CN109459570A - 一种快速检测人体血液中铅离子的胶体金免疫试纸条制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫学技术领域，具体公开了一种快速检测人体血液中铅离子的胶体金免疫试纸条制备方法，包括如下步骤：步骤a：胶体金溶液的制备；步骤b：抗铅离子单抗标记的胶体金溶液的制备；步骤c：喷金；步骤d：硝酸纤维素膜上包被C线与T线；步骤e：胶体金免疫试纸条的组装。本发明制备的铅离子的胶体金免疫试纸条可用于人体血液中铅离子的检测，解决了现有技术中对于人体内铅离子的检测存在的检测时间长、检测成本高的问题。

Description

一种快速检测人体血液中铅离子的胶体金免疫试纸条制备 方法

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，具体涉及一种快速检测人体血液中铅离子的胶体金免疫试纸条制备方法。

背景技术

铅是一种对人体危害极大的有毒重金属。铅及其化合物进入机体后将对神经、造血、消化、肾脏、心血管和内分泌等多个系统造成危害，若含量过高则会引起铅中毒。随着工业市场的迅速发展，铅被广泛应用到各行各业，铅对环境的污染越来越重，对人体的健康危害也越来越大。目前铅主要是通过食物、饮用水、空气等方式影响人体健康。对于成年人，铅的入侵会破坏神经系统，消化系统，男性生殖系统且影响骨骼的造血功能，进而人出现头晕、乏力、眩晕、困倦、失眠、贫血、免疫力低下、腹痛、便秘、肢体酸痛、肌肉关节前、月经不调等症状。对于儿童，由于大脑正在发育，神经系统处于敏感期，在同样的铅环境下吸入量比成人高出好几倍，受害极为严重，因此小孩铅中毒则会出现发育迟缓、食欲不振、行走不便和便秘、失眠；还有的伴有多动、听觉障碍、注意不集中和智力低下等现象，严重者造成脑组织损伤，可能导致终身残废。铅进入孕妇体内则会通过胎盘屏障，影响胎儿发育，造成畸形，流产或死胎等。世卫组织已经把铅确定为引起重大公共卫生关注的十种化学品之一，要求各会员国采取行动，保护工人、儿童和育龄妇女的健康。

目前重金属铅的检测方法主要包括物理和化学法、酶联免疫吸附检测法。物理和化学法主要包括原子吸收分光光度法(AAS)、电感耦合等离子体质谱分析(ICP-MS)、电感耦合等离子体-原子发射光谱法(ICP-AES)、原子荧光光谱分析(AFS)等。这些方法的特点是灵敏、准确，但检测相对费力、费时、费用昂贵，需要进行大量的样品预处理，且样品的检测需在大型分析设备的室内进行，不能用于现场检测，对检测人员技术要求高。酶联免疫吸附检测法是利用抗体和抗原免疫学原理进行定性或定量分析，该方法比较简便快速，可同时处理大量样品。但存在价格昂贵，单次检测成本高等缺点。

发明内容

本发明意在提供一种快速检测人体血液中铅离子的胶体金免疫试纸条制备方法，以解决现有技术中对于铅离子的检测存在的检测时间长、检测成本高的问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：一种铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条制备方法，包括如下步骤：

步骤a：胶体金溶液的制备：质量浓度为0.008～0.012％的氯金酸水溶液80～120mL，搅拌加热至沸腾后一次性快速加入质量浓度为0.8～1.2％的柠檬酸三钠水溶液，继续加热搅拌直至溶液呈酒红色，室温冷却后得含有胶体金颗粒的胶体金溶液，所述胶体金颗粒的粒径为10～30nm；

步骤b：抗铅离子单抗标记的胶体金溶液的制备：将步骤a中的胶体金溶液8～12mL离心后弃上清液，沉淀用pH为8.0～8.5的碳酸钾溶液重新悬浮；将铅离子单克隆抗体0.04～0.1mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀后静置；逐滴加入质量浓度为8～12％的无菌牛血清蛋白，搅拌后室温下静置过夜得标记后的胶体金溶液；将标记后的胶体金溶液再次离心，弃上清液，沉淀用4～6mL重悬液复溶，重悬液的组成为0.01-0.03mol/L磷酸盐、质量浓度为3％-8％的牛血清蛋白、质量浓度为0.1％-0.3％的吐温20和质量浓度为5％-15％的蔗糖，得到铅离子单克隆抗体标记的胶体金溶液；

