CN1547027A - 用间接酶免疫吸附试验检测犬狂犬病毒IgG试剂盒及制备方法 - Google Patents

用间接酶免疫吸附试验检测犬狂犬病毒IgG试剂盒及制备方法 Download PDF

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张瑜
徐国景
唐利军
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张金明
易平
杨文祥
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龚镇奎
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Abstract

本发明涉及一种检测试剂盒及其制备方法，具体地是一种用间接酶免疫吸附试验检测犬狂犬病毒IgG试剂盒及制备方法。试剂盒组成为：已预包被狂犬病毒抗原酶标板，样品稀释液，阳性血清，阴性血清，HRP－抗犬IgG酶结合物，浓缩洗涤液，底物和终止液。本发明试剂盒的特异性达到100％；灵敏度为1∶640；精密性(变异系数C·V)为6.98％。本试剂盒采用间接ELISA检测犬抗狂犬病毒IgG抗体，用于实验犬、宠物犬和普通犬感染狂犬病毒的情况调查和接种狂犬疫苗的效果评价。

Description

用间接酶免疫吸附试验检测犬狂犬病毒IgG试剂盒及制备方法
技术领域
本发明涉及一种检测试剂盒及其制备方法，具体地是一种用间接酶免疫吸附试验检测犬狂犬病毒IgG试剂盒及制备方法。
技术背景
实验动物是生命科学的重要基础和必备的支撑条件之一。实验动物质量的优劣不仅直接关系到相关科研工作的成败，而且也是一个国家总体相关科研水平的重要标志。实验动物的质量保证除了依赖于饲养管理水平和硬件条件外，还依赖于标准化的检测系统，而检测系统的关键是科学、先进的检测方法和标准化的检测试剂。目前，我国实验动物检测标准与体系尚不完备、不统一、不规范、不标准，与国外发达国家相比也有很大差距，这对我国总体相关科学研究的发展是一大障碍。
随着经济的发展和人民生活水平的提高，宠物犬的数量在不但增加，犬的活动区域也在不断扩大，仅武汉市区就有十万只以上。从宠物医疗市场得到的信息，人们是迫切希望了解宠物接种狂犬疫苗后对犬是否具有保护力，而目前狂犬病毒抗体的检测工作因受检测条件和费用的限制，并没有得到广泛的应用。狂犬病毒(Rabies Virus)是狂犬病的病原体，而我国又是狂犬病的高发国家，居世界第二位(仅次于印度)，由于狂犬病是人畜共患性疾病，95％的狂犬病是与人类密切接触的犬传播的，其危害已经引起政府和人民的高度关注。犬不仅用于狩猎(猎犬)、侦破(警犬)、看门、食肉和作为宠物饲养，犬还是进行生命科学、医学、药学、化工、农业、军事、环保、航天及生物工程领域应用广泛的重要实验动物(实验犬)之一。随着我国在生命科学、医学、药学等研究领域发展速度加快，实验犬的使用量不断增大，质量要求不断提高，实验犬的生产基地在不断涌现，但实验犬的检测体系尚未建立，使得狂犬病的危害更加突出，保证犬(尤其是实验犬)的质量和工作人员的身体健康与生命安全成为十分突出的课题。特别是我国进入WTO后，我国生命科学的研究成果、医药、生物制品以及实验犬等将跨出国门走向世界，这些均需要实验犬的质量检测工作标准化作为支撑，以突破发达国家设立的技术壁垒，进入国际市场。
目前，国内外用ELISA方法检测人血清中抗狂犬病毒抗体，辅助临床上狂犬病的诊断和用于狂犬疫苗效果的评价方法已经成熟。但用于实验动物(包括犬、猴、鼠等)狂犬病毒抗体检测的方法和相应的试剂盒尚未见实验动物狂犬病毒抗体检测方法的研究报道，也未见相应的试剂盒商售。因此建立科学、快速、先进的实验动物狂犬病毒抗体检测方法，按规范程序生产相应的标准化试剂盒是当务之急。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用间接酶免疫吸附试验检测犬狂犬病毒IgG试剂盒及制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用间接酶免疫吸附试验检测犬狂犬病毒IgG试剂盒，其组成为：
             已预包被狂犬病毒抗原酶标板                 8×12孔
             样品稀释液                                 10ml
