CN103675281B - 利用表面等离子共振传感器检测黄瓜花叶病毒的方法 - Google Patents
利用表面等离子共振传感器检测黄瓜花叶病毒的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103675281B CN103675281B CN201310610770.3A CN201310610770A CN103675281B CN 103675281 B CN103675281 B CN 103675281B CN 201310610770 A CN201310610770 A CN 201310610770A CN 103675281 B CN103675281 B CN 103675281B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- spr
- gold plaque
- mua
- modified
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 title claims abstract description 35
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 121
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 120
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 120
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 24
- DYAOREPNYXXCOA-UHFFFAOYSA-N 2-sulfanylundecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC(S)C(O)=O DYAOREPNYXXCOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 22
- OMEBWCFMNYDCFP-UHFFFAOYSA-N 1-sulfanylundecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCC(O)S OMEBWCFMNYDCFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 75
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 10
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 30
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 18
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 5
- -1 mercaptoundecyl alcohol Chemical compound 0.000 abstract description 4
- 150000002343 gold Chemical class 0.000 abstract 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 abstract 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 241000724284 Peanut stunt virus Species 0.000 description 15
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 14
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 14
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 241000724280 Tomato aspermy virus Species 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 230000036541 health Effects 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 238000000682 scanning probe acoustic microscopy Methods 0.000 description 4
- 239000013545 self-assembled monolayer Substances 0.000 description 4
- RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M sodium;1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].ON1C(=O)CC(S([O-])(=O)=O)C1=O RPENMORRBUTCPR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 241001533462 Bromoviridae Species 0.000 description 2
