CN1402004A - 一种免疫层析一步法检测β－肾上腺素激动剂类药物的方法及试纸的制备 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域，是一种免疫层析一步法检测β－肾上腺素激动剂(简称β－兴奋剂类药)的方法及试纸的制备，β－兴奋剂类药为克伦特罗，塞曼特罗，沙丁胺醇，马布特罗，马贲特罗和特布他林其中的一种或其组合。试纸制作步骤为(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜的制备；(3)胶体金结合物垫的制备；(4)组装试纸条；样品中的β－兴奋剂类药和胶体金结合物垫上的限量的胶体金标记抗β－兴奋剂类药抗体结合，多余的胶体金标记抗β－兴奋剂类药抗体再和硝酸纤维素膜上的β－兴奋剂类药反应，达到简便、快速、单份筛查β－兴奋剂类药的一种或多种之目的。主要用于饲料、奶品、肉类、血浆、尿液中β－兴奋剂类药的快速筛选。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，公开了一种免疫层析一步法检测β-肾上腺素激动剂(简称β-兴奋剂类药)的方法及试纸的制备。
背景技术
β-兴奋剂作为传统的强心剂和支气管扩张剂已有30多年的历史，但近年来被大量违禁用作畜禽饲料添加剂，以促进家畜生长和改善肉质，导致一系列严重的食品β-兴奋剂类药残留问题，从而引起广泛关注。常见的β-兴奋剂类药物有20多种，目前畜禽违禁使用最广泛的药物是克伦特罗(clenbuterol)，其次是沙丁胺醇(selbuterol)和马布特罗(mabuterol)。近年来其它β-兴奋剂类药物也开始被用于促进生长，如溴布特罗(bromobuterol)，塞布特罗(cimbuterol)，塞曼特罗(cimaterol)，马贲特罗(mapenterol)，特布他林(terbutaline)等。许多国家对饲料和食品中的β-兴奋剂类药物实施了严格的监控。在养殖场，β-兴奋剂类药监测最经常采集的活体样品是尿液，其它易于采集的有效样品如血浆，奶，粪便和饲料也被经常使用。
目前，测定β-兴奋剂类药的方法有高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)和放射免疫测定法(RIA)等。目前免疫测定法ELISA和GC-MS的灵敏度能较好地满足β-兴奋剂类药残留分析要求，应用较多，检测限通常低于0.5ug/kg，前者是主要的筛选方法，后者则是成熟的确证方法。由于以上方法均需借助高档的仪器和设备，成本高，同时对操作人员需要特殊培训，实验结果无法立即显示。因此不适合于商检、防疫、畜牧生产者对怀疑对象的在线检测和监控。
β-兴奋剂类药的免疫测定法和普通的理化检测法相比有许多优势。(1)免疫反应有很好的特异性。选择抗β-兴奋剂类药的特异性单克隆抗体，待检β-兴奋剂类药和其它类型β-兴奋剂类药的交叉反应可以降低到10％以下。(2)β-兴奋剂类药的免疫测定有基团特异性。β-兴奋剂类药有特殊的共有基团，选择抗β-兴奋剂类药的抗共有基团的多克隆抗体或单克隆抗体，可以同时测定数种β-兴奋剂类药。如用抗沙丁胺醇抗体RIA对克伦特罗，马布特罗，特布他林和塞曼特罗的交叉反应分别为118％，78％，29％和11％。
免疫层析是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它往往以条状纤维层析材料为固相，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过酶反应或直接运用可目测的标记物(如胶体金)而得到直观的实验现象(如显色)。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。
免疫层析技术运用最成功的标记物为胶体金，胶体金是指分散相粒子直径在1-150nm的金溶胶，属于多相不均一体系，颜色呈桔红色到紫红色。胶体金技术是一种新兴技术，与传统的放免技术，荧光免疫技术和酶免疫技术相比有许多独特的优点。①结果直观，利用肉眼可见的红色，在不需要任何仪器的情况下对抗原进行检测，方便基层单位和现场使用。②灵敏度高，达到和ELISA相似的灵敏度，如果加入增敏试剂检测灵敏度可超过ELISA1-2个数量级。③速度快，检测时间一般为3-10分钟。
由于胶体金免疫层析技术独特的优点，目前已广泛应用于临床医疗检测中。近年来由于制备技术的改进和试剂原料质量的提高，该技术的应用范围又得到了进一步拓宽。国内外现有的商品供应及文献报道的检测项目主要包括以下方面：违禁药物检测(苯丙胺、可卡因、大麻、吗啡、海洛因等)、传染病病原检测(梅毒螺旋体、淋球菌、泌尿生殖系沙眼衣原体、幽门螺杆菌等)、激素检测、寄生虫、肿瘤标记物、心血管病检测标志物等。胶体金免疫层析技术用于食品安全领域β-兴奋剂类药的检测未见报道。