             阳性血清                                   0.5ml
             阴性血清                                   0.5ml
             HRP-抗犬IgG酶结合物                        10ml
               浓缩洗涤液                      20ml
               (TMB)底物A                      5ml
               (H2O2)底物B                  5ml
               2mol/L(H2SO4)的终止液        5ml；
其中，所述的样品稀释液为0.01mol/L，pH7.2的磷酸缓冲盐水(PBS)；酶结合物为辣根过氧化酶(HRP)-抗犬IgG酶结合物；浓缩涤液为含0.05％吐温(Tween)-20的生理盐水；底物A为3.3′-5.5′-四甲基联苯胺溶液；底物B为双氧水溶液；终止液为用蒸馏水稀释后的1mol/LH2SO4硫酸溶液，纯硫酸与蒸馏水比例为1∶17。
本发明的技术方案不包括上述检测试剂盒的制备方法，其制备方法包括：
A：HRP-兔抗犬IgG酶结合物的制备：
兔抗犬IgG的制备和辣根过氧化物标记：按常规方法提取纯化犬IgG，免疫家兔，当兔抗血清双扩效价达1∶16以上时取血清；经硫酸铵沉淀和DEAE-Sephadex G200柱层析纯化；用改良的过碘酸氧化法进行标记。酶标记物(代号：HRP-兔抗犬IgG)加入1％牛血清白蛋白(BSA)和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用；
B：阳性血清的制备：
(1)挑选体格健壮的6月龄比格犬2～3只，初次免疫用兽用五联苗(狂犬病、犬传染性肝炎、犬副流感、犬瘟热、犬细小病毒)，加强免疫用人用狂犬苗，待犬血清中抗狂犬病毒IgG抗体ELISA效价达1∶500以上，即可采血分离血清；(2)用A液将冻存的阳性血清稀释到工作浓度(O.D控制在0.5～1.0)；
C：阴性血清的制备：用A液将冻存的阴性血清作适当稀释，O.D＜0.1；
D：样品稀释液的制备：将小牛血清(BSA)100ml、甘油100ml、吐温(Tween)-20：1ml、聚乙二醇2万(P)10g、叠氮钠(NaN3)2g、Vero细胞因子1ml、33％原装的双氧水配制成0.01mol/L，pH7.2的磷酸缓冲盐水(PBS)；
E：浓缩洗涤液的制备：将氯化钠(NaCl)170g；吐温(Tween)-20：10ml；蒸馏水1000ml配制成所需的生理盐水浓缩洗涤液；
F：底物A的制备：将3.3′-5.5′-四甲基联苯胺270g、无水乙醇240ml、甘油6ml、双蒸水340ml配制成3.3′-5.5′-四甲基联苯胺溶液；
G：底物B的制备：将Na2HPO4·12H2O的磷酸氢二钠18.41g、无水Na2HPO4的磷酸氢二钠7.33g、枸橼酸5.10g、双蒸水1000ml及原装33％的双氧水1.0ml配制成所需双氧水溶液；
H：终止液的制备：所述终止液为用蒸馏水稀释后的硫酸溶液，纯硫酸与蒸馏水为1∶17；
I：预包被板的制备：将狂犬病毒抗原用磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)即包被液稀释成5μg/ml，包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜；倒掉包被液，每孔加含10％小牛血清的封闭液4℃过夜；倒掉封闭液，吹干，4℃保存备用；
将上述制备好的酶结合物用A液稀释、与样品稀释液、浓缩洗涤液、底物A、底物B、终止液、阳性血清、阴性血清按试剂盒配制定量分装，再与预包被板分装成检测试剂盒；
所述狂犬病毒抗原用狂犬病毒疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融，超声波破碎、差速离心提取，-20℃保存，作为包被用狂犬病毒用抗原；
所述的包被液即0.05mol/L，pH9.6的磷酸缓冲液制备方法为：将碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93g、叠氮钠0.20g、蒸馏水1000ml配制而成。