- 241000724253 Cucumovirus Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 229920002717 polyvinylpyridine Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- ZDPHROOEEOARMN-UHFFFAOYSA-N undecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC(O)=O ZDPHROOEEOARMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005418 vegetable material Substances 0.000 description 2
- CCMKPCBRNXKTKV-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-5-sulfanylidenepyrrolidin-2-one Chemical compound ON1C(=O)CCC1=S CCMKPCBRNXKTKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 1
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N hcl hcl Chemical compound Cl.Cl IXCSERBJSXMMFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
- G01N21/55—Specular reflectivity
- G01N21/552—Attenuated total reflection
- G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons
- G01N21/554—Attenuated total reflection and using surface plasmons detecting the surface plasmon resonance of nanostructured metals, e.g. localised surface plasmon resonance
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了利用表面等离子共振传感器检测黄瓜花叶病毒的方法。本发明提供了一种制备用于检测病毒的SPR金片的方法，包括如下步骤：1）用巯基十一酸和巯基十一醇共修饰SPR金片，得到修饰后金片；2）将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述病毒的SPR金片。本发明的实验证明，本发明首先建立了两种SPR金片修饰方法：分别为11-MUA单独修饰SPR金片，11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片；然后比较了两种修饰SPR金片的灵敏度，11-MUA修饰SPR金片检测灵敏度为10ng/mL,而11-MUA和11-MUO共同修饰SPR金片检测灵敏度为1ng/mL。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用表面等离子共振传感器检测黄瓜花叶病毒的方法。
背景技术
黄瓜花叶病毒(CucumberMosaicVirus,CMV)是黄瓜花叶病的病原，最初是由Doolitte和Jagger发现并报道的。它属于雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）。随着研究的深入发现此病毒的寄主范围很广，不光有67科、470种植物的天然寄主，更能够通过人工接种感染85科、365属、775种植物，这些植物大多属于观赏类植物或蔬菜、果树、禾谷类等重要经济植物。植物感染黄瓜花叶病毒后会出现多种症状，如花叶、环斑、枯萎、丛枝、坏死等症状。
由于黄瓜花叶病毒的有害性，研究出一种便捷、高效的检测黄瓜花叶病毒的方法就十分重要。传统的检测CMV的方法包括dot-blot、ELISA、RT-PCR等方法。这些方法具有一定缺陷，如操作复杂、反应时间长等问题。近年来，生物传感器方面使用表面等离子体共振仪(SPR)的研究越来越多。目前，SPR技术已广泛应用于环境监测、食品安全检测、疾病诊断等领域。SPR技术进行病毒蛋白检测的原理是：通过一定的化学反应将病毒的单克隆抗体固定在传感器芯片上，当病毒蛋白流过芯片表面时，通过免疫反应与固定的抗体结合，芯片表面质量的增加会改变芯片表面光学参数。通过光学参数的改变能够得知与抗体结合的物质的质量。
自从首例CMV分离报道以来，我国已从38科的120多种植物上分离到CMV。这些CMV分离物根据血清学性质、寄主反应等可以区分为性质不同的两个亚组。本文所研究的为亚组Ⅰ的黄瓜花叶病毒。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备用于检测病毒的SPR金片的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1）用巯基十一酸和巯基十一醇共修饰SPR金片，得到修饰后金片；
2）将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述病毒的SPR金片。
