CN1680407A - 三唑磷人工半抗原、抗原、抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是关于三唑磷人工半抗原、人工抗原和特异性抗体的制备方法，属于农药免疫化学技术领域。以O－乙基硫代磷酰二氯为原料，与三唑磷的合成中间体1－苯基－1，2，4－三唑醇在催化剂作用下反应生成一氯物，一氯物与氨基丁酸在缚酸剂的作用下反应生成三唑磷半抗原TZLBu，一氯物与氨基己酸在缚酸剂的作用下反应生成TZLHe；以次为原料，然后通过碳二亚胺法和混合酸酐法与蛋白质分别偶联制备人工抗原。将人工抗原免疫动物后产生对三唑磷高亲合力的特异性抗体。这种抗体与其他化合物不易发生交叉反应。用该抗体建立的酶联免疫吸附分析法可用于快速、灵敏、方便、廉价地检测样本中痕量的三唑磷残留。

Description

三唑磷人工半抗原、抗原、抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及具有-COOH的、又最大可能包含三唑磷原有结构的化合物的三唑磷半抗原，以及相应的抗原、抗体的一种制备方法。

背景技术

本发明属于农药小分子化合物(分子量小于1000道尔顿)免疫化学和残留分析技术领域，涉及有机合成，免疫化学及生物化学等，依靠免疫学、免疫化学基本原理和生物技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应和易被检测识别的标记物的放大作用，定量地检测样本中超微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点，该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和人工全抗原及抗体的制备，因此，目标分析物分子免疫学特性以及如何通过化学或生化技术突出和利用这些特性是该领域极为重要的研究内容，这一技术目前已成为农药残留痕量分析研究的一个崭新领域，被列为当前优先研究、开发和利用的农药残留分析技术，世界粮农组织(FAO)已向许多国家推荐此项技术，美国化学将免疫分析与气相色谱，液相色谱共同列为农药残留分析的支柱技术。

免疫学基本原理认为：抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构，电荷、氢键及范德化引力作用等多种因素，具有极高特异性和灵敏性，遵循质量作用定律，不仅可在体内进行，也可体外进行，这些特点使其能被利用建立免疫分析方法：可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏度。并且，快速、简便，适于检测生物大分子，也可以检测复杂样本中小分子如农药等痕量组分，，然而，与大分子不同，小分子化合物免疫分析有自身特点：

1)分子量小于1000道尔顿的小分子化合物一般不具有免疫原性，不能直接免疫动物产生特异性抗体。绝大多数农药等小分子物质不具备与大分子载体如蛋白质等连接的基团，如-COOH、-NH₂、-OH、-SH等官能团，因此，必须合成突出分子立体结构特异性部位的半抗原，并与大分子载体连接构成有效的人工结合物，才能免疫动物产生针对这一目标小分子化合物的特异性抗体。这种半抗原与大分子载体的结合物称为人工抗原。人工抗原的制备不是任意的，包括结合位点、结合方式、载体种类及半抗原与目标分析物质任何结构上的差异，诸如分子大小、形状、成份、构型、构象、极性、电子云密度等等在内的拓扑性征，都可能极大地影响着相应抗体的性质^[6]。因此，它是决定产生其特异性抗体质量和建立免疫化学分析方法的关键。

2)虽然小分子化合物不具有免疫原性，但具有反应原性，即具有与相应抗体发生免疫学反应的能力，并可体外定量进行，遵循质量作用定律。如引入标记物放大显示这一反应，则其既具有免疫反应的特异性和灵敏性，又具有标记物易被识别和检测的双重特征，可分析环境、食品、人体液等复杂样本中超微量小分子化合物，具有较好的选择性，灵敏度。操作简单快速、成本低廉。

3)基于抗原抗体免疫反应检测小分子化合物的分析技术目前多采用酶免疫分析(EIA)。EIA利用酶促反应显示抗原抗体的定量结合，操作简单，又具有相当的灵敏度，近年来发展很快。这些技术使农药残留分析在方法上获得更大的生命力，对快速分析缺乏检测活性或样本基质过于复杂，因而用普通理化方法难以分析的农药残留，具有相当的应用价值。

影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的选择性(或特异性)与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此，免疫半抗原的分子设计与合成是建立小分子免疫化学分析的关键步骤。分子是构成物质的基础结构，化合物内部分子结构特征及分子间的组合方式等结构信息决定了化合物所表现的性质，也就是说，化合物的理化性质，生物活性及免疫原性等都是以分子为主体来表示和解释的。拓扑学参数直接产生于化合物的分子结构，它是从化合物分子结构的直观概念出发采用图论的方法以数量来表征分子结构，如Winer指数，Randic指数，Hosoya指数和Balaban指数等。这些拓扑指数可以反应分子中键的性质，原子间的结合顺序，分支的多少及分子的形状等拓扑信息，根据这些信息，就可能推测出分子的某些性质、活性。在拓扑学方法中，目前最为常用的是分子连接性指数法(MCI)，它是由Kier和Hall等人根据拓扑理论，在Randic分支指数基础上发展起来的一种新的拓扑方法，它通过对分子中各原子点价(δ)的计算得到MCI指数。由于该法完全以分子结构为基础，并且有计算简便、准确等优点，MCI法已被广泛地应用于有机物理化参数(如Kow，S)，环境参数(如Koc，BCF)以及生物毒性的预测中。但是，当所研究化合物的种类比较复杂，不仅包括疏水性物质还包括有亲水性物质时，仅用简单的连接性指数往往不能得到满意的结果。非色散力因子(△X^V)是由简单分子连接性指数演化而来，Bahnick等成功地应用△X^V对大量不同种类有机物质的K_oc值进行了预测，张育红等也应用△X^V对部分取代芳烃对绿藻的毒性进行了成功的预测。然而，将MCI法和非色散力因子(△X^V)应用于农药半抗原分子设计及其免疫识别预测能力方面的研究还没有见报道。