所述的封闭液制备方法为：将氯化钠8.5g、小牛血清10.0g、双蒸水500ml、甘油500ml配制而成，其中，先将氯化钠和小牛血清溶于双蒸水中，再加甘油。
所述A液制备方法为：将对乙酰氨基酚1.5g，聚乙二醇2万10g，小牛血清2g，吐温-20 1ml，硫柳汞0.2g和0.02mol/L、pH7.2的盐酸缓冲盐水1000ml配制而成。
本发明检测程序：将待检样本用样本稀释液作1∶100稀释，每孔加100μl，同时作阳性、阴性对照血清和空白对照，置37℃反应30分钟；洗板5次，每孔加酶标抗体(工作浓度1∶500)100μl，37℃反应30分钟；洗板5次；加底物溶液A(TMB)、B(H2O2)各50μl，37℃反应15分钟；滴加50μl终止液(2mol/l H2SO4)终止反应。用酶标检测仪测O.D450值。
结果判断：Cutoff＝阴性对照平均O.D450值(阴性O.D450不到0.1，按0.1计算)×2.1倍。样本O.D450＞Cutoff值判为阳性。
本发明试剂盒质量标准的制定及检定：
特异性：20份阴性血清、20份阳性血清，检测符合率不低于95％。
灵敏性：间接ELISA法：抗体阳性犬血清1μl(即1μl血清加到100μl的样本稀释液中)
        能检出。
精密性：变异系数(C·V)≤15％。将同一份血清同步作10孔所得O.D450值，经统计学
        处理，计算C·V值。
稳定性：将试剂盒置37℃不少于3天与4℃存放的试剂盒同步检测10样品，其O.D450值的总变化率≤25％。
试剂的现场试用：
用间接ELISA试剂检测未接种狂犬苗的健康幼犬抗狂犬病毒IgG抗体：从湖北某狗场采集了36份未接种狂苗的幼犬血清样本，按间接ELISA检测程序进行检测。
用本发明试剂检测狂苗免疫犬体内IgG抗体的动态变化：对本研究中2只进行狂苗接种制备抗血清的试验犬(见4)在最后一次加强免疫后第2、9、16天抽血及免疫前的血清样本用间接ELISA分别按检测程序进行IgG抗体检测。
结果表明：
1、试剂的质量检定
特异性：间接ELISA检测犬抗狂犬病毒IgG抗体对20份阴性、10份阳性质控血清，符合率均为100％(结果见表1)
                         表1  间接ELISA试剂特异性检定结果
质控血清                               血清序号        对照
1     2     3     4      5      6      7      8     9    10 S-      S-
阴性20份  0.08  0.09  0.07  0.07   0.08   0.08   0.08   0.08  0.09 0.084     0     5     5      3      4      2      6     4    211    12    13    14     15     16     17     18    19   200.06  0.06  0.10  0.08   0.07   0.08   0.10   0.09  0.09 0.107     8     4     4      7      6      4      0     7    4   0.07     0.047        2空S+白0.53     0.006        0Cutoff＝0.210
阳性10份  1     2     3     4      5      6      7      8     9    10060   0.70  0.69  0.76   0.63   0.72   0.33   0.35  0.47 0.383     2     1     8      9      9      2      8     6    1
灵敏度：两种试剂的灵敏度检定所用质控血清是用狂犬疫苗免疫实验犬(见材料方法4)制备的犬抗狂犬病毒阳性血清。检定结果(表2)表明：间接ELISA法检测灵敏度可达1∶640，
表2 间接ELISA试剂灵敏度检定结果(Cutoff＝0.210)
血清
稀释    1∶10    20     40     80     160     320    640    1280     S+     S-     S-    空白
度
