CN1569840A - 吡虫啉人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途 - Google Patents
吡虫啉人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1569840A CN1569840A CN 200410018201 CN200410018201A CN1569840A CN 1569840 A CN1569840 A CN 1569840A CN 200410018201 CN200410018201 CN 200410018201 CN 200410018201 A CN200410018201 A CN 200410018201A CN 1569840 A CN1569840 A CN 1569840A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- provado
- artificial
- antigen
- antibody
- specific antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- YWTYJOPNNQFBPC-UHFFFAOYSA-N imidacloprid Chemical compound [O-][N+](=O)\N=C1/NCCN1CC1=CC=C(Cl)N=C1 YWTYJOPNNQFBPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 82
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 53
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 53
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- 239000005906 Imidacloprid Substances 0.000 title abstract description 8
- 229940056881 imidacloprid Drugs 0.000 title abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 26
- DKIDEFUBRARXTE-UHFFFAOYSA-N 3-mercaptopropanoic acid Chemical compound OC(=O)CCS DKIDEFUBRARXTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 11
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 9
- -1 sulfo--3-picolyl Chemical group 0.000 claims description 9
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 5
- 238000009413 insulation Methods 0.000 claims description 5
- 238000010792 warming Methods 0.000 claims description 5
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 49
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 7
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 abstract description 4
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 abstract description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 29
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 28
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 15
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 13
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 13
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 13
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 13
- 239000000447 pesticide residue Substances 0.000 description 13
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 12
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 12
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 11
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 10
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 4
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241001674939 Caulanthus Species 0.000 description 4
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical compound C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003452 antibody preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 238000000207 volumetry Methods 0.000 description 4
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 3
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 3