目前，尚未有专门关于半抗原分子设计及其免疫识别机制研究的论述或专著。一般而论，半抗原的分子设计应考虑两方面的因素：第一，能否刺激机体产生免疫应答；第二，产生的抗体能否具有预期的活性，即其免疫识别能否达到预期的效果。“理想的”半抗原首先应包括尽可能多的待测分析物的特征化学结构，特别是立体化学结构，如果特征化学结构稍有变化或缺失，将对人工抗原和相应抗体的特异性反应产生重大影响；其次，“理想的”半抗原应有一个便于抗体对靶结构识别的柄(或间隔臂)，以便分子的特异性结构能够得到最大限度暴露于载体表面，从而保留特异性，对于间隔臂通常应考虑其长度、极性和位置。机体的免疫系统对载体远端的半抗原结构部分识别最强，所以在免疫半抗原分子的设计中间隔臂的位置(或位点)的选择十分重要；最后，“理想的”半抗原应具有与载体蛋白质等偶联的功能团，如-COOH、-NH₂、-OH、-SH等官能团。总体上讲，不同的农药，半抗原分子设计是不同的，同一种农药，半抗原的分子设计也可以从多种“位点”出发，设计出不同结构的半抗原，分别制备出相应的多克隆抗体，因为半抗原结构不同，制备出的抗体对同一种农药的识别也不同。

就半抗原分子的免疫识别机制而言，一般从以下几个方面来进行评价：

1)同源分析(Homologous Assays)，即用同一种半抗原制备的人工抗原与相应的抗体进行免疫分析。针对同一种农药，不同半抗原分子设计模式所得的抗体与抗原在相同条件下反应，抑制该反应所需的农药量越少，则此种抗体对待分析的农药亲和力越大，它对待分析的农药的特异性越强，即该半抗原分子设计模式最佳。

2)异源分析(Heterologous Assays)，即用同一种分析物不同的半抗原所得的抗体分别与不同半抗原所制备的人工抗原进行免疫分析。1991年，Harrison等指出，在竞争反应条件相同时，异源分析有助于提高免疫化学分析的灵敏度。1995年Marco等研究指出，适当的异源分析可以从三个不同的方面来进行分析，即半抗原本身、位点及间隔臂长度，来考查它们识别半抗原与待测农药的能力。

3)特异性分析(Specificity Assays)，结合同源分析，选择亲和力较强的抗体，建立交叉反应分析，如果待测农药的抑制中浓度越小，则它的特异性越强。

三唑磷[triazophos，O，O-二乙基-O-(1-苯基-1，2，4-三唑-3-基)硫代磷酸酯，作为甲胺磷等高毒农药的替代品种，近年来被广泛应用于果树、蔬菜、谷物、茶叶等作物上鳞翅目害虫、螨类、线虫等的防治，也是长江流域防治水稻螟虫不可替代的农药品种。三唑磷原药属中等毒性，对鱼、蜜蜂有毒害作用。由于三唑磷在农业生产上的广泛使用，其在作物及环境中的残留问题也逐渐受到人们的重视。

检测三唑磷残留量常规方法为气相色谱法(GC)。然而该方法需要大多数实验室所不具备的复杂的仪器，且过程繁琐，不适合大批量样品的筛选检测。免疫分析为三唑磷残留研究提供了一个新的快速检测途径。本发明的目的即是通过设计合成三唑磷半抗原和人工抗原，免疫动物产生特异性抗体，以抗原抗体特异性免疫学反应为基础，引入标记物来放大显示这一反应，则可用于样本测定。其选择性取决于免疫学反应的特异性，其灵敏度取决于抗体的亲合性和标记物的可检性。因此，可快速准确地检测三唑磷在样本中的残留量。这种方法灵敏度高、特异性强，样品前处理简单，便于进行现场监控，可以与常规方法互为补充。本研究拟利用三唑磷半抗原，通过设计合成三唑磷将半抗原与载体蛋白偶联得到人工抗原，免疫动物从而产生抗三唑磷多克隆抗体，为建立三唑磷的ELISA分析方法奠定基础。

农药小分子必须与大分子物质连接后才能刺激动物产生特异性抗体，这已成为小分子免疫分析的基本模式。因此，半抗原的合成与鉴定试验是产生特异性抗体和建立农药残留快速检测技术研究最基础和最关键的步骤。理想的半抗原一方面应具备待测物的特征结构，特别是立体化学特征，另一方面半抗原与载体连接后应保证待测物的特征结构能最大程度地为免疫活性细胞识别和结合，以制备出具有预期选择性的抗体。①半抗原通常由待测物衍生化制备，或由原料合成，待测物的代谢或降解产物往往是有用的半抗原；②除待测物特征结构外，在半抗原的未端需有可直接或间接与载体蛋白质偶联的活性基团；③在活性基团与载体之间，必须有一定长度的间隔臂，以便使半抗原突出于载体表面，易为有机免疫系统识别；④间隔臂应远离待测物的特征结构部分和官能团；⑤半抗原的设计应考虑到农药原药和有毒理学意义的代谢物，以及测定对象是单一的农药或某一类农药；⑥机体的免疫应答是个十分复杂的生化过程，半抗原诱导的抗体的选择性和亲合性尚难预测，多数情况下宜合成几种结构的半抗原进行研究。

基于三唑磷苯基三唑环结构是其活性官能团，以三氯硫磷等为原料，经过三步反应，分别与2-氨基乙酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸和9-氨基壬酸反应，引入不同的“连接臂”合成了半抗原2-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-乙酸(简称TZLAc)、4-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-丁酸(简称TZLBu)、半抗原6-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-己酸(简称TZLHe)和9-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-壬酸(简称TZLNe)。最大可能保留了原来三唑磷的分子结构，使三唑磷分子的化学结构与电子分布几乎不受影响，这为获得对三唑磷有高度特异性的抗体提供了保证。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种能最大程度保留了三唑磷的化学结构、又具有可调节长度的连接臂的半抗原的制备方法，以及相应的抗原的制备方法，和相应的检测灵敏度高、特异性强的抗体的制备方法。

本发明为达到以上目的，总体技术方案如下：本发明的半抗原以三氯硫磷为起始原料，先与无水乙醇反应生成O-乙基硫代磷酰二氯(TZLM-1)，再与三唑磷中间体1-苯基-1，2，4-三唑醇反应生成O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰一氯(简称TZLM-2)，最后与氨基酸反应生成三唑磷半抗原(n+1)-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-(n+1)酸(简称TZL-Hap)。反应式如下：

本发明的三唑磷半抗原化合物(TZL-Hap)的合成方法进一步描述如下：

1)、三氯硫磷(PSCl₃)与无水乙醇，采用先滴加后反应的步骤反应1～10小时生成化合物O-乙基硫代磷酰二氯(TZLM-1)，其中三氯硫磷与无水乙醇的克分子比为1∶1～10，滴加温度为-30～0℃，反应温度为-20～15℃。反应中严格控制滴加速度，使反应液温度不超过0℃。反应完毕后用蒸馏水洗涤反应液，分出油层用无水硫酸钠干燥、减压蒸馏收集65-75℃的馏分，即为TZLM-1。

