CN105044055B - 一种蛋白质的检测方法及蛋白质检测阵列传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种蛋白质检测阵列传感器，所述阵列传感器中包含至少三种修饰有不同基团的碳点。在一种具体的实施方式中，所述阵列传感器中包括三种碳点，其中第一碳点表面含有氨基，第二碳点表面含有羟基和羧基，第三碳点表面含有氨基和含硫基团。本发明还相应提供一种使用碳点和LDA的蛋白质检测方法。本发明中阵列传感器的制备简单，成本低廉，使用其检测蛋白质的检测准确度高、重复性好。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质的检测方法及蛋白质检测阵列传感器。
背景技术
蛋白质的检测可应用于生物、化学、医学以及日常生活领域，因而构建灵敏、简便、准确的蛋白质检测阵列传感器以及检测方法能为这些领域带来重要意义。然而，蛋白质的结构多样性和目标分析物的复杂性给蛋白质的检测带来了极大的挑战。目前，应用最广泛的蛋白质检测方法是酶联免疫吸附阵列法(ELISA)。在该体系中，表面抗体通过“锁-钥匙”的方法与抗原结合，而另一种酶耦合抗体与显色或荧光物质反应产生可检测信号。尽管该法的灵敏度高，但因其成本高、不稳定和难于定量测定使其在实际应用中受到极大限制。
另有化学“鼻/舌”法为使用独特的“分析物-受体结合对”作为其基础的传感系统的蛋白质等分析物的检测方法。在此方法中，传感器阵列含有选择性受体，而不是“锁-钥匙”的特定识别模式。总体来说，该阵列具有化学多样性，能够对不同分析物进行差别分析。在过去的十几年中，这种方法已被用于检测多种分析物，包括金属离子、挥发性物质、芳族胺、氨基酸和糖类物质。也有研究者利用这种策略来检测蛋白质，包括基于Hamiltons卟啉类传感器，该传感器被用来识别某种金属和非金属蛋白质，Anslyn使用29种含硼酸的寡肽修饰树脂球珠来区分5种蛋白质和糖蛋白。Vincent等利用6种表面修饰正电荷基团的金纳米粒子猝灭荧光聚合物(PPE-CO2)的荧光，当加入蛋白质之后，金纳米粒子被释放出来，聚合物的荧光得到恢复，基于此，他们构建了7种蛋白质的阵列传感器。
但上述蛋白质阵列传感器的识别元件的修饰过程操作繁琐、蛋白质阵列传感器的生产成本高、应用时重现性不高。因此，本领域还需要一种制备简单且检测精准的蛋白质检测阵列传感器。
发明内容
因此，本发明首先提供一种蛋白质的检测方法，所述方法包括使用三种以上用不同基团修饰的碳点分别与蛋白质作用，测定所述碳点的荧光强度I0以及测定所述碳点与蛋白质结合物的荧光强度I，每种碳点与同种蛋白质的反应次数为6次或以上，计算出每个I/I0值，可获得一数据矩阵，再使用线性判别分析法对该数据矩阵进行分析，可实现对多种蛋白质 的判别和测定。
本发明中，所述碳点即碳量子点，也称为碳纳米粒子。本发明中，仅通过实验示意性地使用三种含不同修饰基团的碳点对血红蛋白、肌红蛋白、糜蛋白酶、人血清白蛋白、脂肪酶、溶菌酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶这8种蛋白质做出判别和检测。本领域技术人员可知的，本发明中提供的蛋白质检测方法当然也可以用于判别和检测其它种蛋白质。此外，本发明中仅示例性地指出含有氨基、羟基、羧基和含硫基团中的一种或多种修饰基团的碳点。本发明的具体实施方式部分示例性地指出了上述三种碳点的制备方法，但本领域技术人员可以采用其它的已知或未知手段来制备得到含有这样的修饰基团的碳点，这在本发明中不受限制。本领域技术人员能理解的，本发明中所使用的用不同基团修饰的碳点种类数可以超过三种，且所得检测结果会随着碳点种类数的增加变得更为准确。同理，每种碳点与同种蛋白质的反应次数也可以多于6次，所得检测结果也会随着反应次数的增加而变得更为准确。
在一种具体的实施方式中，所述基团为选自氨基、羟基、羧基和含硫基团中的一种或多种。更具体地，第一碳点表面含有氨基，第二碳点表面含有羟基和羧基，第三碳点表面含有氨基和含硫基团。所述含硫基团为巯基或硫原子两端均连接在碳原子上的基团。且所述待检测的蛋白质包含血红蛋白、肌红蛋白、糜蛋白酶、人血清白蛋白、脂肪酶、溶菌酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶中的一种或多种。在一种具体的实施方式中，所述第一碳点、第二碳点和第三碳点的激发波长分别为360nm、360nm和350nm，发射波长分别为450nm、460nm和421nm。事实上，使用本发明中提供的上述三种含不同基团修饰的碳点可用于检测的蛋白质种类并不仅限于上述八种，只是本发明的实施例中以上述八种蛋白质为模型进行研究；用以说明本发明中提供的方法适合用于对不同的蛋白质进行检测。