上述方法中，步骤1）中，所述巯基十一酸和巯基十一醇共修饰SPR金片按照如下方法制备：将所述SPR金片浸泡在含有巯基十一酸和巯基十一醇的乙醇溶液中。
上述方法中，所述含有巯基十一酸和巯基十一醇的乙醇溶液中，所述巯基十一酸和所述巯基十一醇的浓度比为1:1-200。
上述方法中，所述巯基十一酸和所述巯基十一醇的浓度比为1:1、1:10、1:50、1:100或1:200。
上述方法中，所述巯基十一酸和所述巯基十一醇的浓度比为1:10；所述巯基十一酸的浓度具体为0.9mM；所述巯基十一醇的浓度具体为9mM。
上述方法中，步骤2）中，所述将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片为将所述抗病毒抗体与所述修饰后金片上的巯基十一酸通过酰胺键连接。
上述将所述抗病毒抗体与所述修饰后金片上的巯基十一酸通过酰胺键连接的方法包括如下步骤：先用EDC和Sulfo-NHS活化所述修饰后金片表面巯基十一酸的羧基，再滴加所述抗病毒抗体，再依次经过静置和BSA封闭，即得到用于检测所述病毒的SPR金片。
上述方法中，所述抗病毒抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，所述抗病毒抗体具体为单克隆抗体。
上述方法中，所述病毒为黄瓜花叶病毒。
由上述的方法制备的用于检测病毒的SPR金片也是本发明保护的范围；上述应用中，所述病毒具体为黄瓜花叶病毒。
上述的用于检测病毒的SPR金片在检测病毒中的应用也是本发明保护的范围；上述应用中，所述病毒具体为黄瓜花叶病毒。
本发明的实验证明，本发明首先建立了两种SPR金片修饰方法：分别为11-MUA单独修饰SPR金片，11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片；然后比较了两种修饰SPR金片的灵敏度，11-MUA修饰SPR金片检测灵敏度为10ng/mL,而11-MUA和11-MUO共同修饰SPR金片检测灵敏度为1ng/mL。且对于检测同浓度的CMV，11-MUA和11-MUO共修饰的SPR金片比11-MUA修饰的SPR金片有更高的响应；另外，其中11-MUA价格为7670.52RMB/g，而11-MUO则只需花169.4RMB/g，显然11-MUA和11-MUO共修饰的SPR金片成本更低。由以上两点确立了使用11-MUO和11-MUA修饰SPR金片的方法为最佳的方法。因此固定CMV单抗、11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片能更好的检测CMV，尤其采用11-MUA和11-MUO浓度比为1:10。
附图说明
图1为11-MUA修饰的SPR金片检测CMV灵敏度
图2为SPR检测CMV特异性结果
图3为SPR检测植物样品
图4为11-MUA和11-MUO浓度比
图5为11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片金片检测CMV的灵敏度
图6为11-MUA和11-MUO修饰SPR检测CMV的特异性
图7为11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片检测植物样品
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的化学试剂及材料如表1所示：
表1化学试剂及材料表
下述实施例中所用的溶液的配置：
（1）巯基十一酸（11-MUA）乙醇溶液（10mM）：用分析天平称取0.2183g11-MUA溶于100mL无水乙醇中，混匀。
（2）含有巯基十一酸（11-MUA）和巯基十一醇（11-MUO）的乙醇溶液（10mM）：在混合溶液中11-MUA和11-MUO的浓度比为1:1、1:10、1:50、1:100、1:200。按照表2中数据称量相应质量11-MUA和11-MUO，溶于100mL无水乙醇中，混匀，使得的混合溶液终浓度为10mM。
表211-MUA和11-MUO浓度及质量
（3）MES（脂肪酸甲酯磺酸盐）溶液：用分析天平称取3.90gMES溶于180mLddH2O，调节pH至5.0，定容到200mL。
（4）EDC（N-羟基硫代琥珀酰亚胺）溶液（0.4M）：用500μLMES溶液溶解0.0388gEDC，振荡均匀。
（5）Sulfo-NHS（N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)碳二亚胺）溶液（0.1M）：用500μLMES溶液溶解0.0109gSulfo-NHS，振荡均匀。
上述两种溶液（4）和（5）均为现用现配。
（6）磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）：用分析天平分别称取4gNaCl、0.72gNa2HPO4、0.12gKH2PO4和0.1gKCl溶于480mL灭菌后的蒸馏水中，使用酸度仪和HCl调节缓冲液的pH至7.4；然后再向瓶中加入灭菌蒸馏水，定容到500mL。
（7）包被缓冲液（pH9.6）：用分析天平分别称取Na2CO31.59g、NaHCO32.93g、叠氮化钠（NaN3）,溶解于ddH2O，定容至1L。
（8）PBST洗液（PBST、pH7.4）：用分析天平分别称取8.0gNaCl、0.2gKH2PO4、1.15gNa2HPO4、0.2gKCl、0.2gNaN3（叠氮化钠）、0.5mLTween-20，用ddH2O溶解，定容至1L。
（9）底物缓冲液：二乙醇胺（C4H11NO2）97mL、ddH2O600mL用盐酸（HCl）调节pH值至9.8，然后用蒸馏水定容至1L。