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N (-)-Nicotine Chemical compound CN1CCC[C@H]1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710153593 Albumin A Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005949 Malathion Substances 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 240000007711 Peperomia pellucida Species 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- SQHCMDCLCOKLDE-UHFFFAOYSA-N [Na].[Na].P(O)(O)(O)=O.C(CC(O)(C(=O)O)CC(=O)O)(=O)O Chemical compound [Na].[Na].P(O)(O)(O)=O.C(CC(O)(C(=O)O)CC(=O)O)(=O)O SQHCMDCLCOKLDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- JXSJBGJIGXNWCI-UHFFFAOYSA-N diethyl 2-[(dimethoxyphosphorothioyl)thio]succinate Chemical compound CCOC(=O)CC(SP(=S)(OC)OC)C(=O)OCC JXSJBGJIGXNWCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- PQLFROTZSIMBKR-UHFFFAOYSA-N ethenyl carbonochloridate Chemical compound ClC(=O)OC=C PQLFROTZSIMBKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229960000453 malathion Drugs 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N n'-hydroxybutanediamide Chemical compound NC(=O)CCC(=O)NO HOGDNTQCSIKEEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 229960002715 nicotine Drugs 0.000 description 2
- SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N nicotine Natural products CN1CCCC1C1=CC=CN=C1 SNICXCGAKADSCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000003822 preparative gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N tributylamine Chemical compound CCCCN(CCCC)CCCC IMFACGCPASFAPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001414720 Cicadellidae Species 0.000 description 1
- 241001498622 Cixius wagneri Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000254171 Curculionidae Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- UATJOMSPNYCXIX-UHFFFAOYSA-N Trinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1 UATJOMSPNYCXIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N atrazine Chemical compound CCNC1=NC(Cl)=NC(NC(C)C)=N1 MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L barium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ba+2] WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910001626 barium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005660 chlorination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910000474 mercury oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- UKWHYYKOEPRTIC-UHFFFAOYSA-N mercury(ii) oxide Chemical compound [Hg]=O UKWHYYKOEPRTIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- NNKVPIKMPCQWCG-UHFFFAOYSA-N methamidophos Chemical compound COP(N)(=O)SC NNKVPIKMPCQWCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003808 methanol extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- DEDOPGXGGQYYMW-UHFFFAOYSA-N molinate Chemical compound CCSC(=O)N1CCCCCC1 DEDOPGXGGQYYMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001473 noxious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005064 physico chemical analysis method Methods 0.000 description 1