步骤c：喷金：将步骤b所得的铅离子单克隆抗体标记的胶体金溶液按6-15μL/cm的喷量喷在结合垫上，烘干后得喷金后的结合垫；

步骤d：硝酸纤维素膜上包被C线与T线：其中C线为质控线，包被羊抗鼠免疫球蛋白G，浓度为0.5-1.5mg/ml；T线为检测线，包被铅的检测抗原Pb²⁺-iEDTA(1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸)-BSA(牛血清蛋白)，浓度为0.1-1.0mg/ml；37℃-45℃抽风烘干，时间为1-24h，得到包被后的硝酸纤维素膜；

步骤e：胶体金免疫试纸条的组装：将全血专用样品垫、喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸以依次相连的方式粘贴在聚氯乙烯底板上进行组装，切割成条，得到铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条。

本技术方案的方法制备而成的铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条包括底板，底板上依次连接有全血样品垫、喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸，所述喷金后的结合垫上喷涂有6-15μl/cm的胶体金颗粒粒径为10-30nm的胶体金溶液。

本技术方案制备的铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条在血液中铅离子检测上的应用。

本技术方案的原理及有益效果在于：胶体金免疫层析技术是一种在免疫渗透技术的基础上建立的一种快速的免疫学检测技术，由该技术制备而成的试纸条具有体积小、携带方便、价格低廉的优点，但是该技术也存在检测灵敏度及检测精度低的问题，因此，只适用于环境、食品中重金属离子的检测，并不适用于人体血液中重金属离子的检测。而本技术方案中通过对胶体金免疫层析试纸条的制备方法进行创新优化的过程中，在胶体金溶液制备时通过一次性快速加入柠檬酸三钠水溶液，并调整其质量浓度，偶然发现柠檬酸三钠的一个浓度范围，能够使得柠檬酸三钠水溶液与氯金酸水溶液反应生成小粒径(10～30nm)的胶体金颗粒，使得胶体金溶液内胶体金颗粒的粒径均一，进而提高制备的胶体金溶液的浓度，使得后期在标记铅离子单克隆抗体时无需进行浓缩，简化了胶体金免疫层析试纸条制备的步骤。在标记铅离子单克隆抗体的过程中，本技术方案在加入碳酸钾溶液调节pH之前，将胶体金溶液进行离心去上清液，而后将沉淀再用碳酸钾调节pH，避免了现有技术中直接用碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH，容易损坏pH计的探头，影响最终调节的pH的准确性，使得容易出现胶体金溶液的团聚问题，为后续铅离子单克隆抗体的标记提供稳定的胶体金溶液，使得单克隆抗体能够稳定的吸附结合在胶体金颗粒的表面。

此外，本技术方案通过对胶体金溶液和铅离子单克隆抗体及喷金量进行整体优化，且通过对重悬液组成的不断探索，发现本技术方案中的重悬液组成能够对制备成的试纸条的灵敏度和层析速度起到积极作用，使得血液中的铅离子顺利通过层析，使得制得的试纸条灵敏度可达100μg/L，满足目前国家对生物标本中铅离子超标的限值要求，且成本低、特异性强，结果准确可靠，无需大型设备和专业技术人员，克服了现有技术中的胶体金试纸条无法检测血液中铅离子的不足。

进一步，步骤b中胶体金溶液离心时，转数为9000～11000r/min，离心时间为10～30min。

在此条件下对胶体金溶液进行离心，能够保证胶体金溶液内清液与沉淀物质的分离效果。

进一步，步骤b中的铅离子单克隆抗体标记的胶体金溶液于4℃下保存备用。

在此条件下可保持铅离子单克隆抗体标记的胶体金溶液的稳定性。

进一步，步骤c中的结合垫为玻璃纤维结合垫。

玻璃纤维结合垫易得且稳定性能高，能够保证铅离子单克隆抗体标记的胶体金溶液的稳定结合，且选用玻璃纤维结合垫，与重悬液下同作用，有利于胶体金颗粒的释放和待检样品的层析过程。

进一步，T线位于靠近全血样品垫的一端。

T先如此设置，符合使用者的使用习惯，便于检测。

进一步，待检测的血液在检测前按照1:1的体积比加入摩尔浓度为0.5-1.5mmol/L的iEDTA-BSA，混合均匀。

如此，使得血液中的铅离子与iEDTA-BSA鳌合，使得血液中的铅离子顺利通过层析。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例1～实施例8为本发明的具体实施例，各实施例制备铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条时的参数如表1所示。