（10）酶标抗体稀释缓冲液：聚乙烯基吡啶烷酮（PVP）20g、2gBSA，用洗液（PBST）定容至1L。
（11）样品抽提缓冲液：1.3gNa2SO3、聚乙烯基吡啶烷酮（PVP）20g，用洗液（PBST）定容至1L。
下述实施例中所用的黄瓜花叶病毒（黄瓜花叶病毒M株系引致烟草症状恢复的初步研究,植物病理学报,2007年,第2期，公众可从中国检验检疫科学研究院获得）；
黄瓜花叶病毒单克隆抗体（购自北京陆桥质检科技有限公司）
花生矮化病毒（PSV；花生矮化病毒(PSV)的研究，植物病理学报，1987年，第2期，公众可从中国检验检疫科学研究院获得）
番茄不孕病毒(TomatoAspermyVirus，TAV，RT-PCR检测番茄不孕病毒，植物检疫，2002年第2期，公众可从中国检验检疫科学研究院获得）
感染黄瓜花叶病毒的烟草叶片及健康烟草叶片由中国检科院植物检验检疫研究所提供。
上述黄瓜花叶病毒单克隆抗体和黄瓜花叶病毒抗原进行如下活性检测：
采用TAS-ELISA（美国Agdia公司，货号：PSA44501/0288；）验证实验黄瓜花叶病毒抗原和抗体活性，具体如下：
包被抗体过程：用包被缓冲液将包被抗体（黄瓜花叶病毒单克隆抗体）稀释200倍，稀释后向每孔加入100μL，每种加3孔，做三次重复。保湿，37℃孵育2小时。之后用PBST洗涤3次，拍干。
加样过程：用高通量组织研磨仪将待检样品研磨，研磨后低速离心，将上清液按十分之一的比例稀释，即0.1g样品加1mL的抽提缓冲液。在96孔板加待检样品、阳性对照、阴性对照，100μL/孔。将酶联板放4℃孵育过夜。先在自来水下冲洗酶标板3次，然后用PBST洗涤3次，拍干。
加酶标抗体过程：按说明用酶标抗体稀释缓冲液稀释酶标抗体A，加样，100μL/孔。37℃孵育4小时。先在自来水下冲洗酶标板3次，然后用PBST洗涤3次，拍干。
加底物过程：将底物加至底物缓冲液中，使浓度为1mg/mL。因为底物暴露于光下会变色，故要注意避光。100μL/孔。室温黑暗条件下孵育1小时。
结果判定：将酶标板放在酶标仪上，在405nm波长下读数，输出数据到Excel中。
包被抗体稀释度1：2000.6mL（4℃储存）
酶标抗体A稀释度1：2000.6mL（4℃储存）
阳性对照每管加1mL样品抽提缓冲液（-20℃分装储存）
通过双抗体夹心法ELISA实验验证了抗原抗体的活性及特异性。在上述TAS-ELISA的第二步中分别加入10ng/mL的CMV抗原、健康烟草叶片抽提液（阴性抽提液）、PSV病毒（阴性对照）及空白对照，每组重复三次。其结果如下表3，表中所列数据为96孔板的其中12个OD值，分别为CMV抗原（10ng/mL）、空白对照、健康烟草叶片抽提液、PSV病毒，1、2、3为每组重复三次，并计算每组平均值。
从表3中数据可以看出能够检出10ng/mL的CMV抗原，说明CMV抗原和CMV抗体是有活性的。同时从CMV抗体检测健康烟草叶片抽提液（阴性抽提液）、PSV病毒（阴性蛋白）及空白对照的结果表明CMV抗体的特异性较好。
表3TAS-ELISA实验数据
实施例1、检测黄瓜花叶病毒的SPR金片的制备
1、SPR金片预处理
按体积比30%氨水、30%双氧水及MilliQ水=1:1:5放入小烧杯中混合均匀，放入恒温在85℃的水浴锅中处理10min后立即取出，顺序用MilliQ水和无水乙醇清洗SPR金片（北京正通远恒科技有限公司，产品货号：SPR102-Au）表面残留液体，氮气吹干，然后用于后续实验。
2、修饰SPR金片
用如下两种方法分别修饰SPR金片，其中11-MUA修饰SPR金片作为对照：
1）11-MUA修饰SPR金片（对照）
将上述1）得到的清洗后的SPR金片置于装有10mM11-MUA乙醇溶液的玻璃瓶中，为了防止溶液挥发用封口膜封闭瓶口，4℃浸泡过夜（12h），得到11-MUA修饰SPR金片（对照）。
2）11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片
将上述1）得到的清洗后的SPR金片分别置于装有10mM的不同浓度比的11-MUA和11-MUO混合乙醇溶液的玻璃瓶中，为了防止溶液挥发用封口膜封闭瓶口，4℃浸泡过夜（12h），得到不同浓度比11-MUA和11-MUO共修饰的SPR金片。
3、固定单抗制备检测黄瓜花叶病毒的SPR传感器金片
将抗病毒抗体固定到修饰后金片为将黄瓜花叶病毒CMV单克隆抗体与修饰后金片上的11-MUA通过酰胺键连接，具体方法如下：
用无水乙醇淋洗上述2得到的不同修饰的SPR金片表面，然后用氮气干燥，将现配制的含有0.4M的EDC和0.1M的Sulfo-NHS的溶液滴于SPR金片表面（溶剂为MES溶液），滴加均匀，常温（25℃）下静置2小时，用以活化固定在SPR金片表面的11-MUA的羧基。倒掉EDC和Sulfo-NHS的混合液，用无水乙醇清洗金片表面，并用氮气吹干表面；然后在金片上滴加CMV单克隆抗体溶液（0.1mg/mL,采用1XPBS稀释抗体，浓度为0.01M，pH7.4），置于37℃恒温箱静置处理3小时，用MilliQ水清洗并干燥；SPR金片上留有未与抗体结合的NHS酯基，用1mg/mLBSA进行封闭，在室温（25℃）下静置1小时，用MilliQ水洗净SPR金片表面，用氮气吹干（存放在PBS，4℃）。
得到两种固定CMV单抗的SPR金片：
固定CMV单抗的11-MUA修饰SPR金片（对照）；
固定CMV单抗不同浓度比11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片。
实施例2、利用表面等离子共振传感器检测黄瓜花叶病毒
一、对照检测CMV