- 238000011197 physicochemical method Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000010223 real-time analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000452 restraining effect Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- FFSJPOPLSWBGQY-UHFFFAOYSA-N triazol-4-one Chemical compound O=C1C=NN=N1 FFSJPOPLSWBGQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种吡虫啉人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途。属于农药免疫化学技术领域。以吡虫啉(1-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-硝基-2-咪唑啉亚胺)为原料,在碱性条件下与3-巯基丙酸反应,合成了半抗原1-(6-(2-羧乙基)硫代-3-吡啶甲基)-N-硝基-2-咪唑啉亚胺(简称IM)。然后通过碳二亚胺法和混合酸酐法分别与蛋白质偶联制备人工抗原(免疫原和包被原)。将免疫原免疫动物制备了对吡虫啉高亲合力、高特异性的抗体。该抗体与其他类似物交叉反应率低。用该抗体建立的酶联免疫吸附分析法可用于快速检测样本中痕量的吡虫啉残留。这种方法灵敏度高、特异性强,样品前处理简单,便于进行现场监控,可以与常规方法互为补充。
Description
技术领域
本发明涉及一种吡虫啉人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途。属于农药免疫化学技术领域。
背景技术
本发明属于农药小分子化合物(分子量小于1000道尔顿)免疫化学和残留分析技术领域,涉及有机合成,免疫化学及生物化学等,依靠免疫学、免疫化学基本原理和生物技术手段,设计、合成小分子目标分析物半抗原,并与载体蛋白质偶联,制备有效人工抗原,通过免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体,利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用,定量地检测样本中超微量小分子目标分析物,具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点,该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工抗原及抗体的制备,因此,目标分析物分子免疫学特性以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性是该领域极为重要的研究内容,这一技术目前已成为农药残留痕量分析研究的一个崭新领域,被列为当前优先研究、开发和利用的农药残留分析技术,世界粮农组织(FAO)已向许多国家推荐此项技术,美国化学将免疫分析与气相色谱,液相色谱共同列为农药残留分析的支柱技术。
分子量小于1000道尔顿的小分子有毒化学品如农药及其代谢产物,传统的残留分析方法主要是依靠气相色谱(GC),液相色谱(HPLC)或质谱等物化分析手段,但由于农药使用规模不断扩大,农药残留造成环境影响和对人类健康的慢性和长期效应日益受到人们关注和担忧,对农药残留的限制也因此越来越严格,对分析测定对象、种类、数量、范围、指标等诸方面都提出了新的要求和更高的标准,但传统的理化分析方法通常繁琐复杂,样品前处理过程复杂、工作量大、仪器昂贵、要求有熟练的技术人员及较长的分析周期。因此人们迫切希望有一种简单、快速、灵敏及价廉的检测技术能在野外和实验室内进行大批量的筛选试验。免疫分析法正具备这些优点,所以尽管免疫分析应用于农药残留分析的时间很短,但已很快用于环境样品和食品中农药残留的分析。
由于农药残留分析对象的复杂性,直到八十年代免疫分析才被逐渐应用于这一领域,免疫学基本原理认为:抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构,电荷、氢键及范德化引力作用等多种因素,具有极高特异性和灵敏性,遵循质量作用定律,不仅可在体内进行,也可体外进行,这些特点使其能被利用建立免疫分析方法:可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏度。并且,快速、简便,适于检测生物大分子,也可以检测复杂样本中小分子如农药等痕量组分,,然而,与大分子不同,小分子化合物免疫分析有自身特点:
1)分子量小于1000道尔顿的小分子化合物一般不具有免疫原性,不能直接免疫动物产生特异性抗体,必须合成突出分子立体结构特异性部位的半抗原,并与大分子载体连接构成有效人工物,才能免疫动物产生针对这一目标小分子化合物的特异性抗体。
2)虽然小分子化合物不具有免疫原性,但具有反应原性,即具有与相应抗体发生免疫学反应的能力,并可体外定量进行,遵循质量作用定律。如引入标记物放大显示这一反应,则其既具有免疫反应的特异性和灵敏性,又具有标记物易被识别和检测的双重特征,可分析环境、食品、人体液等复杂样本中超微量小分子化合物,具有较好的选择性,灵敏度。操作简单快速、成本低廉。
3)基于抗原抗体免疫反应检测小分子化合物的分析技术目前多采用酶免疫分析(EIA)。EIA利用酶促反应显示抗原抗体的定量结合,操作简单,又具有相当的灵敏度,近年来发展很快。这些技术使农药残留分析在方法上获得更大的生命力,对快速分析缺乏检测活性或样本基质过于复杂,因而用普通理化方法难以分析的农药残留,具有相当的应用价值。
第一个农药免疫分析的报道是1967年Centen等人制备的农药马拉硫磷的抗血清,通过抗原抗体沉淀反应,证明了抗血清与马拉硫磷的可反应性。从1967年到70年代末的10余年间,由于技术上的局限,尽管已开发出了几个农药的免疫分析方法,但仍未受到普遍重视,发展相当缓慢。主要原因是(1)八十年代前气相色谱法已经广泛应用,可满足大多数农药残留的测定,(2)残留的免疫分析涉及多个学科,研究工作较复杂,而免疫化学对于分析化学家是一个陌生的领域,另外,农药残留分析不同于医学临床化学分析,测定基质复杂。进入80年代以来,由于人们对分析方法的选择性和灵敏度的要求越来越高,同时对分析对象的种类和环境样品的数量要求也在不断增加,具有高度特异性、灵敏性、快速性的免疫检测技术在农药分析领域得到了较快的发展。进入90年代以来,农药的免疫检测技术发展迅速,到目前为止,已有60多种农药开发了免疫检测技术,其中除草剂和杀虫剂较多,杀菌剂较少。国内这方面的研究也渐渐起步,已有关于对硫磷、三唑酮、禾大壮、甲胺磷、莠去津均三氮苯类等农药的人工抗原和高亲合力的特异性抗体,用RIA法或ELISA法进行样品中痕量农药的分析。但总体来说,国内这方面的研究尚处于跟踪国外的发展。
吡虫啉[imidacloprid,1-(6-氯-3-吡啶甲基)-N-硝基-2-咪唑啉亚胺],商品名为吡虫啉,咪蚜胺等,是德国拜耳公司和日本特殊农药公司共同开发的一种高效、内吸、持效期长的优良农用杀虫剂新品种,广泛用于棉花、蔬菜、果树、水稻、小麦等作物,有效防止蚜虫、飞虱、叶蝉、象甲等害虫。目前已在全球89个国家和地区60多种作物上得到广泛应用。1999年销售额达10亿美元,一跃发展成为全球第二大农药杀虫剂品种。是一种对吮吸式昆虫的神经性毒剂,在1994年开始被引进到美国使用,被广泛用运在各种土壤,种子和叶状作物上。用作种子和土壤处理很方便。吡虫啉可以阻断神经接受端并且导致麻痹最终死亡,对高等动物的毒性相对较低,是由于对昆虫的神经末端的特异性比高等动物强。由于吡虫啉广泛地应用于农业生产上,在粮食等作物上引起的残留问题已有所报道。而且,环境样品中发现吡虫啉残留的情况也日趋严重,对人们的健康构成了潜在的威胁。因此,随着人们对吡虫啉残留的毒性与环境风险的日益关注,急需更科学、快捷和高效的检测手段。
检测吡虫啉残留量常规方法有气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)和气质联用(GC-MS)等方法。然而这些方法的灵敏度受样品的净化,浓缩等步骤的影响很大;再者这些方法需要大多数实验室所不具备的复杂的仪器,且过程繁琐,不适合大批量样品的检测与分析。免疫分析为吡虫啉残留研究提供了一个新的分析检测途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种吡虫啉人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途。
吡虫啉人工半抗原的分子结构式为:
人工半抗原化学名称为:1-(6-(2-羧乙基)硫代-3-吡啶甲基)-N-硝基-2-咪唑啉亚胺(简称IM)。
吡虫啉人工半抗原1-(6-(2-羧乙基)硫代-3-吡啶甲基)-N-硝基-2-咪唑啉亚胺(简称IM)的制备方法是按投料比吡虫啉∶3-巯基丙酸为1∶1~1∶4将吡虫啉溶于20~50mL二甲亚砜,再加入氢氧化钾1.0~3.5g,搅拌使其溶解,称取β-巯基丙酸溶于5~25mL二甲亚砜中并转移至恒压滴液漏斗中,将β-巯基丙酸溶液缓慢滴加到反应液中,缓慢升温至100℃,保温2h,待反应液自然冷却至室温后,加入20~60mL水,以稀盐酸调节pH值为3.0~5.0;用二氯甲烷3×30ml提取,收集有机相,用水3×15ml洗涤有机相,无水硫酸钠干燥、浓缩即可。
利用上述的吡虫啉人工半抗原与蛋白质合成的吡虫啉人工抗原的分子结构式为:
利用上述的吡虫啉人工抗原,免疫动物制备的吡虫啉特异性抗体,它是能与吡虫啉发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
吡虫啉特异性抗体用于检测食品、植物和环境土壤与水等样品中吡虫啉的残留量。
本发明通过设计合成吡虫啉人工半抗原和人工抗原,经免疫动物产生特异性抗体,以抗原抗体特异性免疫学反应为基础,并引入标记物来放大显示这一反应,则可用于样本测定。其选择性取决于免疫学反应的特异性,其灵敏度取决于抗体的亲合性和标记物的可检性。因此,可快速准确地分析检测吡虫啉在样本中的残留量。这种方法灵敏度高、特异性强,样品前处理简单,便于进行现场监控,可以与常规方法互为补充。
附图说明
附图是包被原和抗体浓度分别为0.5μg/ml与2μg/ml时,不同浓度吡虫啉对抗原抗体结合反应的抑制率曲线。
具体实施方式
本发明的总体技术方案如下:
选择确定目标分析物→半抗原的合成→人工抗原的制备→特异性抗体的制备→ELISA方法建立与鉴定→实际样本的分析。
首先根据小分子免疫化学基本原理,设计、合成吡虫啉半抗原,突出目标分子特异性部位,制备人工抗原和包被抗原,再用人工抗原免疫和诱导动物机体产生对吡虫啉特异性抗体,进一步探讨相应抗原抗体免疫化学特性,筛选有效抗体,研究和建立灵敏的ELISA方法,并应用于实际样本的分析。
1 吡虫啉人工半抗原的合成
农药小分子必须与大分子物质连接后才能刺激动物产生特异性抗体,这已成为小分子免疫分析的基本模式。因此,半抗原的合成与鉴定试验是产生特异性抗体和建立农药残留快速检测技术研究最基础和最关键的步骤。理想的半抗原一方面应具备待测物的特征结构,特别是立体化学特征,另一方面半抗原与载体连接后应保证待测物的特征结构能最大程度地为免疫活性细胞识别和结合,以制备出具有预期选择性的抗体。①半抗原通常由待测物衍生化制备,或由原料合成,待测物的代谢或降解产物往往是有用的半抗原;②除待测物特征结构外,在半抗原的未端需有可直接或间接与载体蛋白质偶联的活性基团;③在活性基团与载体之间,必须有一定长度的间隔臂,以便使半抗原突出于载体表面,易为有机免疫系统识别;④间隔臂应远离待测物的特征结构部分和官能团;⑤半抗原的设计应考虑到农药原型和有毒理学意义的代谢物,以及测定对象是单一的农药或某一类农药;⑥从机体的免疫应答是个十分复杂的生化过程,半抗原诱导的抗体的选择性和亲合性尚难预测,多数情况下宜合成几种结构的半抗原进行研究。
为突出吡虫啉分子特异性抗原决定簇,基于吡虫啉苯环侧链上有一个氯原子取代基,为了让吡虫啉的结构特征充分暴露,在氯取代基位点上接上一个连接臂,据此以吡虫啉与3-巯基丙酸在碱性条件下合成了半抗原1-(6-(2-羧乙基)硫代-3-吡啶甲基)-N-硝基-2-咪唑啉亚胺(简称IM)。产物纯化后经质谱(ESI)和核磁共振氢谱(1H-NMR)鉴定,并与类似已知的化合物数据比较确证。
主要半抗原的结构如下:
2 人工抗原的合成
免疫原的合成采用碳二亚胺法。是将50~80微摩尔半抗原IM,溶解在1~2mL的N,N-二甲基甲酰胺中,然后在该溶液中加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺,让其在室温下反应过夜后,离心,取上清液500~800μL加入到4~8mL15~20mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中,加入时应缓慢,在磁力搅拌下反应4~6小时,待反应完成后,装入透析袋,先用蒸馏水透析2~4次,然后用0.8~0.9%生理盐水透析,分装保存于一20℃的冰箱中。
包被抗原的合成利用混合酸酐法。将80~100微摩尔半抗原IM溶解在1~2mL的N,N-二甲基甲酰胺中,然后加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯,在室温下反应1~2小时,反应液500~800μL加入到8~10mL20mg/mL的OVA碳酸缓冲溶液中,然后磁力搅拌下反应2~4小时,待反应完成后,装入透析袋,先用蒸馏水透析2~4次,然后用0.8~0.9%生理盐水透析,分装保存于-20℃的冰箱中。
按照合成吡虫啉免疫原和包被抗原时反应物和产物的比例,分别取反应物和产物进行紫外(200nm~400nm)。偶联物IM-BSA和IM-OVA分别在270nm和277nm处出现最大吸收峰,与IM、BSA和OVA的吸收峰相比,发生了明显的变化,表明人工抗原IM-BSA和IM-OVA的合成是成功的。结果可用下式计算:
经计算半抗原与蛋白质的结合比如下:
IM-BSA 32∶1 IM-OVA 10∶1
3抗体的制备及吡虫啉酶联免疫分析方法的建立
吡虫啉特异性抗体制备方法的步骤如下:
1)实验选用半周岁左右,体重为2~3公斤,健康的雄性家兔或者小鼠。实验免疫剂量基础免疫为0.25~2.0mg/kg,加强免疫剂量为0.5~2.0mg/kg,用生理盐水分别稀释适量人工抗原复合物,加入等体积弗氏完全佐剂,充分乳化,直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。背部皮下免疫4~6点,大腿肌肉注射2~4点,3~4周后进行加强免疫,以后每隔2周再次加强免疫,加强免疫时采用弗氏不完全佐剂。从第三次免疫开始,每次免疫后第8~10天,从兔子心脏或耳缘静脉采血,测定效价和特异性。待免疫血清效价合格后,就可进行采血,分离出抗血清;