2)、化合物TZLM-1与1-苯基-1，2，4-三唑醇在极性溶剂、缚酸剂存在下反应生成化合物O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰一氯(简称TZLM-2)，投料比TZLM-1∶1-苯基-1，2，4-三唑醇＝1∶0.5～1∶3(克分子比)，反应温度为-20～30℃，反应时间为0.5～3.0小时。

3)、(n+1)-氨基酸溶解于碱性溶液中，搅拌下缓慢加入溶解于极性溶剂的TZLM-2溶液，滴加NaOH水溶液，反应生成化合物三唑磷半抗原(n+1)-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-(n+1)酸(简称TZL-Hap)，(n+1)-氨基酸与TZLM-2的克分子比为1∶0.5-6，反应温度为-10～40℃，反应时间为1～5小时。

上述方法制得的三唑磷半抗原，具有三唑磷特征结构同时又具有可以与蛋白质偶联的-COOH结构，分子式如下：

其中n＝1～10。

作为本发明的三唑磷半抗原的合成方法的改进：步骤2)中所述缚酸剂是吡啶、三乙胺(TEA)、N，N-二甲基苯胺、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、或碳酸钾。步骤3)的反应完成后，再滴加NaOH调节反应液pH为8～12，然后用石油醚洗涤，再用盐酸调节pH在2～7，用极性溶剂提取，再将所述提取液进行浓缩。步骤2)中所述极性溶剂是低级链醇、乙醚、醋酸、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷(DCM)、四氢呋喃、丙酮、二氧六环或吡啶。

作为本发明的三唑磷半抗原的合成方法的进一步改进：将步骤3)所得的三唑磷半抗原(n+1)-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-(n+1)酸，用乙酸乙酯-石油醚重结晶。

本发明还提供了一种三唑磷人工抗原的制备方法，将三唑磷半抗原(n+1)-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-(n+1)酸，溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，然后在上述溶液中加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜后，离心，取上清液加入到载体蛋白碳酸盐缓冲溶液中反应；或者将三唑磷半抗原(n+1)-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-(n+1)酸，溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室温搅拌反应1h，取部分反应液缓慢滴加到载体蛋白的碳酸盐缓冲溶液中反应；待上述反应完成后，透析，分装保存于-20℃的冰箱中。

上述方法制得的三唑磷抗原，分子结构式为：

其中n＝1～10。

本发明还提供了一种利用上述三唑磷人工抗原制备三唑磷特异抗体的方法，依次包括以下步骤：

(1)实验选用健康的雄性家兔或者小鼠，实验免疫剂量基础免疫为0.25～2.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5～2.0mg/kg，用生理盐水分别稀释适量三唑磷人工免疫抗原，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法，背部皮下免疫4～6点，大腿肌肉注射2～4点，3～4周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂，从第三次免疫开始，每次免疫后第8～10天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性，待免疫血清效价合格后，就可进行采血，分离出抗血清；

(2)采用辛酸-硫酸铵盐析法，或者采用蛋白A柱层析得到抗血清中的免疫球蛋白质G。

用本发明的方法制备三唑磷半抗原，设计的位点在三唑磷分子结构中-OC₂H₅位置，把-OC₂H₅通过化学合成改造成-NH(CH₂)nCOOH；使得制成的三唑磷半抗原具有一定的可长可短的连接臂(通过控制n的大小)，同时又具有可以与蛋白质偶联的-COOH；为国内外首创的新化合物，最大程度的保留了三唑磷的化学结构，又具有可调节长度的连接臂。

用本发明的方法进一步制备的抗原、抗体，所得抗体的效价、特异性、亲和力都比较好，尤其是n＝5时，所得抗体用于ELISA方法检测三唑磷，最低检测限可达0.9ug/L(0.0009ppm)，与其他有机磷农药的交叉反应率都很低，灵敏度很高。

具体实施方式

实施例1

1、三唑磷人工半抗原合成方法如下：

1)O-乙基硫代磷酰二氯(TZLM-1)的合成

称取三氯硫磷(PSCl₃)68g(约0.4mol)置于带有低温温度计的三口烧瓶中，以冰盐水浴将其冷却至-10～-5℃，在剧烈搅拌下滴加入无水乙醇18.4g(约0.4mol)，严格控制滴加速度，使反应液温度始终处于-30～0℃。滴加完毕后在-20～10℃继续反应1h。反应完，以(0±5)℃蒸馏水洗涤反应液(100ml×2)，分出油层并以无水Na₂SO₄干燥，再经水泵减压蒸馏，收集65～75℃馏分，得到28.5g无色透明油状液体(收率40％，以三氯硫磷计)。

2)O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰一氯(TZLM-2)的合成

称取TZM-1 0.2mol(约36g)置于250ml三口烧瓶中，按照投料比(克分子比)TZM-1∶1-苯基-1，2，4-三唑醇＝1∶0.5，在搅拌下加入1-苯基-1，2，4-三唑醇0.1mol，再加入15～30ml TEA和80～120ml二氯甲烷。待固体全部溶解后，用冰水浴将该溶液降温至-20～20℃，逐滴加入55ml 2mol/L的NaOH水溶液，继续反应0.5h。反应完毕后，加入50ml5％NaOH冰水溶液，振荡后分出水层，油层以冰水洗涤至中性，再经无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩，得少量棕色油状物，该油状物用石油醚萃取(50ml×2)，提取液再减压浓缩，得7.06g黄色液体(收率23.3％，以1-苯基-1，2，4-三唑醇计)。

3)三唑磷半抗原2-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-乙酸(简称TZLAc)的合成(n＝1)

称取0.75g(约10mmol)2-氨基乙酸，溶解于10ml NaOH溶液(1mol/L)中，置于250ml三口烧瓶中，冰水浴冷却至0-10℃，搅拌下缓慢加入1.51g(约5mmol)溶解于10ml二氧六环的TZLM-2溶液，滴加10ml NaOH水溶液(1mol/L)，10～20℃下反应2h。反应完毕后，加入5％NaOH冰水溶液，调节反应液的pH约为8～10，再用石油醚洗涤上述混合液(40ml×2)，弃石油醚层，以2mol/L HCl调节水相pH约为3，再以乙酸乙酯萃取(40ml×2)，提取液用少量水洗涤后经无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩，残余物于4℃密封存放过夜，有无色晶体析出。以乙酸乙酯-石油醚重结晶，过滤，干燥，得到0.936白色固体(收率54.7％，以一氯中间体计)。

产物(TZLAc)的鉴定

取上述合成的产物分别经ESI测定其分子结构。质谱(MS，+cESI)测定结果：m/z为343，相对丰度100％，应为TZLAc的准分子离子峰[M+1]⁺。

所得的三唑磷人工半抗原，分子结构式为(此时n＝1)：

2、三唑磷人工抗原合成方法如下：

1)免疫原的合成与纯化

免疫原的合成利用碳二亚胺法。将50～80微摩尔半抗原TZLAc，溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，让其在室温下反应过夜后，离心，取上清液500～800μL加入到4～8mL15～20mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸盐缓冲溶液中，加入时应缓慢，然后在伴有磁力搅拌情况下反应4～6小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析3天，分装保存于-20℃的冰箱中。

人工抗原的鉴定：

按合成三唑磷免疫抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外(200nm～400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。经计算结果如下：半抗原TZLAc与BSA的结合比为15.1∶1。

2)包被抗原的合成

包被抗原的合成利用混合酸酐法。将50～80微摩尔半抗原TZLAc，溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，让其在室温下反应1小时后，取500～800μL反应液加入到4～8mL15～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，加入时应缓慢，然后在伴有磁力搅拌情况下反应2～6小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析3天，分装保存于-20℃的冰箱中。

人工抗原的鉴定

按合成三唑磷包被抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外(200nm～400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。经计算结果如下：半抗原TZLAc与OVA的结合比为7.5∶1。

所得的三唑磷人工抗原，分子结构式为(此时n＝1)：

3、抗体的制备

免疫动物制备抗血清：

实验选用半周岁左右，体重为2～3公斤，健康的雄性家兔。每种免疫原免疫三只兔子(由浙江省中医学院负责兔子的饲养工作)，分别编号为兔子1～3。

实验免疫剂量基础免疫为0.5～1.0mg/kg，加强免疫剂量为1.0～1.5mg/kg，用生理盐水稀释适量TZLBu-BSA，加入等体积弗氏完全佐剂(加强免疫时采用弗氏不完全佐剂)，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。背部皮下免疫6点，大腿肌肉注射2点，3周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后第8天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。

待免疫血清效价上去后，就可进行采血。本实验采用心脏取血法。采血后，将采血瓶放置于37℃温箱中半小时，待瓶中的血液凝固，然后用接种针沿瓶内壁将血块与玻璃脱离，再放到4℃冰箱中3～4小时，待血块收缩后，用毛细吸管将血清吸入试管中，离心，分离出血清。

抗体的纯化：

一般采用辛酸-硫酸铵盐析法，也可采用蛋白A柱层析法。辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗体的来源不同而不同，人血清为70ul/ml，兔血清为75ul/ml，小鼠血清为40ul/ml，小鼠腹水为33ul/ml。这种方法IgG的回收率达90％以上。最后将抗体制成冻干粉，分装，-20℃保存。

抗血清效价测定：

免疫原复合物按常规方法免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。第5次免疫后，兔子获得了高效价的抗体，抗血清的效价为1∶25600(指OD_490nm值等于1.0)。

抗体的特异性

用具有多种抗原决定簇的免疫原(蛋白质或多肽)制备的抗体，其中含的抗体分子往往是混合体。当有甲、乙两种抗原，其分子结构中具有相同或部分相同的抗原决定簇时，甲抗原可与乙抗原的抗体反应，而乙抗原也可与甲抗原抗体反应，称为交叉反应。抗体的特异性就是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应活性作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越好。

将特异性抗原及其类似物做系列稀释，分别与同一种TZLAc-BSA抗体，按制作标准曲线同样方法制作标准曲线，并在曲线上找出抑制率50％的剂量和类似物抑制率50％时的用量。然后计算出各类似物的交叉反应率。

抗TZLAc-BSA抗体对各类似物的交叉反应率：

二嗪磷为0.54％，对硫磷为0.09％，毒死蜱为0.033％，杀螟硫磷为0.074％，马拉硫磷为＜0.01％。从而可知，所制备的抗体的特异性均较强。

实施例2

1、三唑磷人工半抗原合成方法如下：

1)O-乙基硫代磷酰二氯(TZLM-1)的合成

称取三氯硫磷(PSCl₃)68g(约0.4mol)置于带有低温温度计的三口烧瓶中，以冰盐水浴将其冷却至-10～-5℃，在剧烈搅拌下滴加入无水乙醇55g(约1.2mol)，严格控制滴加速度，使反应液温度始终处于-30～0℃。滴加完毕后在-20～10℃继续反应2h。反应完毕，以(0±5)℃蒸馏水洗涤反应液(100ml×2)，分出油层并以无水Na₂SO₄干燥，再经水泵减压蒸馏，收集65～75℃馏分，得到51.8g无色透明油状液体(收率72.3％，以三氯硫磷计)。

2)O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰一氯(TZLM-2)的合成

称取TZM-1 0.2mol(约36g)置于250ml三口烧瓶中，按照投料比(克分子比)TZM-1∶1-苯基-1，2，4-三唑醇＝1∶1，在搅拌下加入1-苯基-1，2，4-三唑醇0.2mol，再加入15～30ml TEA和80～120ml二氯甲烷。待固体全部溶解后，用冰水浴将该溶液降温至-20～20℃以下，逐滴加入55ml 2mol/L的NaOH水溶液，继续反应1h。反应完毕后，加入50ml5％NaOH冰水溶液，振荡后分出水层，油层以冰水洗涤至中性，再经无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩，得少量棕色油状物，该油状物用石油醚萃取(50ml×2)，提取液再减压浓缩，得10.6g黄色液体(收率35％，以1-苯基-1，2，4-三唑醇计)。

3)三唑磷半抗原4-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-丁酸(简称TZLBu)的合成(n＝3)