1、灵敏度、重复性和特异性检测
采用对照固定CMV单抗的11-MUA修饰SPR金片检测CMV灵敏度、重复性和特异性：
1）、检测CMV灵敏度和重复性
用PBS稀释黄瓜花叶病毒蛋白到5个浓度，即10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、100ng/mL和10ng/mL，取100μL的每个浓度的病毒蛋白进行SPR检测，SPR检测具体如下：
将固定CMV单抗的11-MUA修饰SPR金片放入SPR传感器中，设置温度（低于室温1-2℃）及流速（30uL/min）。使用PBS（使用前超声脱气）或PBST作为缓冲液，走基线，待基线稳定。所有的样品均从进样口进样，将待检测的样品稀释到目标浓度后进样（稀释时应使用与走基线相同的PBS或PBST）。在进样前可以先进PBS或PBST消除背景信号。实验结果可以通过SPR软件实时观察得到。
结果见图1，从图中可以看出，样品浓度越大，与单抗结合的越多，折射率变化也越大。当CMV浓度为10ng/mL以上时，SPR的折射率相对于PBS基线有较明显的变化。因此，此方法的检测限为10ng/mL。
同样，验证了固定CMV单抗的11-MUA修饰SPR金片检测CMV的重复性。在同样的条件下分别对15片SPR金片进行清洗、修饰活化、固定单克隆抗体等过程，将固定好单抗的SPR金片用于检测上述5种浓度的CMV抗原，每个浓度测量三次，得到结果如表4，计算了各个浓度三次测量值的平均值、SD及CV%，得到的CV%均小于相应平均值的10%，说明固定CMV单抗的11-MUA修饰SPR金片检测CMV的重复性较好。
表411-MUA修饰SPR检测CMV重复性
2）、检测CMV的特异性
为了考察固定CMV单抗的11-MUA修饰SPR金片检测CMV的特异性，将与CMV同属的番茄不孕病毒(TomatoAspermyVirus，TAV)和花生矮化病毒(PeanutStuntvirus，PSV)均稀释到1μg/mL取100μL进行SPR检测，看其是否对这两种同属的病毒有反应，以确认本研究所修饰芯片的特异性。同时，将CMV、PSV、TAV三种病毒的混合液（mix=TAV+PSV+CMV）进行SPR检测，检测方法同上。
结果如图2，检测同样浓度的样品溶液，只有CMV和混合液中的CMV能够与金片上的抗体结合，折射率有明显的变化。其余两种病毒蛋白均没有明显的响应。说明此方法检测CMV特异性好。
2、检测植物材料
在研钵内用液氮将染病的烟草叶片和健康的烟草叶片研磨，用一定量的PBS溶解，离心(5000r/min)5分钟,取100μL上清液用固定CMV单抗的11-MUA修饰SPR金片在SPR传感器进行检测，方法同上，来考察11-MUA修饰的SPR金片能否应用于实际植物样品的检测中。
结果如图3，其中感染CMV病毒的烟草叶片（阳性样品）有较明显的响应，而健康烟草叶片（阴性样品）未产生明显响应，说明此方法能够应用于检测携带CMV病毒的植物。
由以上实验结果可知，11-MUA修饰的SPR金片具有良好的特异性，并能应用于实际样品的检测中，其检测CMV灵敏度能够达到10ng/mL。由于11-MUA具有较长的碳链（十一碳），其修饰SPR金片形成的密集、散乱的分子自组装层，会形成空间位阻，会影响活化的11-MUA与抗体结合。同时有一部分活化的11-MUA被阻塞不能与抗体结合。抗体的结合量少，检测到抗原量会更少。所以研究11-MUA和11-MUO共同修饰SPR金片的方法。11-MUA是末端具有羧基的十一烷酸，能够与抗体结合。而11-MUO是末端为羟基的十一烷醇，不能与抗体结合。11-MUO的存在能够使形成的SAMs整齐，并减少空间位阻，使得抗体能够能高效地结合在SAMs中。SAMs结合的抗体量越多，检测的抗原的量也会更多。
二、固定CMV单抗不同浓度比11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片检测CMV的研究
1、11-MUA和11-MUO用量优化
首先考察11-MUA和11-MUO浓度比对抗体结合量的影响，对之后检测CMV抗原的影响。分散在11-MUA中的11-MUO量过少的话，11-MUA分散不开，仍会有较大的位阻影响抗体的结合，影响之后CMV检测。分散在11-MUA中的11-MUO量过多的话，导致11-MUA密度过低，抗体的有效结合量会减少，影响之后CMV检测。因此需确定11-MUA和11-MUO的最佳浓度比。
按照实施例1的方法，得到的5个固定CMV单抗不同浓度比11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片：固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片（1：1）、固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片（1：10）、固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片（1：50）、固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片（1：100）、固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片（1：200）。
将上述5个固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片分别对同样浓度（100ng/mL）的CMV进行SPR检测，检测方法同上。
