CN104090248A - 铕螯合物乳胶时间分辨荧光免疫层析定量检测食品中β-受体激动剂试剂 - Google Patents

Abstract

铕螯合物乳胶时间分辨荧光免疫层析定量检测食品中β-受体激动剂试剂，实施本发明的试剂，由硝酸纤维素膜、吸水纸、样品垫、PVC底板组成的试卡或试条及微孔容器组成。被测样本先溶出附着在微孔容器内标记抗β-受体激动剂小分子抗体的Eu³⁺荧光乳胶颗粒并充分混合，使检测样本和标记物充分反应，然后把此反应液滴加到试卡或试条上进行免疫层析，同时和包被在硝酸纤维膜上的β-受体激动剂小分子BSA结合物进行免疫竞争反应，5分钟后将试卡或试条插入荧光读数仪测量荧光值，得到测定结果，此法灵敏度高且定量，又集操作简便和快速等优点，应用于种植、养殖、牧业、食品加工等生产领域现场快速检测食品和原料中β-受体激动剂等兽药残留。

Description

铕螯合物乳胶时间分辨荧光免疫层析定量检测食品中β-受体激动剂试剂

技术领域

本发明应用免疫学原理，在包有铕螯合物的乳胶颗粒上标记特异性抗体，通过免疫层析技术和相应包被抗原的免疫反应，再借助于时间分辨荧光仪达到定量检测低浓度β-受体激动剂，应用于快速定量检测食品和饲料中β-受体激动剂及兽药残留。

背景技术

食品安全日益受到人们重视，尤其通过2011年“3.15事件”畜牧业上非法添加瘦肉精的暴光，以及近年来食品安全事故频发，例猪肉的瘦肉精中毒、三聚氰胺的毒奶粉、孔雀石绿的致癌鱼等等，使我国的食品安全成了全球关注焦点。

我国虽然加强对“瘦肉精”类的β-受体激动剂监控力度，严厉打击生猪养殖业非法添加，但一些不法分子在黑心利益驱动下逃避政府监控，仍使用“瘦肉精”或类似物。故加强政府监控同时，不断提高检测方法，来震慑那些不法之徒，保障百姓的食品安全。

目前，检测瘦肉精类的β-受体激动剂残留方法，主要有仪器分析，例高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法；酶联免疫吸附分析法；胶体金快速定性检测和荧光检测法。仪器分析法需要昂贵的仪器设备、专业化的实验室和训练有素的专业人才，且对样品前处理要求高、过程复杂、速度慢等缺点。酶联免疫吸附分析技术具有灵敏度高、分析成本低特点，但耗时也需专业人员和实验室，不适合现场筛选。胶体金层析和免疫荧光层析法，特点快速简便，适合现场快速筛选检测，由于胶体金检测是通过肉眼判别结果，对检测限量低的项目，例1ppb以下或不得检出的项目，目前技术很难实现。另外，胶体金微粒在不同介质呈色略微差异，这样依颜色深浅来定量就很难了，由于这些缺陷限止它的纵向发展。荧光检测原理和胶体金法类似，灵敏度比胶体金高，由于试剂组成中的硝酸纤维素膜和检测的样品背景(例尿样、组织样等均含有蛋白、糖类物质，这些物质具有荧光效应)干扰，影响检测结果的准确性，尤其对检测限量低的项目这种噪信号干扰尤为突出，加上此法需配仪器，目前应用面远不如胶体金广。

既要达到胶体金法快速简便又实现高灵敏且定量检测的方法，这是人们翘首以盼的，上世纪80-90年代Pettersson，Eskola首先报告了时间分辨免疫分析法(time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)在测定人绒毛膜促性腺激素临床医学研究中的应用，经过几十年努力TRFIA在临床医学得到快速发展和应用。但农业领域应用TRFIA检测刚刚起步，尤其是对小分子检测例食品中兽药残留、抗生素残留检测更少。与传统发光技术相比，时间分辨荧光一般采用镧系元素中Eu³⁺螯合物，此螯合物激发光波长300-340nm，而发射光波长613nm，stokes位移300nm左右，而且荧光的半衰期1×10³-1×10⁶ns，而一般蛋白荧光半衰期(1-10ns)，所以半衰期是一般蛋白荧光半衰期的5-6个数量级长，这样激发光后，稍延迟一般样品和材料的荧光已衰变完全，此后再采集荧光信号只是Eu³⁺螯合物特异物发出的荧光，由此TRFIA检测技术具有较高的信噪比，具有较高的检测灵敏度原因，时间分辨荧光免疫分析法的检测灵敏度比传统发光检测方法高2到3个数量级，由于荧光由激发后铕螯合物产生的，这种荧光不随样品形式和时间变化而影响，所以从理论上实现定量检测。本发明在包有Eu³⁺螯合物乳胶上标记特异性抗体，在硝酸纤维素膜上包被相应抗原，这两者结合组成试剂，检测过程由TRFIA仪采集信号实现检测结果。

发明内容

铕螯合物乳胶时间分辨荧光免疫层析定量检测食品中β-受体激动剂试剂，是一种在Eu³⁺螯合物乳胶上标记特异性抗体，在硝酸纤素膜上包被相应抗原，由这两者结合组成的测试试剂。此试剂的特点：快速、准确、简便、灵敏和定量。本发明目的为快速准确检测食品中的β-受体激动剂及其他兽药残留和超敏要求的检测物——例抗生素、真菌毒素等——提供更有效手段，同时弥补胶体金法灵敏度低及不能定量的缺陷。

本发明通过以下方案实现：1、包有稀土元素Eu³⁺螯合物的荧光乳胶颗粒(Thermo Fisher)上标记β-受体激动剂类小分子的特异性单抗，例盐酸克仑特罗(Clenbuterol)抗体(俗称瘦肉精)、莱克多巴胺(Ractopamine)抗体等，标记的荧光乳胶包被于400ul或300ul的微孔容器中抽干或冻干。

2、在硝酸纤维素膜(Millipore)的检测区和对照区上分别包被β-受体激动剂类的完全抗原(例Clen-BSA、Rac-BSA)和羊抗鼠IgG。

3、由包被完全抗原的硝酸纤维素膜，加上样品垫及吸水垫，照图示1贴在粘性PVC底板上和标记微孔容器组成检测试剂。

4、免疫层析时(检测)，先将被测样品加入微孔容器内，把附着在容器壁上的标记荧光乳胶颗粒溶出、充分混合，同时如被检测样本含有相应的抗原与荧光乳胶颗粒上的抗体结合发生免疫反应形成复合物，此反应液再滴加到试条的样品垫上进行免疫层析，由于被测样本中的抗原和复溶荧光乳胶标记物的抗体发生了免疫反应，此时混合液层析到检测区时包被抗原无法竞争到标记抗体，检测区内没有出现荧光带，相反如被测样本中没有被测的抗原，则标记抗体层析到检测区时和包被膜上的抗原发生免疫反应形成荧光带。质控区(C)包被羊抗鼠IgG为质控线，所以不管结果怎样质控线C始终出现荧光带，这也证明试剂有效性

5、测定结果：将加样过的试条或试卡插入时间分辨荧光分析仪上读取试剂两个区域上的荧光信号并加以分析处理，获得检测物的定量结果。

本发明中提到Eu³⁺螯合物的乳胶粒标记方法，包有Eu³⁺螯合物的乳胶粒上含有相当数量的游离羧基(-COOH)，而抗体的Fc端含有游离的胺基(-NH₂)，这两个基团通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)共价键偶联(-CONH-)，即将抗体标记到乳胶上。

本发明中提到标记抗体的乳胶包于微孔容器抽干或冻干。也可以将标记物包被于聚脂载体材料或玻纤材料上后再抽干或烘干，后者称标记垫，组成试剂时将标记垫贴在样品垫和硝酸纤维素膜之间直接组成试剂。

本发明中提到的完全抗原是小分子半抗原物质(例瘦肉精(Clenbuterol)、莱克多巴胺(Ractopamine)等)，和载体蛋白(例牛血清白蛋白BSA)通过EDC联偶成结合物，因为小分子半抗原无法固定在硝酸纤维素膜上。

本发明的试剂由五部分组成：硝酸纤维素膜、吸水纸、样品垫(玻纤滤样垫)、PVC底板和微孔容器.

硝酸纤维素膜：包被在检测区(T)上完全抗原(例CLEN-BSA结合物)的检测线，和质控区(C)上羊抗鼠IgG质控线。

吸水纸：贴有印有对应测试物名称的标贴，方便用户辨认品种。

样品垫(玻纤滤样垫)：缓冲液处理过的特定玻纤滤样垫。

PVC底板：支撑硝酸纤维素膜、吸水纸和滤样垫玻纤的粘性板。

微孔容器：含有标记抗体的Eu³⁺螯合物荧光乳胶颗粒。

本发明和现有技术相比具有以下优点：

1、灵敏度高，可以检测到1ng以下，甚至到pg级，而金标法β-受体激动剂类例瘦肉精(Clenbuterol)、莱克多巴胺(Ractopamine)，沙丁胺醇(Salbutamol)，目前水平3-5ng，ELISA可以做到0.1ng左右，但耗时且需专业人员和实验室。