本发明用胶体金免疫层析技术检测β-兴奋剂类药。和其它β-兴奋剂类药检测方法比较，有简单、快速、单份测定、除商品试剂外不需任何仪器设备的优点，特别适合畜禽违禁β-兴奋剂类药的快速筛查。
发明内容
本发明的目的是建立一种简单、快速、单份测定、成本低、除商品试剂外不需任何仪器设备，几分钟即可用肉眼观察结果，既可检测一种β-兴奋剂类药又可同时检测数种β-兴奋剂类药的方法，特别适合饲料，奶品，肉品，血浆，尿液中β-兴奋剂类药的快速筛查，方便在基层单位的使用推广。
为实现本发明的目的采取的方案：
本发明实现免疫层析一步法检测β-肾上腺素激动剂类药物的方法及试纸的制备包括如下步骤：
1.待检样品的处理；
2.硝酸纤维素膜的制备：制备β-兴奋剂类药-载体蛋白复合物。选择β-兴奋剂类药-载体蛋白复合物的一种或组合，在硝酸纤维素膜的相应部位线状点样作为检测线。选择胶体金标记抗体的抗抗体，在硝酸纤维素膜的相应部位线状点样作为质控线。
3.胶体金结合物垫的制备：选择和第2项之与β-兴奋剂类药对应的抗β-兴奋剂类药抗体的一种或组合，标记胶体金颗粒，分散在玻璃纤维纸上，作为胶体金结合物垫。
4.试纸条的组装：①在衬垫上加上样品垫；②在衬垫上加上分散有抗β-兴奋剂类药抗体的一种或组合的胶体金结合物垫；③在衬垫上加上有β-兴奋剂类药-载体蛋白复合物的一种或组合线状点样作为检测线，有胶体金标记抗体的抗抗体线状点样作为质控线的硝酸纤维素膜；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。
方案可细分为四部分：
1.待检样品的处理；2.硝酸纤维素膜的制备；3.胶体金结合物垫的制备；4.试纸条的组装。
1.待检样品的处理：
1)尿样普查无需样品准备：
取适量尿样直接进行试验(尿样混浊时建议离心或过滤)。
2)低脂肪含量的肝、肉、组织：
取绞碎的样品5g，加入5mM Hcl 25ml摇动作用1.5h使其充分匀浆；取6g匀浆(相当于1.0肝)于离心管中；取上清液置另一离心管，加入1M NaOH 300μl混合作用15分钟；加0.5M KH2PO4(pH3.0)45ml，迅速混匀，置4℃中至少1.5小时或过夜处理。4000g离心1分钟或10-15℃高速离心，取上清液(几乎清亮)，平衡至室温。
3)高脂肪肉类组织：
取绞碎样品5克加入PH8.5，50mM Tris缓冲液25ml，振荡作用0.5小时使其充分匀浆；加入15ml正庚烷，振动5分钟；4000g或10-15℃高速离心5分钟；用灭菌吸管移去上层庚烷液和中层脂肪液；用15ml正庚烷重复提取一次；于水溶性肉匀浆中加入0.5ml HCl，振荡1小时；取6克肉匀浆(相当于1.0g肉或组织)上清液置另一离心管，加入1M NaOH 300μl混合作用15分钟；加0.5M KH2PO4(pH3.0)45ml，迅速混匀，置4℃中至少1.5小时或过夜处理。4000g离心1分钟或10-15℃高速离心，取上清液(几乎清亮)，平衡至室温。
4)饲料样品处理方法
用乳钵研碎饲料样品，称2.0g研碎的饲料样品，加入2ml1M HCl，加入16ml双蒸水。旋流3分钟，放振荡器上振荡15分钟。2000rpm离心20分钟，转移出上清液并加入2ml1M NaOH至上清液中混合，检查pH值是否在6.5-7.5之间。2000rpm离心20分钟，转移出上清液。(如果上清液仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤)。用双蒸水10倍稀释上清液(加100μl上清液到900μl双蒸水中并且混合好)，此时样品总的稀释倍数为100。取适量的稀释上清液用进行检测。
2.硝酸纤维素膜的制备：
(1)制备β-兴奋剂类药-载体蛋白复合物。
1)克伦特罗-载体蛋白复合物制备：将5mg盐酸克伦特罗溶于0.5ml 0.5mol/L硫酸，加入2mg亚硝酸钠水溶液0.2ml，室温下搅拌反应10min，加入20mg牛甲状腺蛋白(预先溶于1.8ml 1mol/L碳酸钠，pH10)，室温下搅拌反应5h，离心取上清液用凝胶柱除去未反应的克伦特罗，-20℃保存备用。
2)塞曼特罗，马布特罗，马贲特罗-载体蛋白复合物制备：同上。
3)沙丁胺醇-载体蛋白复合物制备：取80mg(0.33mmol)沙丁胺醇游离碱溶于10ml甲醇，蒸去溶剂，将残留物溶于16ml乙醇，搅拌下加入36mg(0.36mmol)琥珀酸酐，离心，用乙醇将沉淀物洗涤3次，干燥。将40mg(0.12mmol)干燥物溶于二氧六环-水-三乙胺(25+3+0.3)，搅拌下逐滴加入30ul(0.23mmol)氯甲酸异丁酯，逐滴加入25ml溶解有80mg(0.0012mmol)BSA的蒸馏水中，4℃过夜，经磷酸盐缓冲液(PBS)透析冻存备用。
4)特布他林-载体蛋白复合物制备：同上。
(2)选择β-兴奋剂类药-载体蛋白复合物的一种或组合，如下：
1)克伦特罗-载体蛋白复合物；
2)塞曼特罗-载体蛋白复合物；
3)马布特罗-载体蛋白复合物；
4)马贲特罗-载体蛋白复合物；
5)沙丁胺醇-载体蛋白复合物；
6)特布他林-载体蛋白复合物；