其结果如图4所示，由图可知，当11-MUA和11-MUO浓度比为1:10时，检测同样浓度的CMV，折射率变化最大，说明此浓度比下与SAMs结合的抗体最多，因此选用11-MUA和11-MUO浓度比为1:10的固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片（1:10）。
2、11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片检测CMV的灵敏度、重复性和特异性
1）固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片（1:10）检测CMV的灵敏度、重复性
为了考察固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片（1:10）检测CMV的灵敏度，用PBST稀释黄瓜花叶病毒到5个浓度，即5μg/mL、1μg/mL、100ng/mL、10ng/mL和1ng/mL，取100μL的每个浓度的病毒蛋白进行SPR检测，方法同上。重复三次。
结果见图5，从图中可以看出，CMV浓度为1ng/mL以上时，SPR的折射率相对于PBS基线有较明显的变化。因此，此方法的检测限为1ng/mL。
同样，验证了固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片（1:10）检测CMV的重复性。在同样的条件下分别对15片SPR金片进行清洗、修饰活化、固定单克隆抗体等过程，将固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片（1:10）用于检测上述5种浓度的CMV抗原，每个浓度测量三次，得到结果如表5，计算了各个浓度三次测量值的平均值、SD及CV%，得到的CV%均小于相应平均值的10%，说明11-MUA和11-MUO共修饰的SPR金片检测CMV的重复性较好。
表511-MUA和11-MUO修饰SPR检测CMV的重复性
2）固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片（1:10）检测CMV的特异性
为了考察固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片（1:10）检测CMV的特异性，同样取100μL浓度为10ng/mL的PSV、TAV和CMV、PSV、TAV三种病毒的等体积混合液（mix=TAV+PSV+CMV）进行SPR检测，方法同上，看11-MUA和11-MUO共修饰的SPR金片是否对这两种同属的病毒有反应。
结果如图6，检测同样浓度的样品溶液，只有CMV和混合液中的CMV能够与金片上的抗体结合，折射率有明显的变化。其余两种病毒蛋白均没有明显的响应。说明固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片（1:10）具有良好的特异性。
3、固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片（1:10）检测植物材料
在研钵内用液氮将染CMV病毒的烟草叶片和健康的烟草叶片研磨，用一定量的PBS溶解，离心(5000r/min)5分钟,取100μL上清液用固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片放入SPR传感器进行检测，方法同上，来考察11-MUA和11-MUO共修饰的SPR金片能否应用于实际植物样品的检测中，来考察11-MUA和11-MUO共修饰的SPR金片能否应用于实际植物样品的检测中。
结果如图7，其中感染CMV病毒的烟草叶片（阳性样品）有较明显的响应，而健康烟草叶片（阴性样品）未产生明显响应，说明此方法能够应用于检测携带CMV病毒的植物。
三、两种修饰方法的比较
从上述一和二的实验可以看出，11-MUA修饰的SPR金片与11-MUA和11-MUO共修饰的SPR金片均具有良好的特异性并能应用于实际样品中的检测，但是由于11-MUA修饰的SPR金片检测灵敏度为10ng/mL，而11-MUA和11-MUO共修饰的SPR金片具有更高的灵敏度，其检测灵敏度能够达到1ng/mL。且对于检测同浓度的CMV，11-MUA和11-MUO共修饰的SPR金片比11-MUA修饰的SPR金片有更高的响应，因此固定CMV单抗11-MUA和11-MUO共修饰SPR金片能更好的检测CMV，尤其采用11-MUA和11-MUO浓度比为1:10。
Claims (5)
1.一种制备用于检测病毒的SPR金片的方法，包括如下步骤：
1）用巯基十一酸和巯基十一醇共修饰SPR金片，得到修饰后金片；
2）将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片，得到用于检测所述病毒的SPR金片；步骤1）中，所述巯基十一酸和巯基十一醇共修饰SPR金片按照如下方法制备：将所述SPR金片浸泡在含有巯基十一酸和巯基十一醇的乙醇溶液中；
所述含有巯基十一酸和巯基十一醇的乙醇溶液中，所述巯基十一酸和所述巯基十一醇的浓度比为1:1、1:10、1:50、1:100或1:200；
所述抗病毒抗体为单克隆抗体；
所述病毒为黄瓜花叶病毒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述巯基十一酸和所述巯基十一醇的浓度比为1:10；
所述巯基十一酸的浓度为0.9mM；
所述巯基十一醇的浓度为9mM。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