2、定量，胶体金快速检测法仅为定性检测。

3、快速简便，检测时间5-10分钟出结果，不需专业人员操作。

4、不但适用于单一检测，还适用于批量检测和现场检测，ELISA虽能定量灵敏度也高，但不适合单个和现场检测。

5、试剂室温保存，有效期长，便于运输，ELISA低温保存且有效期短。

6、数据易保存和传送，时间分辨荧光仪测量后，数据可直接打印、存贮和传送。

7、数据的重现性好，测量的是铕激发后发出的荧光信号，试条上的铕不随时间而流失，所以测试过的试条随时可复测，而荧光值几乎不变，由于此特点可直接保存测试过的试条，而胶体金等其他试剂不具备此特点。

本发明为食品中的β-受体激动剂和兽药等残留提供了快速、灵敏、定量的检测方法，克服胶体金灵敏度低和无法定量的缺点，也克服ELISA低温保存并需专业人员在实验室完成的缺点。本发明试剂兼顾了他们的优点：快速、操作简便、准确和定量，既适用单个检测又适合批量检测和现场快速筛选的特点，所以此试剂将更受用户青睐。

附图说明

附图1是本发明实施例1的结构示意图。

图中1.硝酸纤维素膜、2.吸水纸、3.玻纤滤样垫、4.PVC底板、5.容器、6.试剂外壳、7.组装试条后的测试卡。

附图2是本发明检测操作方法示意图，图2中的7为试卡检测示意图，图2中的8为试条检测示意图。

附图3是本发明不同浓度的CLEN在365nm波长荧光下情况。

附图4是本发明实施CLEN4参数Logistic回归拟合曲线。

回归方程：回归方程：Y=(A-D)／[1+(X／C)^B]+D

A=1.35092，B=1.53788，C=0.20064，D=0.21183，R2=0.9904；ED50=0.25

具体实施方式

实施例1制备层析检测试剂条／卡(例盐酸克仑特罗)

1)包有Eu³⁺螯合物的荧光乳胶标记盐酸克仑特罗抗体：取100ul10％200nm表面带有羧基的铕乳胶微球(Thermo Fisher公司)，加900ul0.1M MES pH6.1洗涤，13000rpm离心30分钟，弃上清。加1ml0.1MMES pH6.1超声重悬，加NHS(N-羟基丁二酰亚胺，Thermo Fisher)1.2mg，EDC.HCl(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，Thermo Fisher)2mg，室温下活化反应1小时，13000rpm离心30分钟，弃上清。用1ml0.1M MES buffer pH6.1超声重悬，加入盐酸克仑特罗抗体0.2mg混匀，室温(25-30℃)反应2小时。标记后的乳胶以13000rpm离心30分钟，弃上清。加入1ml0.1M pH6.1含1％BSA的MES超声重悬，在室温下封闭2小时，13000rpm离心，30分钟，弃上清，用1ml10mM pH7.2PBS含1％BSA稀释液超声重悬乳胶微粒，即浓度为1％标记荧光乳胶。

2)标记微孔容器或标记垫的制备：

将1)制备的标记铕荧光乳胶用含0.5％BSA、4％蔗糖和0.5％吐温-20表面活性剂的pH7.4的10mM磷酸盐缓冲液稀释，配成0.1％浓度，在每个微孔容器底部加10-15ul，置真空干燥箱抽干。或均匀地包被在聚酯膜上，包被好的标记结合垫在37℃，相对湿度小于20％干燥室干燥10小时。

3)硝酸纤维素膜检测区和对照区的制备

在硝酸纤维素膜的检测区上包被浓度0.4mg／ml含2％蔗糖的0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液中的Clen-BSA(克仑特罗-牛血清白蛋白)偶联物，同时在对照区包被浓度为0.8mg／ml含2％蔗糖的0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液中的羊抗鼠IgG，包被量为1ul／cm，在37℃，相对湿度小于20％的干燥室干燥20小时。

4)样品垫的制备

按下表配方(按百分比计算)配制缓冲液，均匀铺在样品处理垫上并维持在37℃，相对湿度小于20％干燥。

名称	含量
		胆酸钠	0.5％
S17	1％
		S9	0.3％
硼酸钠(pH9.0)缓冲液	0.03mmol／l

S17(Rhodasurf ON-870，RHODIA，INC)，S9(Tetronic-1037，RHODIA，INC)。

5)测试条或试卡组装

包被Clen-BSA偶联物和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、吸水纸、处理后的样品垫依次贴在PVC板上组成测试条，如图1所示，将此试条和标记微孔容器装入铝箔袋中，并封好组成完整的测试条。

如将测试条置于塑料支撑板上固定，用设有加样孔和观察窗的盖板覆盖测试条及支撑板，加样孔位于样品垫处，观察窗位于带有检测和质控区的硝酸纤维素膜处，如图1中的6，7所示组成测试卡，将此试卡和标记微孔容器装入铝箔袋中，并封好组成完整的测试卡。