本发明还相应提供一种蛋白质检测阵列传感器，所述阵列传感器中包含至少三种修饰有不同基团的碳点。本发明中，所述蛋白质检测阵列传感器为一种用于检测蛋白质的产品，所述蛋白质检测阵列传感器最终可以做成试剂盒样，也可以做成试纸样，这在本发明中都不受限制。
在一种具体的实施方式中，所述基团为选自氨基、羟基、羧基和含硫基团中的一种或多种。更具体地，所述阵列传感器中包括三种碳点，其中第一碳点表面含有氨基，第二碳点表面含有羟基和羧基，第三碳点表面含有氨基和含硫基团。
在一种具体的实施方式中，所述阵列传感器中还包括pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液。在一种具体的实施方式中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为5mM。
在一种具体的实施方式中，所述阵列传感器中还包括血红蛋白标准品、肌红蛋白标准品、糜蛋白酶标准品、人血清白蛋白标准品、脂肪酶标准品、溶菌酶标准品、酸性磷酸酶标准品和碱性磷酸酶标准品中的一种或多种。
本发明利用带基团修饰的碳点直接作为识别元件，因不同蛋白质的表面结构不同，因而其与不同碳点的作用力不同，荧光淬灭的程度也不一样，利用线性判别分析(LDA)可对结构具有细微差别的蛋白质进行判别和测定，本发明是基于此原理构建出蛋白质阵列传感器。
本发明能解决多种蛋白质的同时识别和测定的技术问题。具体地，先提取和纯化未知蛋白质(含有上述三种不同碳点的阵列传感器至少可以将上述八种蛋白质区分开来并检测每种蛋白质的浓度)，将标准蛋白质和未知蛋白质稀释至在280nm处的紫外吸收强度为0.005，用相同的方法测定标准蛋白质和未知蛋白质的响应情况，得到的数据矩阵再利用LDA进行分析鉴别，确定未知蛋白质是哪一种。再根据稀释倍数计算出未知蛋白质的浓度。
本发明中阵列传感器的制备简单，成本低廉，使用其检测蛋白质的检测准确度高、重复性好。
附图说明
图1为8种不同蛋白质分别对三种碳点的响应信号图，
图2为阵列传感器对8种蛋白质的识别(LDA)图，
图3为使用本发明方法去识别未知蛋白质样品时的参照图；
图中，1、血红蛋白，2、肌红蛋白，3、糜蛋白酶，4、人血清白蛋白，5、脂肪酶，6、溶菌酶，7、酸性磷酸酶，8、碱性磷酸酶。
具体实施方式
因蛋白质种类繁多，且不同蛋白质间结构相近的情况极为常见，因而利用单一信息通道的传感器很难识别，本发明中利用表面具有不同基团修饰的三种碳点作为识别元件构建三个通道的传感器，每一种蛋白质均与每一识别元件(通道)作用6次，获得6个传感信号。本发明中涉及的8种蛋白质均作用于3个识别元件后可获得3×8×6＝144个传感信号，然后将这144个信号构建一个数据矩阵，利用线性判别分析(LDA)方法对其进行分析。这样虽然蛋白质之间的结构只有细微差别，即使它们作用于识别元件(通道)的传感信号差别不大，最终我们也能够将其识别。
本发明中阵列传感器的研发过程以及使用该阵列传感器检测未知蛋白质样品的步骤 如下：
第一步，碳纳米粒子的合成：
1)表面含有氨基的碳点(碳点1)：准确称取柠檬酸1.0507g和移取乙二胺335μL，混合后溶解于10毫升超纯水中，超声溶解10分钟后将透明溶液转移到50mL的聚四氟乙烯反应釜中于220℃条件下加热5小时。待反应完全后取出反应釜在室温下自然冷却。利用截留分子量为1000Da的透析袋将透明棕褐色的产品在超纯水中进行48小时透析。透析完全后利用截留分子量为10KDa的超滤管于4000rpm条件下离心15分钟以除去大的纳米颗粒。准确移取10mL处理好的碳点溶液于20mL的试剂瓶中冷冻干燥后称得其重量为4.2mg，碳点1浓度为0.42mg/mL，备用；
2)表面含有羟基和羧基的碳点(碳点2)：准确称取0.09g叶酸将其溶解于30mL的超纯水中，超声溶解10分钟后将其转移到50mL的聚四氟乙烯反应釜中于180℃条件下加热2小时。待反应完全后取出反应釜在室温下自然冷却。利用截留分子量为1000Da的透析袋将透明棕褐色的产品在超纯水中进行48小时透析。透析完全后利用截留分子量为10KDa的超滤管于4000rpm条件下离心15分钟以除去大的纳米颗粒。准确移取10mL处理好的碳点溶液于20mL的试剂瓶中冷冻干燥后称得其重量为2.5mg，碳点2浓度为0.25mg/mL，备用；