称取1.03g(约10mmol)4-氨基丁酸，溶解于10ml NaOH溶液(1mol/L)中，置于250ml三口烧瓶中，冰水浴冷却至0-10℃，搅拌下缓慢加入1.51g(约5mmol)溶解于10ml二氧六环的TZLM-2溶液，同时滴加NaOH水溶液(1mol/L)，在20～30℃下反应3h。反应完毕后，加入5％NaOH冰水溶液，调节反应液的pH约为8～10，再用石油醚洗涤上述混合液(40ml×2)，弃石油醚层，以2mol/L HCl调节水相pH约为3，再以乙酸乙酯萃取(40ml×2)，提取液用少量水洗涤后经无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩，残余物于4℃密封存放过夜，有无色晶体析出。以乙酸乙酯-石油醚重结晶，过滤，干燥，得1.01g白色固体(收率54％，以一氯中间体计)。

产物(TZLBu)的鉴定：

取上述合成的产物分别经MS和¹H-NMR测定其分子结构。质谱(MS，+c ESI)测定结果：m/z为371，相对丰度100％，应为TZLBu的准分子离子峰[M+1]⁺。

核磁共振(¹H-NMR，400MHz，CDCl₃)试验结果：δ1.32(t，3H，J＝6.8，-CH₂CH₃)；2.26(m，2H，-CH₂CH₂CH₂)；2.30(t，2H，-CH₂COOH)，3.00(m，2H，-NHCH₂)，4.16(m，2H，-OCH₂CH₃)，6.04(m，1H，-NH)，7.41(m，1H，-ArH)；7.55(m，2H，-ArH)；7.79(d，2H，J＝8.4，-ArH)。

所得的三唑磷人工半抗原，分子结构式为(此时n＝3)：

2、三唑磷人工抗原的合成方法如下：

1)、免疫原的合成与纯化

采用碳二亚胺法，将50～80微摩尔半抗原TZLBu，溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，让其在室温下反应过夜后，离心，取上清液500～800μL缓慢滴加到4～8mL15～20mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸盐缓冲溶液中，然后在伴有磁力搅拌情况下反应4～6小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析3天，分装保存于-20℃的冰箱中。

人工抗原的鉴定：

按合成三唑磷免疫抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外(200nm～400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。经计算结果如下：半抗原TZLBu与BSA的结合比为14.6∶1。

2)、包被抗原的合成

采用混合酸酐法，将50～80微摩尔半抗原TZLBu，溶解在1～2mL的N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，让其在室温下反应1小时后，取500～800μL反应液加入到4～8mL15～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸盐缓冲溶液中，加入时应缓慢，然后在伴有磁力搅拌情况下反应4～6小时，待反应完成后，装入透析袋，先用蒸馏水透析2～4次，然后用生理盐水透析3天，分装保存于-20℃的冰箱中。

人工抗原的鉴定

按合成三唑磷包被抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外(200nm～400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。经计算结果如下：半抗原TZLBu与OVA的结合比为12.8∶1。

制成的三唑磷人工抗原，分子结构式为(此时n＝3)：

3、抗体的制备

免疫动物制备抗血清：

实验选用半周岁左右，体重为2～3公斤，健康的雄性家兔。每种免疫原免疫三只兔子(由浙江省中医学院负责兔子的饲养工作)，分别编号为兔子1～3。

实验免疫剂量基础免疫为0.5～1.0mg/kg，加强免疫剂量为1.0～1.5mg/kg，用生理盐水稀释适量TZLBu-BSA，加入等体积弗氏完全佐剂(加强免疫时采用弗氏不完全佐剂)，充分乳化，直至滴入水中乳滴不分散。采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法。背部皮下免疫6点，大腿肌肉注射2点，3周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后第8天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性。

待免疫血清效价上去后，就可进行采血。本实验采用心脏取血法。采血后，将采血瓶放置于37℃温箱中半小时，待瓶中的血液凝固，然后用接种针沿瓶内壁将血块与玻璃脱离，再放到4℃冰箱中3～4小时，待血块收缩后，用毛细吸管将血清吸入试管中，离心，分离出血清。

抗体的纯化：

一般采用辛酸-硫酸铵盐析法，也可采用蛋白A柱层析法。辛酸-硫酸铵盐析法是一个经典的方法。辛酸在偏酸性的条件下能将血清中除IgG以外的蛋白质都沉淀下来中，上清中只有IgG。辛酸加入因抗体的来源不同而不同，人血清为70ul/ml，兔血清为75ul/ml，小鼠血清为40ul/ml，小鼠腹水为33ul/ml。这种方法IgG的回收率达90％以上。最后将抗体制成冻干粉，分装，-20℃保存。

抗血清效价测定：

免疫原复合物按常规方法免疫了三只兔子。从加强免疫第二次开始，在每次免疫后第8天于兔子耳缘静脉采血，血清经适当稀释后用间接ELISA测定效价。第5次免疫后，兔子获得了高效价的抗体，抗血清的效价为1∶102400(指OD_490nm值等于1.0)。

抗体的特异性

用具有多种抗原决定簇的免疫原(蛋白质或多肽)制备的抗体，其中含的抗体分子往往是混合体。当有甲、乙两种抗原，其分子结构中具有相同或部分相同的抗原决定簇时，甲抗原可与乙抗原的抗体反应，而乙抗原也可与甲抗原抗体反应，称为交叉反应。抗体的特异性就是指它同特异性抗原结合的能力与同该抗原类似物结合能力的比较。常用交叉反应活性作为评价的重要标准。交叉反应越小，抗体的特异性则越好。

将特异性抗原及其类似物做系列稀释，分别与同一种TZLBu-BSA抗体，按制作标准曲线同样方法制作标准曲线，并在曲线上找出抑制率50％的剂量和类似物抑制率50％时的用量。然后计算出各类似物的交叉反应率。

抗TZLBu-BSA抗体对各类似物的交叉反应率：二嗪磷为0.02％，对硫磷为＜0.01％，毒死蜱为＜0.01％，杀螟硫磷为＜0.01％，马拉硫磷为＜0.01％。从而可知，所制备的抗体的特异性均较强。

实施例3

1、三唑磷人工半抗原的合成方法如下：

1)O-乙基硫代磷酰二氯(TZLM-1)的合成

称取三氯硫磷(PSCl₃)68g(约0.4mol)置于带有低温温度计的三口烧瓶中，以冰盐水浴将其冷却至-10～-5℃，在剧烈搅拌下滴加入无水乙醇92g(约2.0mol)，严格控制滴加速度，使反应液温度始终处于-30～0℃。滴加完毕后在-20～10℃继续反应5h。反应完后，以(0±5)℃蒸馏水洗涤反应液(100ml×2)，分出油层并以无水Na₂SO₄干燥，再经水泵减压蒸馏，收集65～75℃馏分，得到57.0g无色透明油状液体(收率79.53％，以三氯硫磷计)。

2)O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰一氯(TZLM-2)的合成

称取TZM-1 0.2mol(约36g)置于250ml三口烧瓶中，按照投料比(克分子比)TZM-1∶1-苯基-1，2，4-三唑醇＝1∶2，在搅拌下加入1-苯基-1，2，4-三唑醇0.4mol，再加入15～30ml TEA和80～120ml二氯甲烷。待固体全部溶解后，用冰水浴将该溶液降温至-20～20℃以下，逐滴加入55ml 2mol/L的NaOH水溶液，继续反应1h。反应完毕后，加入50ml5％NaOH冰水溶液，振荡后分出水层，油层以冰水洗涤至中性，再经无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩，得少量棕色油状物，该油状物用石油醚萃取(50ml×2)，提取液再减压浓缩，得9.12g黄色液体(收率45％，以1-苯基-1，2，4-三唑醇计)。

3)三唑磷半抗原6-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-己酸(简称TZLHe，n＝5)合成

称取1.31g(约10mmol)6-氨基己酸，溶解于10ml NaOH溶液(1mol/L)中，置于250ml三口烧瓶中，冰水浴冷却至0-10℃，搅拌下缓慢加入6.04g(约20mmol)溶解于10ml二氧六环的TZLM-2溶液，滴加10ml NaOH水溶液(1mol/L)，在20～30℃下反应4h。反应完毕后，加入5％NaOH冰水溶液，调节反应液的pH约为8～10。，再用石油醚洗涤上述混合液(40ml×2)，弃石油醚层，以2mol/L HCl调节水相pH约为3，再以乙酸乙酯萃取(40ml×2)，提取液用少量水洗涤后经无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩，残余物于4℃密封存放过夜，有无色晶体析出。以乙酸乙酯-石油醚重结晶，过滤，干燥，得1.22g白色固体(收率60.8％，以一氯中间体计)。

半抗原(TZLHe)的鉴定：

质谱(MS，+cESI)测定结果：m/z为399，相对丰度100％，应为TZLHe的准分子离子峰[M+1]⁺。

核磁共振(¹H-NMR，400MHz，CDCl₃)试验结果：δ1.30(m，5H，-OCH₂CH₃，-CH₂)；1.48(m，4H，-2CH₂))；2.18(t，2H，J＝7.2，-CH₂COOH)，3.00(m，2H，-NHCH₂)，4.19(m，2H，-OCH₂CH₃)，5.94(m，1H，-NH)，7.41(m，1H，J＝7.2，-ArH)；7.55(m，2H，-ArH)；7.78(m，2H，-ArH)。

制成的三唑磷人工半抗原，分子结构式为(此时n＝5)：

2、三唑磷人工抗原的合成方法如下：

1)、人工免疫抗原的制备同实施例2。

免疫抗原的鉴定

按合成三唑磷免疫抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外(200nm～400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。

半抗原TZLHe与BSA的结合比为8.2∶1。

2)、人工包被抗原的制备同实施例2。

包被抗原的鉴定：

按合成三唑磷包被抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外(200nm～400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。

半抗原TZLHe与OVA的结合比为9.4∶1。

制成的三唑磷人工抗原，分子结构式为(此时n＝5)：

3、抗体的制备方法同实施例2。

所得兔子抗血清的效价为1∶204800(指OD_490nm值等于1.0)。

抗TZLHe-BSA抗体对各类似物的交叉反应率：二嗪磷为0.024％，对硫磷为＜0.01％，毒死蜱为＜0.01％，杀螟硫磷为＜0.01％，马拉硫磷为＜0.01％

实施例4

1、三唑磷人工半抗原的合成方法如下：

1)O-乙基硫代磷酰二氯(TZLM-1)的合成

称取三氯硫磷(PSCl₃)68g(约0.4mol)置于带有低温温度计的三口烧瓶中，以冰盐水浴将其冷却至-10～-5℃，在剧烈搅拌下滴加入无水乙醇166g(约3.6mol)，严格控制滴加速度，使反应液温度始终处于-30～0℃。滴加完毕后在-20～10℃继续反应9h。反应完，以(0±5)℃蒸馏水洗涤反应液(100ml×2)，分出油层并以无水Na₂SO₄干燥，再经水泵减压蒸馏，收集65～75℃馏分，得到62.16g无色透明油状液体(收率86.8％，以三氯硫磷计)。

2)O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰一氯(TZLM-2)的合成

称取TZM-1 0.2mol(约36g)置于250ml三口烧瓶中，按照投料比(克分子比)TZM-1∶1-苯基-1，2，4-三唑醇＝1∶3，在搅拌下加入1-苯基-1，2，4-三唑醇0.6mol，再加入15～30ml TEA和80～120ml二氯甲烷。待固体全部溶解后，用冰水浴将该溶液降温至-20～20℃，逐滴加入55ml 2mol/L的NaOH水溶液，继续反应3h。反应完毕后，加入50ml 5％NaOH冰水溶液，振荡后分出水层，油层以冰水洗涤至中性，再经无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩，得少量棕色油状物，该油状物用石油醚萃取(50ml×2)，提取液再减压浓缩，得13.78g黄色液体(收率45.5％，以1-苯基-1，2，4-三唑醇计)。

3)三唑磷半抗原9-[O-乙基-O-(3，5，6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酰胺基]-壬酸(简称TZLNe，n＝8)合成

称取1.73g(约10mmol)9-氨基壬酸，溶解于10ml NaOH溶液(1mol/L)中，置于250ml三口烧瓶中，冰水浴冷却至0-10℃，搅拌下缓慢加入15.1g(约50mmol)溶解于10ml二氧六环的TZM-2溶液，滴加10ml NaOH水溶液(1mol/L)。在20～30℃下保温反应5h。反应完毕后，加入5％NaOH冰水溶液，调节反应液的pH约为8～10。再用石油醚洗涤上述混合液(40ml×2)，弃石油醚层，以2mol/LHCl调节水相pH约为3，再以乙酸乙酯萃取(40ml×2)，提取液用少量水洗涤后经无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩，残余物于4℃密封存放过夜，有无色晶体析出。以乙酸乙酯-石油醚重结晶，过滤，干燥，得1.39g白色固体(收率60.4％，以一氯中间体计)。