O.D450 2.722    2.780  2.824  2.020  1.308   0.624  0.257  0.089    0.536   0.077    0.042  0.000
精密性：本发明试剂用同一份阳性血清的同一稀释度同步作10孔，O.D450的变异系数(C·V)为6.98％表3)。
                              表3 试剂精密性检定结果
                                                                            变异系数
孔号      1     2     3      4      5      6      7      8      9     10
                                                                             (C·V)
O.D450   0.412 0.377 0.411  0.410  0.347  0.372  0.352  0.344  0.376 0.349  6.98％
1.现场试用
1.1 用本发明试剂检测犬抗狂犬病毒IgG抗体：从湖北某狗场随机采集的36只幼犬(未接种狂苗，犬龄30～45天)血清进行抗狂犬病毒IgG抗体检测，结果均为阴性，平均O.D450值为0.096(见表4)。
              表4 36只幼犬抗狂犬病毒IgG抗体检测结果
0.085  0.111  0.033  0.034  0.069  0.072  0.151  0.094  0.137  0.100  0.098  0.095
0.127  0.069  0.036  0.084  0.069  0.078  0.062  0.049  0.121  0.076  0.114  0.127
0.121  0.175  0.114  0.109  0.100  0.122  0.142  0.055  0.128  0.099  0.097  0.099
S+    S-    S-    空白
                                                 Cutoff＝0.210
0.616  0.070  0.045  0.000
实验犬接种狂苗后抗体产生情况的动态监测：两只实验犬免疫前抗狂犬病毒抗体均为阴性，接种狂犬疫苗后，从最后一次加强免疫后的第2、9、16天采集血清检测抗体，结果表明IgG抗体呈明显上升趋势(见表5)。
           表5 用本发明试剂盒检测免疫犬抗狂犬病毒IgG抗体的动态变化
犬号 采血时间                          血清稀释度     对照
1∶10  1∶20  1∶40  1∶80  1∶160 1∶320 1∶640  1∶1280  S-     S-
1号犬 免疫前免后2天免后9天免后16天 0.103  0.067  0.118  0.034  0.032  0.000  0.000   0.0002.683  1.643  0.980  0.317 0.175  0.019  0.050   0.0003.011  2.144  1.387  0.566  0.397 0.119  0.050   0.0632.722  2.780  2.824  2.020  1.308  0.624  0.257  0.089  0.01    0.006       0S+     空白1.92    0.007       0Cutoff＝0.210
2号犬 免疫前免后2天免后9天免后16天 0.147  0.046  0.023  0.080  0.011  0.000  0.054   0.0001.753  0.808  0.505  0.272 0.204  0.144  0.099   0.0502.801  2.274  1.331  0.656  0.430 0.209  0.163   1.0582.849  2.824  2.240  1.125  0.614  0.272 0.170   0.119
经对试生产的试剂盒进行初步质量检定的结果来看，本发明试剂盒的特异性达到100％；灵敏度为1∶640；精密性(变异系数C·V)为6.98％。