7)克伦特罗-载体蛋白复合物与沙丁胺醇-载体蛋白复合
物组合；
8)克伦特罗-载体蛋白复合物与马布特罗-载体蛋白复合
物组合；
9)克伦特罗-载体蛋白复合物，沙丁胺醇-载体蛋白复合
物与马布特罗-载体蛋白复合物组合；
10)克伦特罗-载体蛋白复合物，塞曼特罗-载体蛋白复
合物，马布特罗-载体蛋白复合物与马贲特罗-载体蛋
白复合物组合；
11)沙丁胺醇-载体蛋白复合物与特布他林-载体蛋白复
合物组合；
12)克伦特罗-载体蛋白复合物，沙丁胺醇-载体蛋白复
合物与特布他林-载体蛋白复合物组合。
(3)检测线和质控线的制备
将硝酸纤维素膜按25mm宽的尺寸剪裁。将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.01-0.3mg/ml的β-兴奋剂类药-载体蛋白复合物的一种或组合溶液在膜上线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边4-16mm。然后在膜的顶端喷涂一条胶体金标记抗体的抗抗体作为质控线，室温干燥30min，将膜置于1％牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。
3.胶体金结合物垫的制备：
(1)选择和β-兴奋剂类药对应的抗β-兴奋剂类药抗体的一种或组合：
选择的抗β-兴奋剂类药抗体组合如下，抗β-兴奋剂类药抗体可以选择单克隆抗体，也可选择多克隆抗体：
1)抗克伦特罗抗体；
2)抗塞曼特罗抗体；
3)抗马布特罗抗体；
4)抗马贲特罗抗体；
5)抗沙丁胺醇抗体；
6)抗特布他林抗体；
7)抗克伦特罗抗体与抗沙丁胺醇抗体组合；
8)抗克伦特罗抗体与抗马布特罗抗体组合；
9)抗克伦特罗抗体，抗沙丁胺醇抗体与抗马布特罗抗体
组合；
10)抗克伦特罗抗体，抗塞曼特罗抗体，抗马布特罗抗
体与抗马贲特罗抗体组合；
11)抗沙丁胺醇抗体与抗特布他林抗体组合；
12)抗克伦特罗，抗沙丁胺醇与抗特布他林组合。
(2)抗β-兴奋剂类药抗体标记胶体金颗粒：
1)胶体金溶胶制备：取0.01％四氯化金水溶液200ml，加热至沸腾，加入1-20ml 1％柠檬酸钠水溶液，煮沸5min，出现橙红色，胶体金颗粒直径由电镜测定为10-80nm；
2)抗β-兴奋剂类药抗体标记胶体金颗粒：取50ml胶体金，用0.1mol/L碳酸钾调pH至8.0，搅拌下将胶体金溶胶和抗β-兴奋剂类药抗体混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最终浓度为0.05％。将粗制品6000g离心45min，沉淀用生理盐水混悬至1.5ml，4℃保存。
(3)胶体金结合物垫制备：将标记胶体金颗粒的抗β-兴奋剂类药抗体按比例混合分散在厚度为1mm的玻璃纤维纸上，冻干密封干燥保存。
4.试纸条的组装：①在衬垫上加上样品垫；②在衬垫上加上分散有抗β-兴奋剂类药抗体的一种或组合的胶体金结合物垫；③在衬垫上加上有β-兴奋剂类药-载体蛋白复合物的一种或组合线状点样作为检测线，有胶体金标记抗体的抗抗体线状点样作为质控线的硝酸纤维素膜；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。
本发明的优点及应用范围
简单，快速，单份测定，除商品试剂外不需任何仪器设备，成本低，几分钟即可用肉眼观察结果，既可检测一种β-兴奋剂类药又可同时检测数种β-兴奋剂类药的总量。用于β-兴奋剂类药的快速筛查，方便在基层单位的使用推广。
本发明属于生物医学领域，主要用于饲料，奶品，肉品，血浆，尿液中β-兴奋剂类药的快速筛查。本发明的试纸条的使用单位主要为食品安全检测的执法部门，奶品、肉品生产及消费个人或单位，海关等进出口部门，以及科研部门等。
附图说明
图1：免疫层析一步法检测β-兴奋剂类药试纸条的结构和检测原理图
检测试纸是这样构成的：在衬垫1上按顺序有样品垫2用于加样，胶体金结合物垫3上有胶体金9标记的抗β-兴奋剂类药抗体10，硝酸纤维素膜4上有检测线6和质控线7，检测线6上有β-兴奋剂类药8，质控线7上有抗β-兴奋剂类药抗体10的抗抗体11，5为吸水垫。
检测原理是这样的：在样品垫2上滴加样品，如果样品中有β-兴奋剂类药8，则β-兴奋剂类药8经层析作用移动到胶体金结合物垫3，和限量的抗β-兴奋剂类药抗体10结合，当移动到检测线6时，无多余的胶体金9标记的抗β-兴奋剂类药抗体10和检测线6上的β-兴奋剂类药8结合，检测线6不显色。胶体金9标记的抗β-兴奋剂类药抗体10继续向前移动到质控线7，和质控线7上有抗β-兴奋剂类药抗体10的抗抗体11反应，质控线7显红色。若样品中无β-兴奋剂类药8，则胶体金结合物垫3上的胶体金9标记的抗β-兴奋剂类药抗体10和检测线6上的β-兴奋剂类药8结合，检测线6显红色，质控线7同上显红色。
具体实施方式
实施例一：
克伦特罗免疫层析试纸的制备并用于检测畜尿和饲料样本