步骤2）中，所述将抗病毒抗体固定到所述修饰后金片为将所述抗病毒抗体与所述修饰后金片上的巯基十一酸通过酰胺键连接。
4.由权利要求1-3任一所述的方法制备的用于检测病毒的SPR金片。
5.权利要求4所述的用于检测病毒的SPR金片在检测病毒中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310610770.3A CN103675281B (zh) | 2013-11-26 | 2013-11-26 | 利用表面等离子共振传感器检测黄瓜花叶病毒的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310610770.3A CN103675281B (zh) | 2013-11-26 | 2013-11-26 | 利用表面等离子共振传感器检测黄瓜花叶病毒的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103675281A CN103675281A (zh) | 2014-03-26 |
| CN103675281B true CN103675281B (zh) | 2016-02-10 |
Family
ID=50313467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310610770.3A Active CN103675281B (zh) | 2013-11-26 | 2013-11-26 | 利用表面等离子共振传感器检测黄瓜花叶病毒的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103675281B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| UA120806C2 (uk) * | 2018-07-18 | 2020-02-10 | Інститут Фізики Напівпровідників Ім. В.Є. Лашкарьова Національної Академії Наук України | Спосіб виготовлення чутливого елемента імуносенсора на основі явища поверхневого плазмонного резонансу для діагностики лейкозу великої рогатої худоби |
| CN118425104A (zh) * | 2024-07-03 | 2024-08-02 | 深圳大学 | 光纤生物检测方法、及相关产品 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1421699A (zh) * | 2001-11-23 | 2003-06-04 | 上海数康生物科技有限公司 | 并行检测多个生物学信号的表面等离子体共振生物传感器 |
| CN101241097A (zh) * | 2007-09-18 | 2008-08-13 | 中国科学院上海应用物理研究所 | 一种采用茎环结构检测探针的电化学dna检测方法及其试剂盒 |
| CN101464456A (zh) * | 2007-12-20 | 2009-06-24 | 北京金菩嘉医疗科技有限公司 | 用表面等离子共振技术检测病毒的方法以及其中使用的芯片 |
| CN101477114A (zh) * | 2009-01-22 | 2009-07-08 | 中国医学科学院生物医学工程研究所 | 一种表面等离子共振芯片的制备方法 |
| CN102279266A (zh) * | 2010-06-09 | 2011-12-14 | 中国科学院动物研究所 | 用于检测h5亚型禽流感病毒的生物芯片及其制备方法和用途 |
| CN102297967A (zh) * | 2010-06-22 | 2011-12-28 | 河南农业大学 | 一种pvy/cmv表面等离子体共振检测方法 |
-
2013
- 2013-11-26 CN CN201310610770.3A patent/CN103675281B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1421699A (zh) * | 2001-11-23 | 2003-06-04 | 上海数康生物科技有限公司 | 并行检测多个生物学信号的表面等离子体共振生物传感器 |
| CN101241097A (zh) * | 2007-09-18 | 2008-08-13 | 中国科学院上海应用物理研究所 | 一种采用茎环结构检测探针的电化学dna检测方法及其试剂盒 |
| CN101464456A (zh) * | 2007-12-20 | 2009-06-24 | 北京金菩嘉医疗科技有限公司 | 用表面等离子共振技术检测病毒的方法以及其中使用的芯片 |
| CN101477114A (zh) * | 2009-01-22 | 2009-07-08 | 中国医学科学院生物医学工程研究所 | 一种表面等离子共振芯片的制备方法 |
| CN102279266A (zh) * | 2010-06-09 | 2011-12-14 | 中国科学院动物研究所 | 用于检测h5亚型禽流感病毒的生物芯片及其制备方法和用途 |