本试剂盒采用间接ELISA检测犬抗狂犬病毒IgG抗体，用于实验犬、宠物犬和普通犬感染狂犬病毒的情况调查和接种狂犬疫苗的效果评价。
附图说明
图1    为本发明工艺流程图
具体实施方式：
实施例1：
1  HRP-兔抗犬IgG的制备
1.1  犬IgG的提取、纯化
1.1.1  选择狂犬病毒抗体阴性的6月龄以上的健康合格比格犬1只[许可证号为SCXK(鄂)2003-0001]]，心脏采血或颈动脉放血，分离血清。
1.1.2  取犬血清xml，加xml生理盐水稀释：搅拌下滴加2xml饱和硫酸铵溶液(终浓度为50％饱和硫酸铵)，置4℃30分钟(有絮状沉淀出项)，3000rpm离心30分钟，去上清：沉淀用2xml生理盐水溶解，搅拌下滴加xml饱和硫酸铵(终浓度为33％饱和硫酸铵)，置4℃30分钟，5000rmp离心30分钟，去上清；用少量PBS(0.01mol/L pH7.4)将沉淀溶解，装入投析袋，对PBS透析48小时，期间换液4-5次；将透析除盐的IgG溶液上DEAE-SephadexA-50柱层析，上样量不超过柱床体积的10％，用0.01mol/L，pH7.4的PBS洗脱，流速为1ml/min，分管收集，每管3～5ml；用紫外分光光度计分别测出O.D280值，绘出洗脱曲线，第1个洗脱峰为IgG，收集混合第1峰所含各管的洗脱液，即为纯化的IgG。
1.1.3  纯化的IgG检定：
①含量测定：用紫外分光光度计测出纯化的IgG溶液O.D280和O.D260的值，按公式IgG蛋白(mg/ml)＝(1.45×O.D280-0.74×O.D260)×稀释倍数
②纯度检定：O.D280/O.D260≥1.75
SDS-PAGE只有一条分子量为150,000的蛋白带
1.2  兔抗犬IgG的制备
1.2.1  用纯化的犬IgG按常规免疫家兔。
1.2.2  兔抗犬IgG的提取、纯化检定：同1.1.1～3。
1.3  辣根过氧化物酶(HRP)标记
1.3.1  准确称取HRP(RZ≥3.0，Sigma公司产品)xmg，溶于0.2xml的双蒸水中，电磁搅拌下，滴加新配制的0.1mol/L高碘酸钠(NaIO4)溶液0.04xml，室温(25℃)搅拌20分钟。溶液由棕红色转为墨绿色(醛化的HRP)。
1.3.2  将醛化的HRP装入透析袋内，对1mmol/L醋酸缓冲液(pH4.4)透析过夜。溶液由墨绿色转为棕红色。
1.3.3  用0.2mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)将醛化的HRP溶液pH调至9.0～9.5(每ml醛化HRP加碳酸盐缓冲液0.2ml)，立即加入纯化的IgG(IgG溶液在加入前也应用L碳酸盐缓冲液调pH至9.0～9.5，碳酸盐缓冲液的加入量约为每ml加0.3ml)1.5xmg(IgG溶液中蛋白含量×加入容积)，室温搅拌2小时。
1.3.4  加入新配制的硼氢化钠溶液(4mg/ml)0.02xml，4℃放置2小时。
1.3.5  搅拌下滴加等量饱和硫酸钠溶液，4℃放置30分钟，有絮状沉淀出现。5000rpm离心30分钟，去上清。上清应无色，沉淀为棕红色。
1.3.6  将沉淀用适量PBS溶解，装入透析袋，对PBS透析48小时，其间换液5～6次。即为HRP-兔抗犬IgG(酶结合物)。
在标记并检定合格的酶结合物中加入1％牛血清白蛋白(BSA)，使其充分溶解后，再加入等体积的中性甘油，-20℃保存备用。
1.3.7  HRP-兔抗犬IgG(酶结合物)检定
①外观：应为澄清透明溶液(浅棕红色)，如有不溶物，应离心除去。
②酶结合物中HRP与IgG的克分子比：用紫外分光光度计测出酶结合物中O.D280和O.D403之值，按下列公式计算克分子比：
标记合格的酶结合物其HRP与IgG的克分子比应在1～2之间。
③酶结合物工作浓度的测定：取包被有狂犬病毒的酶标板条3条，1条加同一浓度的阳性血清，1条加阴性血清，1条加临界值血清，每孔100μl，37℃温育30分钟，洗板5次。将酶结合物用酶标抗体稀释从1∶100开始做倍比稀释1∶204800，共12个稀释度，取各稀释度溶液100μl加到3条板条的相应孔中，37℃温育30分钟，洗板5次，加底物A、B各50μl，37℃显色15分钟，加终止液(2mol/L H2SO4)50μl，在酶标监测仪上测定各孔的O.D450值。阳性血清O.D＞0.500、阴性血清O.D＜0.100、临界值血清O.D/阴性血清O.D≥2.1的酶结合物的最高稀释倍数(度)的前1个稀释倍数(度)为此批酶结合物的工作浓度。
1.3.8  酶结合物的保存
在标记并检定合格的酶结合物中加入1％牛血清白蛋白(BSA)，使其充分溶解后，再加入等体积的中性甘油，-20℃保存备用。
2、犬抗狂犬病毒免疫血清的制备
挑选体格健壮的6月龄比格犬2～3只，初次免疫用兽用五联苗(狂犬病、犬传染性肝炎、犬副流感、犬瘟热、犬细小病毒)，加强免疫用人用狂犬苗(均按疫苗使用说明书操作)，待犬血清中抗狂犬病毒IgG抗体ELISA效价达1∶500以上，即可采血分离血清，备用。
3.狂犬病毒抗原的制备
3.1  毒种：狂犬病毒CTN株(武汉生物所疫苗生产毒株)
3.2  细胞：Vero细胞
3.3  将复苏活化的狂犬病毒悬液按1∶10(100ml培养瓶接种1ml病毒悬液)接种到已长成单层的Vero细胞上，37℃培养5～6天(细胞不出现明显病变，但细胞内颗粒增多，纹理紊乱)，收取培养液上清(病毒悬液)。
3.4  在收集的病毒悬液中，加入终浓度为1/3000的甲醛灭活病毒。
3.5  将灭活的病毒悬液5000rpm离心1小时，去沉淀。
3.6  将含病毒的上清40,000rpm离心1小时，去上清。沉淀用适量PBS悬浮测定蛋白含量(同1.1.3①)，加50％的中性甘油，-20℃保存，作为包被用狂犬病毒抗原。
3.7  狂犬病毒抗原检定
①病毒活性检测：将狂犬病毒抗原用维持液作适当稀释(不小于1∶10)接种到已成片的Vero细胞上，同时作正常细胞对照。37℃培养6天接种细胞与正常细胞相同，无病理改变；取培养液上清(包括正常细胞培养液上清)包被酶标板，用阳性血清进行检测，病毒培养液和正常细胞培养液显色情况一致，均为无色，表明作为包被抗原用的狂犬病毒已灭活彻底，不具感染性。
②工作浓度测定：将狂犬病毒抗原用包被液从1∶100开始作倍比稀释到第12管(1∶204800)，每个稀释度取100μl加到12孔板条的相应孔中，共包被3条3：第1条加同1份阳性血清、第2条加阴性血清、第3条加临界值血清每孔100μl，37℃温育30分钟，洗板5次，加酶结合物(每孔100μl)，37℃温育30分钟，洗板5次，加底物A、B各50μl，37℃显色15分钟，加终止液50μl，用酶标检测仪测各孔O.D450值。阳性血清O.D＞0.500、阴性血清O.D＜0.100、临界值血清O.D/阴性血清O.D≥2.1的抗原最高稀释度倍数为此批抗原的工作浓度。
4  试剂盒组件的制备
4.1  预包被板的制作
4.1.1  将狂犬病毒抗原用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)稀释到工作浓度，每孔100μl，4℃过夜(不少于18小时)。
4.1.2  倒掉包被液，用1％BSA的封闭液封闭，每孔150μl，4℃过夜(不少于18小时)。
4.1.3  倒掉封闭液，拍干。室温电风吹干。装入封口袋，放干燥剂一袋，封口，4℃保存。
4.1.4  预包被板的检定
①外观：孔底均匀透明，无水气、污点、尘粒。
②均质性检测：随机抽取1根预包被板条，同一份阳性血清(间接法)同时检测两端和中间共3孔O.D值的变异系数小于10％。
5.1  试剂盒中各种试液的配制与分装：按下表进行。
                         试剂盒中试液的配制分装表
试液名称 配方机配制方法    分装至(ml) 标识
48T  96T
酶结合物 HRP-兔抗犬IgG(溶液为红色)用酶标抗体稀释液(A液)稀释到工作浓度 5.0 10.0 棕色滴瓶
样品稀释液(间接法) PBS(0.01mol/L，pH7.2，灭菌)800ml溶液为蓝绿色小牛血清(灭活：56℃30分钟) 100ml甘  油                    100mlTween-20                  1mlP 20                     10gNaN3                    2gVc因子                   1mlH2O2(33％原装)        1ml 5.0 10.0 绿盖滴瓶
  阳性血清 用A液将冻存的阳性血清稀释到工作浓度 0.5  0.5 0.5ml离
(O.D控制在0.5～1.0)  心管
阴性血清 用A液将冻存的阴性血清作适当稀释(O.D＜0.1) 0.5 0.5  0.5ml离心管