本实施例分为5部分：(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜的制备；(3)胶体金结合物垫的制备；(4)试纸条的组装；(5)检测畜尿和饲料样本。
(1)待检样品的处理：
1)畜尿样本处理：取适量尿样直接进行试验(尿样混浊时建议离心或过滤)。
2)饲料样本处理：用乳钵研碎饲料样品，称2.0g研碎的饲料样品，加入2ml 1M HCl，加入16ml双蒸水。旋流3分钟，放振荡器上振荡15分钟。2000rpm离心20分钟，转移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，检查pH值是否在6.5-7.5之间。离心20分钟2000rpm，转移出上清液。(如果上清液仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤)。用双蒸水10倍稀释上清液(加100μl上清液到900μl双蒸水中并且混合好)，此时样品总的稀释倍数为100。取适量的稀释上清液用于进行检测。
(2)硝酸纤维素膜的制备：
克伦特罗-牛甲状腺蛋白复合物制备：将5mg盐酸克伦特罗溶于0.5ml 0.5mol/L硫酸，加入2mg亚硝酸钠水溶液0.2ml，室温下搅拌反应10min，加入20mg牛甲状腺蛋白(预先溶于1.8ml 1mol/L碳酸钠，pH10)，室温下搅拌反应5h，离心取上清液用凝胶柱除去未反应的克伦特罗，-20℃保存备用。
检测线和质控线的制备：将硝酸纤维素膜按25mm宽的尺寸剪裁。将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.01-0.04mg/ml的克伦特罗-牛甲状腺蛋白复合物溶液在膜上线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边8-15mm。然后在膜的顶端喷涂一条抗小鼠IgG抗体作为质控线，室温干燥30min，将膜置于1％牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。
(3)胶体金结合物垫的制备：
取50ml颗粒直径为30-50nm胶体金，用0.1mol/L碳酸钾调pH至8.0，搅拌下将胶体金溶胶和鼠源性抗克伦特罗单克隆抗体混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最终浓度为0.05％。将粗制品6000g离心45min，沉淀用生理盐水混悬至1.5ml，4℃保存。将标记胶体金颗粒的抗克伦特罗抗体分散在厚度为1mm的玻璃纤维纸上，冻干密封干燥保存。
(4)试纸条的组装：①在衬垫上加上样品垫；②在衬垫上加上分散有胶体金标记抗克伦特罗抗体的胶体金结合物垫；③在衬垫上加上有克伦特罗-牛甲状腺蛋白复合物线状点样作为检测线，有抗小鼠IgG抗体线状点样作为质控线的硝酸纤维素膜；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。
(5)检测畜尿和饲料样本：
畜尿样本：试纸垂直插入尿样，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后观察。质控线显色说明检测有效，检测线不显色说明结果为阳性，尿样克伦特罗浓度超过5ng/ml，反之为阴性。
饲料样本：试纸垂直插入饲料提取液，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后观察。质控线显色说明检测有效，检测线不显色说明结果为阳性，饲料提取液克伦特罗浓度超过5ng/ml，反之为阴性。
实施例二：
沙丁胺醇免疫层析试纸的制备并用于检测畜尿和饲料样本
本实施例分为5部分：(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜的制备；(3)胶体金结合物垫的制备；(4)试纸条的组装；(5)检测畜尿和饲料样本。
(1)待检样品的处理
1)畜尿样本处理：取适量尿样直接进行试验(尿样混浊时建议离心或过滤)。
2)饲料样本处理：用乳钵研碎饲料样品，称2.0g研碎的饲料样品，加入2ml 1M HCl，加入16ml双蒸水。旋流3分钟，放振荡器上振荡15分钟。2000rpm离心20分钟，转移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，检查pH值是否在6.5-7.5之间。离心20分钟2000rpm，转移出上清液。(如果上清液仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤)。用双蒸水10倍稀释上清液(加100μl上清液到900μl双蒸水中并且混合好)，此时样品总的稀释倍数为100。取适量的稀释上清液用于进行检测。
(2)硝酸纤维素膜的制备：
沙丁胺醇-BSA复合物制备：取80mg(0.33mmol)沙丁胺醇游离碱溶于10ml甲醇，蒸去溶剂，将残留物溶于16ml乙醇，搅拌下加入36mg(0.36mmol)琥珀酸酐，离心，用乙醇将沉淀物洗涤3次，干燥。将40mg(0.12mmol)干燥物溶于二氧六环-水-三乙胺(25+3+0.3)，搅拌下逐滴加入30ul(0.23mmol)氯甲酸异丁酯，逐滴加入25ml溶解有80mg(0.0012mmol)BSA的蒸馏水中，4℃过夜，经PBS透析冻存备用。
检测线和质控线的制备：将硝酸纤维素膜按25mm宽的尺寸剪裁。将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.01-0.04mg/ml的沙丁胺醇-BSA复合物溶液在膜上线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边8-15mm。然后在膜的顶端喷涂一条抗小鼠IgG抗体作为质控线，室温干燥30min，将膜置于1％牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。
(3)胶体金结合物垫的制备：
取50ml颗粒直径为30-50nm胶体金，用0.1mol/L碳酸钾调pH至8.0，搅拌下将胶体金溶胶和鼠源性抗沙丁胺醇单克隆抗体混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最终浓度为0.05％。将粗制品6000g离心45min，沉淀用生理盐水混悬至1.5ml，4℃保存。将标记胶体金颗粒的抗沙丁胺醇抗体分散在厚度为1mm的玻璃纤维纸上，冻干密封干燥保存。
(4)试纸条的组装：①在衬垫上加上样品垫；②在衬垫上加上分散有胶体金标记抗沙丁胺醇抗体的胶体金结合物垫；③在衬垫上加上有沙丁胺醇-BSA复合物线状点样作为检测线，有抗小鼠IgG抗体线状点样作为质控线的硝酸纤维素膜；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。
(5)检测畜尿和饲料样本：
畜尿样本：试纸垂直插入尿样，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后观察。质控线显色说明检测有效，检测线不显色说明结果为阳性，尿样沙丁胺醇浓度超过5ng/ml，反之为阴性。
饲料样本：试纸垂直插入饲料提取液，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后观察。质控线显色说明检测有效，检测线不显色说明结果为阳性，饲料提取液沙丁胺醇浓度超过5ng/ml，反之为阴性。
实施例三：
马布特罗免疫层析试纸的制备并用于检测畜尿和饲料样本
本实施例分为5部分：(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜的制备；(3)胶体金结合物垫的制备；(4)试纸条的组装；(5)检测畜尿和饲料样本。
(1)待检样品的处理：
畜尿样本处理：取适量尿样直接进行试验(尿样混浊时建议离心或过滤)。
饲料样本处理：用乳钵研碎饲料样品，称2.0g研碎的饲料样品，加入2ml 1M HCl，加入16ml双蒸水。旋流3分钟，放振荡器上振荡15分钟。2000rpm离心20分钟，转移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，检查pH值是否在6.5-7.5之间。离心20分钟2000rpm，转移出上清液。(如果上清液仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤)。用双蒸水10倍稀释上清液(加100μl上清液到900μl双蒸水中并且混合好)，此时样品总的稀释倍数为100。取适量的稀释上清液用于进行检测。
(2)硝酸纤维素膜的制备：
马布特罗-BSA复合物制备：将5mg马布特罗溶于0.5ml0.5mol/L硫酸，加入2mg亚硝酸钠水溶液0.2ml，室温下搅拌反应10min，加入20mgBSA(预先溶于1.8ml 1mol/L碳酸钠，pH10)，室温下搅拌反应5h，离心取上清液用凝胶柱除去未反应的马布特罗，-20℃保存备用。
检测线和质控线的制备：将硝酸纤维素膜按25mm宽的尺寸剪裁。将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.01-0.04mg/ml的马布特罗-BSA复合物溶液在膜上线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边8-15mm。然后在膜的顶端喷涂一条抗小鼠IgG抗体作为质控线，室温干燥30min，将膜置于1％牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。
(3)胶体金结合物垫的制备：