两种免疫原复合物按常规方法各免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开始,在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血,血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。待第4次免疫时,兔子获得了高效价的抗体,抗血清的效价分别为1∶25600、1∶25600和1∶51200(指OD450nm值大于1.0)。
2)采用辛酸-硫酸铵盐析法,或者采用蛋白A柱层析得到抗血清中的IgG。
利用吡虫啉抗原抗体免疫反应和酶促反应建立吡虫啉酶联免疫分析法。在检测分析食品、植物和环境土壤与水等样品中吡虫啉残留时具有很高的特异性和灵敏度,最低检测限可达到0.005ppm,准确度高,回收率可高达96.5%以上,同时操作方法简单快速,不需要复杂的前处理过程,一次可同时检测大批样品,成本低廉,对操作人员的要求低,便于进行现场监控,可以与常规方法互为补充。
实施例1:半抗原IM的合成
按投料比吡虫啉∶3-巯基丙酸为1∶1将吡虫啉5.15g(20mmol)溶于20mL二甲亚砜,投入三口烧瓶中,再加入KOH 2.25g(40mmol),磁力搅拌使其溶解,称取β-巯基丙酸2.10g(20mmol)溶于10mL二甲亚砜并转移至恒压滴液漏斗中,将β-巯基丙酸溶液缓慢滴加到三口烧瓶中,并使油浴缓慢升温至100℃。保温2h后撤去油浴,待反应液自然冷却至室温后,加入20mL水,以稀盐酸调节pH值为3.0~5.0;用二氯甲烷3×30ml提取,收集有机相,用水3×15ml洗涤有机相,无水硫酸钠干燥、浓缩,得少量白色固体。
产物(IM)的鉴定
取上述合成的产物分别经ESI-MS、1H-NMR确定结构:ESI-MS中丰度最大的为产物分子离子峰m/z 324,1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ2.62(2H,m,CH2),3.29(2H,m,CH2),3.47(2H,m,2H2),3.61(2H,m,CH2),4.36 and4.40(2H,ss,CH2),7.30(1H,m,Pyr:H),7.56(1H,m,Pyr:H),8.43(1H,m,Pyr:H),8.95 and 8.82(1H,ss,NH),12(1H,br,COOH)。
从以上分析综合可知,所合成的产物为目标物。
实施例2:半抗原IM的合成
按投料比吡虫啉∶3-巯基丙酸为1∶2将吡虫啉5.15g(20mmol)溶于20mL二甲亚砜,投入三口烧瓶中,再加入KOH 4.5g(80mmol),磁力搅拌使其溶解,称取β-巯基丙酸4.2g(40mmol)溶于20mL二甲亚砜并转移至恒压滴液漏斗中,将β-巯基丙酸溶液缓慢滴加到三口烧瓶中,并使油浴缓慢升温至100℃。保温2h后撤去油浴,待反应液自然冷却至室温后,加入40mL水,以稀盐酸调节pH值为3.0~5.0;用二氯甲烷3×30ml提取,收集有机相,用水3×15ml洗涤有机相,无水硫酸钠干燥、浓缩,得少量白色固体。
实施例3:半抗原IM的合成
按投料比吡虫啉∶3-巯基丙酸为1∶4将吡虫啉5.15g(20mmol)溶于20mL二甲亚砜,投入三口烧瓶中,再加入KOH 9.0g(160mmol),磁力搅拌使其溶解,称取β-巯基丙酸8.4g(80mmol)溶于40mL二甲亚砜并转移至恒压滴液漏斗中,将β-巯基丙酸溶液缓慢滴加到三口烧瓶中,并使油浴缓慢升温至100℃。保温2h后撤去油浴,待反应液自然冷却至室温后,加入60mL水,以稀盐酸调节pH值为3.0~5.0;用二氯甲烷3×30ml提取,收集有机相,用水3×15ml洗涤有机相,无水硫酸钠干燥、浓缩,得少量白色固体。
实施例4:人工抗原的合成
免疫原的制备:免疫原的合成利用碳二亚胺法:60μmol吡虫啉半抗原IM,用1mLN,N-二甲基甲酰胺溶解,然后在该溶液中加入等当量的二环已基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺溶解,在室温下反应过夜。经离心(4000rpm),取上清液450μL加入到6mL 15mg/mL的牛血清蛋白碳酸盐缓冲溶液中,缓慢加入时应缓慢,搅拌反应4小时,然后装入透析袋,先用蒸馏水透析2~4次(每隔4小时换液一次),然后在0.01M磷酸盐缓冲溶液中透析3天,分装保存于-20℃的冰箱中。
包被抗原制备:包被抗原的合成利用混合酸酐法:80μmol吡虫啉半抗原(IM)用1m 1N,N-二甲基甲酰胺溶解,然后加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯,室温下搅拌反应1h。取反应液400ul缓慢加入8ml 15mg/ml的OVA溶液(pH9.0,0.2mol/l的碳酸盐缓冲溶液溶解),室温下搅拌反应2h后,装入透析袋,先用蒸馏水透析2~4次(每隔4小时换液一次),然后在0.01M磷酸盐缓冲溶液中透析3天,分装保存于-20℃的冰箱中。
人工抗原结合比测定:将偶联物溶液适当稀释(0.01M pH7.4 PBS稀释),使其OD278在0.5~1.0之间,令同样配制0.5mg/ml载体蛋白溶液和0.05mg/ml的半抗原溶液(稀释液用1%的甲醇),以稀释液做空白,分别对蛋白质溶液、半抗原溶液、偶联物溶液进行紫外扫描,结果表明偶联物IM-BSA和IM-OVA分别在270nm和277nm处出现最大吸收峰,与IM、BSA和OVA的吸收峰相比,发生了明显的变化,表明人工抗原IM-BSA和IM-OVA的合成是成功的。并经计算结果如下:
IM-BSA 31∶1 IM-OVA 10∶1。
实施例5:抗体的制备
5.1免疫动物制备抗血清
实验选用半周岁左右,体重为2-3公斤,健康的雄性家兔。每种免疫原免疫三只兔子。实验免疫剂量基础免疫为0.5mg/kg,加强免疫剂量为0.8mg/kg,用生理盐水分别稀释适量IM-BSA复合物,加入等体积弗氏完全佐剂(加强免疫时采用弗氏不完全佐剂),充分乳化,直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。背部皮下免疫6点,大腿肌肉注射2点,4周后进行加强免疫,以后每隔2周再次加强免疫。从第三次免疫开始,每次免疫后第8天,从兔子心脏或耳缘静脉采血,测定效价和特异性。
待免疫血清效价上去后,就可进行采血。本实验采用心脏取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后,先待收集在三角烧瓶中的血液凝固后,然后用接种针沿三角烧瓶边缘将血块与玻璃脱离,放置于37℃温箱中半小时,再放到4℃冰箱中3小时,待血块收缩后,用毛细吸管将血清吸入试管中,以3000rpm离心15分钟,分离出血清。
抗血清效价测定
两种免疫原复合物按常规方法各免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开始,在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血,血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。待第4次免疫时,兔子获得了高效价的抗体,抗血清的效价分别为1∶25600、1∶25600和1∶51200(指OD450nm值大于1.0)。
5.2抗体的纯化与鉴定
一般采用辛酸-硫酸铵盐析法,也可采用蛋白A柱层析。辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来中,上清中只有IgG。辛酸加入因抗体的来源不同而不同,人血清为70ul/ml,兔血清为75ul/ml,小鼠血清为40ul/ml,小鼠腹水为33ul/ml。这种方法IgG的回收率达90%以上,具体操作如下:
(1)取抗血清用60mmol/LpH4.0的醋酸缓冲溶液按1∶4稀释,并用0.1mol/LNaOH调pH至4.5;
(2)在振荡下滴加辛酸(75ul/ml),室温搅拌30分钟,4℃静置小时,以10,000rpm离心30分钟;
(3)弃沉淀,取上清,加入0.1mol/LPBS,以1∶10稀释比加入,用1mol/LNaOH调pH至7.4,在4℃预冷15分钟;
(4)按每mL混合液0.277克加入硫酸铵,搅拌30分钟后置冰箱4℃静置2-3小时,12,000rpm离心20分钟,弃上清;
(5)沉淀用少量0.01mol/LPBS溶解,并在4℃pH7.4,0.01mol/LPBS(含少量EDTA)透析,直至全部SO4 2-或NH4 +被除去为止(当有SO4 2-时,加入1%BaCl2时产生白色沉淀;有NH4 +时加入奈氏试剂产生黄色沉淀);
(6)冷冻干燥;
注意事项:提取免疫球蛋白时,最好在2-4℃条件下进行,假如时间不长,也可在室温下进行,全部材料使用前均应冷却。
实施例6:吡虫啉酶联免疫分析方法的建立
6.1吡虫啉ELISA测定方法的原理
采用间接竞争酶联免疫分析方法。其原理是将农药分子与大分子载体(如蛋白质)偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体(96孔酶标板)上,制备成固相抗原,然后加入待测农药和相应抗体,固相抗原中的农药,待测农药,与抗体进行竞争结合反应,待测农药含量多,则被结合在固相抗原上的抗体少,反之结合在固相抗原的抗体多,反应后加入酶标二抗(只能与结合在固相抗原上的抗体相结合),最后用底物进行显色加以测定,当抗体量一定时,加入的待测农药量越多,与固相抗原结合的抗体就越少,发色反应就减弱,抑制率增高,反之,则发色反应增强,抑制率减低,因而可根据已知量农药的标准线和待检样品的抑制率,推算出待测农药的浓度。
6.2最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度的确定
用方阵滴定法,同时稀释抗血清和固相抗原包被液。在同一包被液浓度下,随着抗血清的稀释,所得的OD值呈下降趋势,同样在同一抗血清稀释浓度下,随着包被液浓度的下降,所得OD值也呈下降趋势。根据通常选择OD值为1.0(结合率=1.0)左右的抗血清和包被抗浓度作为工作浓度。
6.3工作曲线的制作
采用间接ELISA法测定吡虫啉对抗原抗体结合反应的抑制率,以抑制率为纵坐标,以吡虫啉浓度的对数为横坐标,建立吡虫啉对抗原抗体结合反应的抑制曲线和回归方程。根据回归方程计算出线性范围,及产生20%和50%抑制作用时所需的吡虫啉浓度。即I20和I50,以I20为方法的检测限。抑制率按以下式计算:
6.4抗体的特异性
用具有多种抗原决定簇的免疫原(蛋白质或多肽)制备的抗血清,其中含的抗体分子往往是混合体。当有甲、乙两种抗原,其分子结构中具有相同或部分相同的抗原决定簇时,甲抗原可与乙抗原的抗血清反应,而乙抗原也可与甲抗原抗血清反应,称为交叉反应。抗血清的特异性就是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应活性作为评价的重要标准。交叉反应越小,抗血清的特异性则越好。
将特异性抗原及其类似物做系列稀释,分别与同一种抗血清,按制作标准曲线同样方法制作标准曲线,并在曲线上找出抑制率50%的剂量和类似物抑制率50%时的用量。然后计算出各类似物的交叉反应率。
吡虫啉系氯化烟酰类杀虫剂,结构上类似化合物有吡虫清、烟碱、6-氯烟酸等、5-羟基吡虫啉和烯基吡虫啉等。所以选择以上类似物作亲和性和交叉反应率试验,经测定与烟碱、吡虫清、6-氯烟酸交叉反应率分别为0.5%、2%、4%,与5-羟基吡虫啉和烯基吡虫啉的交叉反应率分别为16%。和11%。由于半抗原IM与蛋白质结合的位点能够很好的突出农药的活性位置,从而抗IM-BSA抗体对各类似农药的交叉反应率均较小,仅仅与结构非常类似的化合物有较高的交叉反应率。从而可知,所制备的抗体的特异性均较强。
6.5样品测定
6.5.1回收率
在定量样品中添加一定量的农药标样,提取液作适当的稀释后用于ELISA分析,根据ELISA测得的OD值及抑制率从标准曲线上查得农药的含量,然后再换算得样品中农药的含量,进而计算回收率。回收率越高,则说明测得值与真值接近程度越好,方法越可靠;若回收率较低,则方法的可信度便较差。
精密度
6.5.2精密度(Precision)
是指方法的重复性。如果一个分析方法测定结果的重复性很差,就无法评价其灵敏度,特异性和准确度,也就无法得出令人信服的结果,在ELISA实验中,常采用批内和批间误差来表示其精密度。
1)批内误差:以标准曲线的批内平均变异系数来表示。
2)批间误差:以6块不同板上的测定结果进行平均,求得标准曲线12个剂量点的批间平均
变异系数即为批间变异系数。
从试验的结果可以看出,吡虫啉含量高的样品在测定过程中,其重复性较好,批内批间的变异也较小,且批内批间相差也较小。
实施例7:吡虫啉酶联免疫吸附测定方法建立
7.1间接ELISA法工作浓度的确定(用方阵滴定法)
1)包被
从低温冰箱中取出一管IM-OVA偶联复合物,使之完全解冻后,配制浓度为8μg/mL,然后倍比稀释4、2、1、0.5、0.25μg/mL。按方阵滴定法,每孔加入上面所配的抗原包被液100μL,于37℃温箱中温育2h。
2)封闭
取出包被好的微量反应板,然后用自动洗板机洗三遍(洗涤液用含0.05%吐温-20 0.01M PBS溶液),每孔加入2%的脱脂奶200μL,于37℃温箱中温育0.5h。
3)点板
用0.01M PBS配制抗体冻干粉溶液,浓度分别为4、2、1、0.5、0.25μg/mL。
取出经封闭的板然后,用自动洗板机洗三遍,按方阵滴定法,每孔加入100μL配制的抗体溶液,对照孔加入PBST 100μL。放入37℃温箱中温育1h,弃去孔内液体,用自动洗板机洗三遍。
4)加酶标二抗
每孔加入经1∶1000稀释的羊抗兔辣根过氧化物酶PBST溶液100μL,放入37℃温箱中1小时,用自动洗板机洗三遍。
5)显色
每孔加入底物邻苯二胺溶液(用柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液配制)100μL,37℃温箱中温育15min后用50μL 2M H2SO4终止反应。在酶联仪上测定490nm波长下的吸光值。
同一包被液浓度下,随着抗血清的稀释,所得的OD值呈下降趋势,同样在同一抗血清稀释浓度下,随着包被液浓度的下降,所得OD值也呈下降趋势。可知,当抗体冻干粉浓度为2μg/mL,包被抗原浓度为0.5μg/mL时OD值处于1.0左右,且根据通常选择1.0(结合率=1.0)左右的抗血清和包被抗浓度作为工作浓度,于是选择当抗体冻干粉浓度为2μg/mL,包被抗原浓度为0.5μg/mL作为最佳包被浓度。
7.2标准曲线的制备,其基本的操作步骤如下:
7.2.1包被
1)包被抗原溶液的配制
从低温冰箱中取出M-OVA偶联复合物,使之完全解冻后,稀释成相应工作浓度0.5μg/mL。
2)微量反应板的包被
96孔聚苯乙烯微量反应板用蒸馏水洗涤后,每孔加入上面所配的抗原包被液100μL,于37℃温箱中温育2h。
7.2.2微量反应板的封闭
取出包被好的微量反应板,然后用自动洗板机洗三遍(洗涤液用含0.05%吐温-20 0.01M PBS溶液),每孔加入2%的脱脂奶200μL,于37℃温箱中温育0.5h。
7.2.3点板
1)配制吡虫啉的标准溶液
由于吡虫啉在水中的溶液度大于500ppm,直接用双蒸水配制系列浓度吡虫啉标样(作倍比稀释,稀释成8个浓度)。
2)吡虫啉抗体溶液的配制
从冰箱中取出抗体冻干粉,用0.01M PBS缓冲液配制成响应工作浓度2μg/mL。
3)点板
取出经封闭的板,待板恢复室用自动洗板机洗板后,每孔加入经系列稀释制备出的吡虫啉各浓度标准液50μL,再加入抗血清稀释液50μL,对照孔加入PBST50μL和抗血清稀释液50μL,在微量振荡器混匀2分钟,然后放入37℃温箱中温育1h,待板恢复室温用洗板机洗板。
7.2.4加酶标二抗
每孔加入经1∶1000稀释的羊抗兔辣根过氧化物酶PBST溶液100μL,放入37℃温箱中1小时,待板恢复室温用洗板机洗板。
7.2.5显色
每孔加入底物邻苯二胺溶液(用柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液配制)100μL,37℃温箱中温育15min后用50μL 2M H2SO4终止反应。在酶联仪上测定490nm波长下的吸光值。根据抑制与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。
ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示,由公式计算得吡虫啉各浓度的抑制率作图。包被原和抗体浓度分别为0.5μg/ml与2μg/ml时,不同浓度吡虫啉对抗原抗体结合反应的抑制率曲线如附图,可知在1~103μg/ml吡虫啉浓度与抑制率有较好线性关系,线性方程为y=10.259Ln(x)+18.904相关系数为0.999,计算得I50=20.7μg/l和最低检测限(抑制率为20%时)I20=1.1μg/l。
实施例8:甘蓝样品快速测定
8.1提取方法
(1)将甘蓝样品切碎后,称14份,每份10g,分别装入三角瓶中。
(2)配制三个不同水平的吡虫啉丙酮溶液。药液浓度分别为100ppm、10ppm、1ppm,分别从中取0.5mL和1mL加入到样品中,重复二次,共12个样品,余下的二个作对照。
(3)2h后,在样品中加入50mL的丙酮放在国际型振荡器上振荡提取15分钟。
(4)振荡完毕后,提取液用布氏漏斗抽滤,用30mL的甲醇冲洗滤渣,抽滤完毕后,移入到250mL的平底烧瓶中。
(5)用旋转蒸发器浓缩至2mL左右,用氮吹仪吹干后用PBST定容至10mL。
8.2样品的ELISA法测定
方法同标准曲线的制作。已包被好的板每孔加入系列已知添加浓度的样品液50μL,再加配制好的抗体溶液50μL,对照孔加入100μL抗血清,盖好板,37℃温育2小时,弃去孔内液体,余后步骤同前。经分析可知,该方法的平均回收率为90.14%,平均变异系数为9.45%,且吡虫啉的添加量为0.050ppm以上时,方法的变异系数均小于10.00%,而小于0.050ppm时,方法的变异系数为10-20%之间。随着农药添加量的降低,回收率基本上也呈现下降的趋势。
在制作标准曲线时,得到的检测极限为0.001ppm,而在测定甘蓝样品的过程中,受到基质与测定环境的影响检测限有所下降0.005ppm,而用气相色谱对吡虫啉的检测限为0.02ppm,从而可知用ELISA分析方法来测定甘蓝中吡虫啉量是可行的。且与气相色谱相比,ELISA分析方法样品的前处理快捷简单,只用甲醇提取后浓缩定容即可进行检测,而用气相色谱法分析,样品前处理过程复杂,工作量大,所以建立吡虫啉的ELISA分析方法能够大大提高工作效率。
Claims (5)
1.一种吡虫啉人工半抗原,其特征在于它的化学名称为:1-(6-(2-羧乙基)硫代-3-吡啶甲基)-N-硝基-2-咪唑啉亚胺(简称IM),它的分子结构式为:
2.一种如权利要求1所述的吡虫啉人工半抗原1-(6-(2-羧乙基)硫代-3-吡啶甲基)-N-硝基-2-咪唑啉亚胺的制备方法,其特征在于:按投料比吡虫啉:3-巯基丙酸为1∶1~1∶4将吡虫啉溶于20~50mL二甲亚砜,再加入氢氧化钾1.0~3.5g,搅拌使其溶解,称取β-巯基丙酸溶于5~25mL二甲亚砜中并转移至恒压滴液漏斗中,将β-巯基丙酸溶液缓慢滴加到反应液中,缓慢升温至100℃,保温2h,待反应液自然冷却至室温后,加入20~60mL水,以稀盐酸调节pH值为3.0~5.0;用二氯甲烷3×30ml提取,收集有机相,用水3×15ml洗涤有机相,无水硫酸钠干燥、浓缩即可。
4.一种利用权利要求3所述的吡虫啉人工抗原,免疫动物制备的吡虫啉特异性抗体,其特征在于它是能与吡虫啉发生特异性免疫反应的免疫球蛋白。
5.一种如权利要求4所述的吡虫啉特异性抗体的用途,其特征在于:它用于检测食品、农产品和环境样品中吡虫啉的残留量。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200410018201 CN1569840A (zh) | 2004-04-30 | 2004-04-30 | 吡虫啉人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 200410018201 CN1569840A (zh) | 2004-04-30 | 2004-04-30 | 吡虫啉人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1569840A true CN1569840A (zh) | 2005-01-26 |
Family
ID=34479401
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 200410018201 Pending CN1569840A (zh) | 2004-04-30 | 2004-04-30 | 吡虫啉人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1569840A (zh) |
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101880325A (zh) * | 2010-06-22 | 2010-11-10 | 南京农业大学 | 一种应用于吡虫啉农药残留检测的单克隆抗体 |
CN102507930A (zh) * | 2011-11-07 | 2012-06-20 | 石洪波 | 一种快速检测痕量吡虫啉残留的试剂盒 |
CN103588661A (zh) * | 2012-08-17 | 2014-02-19 | 北京维德维康生物技术有限公司 | 尼卡巴嗪半抗原和人工抗原的制备 |