3)表面含有含硫基团和氨基的碳点(碳点3)：准确称取柠檬酸2.0000g和1.2116g半胱氨酸，混合后溶解于10毫升超纯水中，超声溶解10分钟后将透明溶液转移到50mL的聚四氟乙烯反应釜中于200℃条件下加热1小时。待反应完全后取出反应釜在室温下自然冷却。利用截留分子量为1000Da的透析袋将得到产物在超纯水中进行48小时透析。透析完全后利用截留分子量为10KDa的超滤管于4000rpm条件下离心15分钟以除去大的纳米颗粒。准确移取10mL处理好的碳点溶液于20mL的试剂瓶中冷冻干燥后称得其重量为10mg，碳点3浓度为1.0mg/mL，备用。
第二步，碳点的荧光光谱测定：碳点1、碳点2和碳点3的激发波长分别为360nm、360nm和350nm，发射波长分别为450nm、460nm和421nm，此时这三种碳点的荧光强度最强。所用比色皿为常规石英比色皿(10×10×40mm)，所用仪器为Shimadzu RF-5301PC荧光分光光度计spectrofluorophotometer，测定温度为室温(约25℃)。
第三步，蛋白质识别：3种碳点分别加入三个96孔板(300ml Whatman GlassBottom microplate)的共48个孔中，每个孔加入碳点的体积为200μL，所有碳点的溶剂都是5mM磷酸盐缓冲溶液，pH为7.4。分别在激发波长为360nm、360nm和350nm，发射波长为450nm、460nm和421nm处测定碳点的荧光强度(见表1)。接着向每个孔加入含各种不同蛋白质的储备液(浓度为2.1μM)10μL，最终浓度为100nM。混合15分钟后，分别在激发波长为360nm、360nm和350nm，发射波长为450nm、460nm和421nm处测定蛋白质与碳点混合物的荧光强度(见表1-1至1-3)，以加入蛋白质后和加入前的荧光强度的比值(I/I0)为响应信号。由于每一种蛋白质均与每一种碳点作用6次，获得6个传感信号，8种蛋白质均作用于3个碳点后可获得3×8×6＝144个传感信号，然后将这144个信号构建一个数据矩阵(见表2)，利用线性判别分析(LDA)方法对其进行分析，这样虽然不同蛋白质之间的结构只有细微差别，即使它们作用于识别元件(通道)的传感信号差别不大，最终我们也能够将其识别(见图1和图2)。
表1
表1-1.碳点1的荧光强度
表1-2.碳点2的荧光强度
表1-3.碳点3的荧光强度
表2为将表1中检测得到的数据整理后得到阵列传感器对各种蛋白质的荧光反应模式数据矩阵(8种蛋白质浓度均为100nM)。
表2
| Proteins | 碳点1(I/I0) | 碳点2(I/I0) | 碳点3(I/I0) |
| Hem | 0.63158572 | 0.5904875 | 0.70972796 |
| Hem | 0.62508955 | 0.58961711 | 0.71787033 |
| Hem | 0.61984332 | 0.62677705 | 0.7197581 |
| Hem | 0.62251365 | 0.62783943 | 0.70455017 |
| Hem | 0.6122489 | 0.62862943 | 0.67423434 |
| Hem | 0.60416748 | 0.65205789 | 0.66775027 |
| Myo | 0.67212298 | 0.76624961 | 0.91164104 |
| Myo | 0.67630027 | 0.75961372 | 0.9058379 |
| Myo | 0.71650208 | 0.82134588 | 0.92522428 |
| Myo | 0.69178598 | 0.85133657 | 0.91017474 |
| Myo | 0.69085917 | 0.85776436 | 0.89818052 |
| Myo | 0.6871764 | 0.80643819 | 0.90922314 |
| ChT | 0.63212346 | 0.63820895 | 0.73537021 |
| ChT | 0.62270443 | 0.61835363 | 0.73838865 |
| ChT | 0.61689498 | 0.64650131 | 0.73682642 |
| ChT | 0.61670074 | 0.63550851 | 0.74054705 |
| ChT | 0.61293943 | 0.63500916 | 0.70674845 |
| ChT | 0.61832405 | 0.64602778 | 0.72756569 |
| HSA | 0.64477178 | 0.6788979 | 0.84465737 |
| HSA | 0.65170754 | 0.69128989 | 0.85735615 |
| HSA | 0.62587226 | 0.66829735 | 0.85323316 |
| HSA | 0.64086429 | 0.7111523 | 0.81100896 |
| HSA | 0.63050884 | 0.69342821 | 0.85756184 |
| HSA | 0.64352903 | 0.71344146 | 0.87242821 |
| Lip | 0.97005558 | 0.84847161 | 0.98121979 |
| Lip | 0.95949226 | 0.86515635 | 0.98894495 |
| Lip | 0.95706877 | 0.89251656 | 0.98666373 |
| Lip | 0.96487036 | 0.88341194 | 0.97239552 |
| Lip | 0.95839617 | 0.90205276 | 0.98452094 |
| Lip | 0.96320546 | 0.92991991 | 0.99930025 |
| Lys | 0.92359007 | 0.92743241 | 0.95190541 |
| Lys | 0.93319236 | 0.8655537 | 0.96368379 |
| Lys | 0.92936887 | 0.84559179 | 0.95236987 |
| Lys | 0.90803292 | 0.86647488 | 0.95239251 |
| Lys | 0.90121914 | 0.87243276 | 0.95524741 |
| Lys | 0.908522 | 0.92592096 | 0.98060195 |
| PhosA | 0.89517859 | 0.86283149 | 0.93541343 |
| PhosA | 0.89236337 | 0.79405535 | 0.89886626 |
| PhosA | 0.86736635 | 0.80407953 | 0.9309747 |
| PhosA | 0.89943612 | 0.88737953 | 0.91335041 |
| PhosA | 0.89635106 | 0.87601295 | 0.90549473 |
| PhosA | 0.87824523 | 0.88319036 | 0.92026248 |
| PhosB | 0.72410912 | 0.88552441 | 0.91658356 |
| PhosB | 0.71952229 | 0.74419112 | 0.92314166 |
| PhosB | 0.71771882 | 0.76867735 | 0.92586081 |
| PhosB | 0.7173108 | 0.90294234 | 0.90476422 |
| PhosB | 0.73098559 | 0.78829712 | 0.88041083 |
| PhosB | 0.73161116 | 0.88606796 | 0.88713074 |
第四步，方法的可靠性验证：为验证该方法的可靠性，随机从8种蛋白质中配制64个样品，按照上述方法对其进行分析，结果可准确识别62个，准确率达96.9％，方法可靠。
第五步：检测未知样品：分别将上述8种蛋白质各选取一种，配制成8个未知样品。未知样本均稀释至在280nm处的紫外吸收强度为0.005，记录该样本的稀释倍数，然后按照步骤二和步骤三的方法测定其荧光强度(信号强度的比值见表3)，再用线性判别分析(LDA)方法对其进行分析，构建在该吸光度级别时蛋白质的分布情况(见图3)。然后对上述8种蛋白质随机选取数量的共52个未知样品按照与本步骤中前述方法相同的方法配制待检液，测定其荧光强度，根据荧光响应信号在矩阵分布图(图3)中找出蛋白质的归宿，并根据朗伯-比尔定律(c＝A280/ε280·l)计算其浓度。52个样品漏检2个，检出率达96.2％。
表3为阵列传感器对各种蛋白质的荧光反应模式数据矩阵(蛋白质在280nm处的吸光度均为0.005)。
表3
在图3中，8种蛋白质在280nm处吸光度为0.005时的浓度分别为：Hemoglobin(40nM)、Myoglobin(360nM)、α-chymotrypsin(100nM)、Human serum albumin(130nM)、Lipase(90nM)、Lysozyme(130nM)、Acid phosphatase(20nM)、Alkaline phosphatase(80nM)。
从图2和图3中可见，本发明的LDA图中的各椭圆相互不会重叠，甚至少有交叉，说明使用本发明的方法能显著区分上述八种蛋白质。
此外，图2和图3中的各蛋白质对应的椭圆的位置并不完全一致；同样的，表2和表3中提供的数据也不尽相同，这都是因在这两次检测过程中所用的蛋白质浓度不一致引起的。
本发明中，利用柠檬酸和乙二胺通过水热合成法一步合成表面带氨基的碳纳米粒子(第一碳点)，利用叶酸酸通过水热合成法一步合成表面带羟基和羧基的碳纳米粒子(第二碳点)，利用柠檬酸和半胱氨酸通过水热合成法一步合成表面带含硫基团和氨基的碳纳米粒子(第三碳点)。选取血红蛋白、肌红蛋白、糜蛋白酶(CHT)、人血清白蛋白(HSA)、脂肪酶(LIP)、溶菌酶、酸性磷酸酶(PhosA)和碱性磷酸酶(PhosB)这8种蛋白质作为模型目标物，分别置于3个96孔板(每一种碳点置于一个96孔板)中，利用磷酸盐缓冲溶 液作为缓冲，构建模型时，每一种蛋白质的浓度都为100nM，每种蛋白质分别与同一种碳点作用6次，然后分别于其特定的荧光波长下进行荧光检测。得到一个8(蛋白质)×3(碳纳米粒子)×6(重复次数)的数据矩阵，然后利用线性判别分析(LDA)对其进行分析，实现对8种蛋白质的区分鉴别。本发明提供的检测阵列传感器的制备和使用均简便快速，它可对结构上只有细微差别的蛋白质进行辨别和测定。
本发明的开发过程中，通过碳纳米粒子的合成、碳纳米粒子的结构分析和蛋白质的结构分析及它们相互作用的试验，然后结合线性判别分析(LDA)构建模型，再利用未知样品进行验证，最后得到的结论是该阵列传感器和方法检测未知蛋白质的准确率在95％以上，说明该方法可应用于对实际未知样品的分析。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种蛋白质的检测方法，所述方法包括使用三种以上用不同基团修饰的碳点分别与蛋白质作用，测定所述碳点的荧光强度I0以及测定所述碳点与蛋白质结合物的荧光强度I，每种碳点与同种蛋白质的反应次数为6次或以上，计算出每个I/I0值，可获得一数据矩阵，再使用线性判别分析法对该数据矩阵进行分析，可实现对多种蛋白质的判别和测定，所述基团为选自氨基、羟基、羧基和含硫基团中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，第一碳点表面含有氨基，第二碳点表面含有羟基和羧基，第三碳点表面含有氨基和含硫基团，且所述多种蛋白质包含血红蛋白、肌红蛋白、糜蛋白酶、人血清白蛋白、脂肪酶、溶菌酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述第一碳点、第二碳点和第三碳点的激发波长分别为360nm、360nm和350nm，发射波长分别为450nm、460nm和421nm。
4.一种蛋白质检测阵列传感器，所述阵列传感器中包含至少三种修饰有不同基团的碳点，且所述基团为选自氨基、羟基、羧基和含硫基团中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的阵列传感器，其特征在于，所述阵列传感器中包括三种碳点，其中第一碳点表面含有氨基，第二碳点表面含有羟基和羧基，第三碳点表面含有氨基和含硫基团。
6.根据权利要求4或5所述的阵列传感器，其特征在于，所述阵列传感器中还包括pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液。
7.根据权利要求4或5所述的阵列传感器，其特征在于，所述阵列传感器中还包括血红蛋白标准品、肌红蛋白标准品、糜蛋白酶标准品、人血清白蛋白标准品、脂肪酶标准品、溶菌酶标准品、酸性磷酸酶标准品和碱性磷酸酶标准品。
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