实施例2样品检测

A.标准曲线建立

配制1.0ml浓度为6.4ng／ml的盐酸克仑特罗的0.01M pH7.2的PBS溶液，取500ul用PBS进行倍比稀释获得不同浓度的盐酸克仑特罗溶液(3.20，1.60，0.80，0.40，0.20，0.10，0.05ng／ml)，以PBS为空白对照。取100ul标准品直接加至标记微孔容器中，把附着在容器壁上的标记荧光乳胶颗粒溶出、充分混合，滴加试条或试卡的样品垫上，室温下反应5分钟，再将检测条插入荧光读数仪检测T和C区的荧光值，结果如下表。

B.数据处理

获得T线和C线的荧光值后，计算出T／C比值，以样品浓度为X轴，T／C比值为Y轴，进行4参数Logistic回归拟合分析，图4为工作曲线图。

图中的回归方程：Y=(A-D)／[1+(X／C)^B]+D

A=1.35092，B=1.53788，C=0.20064，D=0.21183，R2=0.9904；ED50=0.25

C.检测步骤：

●吸取一定量的样品滴入微孔容器中，用移液器将样液充分混合，直至容器底部及四壁的标记物全部溶解，约一分钟，即得待检样品。

●取出试剂，平放在桌面上。

●用移液器吸取100ul待检样品，滴入加样孔中，开始计时；如是试条直接插入试条到微孔中10-15秒，取出平放台上。

●在室温反应5分钟，再将检测试条插入荧光读数仪测量其检测区和质控区的荧光值，得到测定数值。

D.检测灵敏度：

瘦肉精(Clenbuterol)、莱克多巴胺(Ractopamine)，沙丁胺醇(Salbutamol)为0.1ng／ml，其它兽药视具体检测项而定。

根据本发明公开内容，本领域的熟练技术人员无须过多实验即可对本发明所要求保护的内容进行实施，并达到预期效果。本发明公开的实施例仅是对本发明进行详细描述，但并不构成对本发明的限制。本领域的熟练技术人员用相似改造的有关内容，但不超出本发明的精神、范围和思想，均落入本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.铕螯合物乳胶时间分辨荧光免疫层析定量检测食品中β-受体激动剂试剂，其特征是，采用检测样品首先浸出附着在微孔容器内含有Eu³⁺螯合物的荧光乳胶颗粒标记的抗β-受体激动剂的小分子抗体，在容器内充分混合反应，然后将此反应液滴加到免疫层析试剂上，含有铕荧光乳胶颗粒标记的反应液与包被在硝酸纤维素膜上的β-受体激动剂的小分子-BSA结合物进行免疫竞争反应。

2.铕螯合物乳胶时间分辨荧光免疫层析定量检测食品中β-受体激动剂试剂，其特征是，经标记的铕荧光乳胶干燥后附着在微孔容器内壁得到标记的微孔容器。

3.权利要求2所述的标记的微孔容器，也可以将标记的铕荧光乳胶包被于聚脂载体材料或玻纤材料上后再抽干或烘干，后者称标记垫。

4.权利要求2所述的容器，容器内壁附着标记抗β-受体激动剂特异性抗体的Eu³⁺螯合物荧光乳胶颗粒，其特征是，容器内壁附着物不受标记的种类限制，其他它抗小分子物质的抗体，例抗生素类、兽药类、农药类、毒品类、真菌毒素类等抗体，能在使用这些不同抗体标记荧光乳胶颗粒制造的容器中应用。

5.铕螯合物乳胶时间分辨荧光免疫层析定量检测食品中β-受体激动剂试剂，其特征是，检测样品先加入由权利要求2所述容器，浸出标记的荧光胶乳颗粒与之充分混合反应得反应液。

6.权利要求5所述的检测样品，可以是各种溶液、饮用水、饮料、牛奶、食品等；还包括人和动物的血清、血浆以及各种体液如尿液、唾液、汗液、眼泪等分泌物；也可以是人和动物的组织提取液。

7.铕螯合物乳胶时间分辨荧光免疫层析定量检测食品中β-受体激动剂试剂，其特征是，把由权利要求5所述反应液加到试剂条上进行免疫层析。

8.铕螯合物乳胶时间分辨荧光免疫层析定量检测食品中β-受体激动剂试剂，其特征是，试剂由五部分组成：硝酸纤维素膜NC、吸水纸、样品垫、PVC底板和容器。

9.一种由权利要求8所述的试剂中硝酸纤维素膜，其特征是，NC膜上有检测区T和质控区C，检测区包被β-受体激动剂-BSA结合物，质控区包被相应抗体的二抗IgG，检测区T上包被BSA的结合物不受结合物种类限制，其他小分子的载体蛋白结合物，例生素类、兽药类、农药类、毒品类、真菌毒素类等BSA的结合物，能在使应用这些不同的结合物包被检测区中应用。