CN103412124A - 黄曲霉毒素m1金标快速检测卡及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了黄曲霉毒素M1（AFM₁）快速检测卡及其制备方法和应用，属于免疫学领域，涉及毒素检测技术。该检测卡包括检测条和塑料卡壳，所述检测条是以PVC底衬为依托，由样品垫、金标抗体结合垫、包被膜以及吸水垫依次衔接组成，其中金标抗体结合垫为玻璃纤维，包被有结合于胶体金颗粒上的黄曲霉毒素M1单克隆抗体；包被膜为硝酸纤维素膜，包被有含隐性黄曲霉毒素M1蛋白偶联物的检测线（T线）和含羊抗鼠单克隆抗体的控制线（C线）；样品垫为缓冲体系处理后的玻璃纤维。本发明是基于胶体金免疫层析技术，具有操作简单、携带方便、结果判定快速、准确、检测所需时间仅40～50分钟，适用于现场监控和大量样本的定性筛查。

Description

黄曲霉毒素M1金标快速检测卡及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于免疫学领域，涉及原料奶中黄曲霉毒素M1快速检测产品和方法。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF）属于黄曲霉毒素类的一种，均为二氢呋喃香豆素的衍生物，是食品中广泛存在的一种高致癌性真菌毒素，是黄曲霉(Asperillusflavus)和寄生曲霉(Asperillus parasiticus)的二次代谢产物。黄曲霉毒素M1(Aflatoxin M1，AFM₁)是动物摄入黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，AFB₁)后在体内经羟基化而形成的产物，其危害主要表现在致癌性和致突变性，对人及动物肝脏组织有破坏作用，可导致肝癌甚至死亡，主要存在于动物的可食部分，如乳、肝、蛋类等，其中以乳最为常见。

在动物实验中，成功诱发肝癌的动物有大鼠、小鼠、豚鼠、雪豹、鸭狗、猫、兔、猴等，所以AFM₁被国际食品准则委员会列为ⅡB人类致癌物，现在已归为一类致癌物。我国于1998年规定牛乳中AFM₁的限量标准为0.5μg/Kg，与美国、日本的限量标准类似，但是远比欧盟的限量标准宽松。2004年国家质检总局发布消息称，欧盟公布了新的黄曲霉毒素限量标准，其中规定在包括谷类食品在内的婴幼儿食品以及具有特殊医疗目的的婴儿食品中，AFM₁的最大限量分别为0.1和0.025μg/kg，该规定在2005年11月1日起在所有的成员国实施。鉴于国外对AFM₁限量标准的进一步提高的趋势，我国急需制定新的相关标准，同时需要开发与新标准相适应的新的AFM₁快速检测方法。

国内外检测AF的方法有微柱法、薄层色谱法（TLC）、液相色谱法（LC）、ELISA等。

Romer微柱法于1975年首次通过，1988年最后通过作为AOAC的法定方法。该法适用于检测食品及饲料中的总AF。Holaday-Velasco微柱法于1979年首次通过，1988年最后通过AOAC法定方法。该法适用于检测白玉米﹑黄玉米﹑生的去壳花生中≥10μg/kg的总AF。TLC是检测AF常用的方法。AOAC的TLC法有检测花生和花生制品中AF的CB法和BF法，这两种方法均作为法定方法于1988年首次通过。还有检测椰子、干椰子和椰子粉、玉米、鲜咖啡、开心果、大豆、鸡蛋、奶及奶制品、肝等食品中测定AF/AFB₁/AFM₁的TLC法也作为法定方法于1988年最后通过。20世纪90年代AOAC开始将免疫学用于检测AF的法定方法。

我国于20世纪70年代初建立检测各种食品中AF的方法。测定AFB₁的TLC法已通过作为国标方法(GB/T5009.22-1996)，该方法适用于粮食、花生及其制品、薯类、豆类、发酵食品及酒类等各种食品中AFB₁的测定；AFB₁与AFM₁的TLC法。GB/T5009.24-1996)适用于测定牛乳及其制品﹑黄油及新鲜猪组织(肝、肾、血及瘦肉)等食品中的AFB1和AFM₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂的TLC法，适用于各种食品中的总AF的测定。AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂的微柱筛选法。(GB/T500009.23-1996)可用于测定各种食品中总AF。除上述方法外，还建立了测定各种食品中AF的ELISA以及HPLC法等，这些检测方法的建立为食品中AF的污染监测提供了技术支撑。

但这些检测方法对操作人员的专业技术要求高、前处理方法复杂、检测时间长、需昂贵仪器的辅助以及单个样品检测成本高等特点不能广泛的应用于大量样品的快速筛查。胶体金免疫层析技术很好的规避了上述问题，具有检测速度快、检测成本低、对操作人员专业要求不高等特点，可应用于实验室和现场的残留检测。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种能够对原奶样品中黄曲霉毒素M1残留进行快速筛选检测的试剂盒及其检测方法和应用；发明主要目的在于实现大量样品的快速筛选检测，解决传统检测方法耗时长、成本高、操作人员专业要求高、需仪器设备辅助，不能实现大量样品的快速筛查等特点，同时通过样品前处理实现不同检测灵敏度的检测，满足不同客户的检测需求，从而提供一种更加快速、简捷、性价比高、安全的检测试剂盒及检测方法。

食品中黄曲霉毒素M1金标快速检测卡，所述检测卡包括检测条和塑料卡壳，所述检测条由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成。所述金标结合垫为包被有胶体金颗粒标记的黄曲霉毒素M1单克隆抗体的玻璃纤维、硝酸纤维素膜包被有隐性黄曲霉毒素M1蛋白偶联物的检测线（T线）以及羊抗鼠单克隆抗体的控制线（C线）。

金标结合垫上的胶体金颗粒标记的黄曲霉毒素M1单克隆抗体是黄曲霉毒素M1单克隆抗体与25um的胶体金颗粒通过物理方法结合在一起的产物，抗体标记量为3ug/ml；

所述检测线上包被的黄曲霉毒素M1蛋白偶联物的浓度为0.1mg/ml，包被量为1μl/cm；控制线上包被的羊抗鼠单克隆抗体的浓度为1mg/mL，包被量为1μl/cm。

一种制备黄曲霉毒素M1金标快速检测卡的方法如下：

1、金标抗体结合垫的制备

a.空白胶体金的制备：

采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，通过改变氯金酸和柠檬酸三钠加入量制备不同颗粒大小的胶体金溶液。炼制过程中溶液的颜色会发生变化，当溶液的颜色不再发生变化时保持沸腾状态10min后将烧瓶置于室温，充分冷却后，4℃冷藏保存，保质期为1个月；

b.金标抗体重悬液的配制：

第一步  用分析天平称取Tris0.605g，加入1L烧杯中。

第二步  用分析天平称取蔗糖25.000g,加入以上烧杯中。

第三步  500ml量筒量取纯水500ml，加入上述烧杯中，使其充分溶解。

第四步  于磁力搅拌器上温和搅拌，使各组份充分溶解、混匀。

第五步  将上述液体用4NHCl调节pH值至8.2±0.1。

第六步  用分析天平称取牛血清白蛋白（BSA）5.000g，加入以上烧杯中

第七步  再次于磁力搅拌器上温和搅拌，使BSA充分溶解、混匀。

第八步  将上述液体用0.22um微孔滤膜无菌过滤，过滤后的液体装入500ml试剂瓶中，贴签，4℃备用，保存有效期2个月。

c.胶体金标记抗体的制备：

取空白胶体金溶液100ml于三角烧瓶中，置磁力搅拌器上低速搅拌，加入0.1M(摩尔)碳酸钾溶液150～200ul，保持7～10min后，在搅拌状态下缓慢加入浓度为0.2mg/ml的黄曲霉毒素M1单克隆抗体进行抗体胶体金标记，使抗体终浓度达到3ug/ml，继续搅拌30min后逐滴加入25%的BSA溶液使之终浓度达到0.4%，持续搅拌30min，最后离心，弃去上层溶液（内含未结合的游离蛋白），用金标抗体重悬液将沉淀金标抗体重悬至原体积后备用。

d.金标抗体结合垫的制备：

将重悬好的金标抗体包被于预先切割好的尺寸为1cm*30cm的玻璃纤维素膜上，包被量为2ml/30cm，37℃干燥过夜，密封避光干燥处保存；

2、包被膜上T、C线的包被

a.黄曲霉毒素M1-蛋白偶联物的制备

2mgAFM₁与4mgCMO（O-羧甲基羟胺）溶解于400μl吡啶中，25℃避光振摇反应24h后将反应产物冷冻干燥。称取0.2mg的反应物溶于100μlDMF-水中，所述μlDMF与水的体积比为6:9；加入EDC，避光混匀。再加入0.5%OVA（卵清蛋白）溶液，25℃避光、100r/min反应4h，再补加EDC30mg，继续反应20h。将偶联产物装入透析袋，在0.01mol/LPBS（pH7.4）中置4℃透析袋3天，期间换透析液3次（24h更换一次）。

b、硝酸纤维素膜上T、C线的包被

调试好二维喷点平台，将配制好的黄曲霉M1蛋白偶联物通过划线的方式包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，同时包被羊抗鼠单克隆抗体的作为控制线，37℃干燥2h后，密封避光干燥处保存；

硝酸纤维素膜上包被的检测线浓度为0.11mg/ml，包被量均为1μL/cm；控制线上包被羊抗鼠单克隆抗体，浓度为1mg/mL，包被量为1μL/cm。

3、试纸条的组装

将最终切割尺寸的样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按序搭接黏贴在PVC底板上，将贴好的底板在切条机上切割成宽为4mm的试纸条，最后固定在塑料卡壳内。

应用本发明试剂盒检测食品中黄曲霉毒素M1残留，包括以下步骤：

使用步骤：

1、普通食品样品可加适量无菌生理盐水混合，8000-10000rpm离心10min，取上清液备用；

2、牛奶样品

（1）脱脂：取5-6mL奶样于离心管中，2000×g，离心10min，去除上层脂肪部分；

（2）吸取脱脂奶样3ml于试管中，再加入6ml二氯甲烷，水平轻轻晃动，混匀后竖直静置2-3min（注意：不可用力震荡或涡动，以防样品乳化。），取4mL下层液体，氮气吹干；

（3）取120-150μL样品稀释液于样品管中，涡旋振荡，并用滴管不断吸取冲洗，直至完全溶解管壁残留；待检。

3、拆开包装袋，取出检测卡，用塑料滴管吸取待测溶液，垂直滴加3滴于检测卡的加样孔中，加样同时开始计时（包装拆开后尽快在一个小时内使用）；

4、10-15分钟即可进行结果判读，30分钟后结果无效。

结果判断：

读取结果时，检测卡应如上图所示摆放方式置于观察者的正面，请勿从检测卡侧面或倒置检测卡进行结果观察，如下所示：

阴性：出现两条红色条带，一条是检测线（T），另一条是质控线（C）。

阴性结果表示：牛奶样品中黄曲霉毒素M1类药物浓度低于最低检测限（最低检测限见说明书第一列）。

阳性：仅质控线（C）出现一条红色条带，在检测线（T）无红色条带出现。

阳性结果表示：牛奶样品中黄曲霉毒素M1类药物浓度高于最低检测限；

无效：质控线（C）未出现红色条带，表明不正确的操作过程或检测条已失效。

根据试纸条显色，直接读取检测结果。

1）质控标准

每个测试样本至少出现一条质控线，有或无检测线。

2）结果描述及判定

仅在质控线C出现一条红线，表示样品中黄曲霉毒素M的残留高于试剂盒最低检测限；

质控线C和检测线T同时出现时，表示样品中黄曲霉毒素M的残留呈低于试剂盒最低检测限；

当检测卡上无C线出现，无论T线有无，均判定为无效结果。

本发明试剂盒的技术原理如下：

根据抗原抗体反应原理，进行抗体胶体金的有效标记，同时在硝酸纤维素膜上划制黄曲霉毒素M1-蛋白偶联物作为检测线，羊抗鼠单克隆抗体作为控制线。在层析过程中样本中的目标物与金标结合垫上金标复合物进行结合，当层析到检测线时，游离的金标抗体与检测线上蛋白偶联物相结合，同时由于抗原抗体反应的可逆反应，蛋白偶联物还竞争性的结合已与目标物结合的金标抗体从而被检测线捕获显色。样本中目标物越多检测线显色就越浅，当样本中的目标物达到一定浓度时，检测线由于捕获不到游离的金标抗体不再显色。控制线上包被黄曲霉毒素M1单克隆抗体特异性认别的抗体可被游离的或已与待检物结合的金标抗体捕获显色。

发明人发现在黄曲霉毒素M1-蛋白偶联物的制备环节中，采用100μlDMF-水溶液，该发明所获得的黄曲霉毒素M1金标快速检测卡比其他溶液的检测灵敏度提高了15%，而采用采用DMF与水采用6：9的体积比使黄曲霉毒素M1金标快速检测卡其他体积比的检测灵敏度提高8-15%。

有益效果：

该试剂盒将胶体金金颗粒的可见性和免疫层析技术进行有机结合实现牛奶样品中常见毒素黄曲霉毒素M1残留的快速筛选检测。其主要通过对牛奶样本进行简单的前处理，在45～50min内即可实现黄曲霉毒素M1的残留检测。该试剂盒具有以下特点：

1.前处理较传统方法方便：仅需通过有机溶液简单的抽提浓缩处理就可实验样品检测；

2.检测时间短：在45～50min内即可实现牛奶中黄曲霉毒素M1的检测；

3.检测成本低：相对于仪器方法和酶联免疫方法，所需检测费用更低；

4.适用范围广：由于试剂盒对操作环境要求不高同时无昂贵仪器要求，可用于实验室和野外以及现场的检测；

5.人员要求低：由于在整个检测过程中需用的仪器及试剂较少，对实验人员的专业要求不高，整个操作过程简单，检测结果肉眼就能进行判读；

6.安全性较高：试剂盒内无任何有毒有害物质。特异性：本产品与黄曲霉毒素类其他药物间交叉反应率<0.1%，与氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素和磺胺类等其他药物的交叉反应率<0.1%。

本发明所研究的黄曲霉毒素M1金标快速检测卡，实现了对乳制品中多种抗生素的残留检测，其检测时间短，检测成本低，检测范围广；检测灵敏度符合国家和欧盟标准。因此，它符合国家对食品安全与出入境检验检疫中检测技术的发展要求，有利于提高食品安全与出入境检验检疫工作的效率与准确率，有利于保证食品安全与进出口贸易，从而在公共安全领域发挥重要作用。

附图说明

图1：样品添加示意图及检测结果判定方法；

图2：检测结果实例图（检测灵敏度0.3ug/kg）；

图3：试剂盒结构示意图；

附图标记

1加样孔2检测线，（T线），3控制线（C线），4塑料卡壳，5吸水垫，6硝酸纤维素膜，7金标抗体结合垫，8样品垫；

具体实施方式

以下对本发明做进一步的的具体实施说明，

实施例1试剂盒的灵敏度实验

一、检测样本的筛选

抽取若干未知奶样用《GB5009.24-2010食品安全国家标准食品中黄曲霉毒素M1和B1的测定》方法进行检测，最后从检测结果为阴性的奶样中随机选择30份用于试剂盒的灵敏度验证实验。

二、污染样本的制备

1.标准品溶液的配制

黄曲霉毒素M1液态标准品购自SIGMA公司，浓度为10mg/kg。使用前用双蒸水配制成100ug/kg的贮存液，4℃保存，即时可用。

2.样品添加

取30份阴性奶样，每份奶样分为5组：一组作为空白对照；一组按照1ml奶样+1.5μl准溶液进行添加；一组按照1ml奶样+3μl标准溶液进行添加；一组按照1ml奶样+5μl标准溶液进行添加；一组按照1ml奶样+10μl标准溶液进行添加。每组每份奶样制备体积为30ml，其中0、0.15、0.3和1ug/kg的添加浓度按说明书中样品前处理方法一（简称方法一）进行处理，0、0.3、0.5和1ug/kg的添加浓度按按说明书中样品前处理方法二（简称方法二）进行处理。按此方法配制成的奶样，其中黄曲霉毒素M1的浓度分别为0、0.15、0.3、0.5和1ug/kg。