| CN102297967A (zh) * | 2010-06-22 | 2011-12-28 | 河南农业大学 | 一种pvy/cmv表面等离子体共振检测方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 利用表面等离子共振传感器检测苏云金芽孢杆菌cry1F蛋白;曾倡等;《生物技术通讯》;20121130;第23卷(第6期);851-853 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103675281A (zh) | 2014-03-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lum et al. | Rapid detection of avian influenza H5N1 virus using impedance measurement of immuno-reaction coupled with RBC amplification | |
| Karash et al. | Rapid detection of avian influenza virus H5N1 in chicken tracheal samples using an impedance aptasensor with gold nanoparticles for signal amplification | |
| Wang et al. | Sensitive point-of-care monitoring of cardiac biomarker myoglobin using aptamer and ubiquitous personal glucose meter | |
| CN103901216B (zh) | 人h-fabp胶体金检测试纸及其制备方法 | |
| Zeng et al. | Rapid and sensitive detection of maize chlorotic mottle virus using surface plasmon resonance-based biosensor | |
| Jiang et al. | Development and evaluation of a polydiacetylene based biosensor for the detection of H5 influenza virus | |
| CN102175870B (zh) | 一种胶乳微球交联方式增加胶乳试剂灵敏度的方法 | |
| CN103792368B (zh) | 一种表面等离子体共振免疫传感芯片及其制备方法与应用 | |
| CN104198731B (zh) | 一种c反应蛋白半定量检测试剂及应用该试剂的试纸 | |
| CN103884682B (zh) | 表面等离子体共振生物芯片及其制备方法与应用 | |
| CN103808773B (zh) | 聚乙二醇固定的桔小实蝇气味结合蛋白传感器的制备方法 | |
| CN103472102A (zh) | 基于阻抗分析的气味结合蛋白传感器的制备方法及应用 | |
| Dewey et al. | Use of monoclonal antibodies to detect, quantify and visualize fungi in soils | |
| CN105044055B (zh) | 一种蛋白质的检测方法及蛋白质检测阵列传感器 | |
| CN104142401A (zh) | 膀胱肿瘤相关抗原检测试剂盒 | |
| CN103675281B (zh) | 利用表面等离子共振传感器检测黄瓜花叶病毒的方法 | |
| CN114460287A (zh) | 一种中和抗体的检测方法和试剂盒 | |
| KR20170063000A (ko) | 바이러스 특이적 핵산앱타머-나노입자 복합체를 이용한 바이러스 검출방법 | |
| Alenichev et al. | Nano-biosensor based on the combined use of the dynamic and static light scattering for Aspergillus galactomannan analysis | |
| CN111205219A (zh) | 百草枯半抗原、完全抗原、纳米抗体、检测试纸、试剂盒及制备方法、用途 | |
| CN103267745B (zh) | 一种内毒素mip-spr芯片、制备方法及其用途 | |
| Fernandez-Baldo et al. | Microfluidic immunosensor with micromagnetic beads coupled to carbon-based screen-printed electrodes (SPCEs) for determination of Botrytis cinerea in tissue of fruits | |
| Ming et al. | Detection of Bacillus thuringiensis Cry1Ab protein based on surface plasmon resonance immunosensor | |
| CN103792352A (zh) | 利用qcm传感器检测玉米褪绿斑驳病毒的方法及专用金片 | |
| CN113480624A (zh) | 含有黄曲霉毒素预警分子的黄曲霉产毒菌参考物质、制备方法及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |