CN1908667A - 弓形虫IgM抗体检测试剂及应用 - Google Patents
弓形虫IgM抗体检测试剂及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1908667A CN1908667A CN 200510036318 CN200510036318A CN1908667A CN 1908667 A CN1908667 A CN 1908667A CN 200510036318 CN200510036318 CN 200510036318 CN 200510036318 A CN200510036318 A CN 200510036318A CN 1908667 A CN1908667 A CN 1908667A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antigen
- monoclonal antibody
- toxoplasma
- antibody against
- enzyme labeling
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了弓形虫IgM抗体检测试剂及应用,涉及应用酶联免疫捕获法原理检测人血清或血浆样品中的抗弓形虫IgM抗体。用抗人IgM-μ链单克隆抗体包被微孔板,以弓形虫抗原和酶标记抗弓形虫单克隆抗体及其他辅助试剂制成检测试剂,其中抗弓形虫单克隆抗体酶标记物和弓形虫抗原混合,配制成可供检测的工作浓度。本检测试剂盒灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简单。
Description
技术领域
本发明涉及抗体检测试剂,具体地说是涉及弓形虫IgM抗体检测试剂及其制备方法和用途
背景技术
现有检测弓形虫IgM抗体的方法主要是酶联免疫法和免疫胶体金法,其基本的理论依据均是利用抗原抗体的特异性结合而制备的。其中免疫胶体金法虽然具有操作简便、快速,无需专业人员和专业仪器的优势,但目前国内外的免疫胶体金法产品的特异性和灵敏度均比酶联免疫法差;而酶联免疫法又有间接法和捕获法两种,间接法试剂盒操作也较简便、快速,但特异性和灵敏度又比捕获法差。国内外现有的捕获法试剂盒有二种,一种是抗原直接标记酶的,但其灵敏度不够高;另一种是利用弓形虫抗原和酶标记抗弓形虫单克隆抗体,即先加入工作浓度的弓形虫抗原于酶标板孔中与特异性抗体反应一段时间,洗板后再加入工作浓度的酶标记弓形虫单抗于板孔中反应一段时间,其操作过程分三步进行,反应时间长,操作复杂,用户在使用时需要自行稀释弓形虫抗原或酶标弓形虫单抗。甚至有些试剂盒中抗弓形虫单克隆抗体没有标记酶,而需再加入酶标记抗鼠IgG抗体来完成反应。
发明内容
本发明的目的是为克服现有技术中的缺陷,提供一种捕获法检测试剂,具有灵敏度高、特异性强、重复性好、操作简单,用户使用时无需稀释弓形虫抗原及酶标记的抗弓形虫单抗。
本发明的另一目的是提供该试剂在检测弓形虫IgM抗体中的应用。
本发明的技术方案在于:
用抗人IgM-μ链单克隆抗体包被微孔板、弓形虫抗原和酶标记抗弓形虫单克隆抗体及其他辅助试剂制成检测试剂,应用酶联免疫捕获法原理检测人血清或血浆样品中的抗弓形虫IgM抗体。
本发明弓形虫IgM抗体检测试剂,是由弓形虫抗原和酶标记抗弓形虫单克隆抗体及其他辅助试剂组成,其特征是将酶标记抗弓形虫单克隆抗体和弓形虫抗原混合,配制成可供检测的工作浓度。
所述的弓形虫IgM抗体检测试剂,其中酶标记抗弓形虫单克隆抗体和弓形虫抗原混合液中酶标记抗弓形虫单克隆抗体工作浓度为1∶5000~1∶10000,弓形虫抗原的工作浓度为40~100μg/ml。
所述的弓形虫IgM抗体检测试剂,其中酶标记抗弓形虫单克隆抗体是采取2株抗弓形虫单克隆抗体标记辣根过氧化物酶后,等体积混合,再与弓形虫抗原用含10%小牛血清、5%蛋清的PBS缓冲液配制成而成。
一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒,包括上述的检测试剂。
本发明弓形虫IgM抗体检测试剂盒,其组成为预包被抗人IgM-μ链单克隆抗体的微孔板、酶标记抗弓形虫单克隆抗体和弓形虫抗原混合物、阳性对照、临界对照、阴性对照、显色液A、显色液B、终止液、样品稀释液、浓缩洗涤液、密封袋、不干胶、记录纸、说明书。
上述试剂组成中,抗人IgM-μ单克隆抗体,由自备的杂交瘤细胞株,经常规方法制备腹水,以硫酸铵盐析法提纯抗体。
弓形虫抗原的制备方法:弓形虫RH虫株由本发明人保种。弓形虫RH株经Vero细胞传代培养扩增,收集原虫并经磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤,以G3砂蕊漏斗过滤,去除细胞等杂质,收集虫体,原虫纯度>98%。反复冻融3次,再以超声波粉碎,4℃10000转/分(rpm)离心30分钟,取上清作为试剂盒使用的弓形虫抗原。
上述组成中的阳性对照、临界对照、阴性对照、显色液A、显色液B、终止液、样品稀释液、浓缩洗涤液等均为本领域常用的试剂,如阳性对照为抗弓形虫IgM抗体阳性人血清,临界对照为抗弓形虫IgM抗体弱阳性人血清。
本发明的有益效果在于:常规捕获法酶联免疫试剂,是分别将弓形虫抗原和酶标记抗弓形虫单克隆抗体加入酶标板孔中,即先加入工作浓度的弓形虫抗原于酶标板孔中与特异性抗体反应一段时间,洗板后再加入工作浓度的酶标记弓形虫单克隆抗体于板孔中反应一段时间,其操作过程分三步进行,反应时间长,操作复杂,用户在使用时需要自行稀释弓形虫抗原或酶标弓形虫单抗,甚至有些试剂盒中抗弓形虫单克隆抗体没有标记酶,而需再加入酶标记抗鼠IgG抗体来完成反应。
而本发明是将抗弓形虫单克隆抗体酶标记物与弓形虫抗原直接混合配制成工作浓度,用户在使用时无需稀释,无需临时将两者混合,无需加两次,从而简化了操作步骤,一步即可完成,缩短了反应时间。
本发明临床试验数据:本试剂与意大利DiaSorin公司平行检测450例血清样品,本试剂和DiaSorin试剂检测同时阳性的血清有11例,同时阴性的血清有438例,本试剂阳性而DiaSorin试剂阴性的血清有1例,本试剂阴性而DiaSorin试剂阳性的血清有0例。本试剂和DiaSorin试剂比较,其灵敏度为100%,特异度为99.8%,假阳性率为0.2%,假阴性率为0,粗一致性为99.8%,调整一致性为97.9%,约登指数为0.998,阳性预示值为91.7%,阴性预示值为100%。本试剂与意大利DiaSorin公司同类试剂相比较,其特异性好,灵敏度高,符合率高,重复性好,并且操作快速、简便,结果判断简单。应用本发明诊断试剂盒(酶联免疫捕获法)进行弓形虫IgM抗体检测,对于优生优育及弓形虫病防治工作具有重要意义。
具体实施例
实施例1:抗弓形虫单克隆抗体制备
1、材料和方法
1.1BABL/C小鼠
SPF级,雌性,4~6周龄,体重18~22克。
1.2免疫用弓形虫抗原
弓形虫RH虫株由本公司保种。弓形虫RH株经小鼠腹腔传代培养扩增,收集原虫并经PBS洗涤,以G3砂芯漏斗过滤,去除小鼠腹腔细胞等杂质,收集虫体,原虫纯度>98%。反复冻融3次,作为免疫原。
1.3小鼠骨髓瘤细胞株
SP2/0骨髓瘤细胞株。
1.4其它试剂和消耗物品,均为本领域所公知的,在此略过。
2、免疫小鼠
取弓形虫抗原加等量0.2%利复星,混匀,第一次于小鼠腹腔注射,14天后于背部皮下注射,间隔14天于皮下注射,共注射5次,每次抗原注射量均为每只小鼠40微克的抗原蛋白。
3、细胞融合
间接ELISA法测定免疫血清效价,选择效价最高的免疫小鼠,于融合前3天腹腔注射60微克抗原。无菌取小鼠脾脏,制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0按10∶1的比例混合,用50%PEG进行融合。融合后的细胞用HAT选择培养基于37℃,二氧化碳含量为5%的二氧化碳培养箱培养,每3天用此培养基换液一次,直至克隆细胞形成。
4、筛选分泌抗弓形虫单克隆抗体的杂交瘤
用间接ELISA法检测细胞培养上清,阳性孔用有限稀释法连续克隆化3次。得到稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。
5、杂交瘤细胞库的建立
5.1原始细胞库的建立
将融合细胞管、一次或多次克隆的细胞管及鉴定证明特异性、体外连续培养3个月以上稳定分泌抗体的细胞管保存于专用的液氮罐中。
5.2主细胞库的建立
将原始细胞库的杂交瘤细胞株全面检定合格后的细胞株扩大培养后,每株细胞冻存20管作为主细胞库。
5.3工作细胞库的建立
从主细胞库的细胞管大量培养,经抗体活性、支原体复查合格后冻存1批细胞管,每批不少于20管,每次生产时取1管复苏,用于制备腹水,不再冻存。
6、单克隆抗体的制备
6.1腹水的制备
6.1.1杂交瘤细胞株培养
6.1.2从工作细胞库中取出1支细胞,37℃水浴中迅速融化,吸取冻存管中细胞到装有预冷4ml杂交瘤完全培养基的15ml离心管中,离心后弃去上清,用完全培养基重悬后加入75cm2培养瓶中,置37℃ 5%CO2培养箱中培养。
6.1.3取处于对数生长期的细胞,离心弃上清,用预冷的无血清的RPMI1640培养基重悬并洗涤细胞2次,以适量的培养基重悬细胞到2~5×106个/100ul。
6.1.4小鼠腹腔注射杂交瘤细胞株,取100ul注射于用降植烷处理过的BALB/C鼠腹腔。
6.2、腹水收集
6.2.1小鼠腹水形成后可见腹腔明显变圆、肿胀,取腹水并用15ml离心管置于冰上收集,立即加硫柳汞,至终浓度为0.01%。于4℃待用。
6.3、单克隆抗体的纯化及活性测定
6.3.1单克隆抗体的纯化
经过预处理的腹水,12000rpm、4℃离心30分钟,取上清。加入与上清体积等量的0.01mol/L、PH7.4PBS缓冲液。室温搅拌下逐滴缓慢加入2倍上清体积的饱和硫酸铵溶液。4℃静置4小时,12000rpm,4℃离心30分钟,取沉淀加入适量33%的饱和硫酸铵溶液,4℃静置4小时,12000rpm,4℃离心30分钟,取沉淀加入适量0.01mol/L、PH7.4PBS,并在此PBS中4℃透析过夜,换液三次。透析后的抗体于12000rpm,4℃离心30分钟,除去不溶性沉渣,即可用于标记或加50%甘油-20℃冻存备用。
6.3.2单克隆抗体效价检定
用含1%BSA、0.1%Tween20、0.01mol/L PBS系列稀释单克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价。
6.4单克隆抗体特异性的鉴定
免疫印迹分析法分析单克隆抗体特异性。将弓形虫速殖子抗原做电泳分离,转印到硝酸纤维膜上,封闭后分别加入杂交瘤细胞培养上清,4℃反应过夜,用含有0.5%Tween20的PBS洗涤膜后,加入HRP标记羊抗鼠IgG,置室温反应1小时,洗涤后,DAB显色后,用去离子水终止显色。结果抗弓形虫单克隆抗体与弓形虫抗原在28~36KD处有一条明显的显色带。
实施例2:试剂盒的制备
本试剂盒的组成为:
(1)单抗人IgM微孔板 96孔 (8)浓缩洗涤液(10倍) 50ml×1瓶
(2)酶标记物 1瓶 (9)样品稀释液 50ml×2瓶
(3)阳性对照(直接使用) 1支 (10)终止液 1瓶
(4)阴性对照(直接使用) 1瓶 (11)密封袋 1个
(5)临界对照(直接使用) 1支 (12)不干胶 2片
(6)显色液A 1瓶 (13)记录纸 1份
(7)显色液B 1瓶 (14)说明书 1份
其中96孔单抗人IgM微孔板是用抗人IgM-μ链单克隆抗体包被。
酶标记物是采取2株自制的抗弓形虫单克隆抗体标记辣根过氧化物酶后,等体积混合,再与弓形虫抗原用含10%小牛血清、5%蛋清的PBS缓冲液配制成而成。抗弓形虫单克隆抗体酶标记物工作浓度为1∶5000~1∶10000,弓形虫抗原的工作浓度为40μg/ml、或80μg/ml。
本试剂盒其它组分为:阳性对照是抗弓形虫IgM抗体阳性人血清,阴性对照是抗弓形虫IgM抗体检测为阴性的5份混合的正常人血清,临界对照是抗弓形虫IgM抗体弱阳性人血清,显色液A是过氧化氢-柠檬酸磷酸盐缓冲液,显色液B是TMB-柠檬酸磷酸盐缓冲液,浓缩洗涤液是含吐温-20的磷酸盐缓冲液,样品稀释液是磷酸盐缓冲液,终止液是0.5mol/L的硫酸溶液。
实施例3:试剂盒应用:
1、样本要求
本试验用血清或血浆进行检测,用量为10μl。血清或血浆勿使用染菌、脂血或溶血样品。按照标准方法收集血清,室温保存样品不要超过8小时,若实验在8小时以后进行,需将样品保存在2~10℃,如保存超过1周则保存在-20℃。
2、操作程序
1>、试剂盒在室温平衡20~30分钟。浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水10倍稀释。
2>、样品1∶100稀释:将样品稀释液1ml加入一洁净小管内,加10μl待检样品,充分混匀。
3>、将板条固定于板架上,剩余的板条用不干胶密封并放入密封袋中保存。每孔加入稀释后样品100μl。阳性对照、阴性对照各加2孔,临界对照加3孔,100μl/孔。另留一孔不加任何液体为空白对照。置37℃30分钟。
4>、甩净孔中液体,洗板3次,每次停留1分钟后甩净拍干,除空白对照外每孔加酶标记物50μl,置37℃30分钟。
5>、甩净孔中液体,同上洗板3次,拍干后各孔滴加显色液A、B各50μl,置37℃避光10分钟,每孔立即加入终止液50μl,混匀后用酶标仪450nm读数判定结果。