取50ml颗粒直径为30-50nm胶体金，用0.1mol/L碳酸钾调pH至8.0，搅拌下将胶体金溶胶和鼠源性抗马布特罗单克隆抗体混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最终浓度为0.05％。将粗制品6000g离心45min，沉淀用生理盐水混悬至1.5ml，4℃保存。将标记胶体金颗粒的抗马布特罗抗体分散在厚度为1mm的玻璃纤维纸上，冻干密封干燥保存。
(4)试纸条的组装：①在衬垫上加上样品垫；②在衬垫上加上分散有胶体金标记抗马布特罗抗体的胶体金结合物垫；③在衬垫上加上有马布特罗-BSA复合物线状点样作为检测线，有抗小鼠IgG抗体线状点样作为质控线的硝酸纤维素膜；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。
(5)检测畜尿和饲料样本：
畜尿样本：试纸垂直插入尿样，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后观察。质控线显色说明检测有效，检测线不显色说明结果为阳性，尿样马布特罗浓度超过5ng/ml，反之为阴性。
饲料样本：试纸垂直插入饲料提取液，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后观察。质控线显色说明检测有效，检测线不显色说明结果为阳性，饲料提取液马布特罗浓度超过5ng/ml，反之为阴性。
实施例四：
克伦特罗和沙丁胺醇免疫层析试纸的制备并用于检测畜尿和饲料样本
本实施例分为5部分：(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜的制备；(3)胶体金结合物垫的制备；(4)试纸条的组装；(5)检测畜尿和饲料样本。
(1)待检样品的处理：
1)畜尿样本处理：取适量尿样直接进行试验(尿样混浊时建议离心或过滤)。
2)饲料样本处理：用乳钵研碎饲料样品，称2.0g研碎的饲料样品，加入2ml 1M HCl，加入16ml双蒸水。旋流3分钟，放振荡器上振荡15分钟。2000rpm离心20分钟，转移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，检查pH值是否在6.5-7.5之间。离心20分钟2000rpm，转移出上清液。(如果上清液仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤)。用双蒸水10倍稀释上清液(加100μl上清液到900μl双蒸水中并且混合好)，此时样品总的稀释倍数为100。取适量的稀释上清液用于进行检测。
(2)硝酸纤维素膜的制备：
克伦特罗-牛甲状腺蛋白复合物制备：将5mg盐酸克伦特罗溶于0.5ml 0.5mol/L硫酸，加入2mg亚硝酸钠水溶液0.2ml，室温下搅拌反应10min，加入20mg牛甲状腺蛋白(预先溶于1.8ml 1mol/L碳酸钠，pH10)，室温下搅拌反应5h，离心取上清液用凝胶柱除去未反应的克伦特罗，-20℃保存备用。
沙丁胺醇-BSA复合物制备：取80mg(0.33mmol)沙丁胺醇游离碱溶于10ml甲醇，蒸去溶剂，将残留物溶于16ml乙醇，搅拌下加入36mg(0.36mmol)琥珀酸酐，离心，用乙醇将沉淀物洗涤3次，干燥。将40mg(0.12mmol)干燥物溶于二氧六环-水-三乙胺(25+3+0.3)，搅拌下逐滴加入30ul(0.23mmol)氯甲酸异丁酯，逐滴加入25ml溶解有80mg(0.0012mmol)BSA的蒸馏水中，4℃过夜，经PBS透析冻存备用。
检测线和质控线的制备：将硝酸纤维素膜按25mm宽的尺寸剪裁。将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.02-0.08mg/ml的克伦特罗-牛甲状腺蛋白复合物和沙丁胺醇-BSA复合物按溶液2∶1混合在膜上线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边8-15mm。然后在膜的顶端喷涂一条抗小鼠IgG抗体作为质控线，室温干燥30min，将膜置于1％牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。
(3)胶体金结合物垫的制备：
取50ml颗粒直径为30-50nm胶体金，用0.1mol/L碳酸钾调pH至8.0，搅拌下将胶体金溶胶和抗克伦特罗羊多克隆抗体混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最终浓度为0.05％。将粗制品6000g离心45min，沉淀用生理盐水混悬至1.5ml，4℃保存。同上法，用胶体金标记抗沙丁胺醇羊多克隆抗体。按2∶1混合胶体金标记的抗克伦特罗羊多克隆抗体和抗沙丁胺醇羊多克隆抗体。将混合物分散在厚度为1mm的玻璃纤维纸上，冻干密封干燥保存。
(4)试纸条的组装：按附图1在衬垫上加上样品垫，胶体金结合物垫，硝酸纤维素膜，吸水垫部件，组装为检测试纸条。
(5)检测畜尿和饲料样本：
畜尿样本：试纸垂直插入尿样，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后观察。质控线显色说明检测有效，检测线不显色说明结果为阳性，尿样克伦特罗和沙丁胺醇等β-兴奋剂类药浓度超过5ng/ml，反之为阴性。
饲料样本：试纸垂直插入饲料提取液，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后观察。质控线显色说明检测有效，检测线不显色说明结果为阳性，饲料提取液克伦特罗和沙丁胺醇等β-兴奋剂类药浓度超过5ng/ml，反之为阴性。
实施例五：
克伦特罗，沙丁胺醇与马布特罗免疫层析试纸的制备并用于检测畜尿和饲料样本
本实施例分为5部分：(1)待检样品的处理；(2)硝酸纤维素膜的制备；(3)胶体金结合物垫的制备；(4)试纸条的组装；(5)检测畜尿和饲料样本。
(1)待检样品的处理：
1)畜尿样本处理：取适量尿样直接进行试验(尿样混浊时建议离心或过滤)。
2)饲料样本处理：用乳钵研碎饲料样品，称2.0g研碎的饲料样品，加入2ml 1M HCl，加入16ml双蒸水。旋流3分钟，放振荡器上振荡15分钟。2000rpm离心20分钟，转移出上清液并加入2ml 1M NaOH至上清液中混合，检查pH值是否在6.5-7.5之间。离心20分钟2000rpm，转移出上清液。(如果上清液仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤)。用双蒸水10倍稀释上清液(加100μl上清液到900μl双蒸水中并且混合好)，此时样品总的稀释倍数为100。取适量的稀释上清液用于进行检测。
(2)硝酸纤维素膜的制备：
克伦特罗-牛甲状腺蛋白复合物制备：将5mg盐酸克伦特罗溶于0.5ml 0.5mol/L硫酸，加入2mg亚硝酸钠水溶液0.2ml，室温下搅拌反应10min，加入20mg牛甲状腺蛋白(预先溶于1.8ml 1mol/L碳酸钠，pH10)，室温下搅拌反应5h，离心取上清液用凝胶柱除去未反应的克伦特罗，-20℃保存备用。
沙丁胺醇-BSA复合物制备：取80mg(0.33mmol)沙丁胺醇游离碱溶于10ml甲醇，蒸去溶剂，将残留物溶于16ml乙醇，搅拌下加入36mg(0.36mmol)琥珀酸酐，离心，用乙醇将沉淀物洗涤3次，干燥。将40mg(0.12mmol)干燥物溶于二氧六环-水-三乙胺(25+3+0.3)，搅拌下逐滴加入30ul(0.23mmol)氯甲酸异丁酯，逐滴加入25ml溶解有80mg(0.0012mmol)BSA的蒸馏水中，4℃过夜，经PBS透析冻存备用。
马布特罗-BSA复合物制备：将5mg马布特罗溶于0.5ml0.5mol/L硫酸，加入2mg亚硝酸钠水溶液0.2ml，室温下搅拌反应10min，加入20mgBSA(预先溶于1.8ml 1mol/L碳酸钠，pH10)，室温下搅拌反应5h，离心取上清液用凝胶柱除去未反应的马布特罗，-20℃保存备用。
检测线和质控线的制备：将硝酸纤维素膜按25mm宽的尺寸剪裁。将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.03-0.12mg/ml的克伦特罗-牛甲状腺蛋白复合物，沙丁胺醇-BSA复合物和马布特罗-BSA复合物按溶液1∶1∶1混合在膜上线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边8-15mm。然后在膜的顶端喷涂一条抗小鼠IgG抗体作为质控线，室温干燥30min，将膜置于1％牛血清白蛋白的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。
(3)胶体金结合物垫的制备：
取50ml颗粒直径为30-50nm胶体金，用0.1mol/L碳酸钾调pH至8.0，搅拌下将胶体金溶胶和抗克伦特罗羊多克隆抗体混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最终浓度为0.05％。将粗制品6000g离心45min，沉淀用生理盐水混悬至1.5ml，4℃保存。同上法，用胶体金标记抗沙丁胺醇羊多克隆抗体和抗马布特罗羊多克隆抗体。按1∶1∶1混合胶体金标记的抗克伦特罗羊多克隆抗体，抗沙丁胺醇羊多克隆抗体和抗马布特罗羊多克隆抗体。将混合物分散在厚度为1mm的玻璃纤维纸上，冻干密封干燥保存。
(4)试纸条的组装：按附图1在衬垫上加上样品垫，胶体金结合物垫，硝酸纤维素膜，吸水垫部件，组装为检测试纸条。
(5)检测畜尿和饲料样本：
畜尿样本：试纸垂直插入尿样，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后观察。质控线显色说明检测有效，检测线不显色说明结果为阳性，尿样克伦特罗，沙丁胺醇和马布特罗等β-兴奋剂类药浓度超过5ng/ml，反之为阴性。