CN105301233A (zh) * | 2015-08-21 | 2016-02-03 | 贵州勤邦食品安全科学技术有限公司 | 检测茶叶中吡虫啉残留的酶联免疫试剂盒及使用方法 |
CN105510576A (zh) * | 2014-10-17 | 2016-04-20 | 镇江亿特生物科技发展有限公司 | 一种检测吡虫啉的化学发光酶联免疫分析法 |
CN105675874A (zh) * | 2016-01-11 | 2016-06-15 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种检测吡虫啉的胶体金试纸条及其应用 |
CN107805241A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-16 | 福建安欣睿捷生物科技有限公司 | 一种吡虫啉半抗原、完全抗原及制备方法和应用 |
CN109917126A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-06-21 | 成都市房屋安全事务中心((成都市白蚁防治研究中心)) | 一种检测吡虫啉的试纸条、吡虫啉半抗原的制备方法及检测吡虫啉残留的方法 |
CN113372328A (zh) * | 2021-07-08 | 2021-09-10 | 扬州大学 | 一种吡虫啉人工半抗原合成方法 |
CN114644572A (zh) * | 2022-03-22 | 2022-06-21 | 华南农业大学 | 一种溴己新半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 |
-
2004
- 2004-04-30 CN CN 200410018201 patent/CN1569840A/zh active Pending
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101880325A (zh) * | 2010-06-22 | 2010-11-10 | 南京农业大学 | 一种应用于吡虫啉农药残留检测的单克隆抗体 |
CN102507930A (zh) * | 2011-11-07 | 2012-06-20 | 石洪波 | 一种快速检测痕量吡虫啉残留的试剂盒 |
CN103588661A (zh) * | 2012-08-17 | 2014-02-19 | 北京维德维康生物技术有限公司 | 尼卡巴嗪半抗原和人工抗原的制备 |
CN105510576A (zh) * | 2014-10-17 | 2016-04-20 | 镇江亿特生物科技发展有限公司 | 一种检测吡虫啉的化学发光酶联免疫分析法 |
CN105301233A (zh) * | 2015-08-21 | 2016-02-03 | 贵州勤邦食品安全科学技术有限公司 | 检测茶叶中吡虫啉残留的酶联免疫试剂盒及使用方法 |
CN105675874A (zh) * | 2016-01-11 | 2016-06-15 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种检测吡虫啉的胶体金试纸条及其应用 |
CN107805241A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-16 | 福建安欣睿捷生物科技有限公司 | 一种吡虫啉半抗原、完全抗原及制备方法和应用 |
CN109917126A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-06-21 | 成都市房屋安全事务中心((成都市白蚁防治研究中心)) | 一种检测吡虫啉的试纸条、吡虫啉半抗原的制备方法及检测吡虫啉残留的方法 |
CN113372328A (zh) * | 2021-07-08 | 2021-09-10 | 扬州大学 | 一种吡虫啉人工半抗原合成方法 |
CN114644572A (zh) * | 2022-03-22 | 2022-06-21 | 华南农业大学 | 一种溴己新半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN1314707C (zh) | 2,4,6-三氯酚人工抗原、制备方法及其用途 | |
CN1413195A (zh) | 用于新烟碱基杀虫剂的免疫测定法 | |
CN1680407A (zh) | 三唑磷人工半抗原、抗原、抗体的制备方法 | |
CN1811443A (zh) | 一种检测19-去甲睾酮的方法及其专用酶联免疫试剂盒 | |
CN101245032A (zh) | 隐孔雀石绿半抗原及制备得到的抗体和抗体的应用 | |
CN1179966C (zh) | 毒死蜱人工半抗原、人工抗原、特异抗体制备方法及其用途 | |
CN113637081B (zh) | 一株分泌抗二甲戊灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 | |
CN1569840A (zh) | 吡虫啉人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途 | |
CN101100456A (zh) | 氟虫腈人工半抗原及合成方法、抗原和抗体及用途 | |
CN1153908A (zh) | 一种检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及其检测方法 | |
CN1240685C (zh) | 二氯喹啉酸人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途 | |
CN100340567C (zh) | 三唑磷人工半抗原、抗原、特异性抗体及其用途 | |
CN109824599B (zh) | 一种阿苯达唑半抗原及其制备方法和应用 | |
CN101135683B (zh) | 联苯菊酯抗原、抗体及其应用 | |
CN1687783A (zh) | 莱克多巴胺的亲和层析-酶联免疫检测方法及其专用试剂盒 | |
CN1680405A (zh) | 毒死蜱人工半抗原、抗原、抗体及用途、半抗原合成方法 | |
CN100340543C (zh) | 氰戊菊酯半抗原化合物、合成方法及其用途 | |
CN1696698A (zh) | Pat蛋白的亲和层析-酶联免疫检测方法及其专用试剂盒 | |
CN101412673A (zh) | 溴氰菊酯抗原、抗体及其应用 | |
CN101052877A (zh) | 环磷酰胺抗体和免疫测定 | |
CN110981875A (zh) | 一种阿托品半抗原及其合成方法、抗原、抗体和应用 | |
CN114031528B (zh) | 氟苯尼考半抗原、人工抗原、抗体及其合成方法和应用 | |
CN1811441A (zh) | 一种检测盐霉素的方法及其专用酶联免疫试剂盒 | |
CN102295698B (zh) | 环孢霉素a免疫原、特异性抗体、检测试剂及检测试剂盒 | |
CN113717950B (zh) | 一株分泌戊菌唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |