∶1～2∶1。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2007100460908A CN101241097B (zh) | 2007-09-18 | 2007-09-18 | 一种采用茎环结构检测探针的电化学dna检测方法及其试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2007100460908A CN101241097B (zh) | 2007-09-18 | 2007-09-18 | 一种采用茎环结构检测探针的电化学dna检测方法及其试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101241097A CN101241097A (zh) | 2008-08-13 |
| CN101241097B true CN101241097B (zh) | 2011-08-03 |
Family
ID=39932791
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2007100460908A Active CN101241097B (zh) | 2007-09-18 | 2007-09-18 | 一种采用茎环结构检测探针的电化学dna检测方法及其试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101241097B (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101921829B (zh) * | 2010-03-09 | 2012-04-25 | 中国科学院上海应用物理研究所 | 一种dna三维纳米结构探针的电化学检测方法 |
| WO2013021841A1 (ja) * | 2011-08-05 | 2013-02-14 | 株式会社 東芝 | 核酸解析法 |
| CN103675281B (zh) * | 2013-11-26 | 2016-02-10 | 中国检验检疫科学研究院 | 利用表面等离子共振传感器检测黄瓜花叶病毒的方法 |
| CN107870188B (zh) * | 2016-09-23 | 2020-07-14 | 南京大学 | 检测试剂盒及其制备方法、包含检测试剂盒的分析系统、及它们的用途 |
| CA3074349A1 (en) * | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Sensor apparatus and method for testing a sample |
| CA3108430A1 (en) * | 2018-08-09 | 2020-02-13 | Speedx Pty Ltd | Multiplex detection of nucleic acids |
| CN110923338A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-03-27 | 北京贝尔生物工程股份有限公司 | 一种能检测多种细菌基因组dna的微阵列芯片及其制备方法 |
| CN116297758B (zh) * | 2023-02-03 | 2024-03-19 | 中国科学院地理科学与资源研究所 | 高灵敏识别的电化学dna传感器及其应用 |
| CN116593546B (zh) * | 2023-04-27 | 2024-07-30 | 无锡学院 | 一种检测膝沟藻毒素的邻位连接电化学发光分析方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000032813A1 (en) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Method and system for detecting oligonucleotides in a sample |
| US6391558B1 (en) * | 1997-03-18 | 2002-05-21 | Andcare, Inc. | Electrochemical detection of nucleic acid sequences |
| WO2003019147A2 (en) * | 2001-08-30 | 2003-03-06 | Combimatrix Corporation | Enzyme-amplified redox microarray detection process |
| CN1553188A (zh) * | 2003-06-06 | 2004-12-08 | 克 宋 | 微阵列信号放大方法 |
| CN1605861A (zh) * | 2004-11-15 | 2005-04-13 | 东南大学 | 电化学定量聚合酶链式反应检测芯片的制备和检测方法 |
| WO2005106034A1 (en) * | 2004-04-29 | 2005-11-10 | Agency For Science, Technology And Research | Method and device for detection of nucleic acids and/or polypeptides |
-
2007
- 2007-09-18 CN CN2007100460908A patent/CN101241097B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6391558B1 (en) * | 1997-03-18 | 2002-05-21 | Andcare, Inc. | Electrochemical detection of nucleic acid sequences |
| WO2000032813A1 (en) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Method and system for detecting oligonucleotides in a sample |
| WO2003019147A2 (en) * | 2001-08-30 | 2003-03-06 | Combimatrix Corporation | Enzyme-amplified redox microarray detection process |
| CN1553188A (zh) * | 2003-06-06 | 2004-12-08 | 克 宋 | 微阵列信号放大方法 |
| WO2005106034A1 (en) * | 2004-04-29 | 2005-11-10 | Agency For Science, Technology And Research | Method and device for detection of nucleic acids and/or polypeptides |
| CN1605861A (zh) * | 2004-11-15 | 2005-04-13 | 东南大学 | 电化学定量聚合酶链式反应检测芯片的制备和检测方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Chunhai Fan等.Biosensors based on binding-modulated.《TRENDS in Biotechnology》.2005,第23卷(第4期),186-192. * |
| Eleftheria Laios等.Enzyme-Amplified Aequorin-Based Bioluminometric.《Analytical chemistry》.2001,第73卷(第3期),689-692. * |
| Jin Pan.Voltammetric detection of DNA hybridization using a.《Biochemical Engineering Journal》.2007,第35卷(第2期),183-190. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101241097A (zh) | 2008-08-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101241097B (zh) | 一种采用茎环结构检测探针的电化学dna检测方法及其试剂盒 | |
| Guo et al. | Solid-state label-free integrated aptasensor based on graphene-mesoporous silica–gold nanoparticle hybrids and silver microspheres | |
| Zeng et al. | Ultrasensitive and label-free electrochemical aptasensor of kanamycin coupling with hybridization chain reaction and strand-displacement amplification | |
| Pavlov et al. | Amplified chemiluminescence surface detection of DNA and telomerase activity using catalytic nucleic acid labels | |
| Tosar et al. | Electrochemical DNA hybridization sensors applied to real and complex biological samples | |
| Qian et al. | A novel signal-on electrochemical DNA sensor based on target catalyzed hairpin assembly strategy | |
| CN105755101B (zh) | 一种基于单个量子点水平检测dna糖基化酶活性的方法 | |
| Jin et al. | Hyperbranched rolling circle amplification based electrochemiluminescence aptasensor for ultrasensitive detection of thrombin | |
| CN101921829B (zh) | 一种dna三维纳米结构探针的电化学检测方法 | |
| Wang et al. | Design of a sandwich-mode amperometric biosensor for detection of PML/RARα fusion gene using locked nucleic acids on gold electrode | |
| Bai et al. | Bi-enzyme functionlized hollow PtCo nanochains as labels for an electrochemical aptasensor | |
| Shen et al. | Electrochemical aptasensor for highly sensitive determination of cocaine using a supramolecular aptamer and rolling circle amplification | |
| Li et al. | Development of a sensitive electrochemical DNA sensor by 4-aminothiophenol self-assembled on electrodeposited nanogold electrode coupled with Au nanoparticles labeled reporter ssDNA | |
| CN103698375A (zh) | 一种检测miRNA的方法 | |
| Cui et al. | An electrochemical DNA sensor for sequence-specific DNA recognization in a homogeneous solution | |
| CN103175873B (zh) | 基于目标dna重复序列自身增强放大信号的dna电化学传感器 | |
| Rai et al. | Electrochemically amplified molecular beacon biosensor for ultrasensitive DNA sequence-specific detection of Legionella sp. | |
| Gao et al. | Exonuclease I-assisted general strategy to convert aptamer-based electrochemical biosensors from “signal-off” to “signal-on” | |
| Rashid et al. | Label free ultrasensitive detection of NS1 based on electrochemical aptasensor using polyethyleneimine aggregated AuNPs | |
| Wang et al. | A versatile label-free and signal-on electrochemical biosensing platform based on triplex-forming oligonucleotide probe | |
| Yi et al. | A pseudo triple-enzyme cascade amplified aptasensor for thrombin detection based on hemin/G-quadruplex as signal label | |
| Wang et al. | A novel label-free and signal-on electrochemical aptasensor based on the autonomous assembly of hemin/G-quadruplex and direct electron transfer of hemin | |
| CN102539494B (zh) | 基于蛋白质控制组装界面的安培型dna电化学传感器 | |
| CN109613093A (zh) | 基于dna纳米三棱柱构建组蛋白乙酰转移酶电化学发光生物传感器及其应用 | |
| Li et al. | A high-performance DNA biosensor based on the assembly of gold nanoparticles on the terminal of hairpin-structured probe DNA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CI01 | Publication of corrected invention patent application |
Correction item: Specifications, claims Correct: The original application documents submitted on the application date require 8-17 items, the 1-89 paragraph of the instruction, the appended drawings, 1-5, and the 1-7 claims submitted in February 11, 2011 False: The 1-5 section of the prospectus, the 1-89 paragraph of the original application document submitted in the application date, and the claim 1-7 submitted in February 11, 2011 Number: 31 Volume: 27 |
|
| CI03 | Correction of invention patent |
Correction item: Specifications, claims Correct: The original application documents submitted on the application date require 8-17 items, the 1-89 paragraph of the instruction, the appended drawings, 1-5, and the 1-7 claims submitted in February 11, 2011 False: The 1-5 section of the prospectus, the 1-89 paragraph of the original application document submitted in the application date, and the claim 1-7 submitted in February 11, 2011 Number: 31 Page: Description Volume: 27 |
|
| ERR | Gazette correction |
Free format text: CORRECT: DESCRIPTION CLAIM OF RIGHT; FROM: APPLICATION DATE PARAGRAPH 1-89 OF THE INSTRUCTION OF THE SUBMITTED ORIGINAL APPLICATION DOCUMENT, PIC 1-5, SUBMITTED ON FEBRUARY 2ND, 2011 CLAIM OF RIGHT ITEM 1-7 TO: APPLICATION DATE OF THE SUBMITTED ORIGINAL APPLICATION DOCUMENT CLAIM OF RIGHT ITEM 8-17, PARAGRAPH 1-89 OF THE DESCRIPTION, PIC 1-5, SUBMITTED ON FEBRUARY 2ND, 2011 CLAIM OF RIGHT ITEM 1-7 |