饲料样本：试纸垂直插入饲料提取液，插入深度不超过样品垫，在样本中停留约5秒，垂直取出试纸，5分钟后观察。质控线显色说明检测有效，检测线不显色说明结果为阳性，饲料提取液克伦特罗，沙丁胺醇和马布特罗等β-兴奋剂类药浓度超过5ng/ml，反之为阴性。
Claims (8)
1.一种免疫层析一步法检测β-肾上腺素激动剂类药物的方法，包括如下步骤：
(1)待检样品的处理，(2)硝酸纤维素膜的制备，(3)胶体金结合物垫的制备，(4)组装试纸条；其特征是所述的
硝酸纤维素膜制备，包括如下步骤：
(1)制备β-兴奋剂类药-载体蛋白复合物；
(2)选择β-兴奋剂类药-载体蛋白复合物的一种或组合；
(3)检测线和质控线的制备。
2.根据权利要求书1所述的一种免疫层析一步法检测β-肾上腺素激动剂类药物的方法，其特征是所述的
选择β-兴奋剂类药-载体蛋白复合物的一种或组合，如下：
1)克伦特罗-载体蛋白复合物；
2)塞曼特罗-载体蛋白复合物；
3)马布特罗-载体蛋白复合物；
4)马贲特罗-载体蛋白复合物；
5)沙丁胺醇-载体蛋白复合物；
6)特布他林-载体蛋白复合物；
7)克伦特罗-载体蛋白复合物与沙丁胺醇-载体蛋白复
合物组合；
8)克伦特罗-载体蛋白复合物与马布特罗-载体蛋白复
合物组合；
9)克伦特罗-载体蛋白复合物，沙丁胺醇-载体蛋白复
合物与马布特罗-载体蛋白复合物组合；
10)克伦特罗-载体蛋白复合物，塞曼特罗-载体蛋白
复合物，马布特罗-载体蛋白复合物与马贲特罗-载
体蛋白复合物组合；
11)沙丁胺醇-载体蛋白复合物与特布他林-载体蛋白
复合物组合；
12)克伦特罗-载体蛋白复合物，沙丁胺醇-载体蛋白
复合物与特布他林-载体蛋白复合物组合。
3.根据权利要求书1所述的一种免疫层析一步法检测β-肾上腺素激动剂类药物的方法，其特征是所述的检测线和质控线是这样制备的：
将硝酸纤维素膜按25mm宽的尺寸剪裁；将经生理盐水缓冲液充分透析，浓度调整为0.01-0.3mg/ml的β-兴奋剂类药-载体蛋白复合物的一种或组合溶液在膜上线状点样作为检测线，检测线点样位置离膜底边4-16mm；然后在膜的顶端喷涂一条胶体金标记抗体的抗抗体条带作为质控线，室温干燥30min，将膜置于1％牛血清白蛋白(BSA)的生理盐水中浸泡30min，取出吸干水分，于37℃孵育30min，置室温下干燥处密封储藏。
4.根据权利要求书1所述的一种免疫层析一步法检测β-肾上腺素激动剂类药物的方法，其特征是所述的胶体金结合物垫的制备，包括如下步骤：
(1)选择和β-兴奋剂类药对应的抗β-兴奋剂类药抗体的一种或组合；
(2)抗β-兴奋剂类药抗体标记胶体金颗粒；
(3)胶体金结合物垫制备。
5.根据权利要求书4所述的一种免疫层析一步法检测β-肾上腺素激动剂类药物的方法，其特征是所述的选择和β-兴奋剂类药对应的抗β-兴奋剂类药抗体的一种或组合，组合是这样的：
1)抗克伦特罗抗体；
2)抗塞曼特罗抗体；
3)抗马布特罗抗体；
4)抗马贲特罗抗体；
5)抗沙丁胺醇抗体；
6)抗特布他林抗体；
7)抗克伦特罗抗体与抗沙丁胺醇抗体组合；
8)抗克伦特罗抗体与抗马布特罗抗体组合；
9)抗克伦特罗抗体，抗沙丁胺醇抗体与抗马布特罗抗
体组合；
10)抗克伦特罗抗体，抗塞曼特罗抗体，抗马布特罗抗
体与抗马贲特罗抗体组合；
11)抗沙丁胺醇抗体与抗特布他林抗体组合；
12)抗克伦特罗，抗沙丁胺醇与抗特布他林组合。
6.根据权利要求书4所述的一种免疫层析一步法检测β-肾上腺素激动剂类药物的方法，其特征是所述的选择和β-兴奋剂类药对应的抗β-兴奋剂类药抗体的一种或组合，抗体是指抗克伦特罗抗体，抗塞曼特罗抗体，抗沙丁胺醇抗体，抗马布特罗抗体，抗马贲特罗抗体和抗特布他林抗体其中的一种或其组合，抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。
7.根据权利要求书4所述的一种免疫层析一步法检测β-肾上腺素激动剂类药物的方法，其特征是所述的抗β-兴奋剂类药抗体标记胶体金颗粒，步骤如下：
1)胶体金溶胶制备：取0.01％四氯化金水溶液200ml，加热至沸腾，加入1-20ml 1％柠檬酸钠水溶液，煮沸5min，出现橙红色，胶体金颗粒直径由电镜测定为10-80nm；
2)抗β-兴奋剂类药抗体标记胶体金颗粒：取50ml胶体金，用0.1mol/L碳酸钾调pH至8.0，搅拌下将胶体金溶胶和抗β-兴奋剂类药抗体混合，再加入聚乙二醇水溶液，使最终浓度为0.05％；将粗制品6000g离心45min，沉淀用生理盐水混悬至1.5ml，4℃保存。
8.根据权利要求书1所述的一种免疫层析一步法检测β-肾上腺素激动剂类药物的方法，其特征是所述的组装试纸条，步骤如下：
①在衬垫上加上样品垫；②在衬垫上加上分散有抗β-兴奋剂类药抗体的一种或组合的胶体金结合物垫；③在衬垫上加上有β-兴奋剂类药-载体蛋白复合物的一种或组合线状点样作为检测线，有抗胶体金标记抗体的抗抗体线状点样作为质控线的硝酸纤维素膜；④在衬垫上加上吸水垫；组装为检测试纸条。
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