半抗原(TZLNe)的鉴定：

质谱(MS，+cESI)测定结果：m/z为441，相对丰度100％，应为TZLNe的准分子离子峰[M+1]⁺。

所制成的三唑磷人工半抗原，分子结构式为(此时n＝8)：

2、三唑磷人工抗原的合成方法如下：

1)、人工免疫抗原的制备同实施例2。

按合成三唑磷免疫抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外(200nm～400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。

经计算结果如下：

半抗原TZLNe与BSA的结合比为10.3∶1。

2)、人工包被抗原的制备同实施例2。

包被抗原的鉴定：

按合成三唑磷包被抗原反应所用半抗原、载体蛋白与偶联产物的比例，分别进行紫外(200nm～400nm)扫描测定，通过比较三者分别在260nm和280nm的吸光值计算其结合比。

经计算结果如下：

半抗原TZLNe与OVA的结合比为6.8∶1。

所制成的三唑磷人工抗原，分子结构式为(此时n＝8)：

3、抗体的制备方法同实施例2。

所得3只兔子抗血清的效价为1∶12800(指OD_490nm值等于1.0)。

抗TZLNe-BSA抗体对各类似物的交叉反应率：二嗪磷为1.03％，对硫磷为2.57％，毒死蜱为1.87％，杀螟硫磷为2.62％，马拉硫磷为＜0.01％。

实施例5 三唑磷酶联免疫吸附测定方法建立与鉴定

因为用n＝1，3，5，8时四种不同连接臂长的三唑磷半抗原制备的免疫抗原去免疫兔子得到的四种抗体相比较，从抗体的效价、特异性来看，n＝3，5时比n＝1，8时得到的抗体比较好，可以用于进一步建立三唑磷ELISA测定方法，所以本专利就这两种抗体进一步研究建立了三唑磷ELISA测定方法。

1、三唑磷ELISA测定方法的建立及其工作条件和基本参数

采用直接竞争酶联免疫分析方法。其测定原理已作了简单论述，现作一详细论述。它是将农药分子与大分子载体(如蛋白质)偶联制得的复合物作为包被抗原吸附于固相载体(96孔酶标板)上，制备成固相抗原，然后加入待测农药和相应酶标抗体。固相抗原、待测农药与酶标抗体进行竞争结合反应，待测农药含量多，则被结合在固相抗原上的酶标抗体少，反之结合在固相抗原的酶标抗体多，最后用底物进行显色加以测定，当酶标抗体量一定时，加入的待测农药量越多，与固相抗原结合的酶标抗体就越少，发色反应就减弱，抑制率增高，反之，则发色反应增强，抑制率减低，因而可根据已知量农药的标准线和待检样品的抑制率，推算出待测农药的浓度。

2、酶标抗体的制备

采用改良过碘酸钠法，将抗体与等量的辣根过氧化物酶(HRP)偶联。偶联物加入甘油，混匀，分装，-20℃保存。

3、最佳抗体工作浓度和包被抗原复合物浓度的确定

用方阵滴定法，同时稀释酶标抗体和固相抗原包被液。在同一包被液浓度下，随着酶标抗体的稀释，所得的OD值呈下降趋势，同样在同一酶标抗体稀释浓度下，随着包被液浓度的下降，所得OD值也呈下降趋势。通常选择OD值1.0左右时的抗体和包被抗原浓度作为工作浓度。从实验可知，当TZLBu-BSA酶标抗体2.0μg·mL^-1、包被抗原TZLBu-OVA浓度为4.0μg·mL^-1时OD值约等于1.0；当TZLHe-BSA酶标抗体为1.0μg·mL^-1，包被抗原TZLHe-OVA浓度为2.0μg·mL^-1时，OD值约等于1.0。

4、标准曲线和检测灵敏度

从低温冰箱中取出TZLBu-OVA或TZLHe-OVA偶联复合物，使之完全解冻后用包被液稀释成1.0μg·mL^-1的包被抗原溶液。96孔微量反应板用蒸馏水洗涤后，每孔加入上述包被液100μL，于37℃温箱中孵育2h。甩掉包被液，用PBST缓冲液洗涤，每孔加入封闭液300μL，于37℃温箱中孵育0.5h。甩掉封闭液，用PBST缓冲液洗涤，加入预先配制的三唑磷各浓度标准液50μL/孔，每浓度8孔重复，再加入预先配制的对应的酶标抗体稀释液(TZLBu-BSA酶标抗体：4.0μg·mL^-1，TZLHe-BSA酶标抗体：2.0μg·mL^-1)50μL/孔，设不加药对照和空白对照。放入37℃温箱中孵育1h，甩去孔内液体，用PBST溶液洗涤。加入OPD-过氧化氢底物溶液100μL/孔，37℃温箱中孵育15min后加入2mol/L H₂SO₄ 50μL/孔终止反应。在酶联仪上测定490nm波长下的吸光值。根据抑制与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。

ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式

式中：OD_max为不加药时的吸光值，OD_x为农药x时的吸光值，OD_min为空白对照孔的吸光值。

由上述公式计算得三唑磷各浓度的抑制率，作图。用抗TZLBu-BSA抗体测定时，抑制率为50％时三唑磷的浓度(I₅₀)为17.4μg·L^-1，最低检测限[抑制率为20％时三唑磷的浓度(I₂₀)]为1.5μg·L^-1；用抗TZLHe-BSA抗体测定时，I₅₀＝11.2μg·L^-1，I₂₀＝0.9μg·L^-1。从图中还可知，三唑磷在1-200μg·L^-1范围内，抑制率与三唑磷浓度的对数值呈显著的线性关系，抗TZLBu-BSA抗体的相关系数为r＝0.9903，抗TZLHe-BSA抗体的相关系数为r＝0.9945。

 5、精密度

精密度(Precision)是指方法的重复性。如果一个分析方法测定结果的重复性很差，就无法评价其灵敏度，特异性和准确度，也就无法得出令人信服的结果，在ELISA实验中，常采用批内和批间误差来表示其精密度。

(1)批内误差：以标准曲线的批内平均变异系数来表示。标准曲线各剂量点的批内平均变异系数CV％＝4.7％。

(2)批间误差：以6块不同板上的测定结果进行平均，求得标准曲线各剂量点的批间平均变异系数CV％＝8.2％。

从批内和批间的数据可以看出，三唑磷含量高的样品在测定过程中，其重复性较好，批内批间的变异也较小，且批内批间相差也较小。

6、准确度

准确度(Accuracy)是指测得值与真值的符合程度。在农药ELISA实验中，以回收率和健全性来表示其准确度。

6.1、回收率

在三角瓶中称取土壤样品，每份10g。加入一定量的三唑磷标准溶液，配制成含三唑磷浓度分别为1000μg·L^-1、100μg·L^-1的土壤添加样品。每浓度3个重复，设空白对照。一定时间后，在样品中加入50mL的甲醇振荡提取30分钟。抽滤，用30mL甲醇冲洗滤渣，抽滤完毕后，减压浓缩至2mL左右，用甲醇定容至10mL，再吸1ml，以PBS缓冲液稀释并定容至10ml，待测。配制2倍于工作浓度的的酶标抗体稀释液。在已包被好的96孔板内每孔加入系列待测液50μL，重复4孔，再每孔加入酶标抗体稀释液50μL，空白对照孔加入100μL PBS缓冲液，同时作标准曲线。盖好板，37℃孵育1小时，甩去孔内液体，用PBST溶液洗涤。加入OPD-过氧化氢底物溶液100μL/孔，37℃温箱中孵育15min后加入2mol/L H₂SO₄ 50μL/孔终止反应。在酶联仪上测定490nm波长下的吸光值。根据各添加样品的抑制率，查标准曲线计算出三唑磷浓度并计算回收率。

经分析可知，该方法的平均回收率为111.8％，平均变异系数为9.0％。

在制作标准曲线时，得到的检测极限为0.9μg·L^-1，而在测定土壤样品的过程中，对其提取液作了10倍的稀释，换算可得用此方法检测土壤中的三唑磷检测限可达9.0μg·L^-1，而用气相色谱硫磷检测器时对三唑磷的检测限为50μg·L^-1，从而可知用ELISA分析方法来测定土壤中三唑磷量是可行的。

与气相色谱相比，ELISA分析方法样品的前处理快捷简单，只用甲醇提取后浓缩定容、PBS稀释即可进行检测，而用气相色谱法分析，样品前处理过程复杂，先要用缓冲溶液提取，然后用二氯甲烷萃取，萃取后浓缩，浓缩后又要用小型硅胶柱净化，工作量大，故建立三唑磷的ELISA分析方法能够大大提高工作效率。

6.2健全性

将添加1000μg·L^-1三唑磷的土壤样品的提取液在作了10倍稀释后作系列稀释，进行重叠性试验，样品提取液的稀释曲线基本上与标准曲线平行。说明所测样品与标准样品的免疫化学性质相同，可以通过标准曲线检测被测物质，也说明测定结果不会因样品稀释度的改变而发生显著变化。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1、一种三唑磷人工半抗原的合成方法，其特征在于依次包括下列步骤：

1)O-乙基硫代磷酰二氯的合成：三氯硫磷与无水乙醇，采用先滴加后反应的步骤反应1～10小时，所述三氯硫磷与无水乙醇的克分子比为1∶1～10，滴加温度为-30～0℃，反应温度为-20～15℃；

2)O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰一氯的合成：将O-乙基硫代磷酰二氯与1-苯基-1，2，4-三唑醇在极性溶剂、缚酸剂存在下反应，投料比O-乙基硫代磷酰二氯∶1-苯基-1，2，4-三唑醇＝1∶0.5～1∶3(克分子比)，反应温度为-20～30℃，反应时间为0.5～3.0小时；

3)三唑磷半抗原(n+1)-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-(n+1)酸的合成：将(n+1)-氨基酸溶解于碱性溶液中，搅拌下缓慢加入溶解于极性溶剂的O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰-氯溶液，再滴加氢氧化钠水溶液进行反应，(n+1)-氨基酸与O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰一氯的克分子比为1∶0.5～6，反应温度为-10～40℃，反应时间为1～5小时。

2、一种如权利要求1所述的三唑磷半抗原的合成方法，其特征是：步骤2)中所述缚酸剂是吡啶、三乙胺、N，N-二甲基苯胺、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、或碳酸钾。

3、一种如权利要求2所述的三唑磷半抗原的合成方法，其特征是：所述步骤3)的反应完成后，再滴加氢氧化钠调节反应液pH为8～12，然后用石油醚洗涤，再用盐酸调节pH在2～7，用极性溶剂提取，再将所述提取液进行浓缩。

4、一种如权利要求3所述的三唑磷半抗原的合成方法，其特征是：将步骤3)所得的三唑磷半抗原(n+1)-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-(n+1)酸，用乙酸乙酯—石油醚重结晶。

5、一种如权利要求4所述的三唑磷半抗原的合成方法，其特征是：步骤2)中所述极性溶剂是低级链醇、乙醚、醋酸、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、丙酮、二氧六环或吡啶。

6、一种三唑磷人工抗原的制备方法，其特征在于：将三唑磷半抗原(n+1)-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-(n+1)酸，溶解在N，N-二甲基甲酰胺中制成溶液，然后在所述溶液中加入等当量的二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，室温下反应过夜后，离心，取上清液加入到载体蛋白碳酸盐缓冲溶液中反应；或者将三唑磷半抗原(n+1)-[O-乙基-O-[3-(1-苯基-1，2，4-三唑基)]硫代磷酰胺基]-(n+1)酸，溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，室温搅拌反应1h，取部分反应液缓慢滴加到载体蛋白的碳酸盐缓冲溶液中反应；待上述反应完成后，透析，分装保存于-20℃的冰箱中。

7、一种利用如权利要求6中所述的三唑磷人工抗原制备三唑磷特异抗体的方法，其特征在于，依次包括以下步骤：

(1)实验选用健康的雄性家兔或者小鼠，实验免疫剂量基础免疫为0.25～2.0mg/kg，加强免疫剂量为0.5～2.0mg/kg，用生理盐水分别稀释适量三唑磷人工免疫抗原，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，采用背部皮下多点注射与大腿肌肉注射相结合的方法，背部皮下免疫4～6点，大腿肌肉注射2～4点，3～4周后进行加强免疫，以后每隔2周再次加强免疫，加强免疫时采用弗氏不完全佐剂，从第三次免疫开始，每次免疫后第8～10天，从兔子心脏或耳缘静脉采血，测定效价和特异性，待免疫血清效价合格后，就可进行采血，分离出抗血清；

(2)采用辛酸-硫酸铵盐析法，或者采用蛋白A柱层析得到抗血清中的免疫球蛋白质G。