以实施例4为例阐述一种快速检测人体血液中铅离子的胶体金免疫试纸条制备方法，包括如下步骤：

步骤a：胶体金溶液的制备：取质量浓度为0.01％的氯金酸水溶液100ml，搅拌加热至沸腾，一次性快速加入质量浓度为1.0％的柠檬酸三钠水溶液4ml，继续搅拌加热1h，直至溶液呈酒红色，室温冷却，得到含有粒径为18nm的胶体金颗粒的胶体金溶液；

步骤b：抗铅离子单抗标记的胶体金溶液的制备：取步骤a所得胶体金溶液10ml，10000r/min离心30min，弃上清液，沉淀用5ml pH值为8.3碳酸钾溶液重悬，将铅离子单克隆抗体0.05mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀，静置2.0小时；逐滴加入质量浓度为10％的无菌牛血清蛋白0.5ml，搅拌1.0小时，室温下静置过夜；将标记后的胶体金溶液于10000r/min离心15min，弃去上清液，沉淀用5ml重悬液(0.01mol/L磷酸盐、质量浓度为4％的牛血清蛋白，质量浓度为0.1％的吐温20，质量浓度为5％的蔗糖)复溶，得到铅离子单克隆抗体标记的胶体金溶液，4℃冰箱保存备用；

步骤c：喷金：把步骤b所得铅离子单克隆抗标记的胶体金溶液按10μL/cm的喷量喷在玻璃纤维结合垫上，37℃抽风烘干，时间为24h，得到喷金后的玻璃纤维结合垫；

步骤d：硝酸纤维素膜上包被C(质控)和T(检测)线：在硝酸纤维素膜上包被C线和T线，其中C线包被羊抗鼠IgG，浓度为1.0mg/ml；T线包被铅的检测抗原Pb²⁺-iEDTA(1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N,N-四乙酸)-BSA,浓度为0.6mg/ml；37℃抽风烘干，时间为24h,得到包被后的硝酸纤维素膜；其中检测线T线靠近样品垫一端；

步骤e：铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条的组装：将血清专用样品垫、步骤c所嘚喷金后的玻璃纤维结合垫、步骤d所得包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸以依次相连的方式粘贴在聚氯乙烯底板上组装，切割成条，得到铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条。

实施例1～实施例8所制得的铅离子胶体金免疫层析试纸条均包括底板，底板上依次连接有全血样品垫、喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸，喷金后的结合垫上喷涂有胶体金颗粒粒径为18nm的胶体金溶液，喷金量分别为6μl/cm、10μl/cm、15μl/cm、10μl/cm、6μl/cm、10μl/cm、15μl/cm、和10μl/cm。

采用上述铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条检测血液中铅离子步骤如下：

制备不同铅离子浓度的生物标本血液，生物标本血液中铅离子的浓度分别为1000μg/L、800μg/L、600μg/L、400μg/L、200μg/L、100μg/L、80μg/L、60μg/L采用实施例1～实施例8制备而成的胶体金免疫层析快速检测试纸条进行检测，同时用原子吸收法(步骤参照卫生组织推荐标准WS/T 20-1996)作为对比例进行检测，每个浓度进行三次重复试验。

铅离子胶体金免疫层析检测试纸条用于血液中铅离子的检测，包括以下操作步骤：

(1)取生物标本血液1ml，按照1:1的体积比加入摩尔浓度为1.0mmol/L的iEDTA-BSA，混合均匀，使铅离子与iEDTA螯合，得到待检测样品溶液；

(2)用滴管吸取步骤(1)所得待检样品溶液200μL，滴加于试纸条的样品垫上，滴加样品后开始计时；

(3)在滴加样品后10min读取结果，读取时，将试纸条以样品垫一端向下的方式垂直，置于观察者正面；

(4)结果判断：质控线C线显示为红色线条，当T线显色，结果为阴性；当T线不显色，结果为阳性。

检测结果如表2所示：

表2检测结果对比

注：+表示结果为阳性，检出；+表示结果为阴性，未检出。

表3检测时间对比单位：min

结合表2、表3所示，本技术方案制备的胶体金免疫层析试纸条能够准确检测出血液中的铅离子，检测结果均符合我国GBZ 2-2002中有害物质生物接触限值标准中对于血铅的职业接触限值1.9μmol/L即393.3μg/L的要求。且在胶体金溶液调节pH前经过离心处理步骤，即实施例1～4，检测灵敏度为100μg/L，检测灵敏度均高于我国GBZ 2-2002中有害物质生物接触限值标准中对于血铅的职业接触限值的要求，符合儿童血铅的正常参考范围-小于100μg/L的检测要求。克服了现有技术的胶体金免疫层析试纸条无法检测出血液中铅离子的缺陷。且与传统的检测方法(对比例)相比，采用胶体金免疫层析试纸条能够在保证检测结果准确的前提下，显著缩短检测时间，且携带方便能够大批量处理样品。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (8)

1.一种铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤a：胶体金溶液的制备：质量浓度为0.008～0.012％的氯金酸水溶液80～120mL，搅拌加热至沸腾后一次性快速加入质量浓度为0.8～1.2％的柠檬酸三钠水溶液，继续加热搅拌直至溶液呈酒红色，室温冷却后得含有胶体金颗粒的胶体金溶液，所述胶体金颗粒的粒径为10～30nm；

步骤b：抗铅离子单抗标记的胶体金溶液的制备：将步骤a中的胶体金溶液8～12mL离心后弃上清液，沉淀用pH为8.0～8.5的碳酸钾溶液重新悬浮；将铅离子单克隆抗体0.04～0.1mg加入到胶体金溶液中，搅拌均匀后静置；逐滴加入质量浓度为8～12％的无菌牛血清蛋白，搅拌后室温下静置过夜得标记后的胶体金溶液；将标记后的胶体金溶液再次离心，弃上清液，沉淀用4～6mL重悬液复溶，重悬液的组成为0.01-0.03mol/L磷酸盐、质量浓度为3％-8％的牛血清蛋白、质量浓度为0.1％-0.3％的吐温20和质量浓度为5％-15％的蔗糖，得到铅离子单克隆抗体标记的胶体金溶液；

步骤c：喷金：将步骤b所得的铅离子单克隆抗体标记的胶体金溶液按6-15μL/cm的喷量喷在结合垫上，烘干后得喷金后的结合垫；

步骤d：硝酸纤维素膜上包被C线与T线：其中C线为质控线，包被羊抗鼠IgG(免疫球蛋白G)，浓度为0.5-1.5mg/ml；T线为检测线，包被铅的检测抗原Pb²⁺-iEDTA(1-(4-异硫氰苄基)乙烯基二胺-N,N,N',N'-四乙酸)-BSA(牛血清蛋白)，浓度为0.1-1.0mg/ml；37℃-45℃抽风烘干，时间为1-24h，得到包被后的硝酸纤维素膜；

步骤e：胶体金免疫试纸条的组装：将全血专用样品垫、喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸以依次相连的方式粘贴在聚氯乙烯底板上进行组装，切割成条，得到铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条。

2.根据权利要求1所述的一种铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条制备方法，其特征在于：步骤b中胶体金溶液离心时，转数为9000～11000r/min，离心时间为10～30min。

3.根据权利要求1所述的一种快速检测人体血液中铅离子的胶体金免疫试纸条制备方法，其特征在于：步骤b中的铅离子单克隆抗体标记的胶体金溶液于4℃下保存备用。

4.根据权利要求3所述的一种铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条制备方法，其特征在于：步骤c中的结合垫为玻璃纤维结合垫。

5.根据权利要求4所述的一种铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条制备方法，其特征在于：所述T线位于靠近全血样品垫的一端。

6.根据权利要求1-5任一所述方法制备的铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条，其特征在于：包括底板，底板上依次连接有全血样品垫、喷金后的结合垫、包被后的硝酸纤维素膜和吸水纸，所述喷金后的结合垫上喷涂有6-15μL/cm的胶体金颗粒粒径为10-30nm的胶体金溶液。

7.根据权利要求6所述的铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条在血液中铅离子检测上的应用。

8.根据权利要求7所述的铅离子胶体金免疫层析快速检测试纸条在血液中铅离子检测上的应用，其特征在于：待检测的血液在检测前按照1:1的体积比加入摩尔浓度为0.5-1.5mmol/L的iEDTA-BSA，混合均匀。