浓缩洗涤液(20×) NaCl             170gTween-20         10ml蒸馏水           10000ml 10.0 20.0  白色平口瓶
底物A TMB              270g无水乙醇         240ml(使TMB完全溶解后再加其他)甘油             6ml双蒸水           340ml 2.5 5.0 黑色滴瓶
底物B(pH5.0) 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)18.41g(无水Na2HPO4：7.33g)枸橼酸(C6H8O7·H2O) 5.10g双蒸水              1000mlH2O2(原装33％)   1.0ml 2.5 5.0 蓝盖滴瓶
终止液(1mol/LH2SO4) 将原装分析纯硫酸按1份硫酸，17份蒸馏水稀释即成，注意应在搅拌下缓慢将硫酸滴入水中。 2.5 5.0 红盖滴瓶
注：1.A液配方：将对乙酰氨基酚1.5g，聚乙二醇2万10g，小牛血清2g，吐温-20 1ml，硫柳汞0.2g和0.02mol/L、pH7.2的盐酸缓冲盐水1000ml配制而成。
             生产过程中所用试剂的配制
1. 生理盐水(0.85％ NaCl)：
  NaCl      170g       85g         8.5g         0.85g
  蒸馏水    20000ml    10000ml     1000ml       100ml
2. 饱和硫酸铵溶液
       (NH4)2SO4                       156g
       蒸馏水                               200ml
加热溶解，趁热过滤，用28％氨水调至pH7.0，室温保存。
3. 磷酸缓冲盐水(PBS，0.01mol/L pH7.4)
0.2mol/L Na2HPO4           81ml
0.2mol/L NaH2PO4           19ml
NaCl                          17g
蒸馏水   定溶至                2000ml
4. 1mol/L醋酸盐缓冲液(pH4.4)
0.2mol/L NaAc               1.85ml
0.2mol/L HAc                3.15ml
双蒸水   定溶至              1000ml
5. 0.2mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.5)
0.2mol/L Na2CO3             3ml
0.2mol/L NaHCO3              7ml
1. 包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液CB pH9.6)
Na2CO3                      1.59g
NaHCO3                       2.93g
NaN3                         0.20g
蒸馏水                         1000ml
2. 封闭液
NaCl                        8.5g
BSA                         10.0g
双蒸水                      500ml
甘油                        500ml
先将NaCl和BSA溶于双蒸水中，再加甘油。

Claims (6)

1、一种用间接酶免疫吸附试验检测犬狂犬病毒IgG试剂盒，其特征在于：所述试剂盒组成为：
                已预包被狂犬病毒抗原酶标板    8×12孔
                样品稀释液                    10ml
                阳性血清                      0.5m
                阴性血清                      0.5ml
                酶结合物                      10ml
                浓缩洗涤液                    20ml
                底物A                         5ml
                底物B                         5ml
                终止液                        5ml
其中，所述的样品稀释液为0.01mol/L，pH7.2的磷酸缓冲盐水；酶结合物为辣根过氧化酶-抗犬IgG酶结合物；浓缩涤液为含0.05％吐温-20的生理盐水；底物A为3.3′-5.5′-四甲基联苯胺溶液：底物B为双氧水溶液；终止液为用蒸馏水稀释后的1mol/LH2SO4硫酸溶液，纯硫酸与蒸馏水比例为1∶17。
2、制备如权利要求1所述的试剂盒的方法，其特征在于所述的制备方法如下：
A：RP-兔抗犬IgG酶结合物的制备：
兔抗犬IgG的制备和辣根过氧化物标记：按常规方法提取纯化犬IgG；免疫家兔，当兔抗血清双扩效价达1∶16以上时取血清；经硫酸铵沉淀和DEAE-Sephadex G200柱层析纯化；用改良的过碘酸氧化法进行标记；代号为HRP-兔抗犬IgG的酶标记物加入1％牛血清白蛋白和50％的中性甘油，测定工作浓度后，-20℃保存备用：
B：阳性血清的制备：
挑选体格健壮的6月龄比格犬2～3只，初次免疫用兽用五联苗(狂犬病、犬传染性肝炎、犬副流感、犬瘟热、犬细小病毒)，加强免疫用人用狂犬苗，待犬血清中抗狂犬病毒IgG抗体ELISA效价达1∶500以上，即可采血分离血清；用A液将冻存的阳性血清稀释到工作浓度，O.D为0.5～1.0；
C：阴性血清的制备：用A液将冻存的阴性血清作适当稀释，O.D＜0.1；
D：样品稀释液的制备：将小牛血清100ml、甘油100ml、吐温-20：1ml、聚乙二醇2万10g、叠氮钠2g、Vero细胞因子1ml、33％原装的双氧水配制成0.01mol/L，pH7.2的磷酸缓冲盐水；
E：浓缩洗涤液的制备：将氯化钠170g；吐温-20：10ml；蒸馏水1000ml配制成所需的生理盐水浓缩洗涤液；
F：底物A的制备：将3.3′-5.5-四甲基联苯胺270g、无水乙醇240ml、甘油6ml、双蒸水340ml配制成3.3′-5.5′-四甲基联苯胺溶液；
G：底物B的制备：将Na2HPo4·12H2O的磷酸氢二钠18.41g、无水Na2HPO4的磷酸氢二钠7.33g、枸橼酸5.10g、双蒸水1000ml及原装33％的双氧水1.0ml配制成所需双氧水溶液；
H：终止液的制备：所述终止液为用蒸馏水稀释后的硫酸溶液，纯硫酸与蒸馏水为1∶17；
I：预包被板的制备：将狂犬病毒抗原用0.05mol/L，pH9.6的磷酸缓冲液即包被液稀释成5μg/ml，包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜；倒掉包被液，每孔加含10％小牛血清的封闭液4℃过夜；倒掉封闭液，吹干，4℃保存备用。
将上述制备好的酶结合物用A液稀释，与样品稀释液、浓缩洗涤液、底物A、底物B、终止液、阳性血清、阴性血清按权利要求1所述的定量分装，再与预包被板分装成检测试剂盒。
3、如权利要求2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于所述狂犬病毒抗原用狂犬病毒疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融，超声波破碎、差速离心提取，-20℃保存，作为包被用狂犬病毒用抗原。
4、如权利要求2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于所述的包被液即0.05mol/L，pH9.6的磷酸缓冲液制备方法为：将碳酸钠1.59g、碳酸氢钠2.93g、叠氮钠0.20g、蒸馏水1000ml配制而成。
5、如权利要求2所述的试剂盒的制备方法，其特征在于所述的封闭液制备方法为：将氯化钠8.5g、小牛血清10.0g、双蒸水500ml、甘油500ml配制而成，其中，先将氯化钠和小牛血清溶于双蒸水中，再加甘油。
6、如权利要求2所这的试剂盒的制备方法，其特征在于所述A液制备方法为：将对乙酰氨基酚1.5g，聚乙二醇2万10g，小牛血清2g，吐温-201ml，硫柳汞0.2g和0.02mol/L、pH7.2的盐酸缓冲盐水1000ml配制而成。
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