方法一：

（1）脱脂：取5-6mL奶样于离心管中，2000×g，离心10min，去除上层脂肪部分；

（2）吸取脱脂奶样3ml于试管中，再加入6ml二氯甲烷，水平轻轻晃动，混匀后竖直静置2-3min（注意：不可用力震荡或涡动，以防样品乳化。），取4mL下层液体，氮气吹干；

（3）取150μL样品稀释液于样品管中，涡旋振荡，并用滴管不断吸取冲洗，直至完全溶解管壁残留；待检。

方法二：

（1）脱脂：取5-6mL奶样于离心管中，2000×g，离心10min，去除上层脂肪部分；

（2）吸取脱脂奶样2ml于试管中，再加入4ml二氯甲烷，水平轻轻晃动，混匀后竖直静置2-3min（注意：不可用力震荡或涡动，以防样品乳化。），取2mL下层液体，氮气吹干；

（3）取120μL样品稀释液于样品管中，涡旋振荡，并用滴管不断吸取冲洗，直至完全溶解管壁残留；待检。

三、灵敏度实验

取上述制备好的污染奶样，分别按说明书中方法一和方法二分别进行样品前处理，每份污染奶样处理3个平行样。处理完的奶样按说明书要求使用试剂盒中提供的样品稀释液重悬后备用。将每个浓度的污染样品随机分为三组，每组30个样品（平行样不分开），分别使用三个不同批号的黄曲霉毒素M1金标快速检测卡进行检测，检测方法及结果判定方法请参照说明书。以95%出现阳性结果的最低浓度作为试剂盒的检测灵敏度。

30份奶样不同浓度添加样本的检测结果见表1、表2。结果表明，按方法一进行处理后该试剂盒的检测灵敏度为0.3ug/kg，按方法二进行处理后该试剂盒的检测灵敏度为0.5ug/kg。

表1  方法一的检测结果

注：每组每份奶样为30份，每份3个平行样，计90个检测样。“-”表示检测结果为阴性的奶样，“+”表示检测结果为阳性的奶样。

由表1可知，3个批次检测条对阴性牛奶样本的阳性检出率均为0%；黄曲霉毒素M1添加浓度为0.15ug/kg牛奶样本的阳性检出率为4.4%；黄曲霉毒素M1添加浓度为0.30ug/kg牛奶样本的阳性检出率为100%；黄曲霉毒素M1添加浓度为1.00μg/kg时，牛奶样本的阳性检出率均为100%。

表2  方法二的检测结果

注：每组每份奶样为30份，每份3个平行样，计90个检测样。“-”表示检测结果为阴性的奶样，“+”表示检测结果为阳性的奶样。

由表2可知，3个批次检测条对阴性牛奶样本的阳性检出率均为0%；黄曲霉毒素M1添加浓度为0.30ug/kg牛奶样本的阳性检出率为2.2%；黄曲霉毒素M1添加浓度为0.50ug/kg牛奶样本的阳性检出率为100%；黄曲霉毒素M1添加浓度为1.00μg/kg时，牛奶样本的阳性检出率均为100%。

由上述结果可知：该检测卡可用于牛奶样品中黄曲霉毒素M1的快速检测；采用消线法进行的结果判定，一目了然，不需任何仪器的辅助；不同的前处理方法实现了2种检测限的同时检测，可满足不同客户的检测需求；检测灵敏度为0.3和0.5ug/kg，满足国家和欧盟残留检测限量要求。

Claims (5)

1.一种黄曲霉毒素M1金标快速检测卡，所述检测卡包括检测条和塑料卡壳，所述检测条由样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫组成；所述金标结合垫为包被有胶体金颗粒标记的黄曲霉毒素M1单克隆抗体的玻璃纤维、硝酸纤维素膜包被有隐性黄曲霉毒素M1蛋白偶联物的检测线（T线）以及羊抗鼠单克隆抗体的控制线（C线）。 

2.如权1中所述黄曲霉毒素M1金标快速检测卡，其特征在于金标结合垫上的胶体金颗粒标记的黄曲霉毒素M1单克隆抗体是黄曲霉毒素M1单克隆抗体与25um的胶体金颗粒通过物理方法结合在一起的产物，抗体标记量为3ug/ml。 

3.如权1所述黄曲霉毒素M1金标快速检测卡，其特征在于所述检测线上包被的黄曲霉毒素M1蛋白偶联物的浓度为0.1mg/ml，包被量为1μl/cm；控制线上包被的羊抗鼠单克隆抗体的浓度为1mg/mL，包被量为1μl/cm。 

4.一种权种要求1所述的黄曲霉毒素M1金标快速检测卡的制备方法，包括以下步骤： 

1）金标抗体结合垫的制备 

a.空白胶体金的制备： 

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，制备方法为用量筒量取浓度为0.01%的氯金酸溶液100ml，加入带有磁力搅拌子的烧瓶内，置于加热磁力搅拌器上高速加热搅拌，等液体完全沸腾后加入浓度为1%的柠檬酸三钠溶液1.5ml；当溶液的颜色转变为桔红色且不再发生变化时保持沸腾状态10min，10min后取下烧瓶于室温自然冷却，最后取出转子，4℃避光冷藏保存； 

b.金标抗体重悬液的配制 

第一步用分析天平称取Tris0.605g，加入1L烧杯中； 

第二步用分析天平称取蔗糖25.000g,加入以上烧杯中； 

第三步500ml量筒量取纯水500ml，加入上述烧杯中，使其充分溶解； 

第四步于磁力搅拌器上温和搅拌，使各组份充分溶解、混匀； 

第五步将上述液体用4NHCl调节pH值至8.2±0.1； 

第六步用分析天平称取牛血清白蛋白（BSA）5.000g，加入以上烧杯中； 

第七步再次于磁力搅拌器上温和搅拌，使BSA充分溶解、混匀； 

第八步将上述液体用0.22um微孔滤膜无菌过滤，过滤后的液体装入500ml试剂瓶中，贴签，4℃备用，保存有效期2个月； 

c.胶体金标记抗体的制备： 

取空白胶体金溶液100ml于三角烧瓶中，置磁力搅拌器上低速搅拌，加入0.1M碳酸钾溶液150～200ul，保持7-10分钟后，在搅拌状态下缓慢加入浓度为0.2mg/ml的黄 曲霉毒素M1单克隆抗体进行抗体胶体金标记，使抗体终浓度达到3ug/ml，继续搅拌30min后逐滴加入25%的BSA溶液使之终浓度达到0.4%，持续搅拌30min，最后离心，弃去未结合的游离蛋白，用金标抗体重悬液将沉淀金标抗体充分重悬后备用； 

d.金标抗体结合垫的制备： 

将重悬好的金标抗体包被于预先切割好的尺寸为1cm*30cm的玻璃纤维素膜上，包被量为2ml/30cm，37℃干燥过夜，密封避光干燥处保存； 

2）包被膜上T、C线的包被 

a.黄曲霉毒素M1-蛋白偶联物的制备 

2mgAFM₁与4mgCMO溶解于400μl吡啶中，25℃避光振摇反应24h后将反应产物冷冻干燥；称取0.2mg的反应物溶于100μlDMF-水中，加入EDC30mg，避光混匀；再加入0.5%OVA溶液，25℃避光、100r/min反应4h，再补加EDC5-10mg，继续反应20h。将偶联产物装入透析袋，在0.01mol/LPBS中置4℃透析袋3天，期间换透析液3次；

b.T、C线的包被 

调试好二维喷点平台，将权利3中配制好的蛋白偶联物通过划线的方式按顺序包被在硝酸纤维素膜上作为检测线，同时进行羊抗鼠单克隆抗体的包被作为控制线，37℃干燥2h，密封避光干燥处保存； 

3）试纸条的组装 

按权1中的要求将样品垫、金标抗体结合垫、硝酸纤维素膜以及吸水垫按序搭接黏贴在PVC底板上，将贴好的底板在切条机上切割成宽为4mm的试纸条，最后固定在塑料卡壳内。 

5.根据权利要求4所述一种权种要求1所述的黄曲霉毒素M1金标快速检测卡的制备方法，其特征在于所述黄曲霉毒素M1-蛋白偶联物的制备步骤中，所述100μlDMF-水中DMF与水的体积比为6：9。 

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