3、质量控制
以空白孔调零,450nm波长测定A值。阳性对照平均值大于0.50,阴性对照平均值小于0.15,临界对照A值平均值介于0.15~0.60,证明实验成立。
4、结果判定
1>、酶标仪设定波长450nm,先用空白调零,然后测定各孔A值。
2>、样品A值<临界对照A值均值为阴性,样品A值≥临界对照值均值为阳性。
Claims (5)
1、一种弓形虫IgM抗体检测试剂,是由弓形虫抗原和酶标记抗弓形虫单克隆抗体及其他辅助试剂组成,其特征是将酶标记抗弓形虫单克隆抗体和弓形虫抗原混合,配制成可供检测的工作浓度。
2、权利要求1所述的弓形虫IgM抗体检测试剂,其中酶标记抗弓形虫单克隆抗体和弓形虫抗原混合液中酶标记抗弓形虫单克隆抗体工作浓度为1∶5000~1∶10000,弓形虫抗原的工作浓度为40~100μg/ml。
3、权利要求1的弓形虫IgM抗体检测试剂,其中酶标记抗弓形虫单克隆抗体是采取2株抗弓形虫单克隆抗体标记辣根过氧化物酶后,等体积混合,再与弓形虫抗原用含10%小牛血清、5%蛋清的PBS缓冲液配制而成。
4、一种弓形虫IgM抗体检测试剂盒,包括权利要求1~3之一所述的检测试剂。
5、权利要求4的弓形虫IgM抗体检测试剂盒,其组成为预包被抗人IgM-μ链单克隆抗体的微孔板、酶标记抗弓形虫单克隆抗体和弓形虫抗原混合物、阳性对照、临界对照、阴性对照、显色液A、显色液B、终止液、样品稀释液、浓缩洗涤液、密封袋、不干胶、记录纸、说明书。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB2005100363186A CN100554965C (zh) | 2005-08-05 | 2005-08-05 | 弓形虫IgM抗体检测试剂及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB2005100363186A CN100554965C (zh) | 2005-08-05 | 2005-08-05 | 弓形虫IgM抗体检测试剂及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1908667A true CN1908667A (zh) | 2007-02-07 |
CN100554965C CN100554965C (zh) | 2009-10-28 |
Family
ID=37699839
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB2005100363186A Active CN100554965C (zh) | 2005-08-05 | 2005-08-05 | 弓形虫IgM抗体检测试剂及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN100554965C (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102183637A (zh) * | 2011-01-25 | 2011-09-14 | 中国检验检疫科学研究院 | 检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法 |
CN103323604A (zh) * | 2013-06-27 | 2013-09-25 | 潍坊市康华生物技术有限公司 | 一种结核杆菌IgG抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法 |
CN103364552A (zh) * | 2012-04-01 | 2013-10-23 | 武汉中博生物股份有限公司 | 猪细小病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和其应用 |
CN103777025A (zh) * | 2012-10-18 | 2014-05-07 | 上海铭源数康生物芯片有限公司 | 蛋白质微阵列芯片的临界值一级参考品的制备方法、临界值系数的确定和实验结果判定方法 |
CN104965086A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-10-07 | 华南农业大学 | 一种犬弓形虫抗体间接elisa检测试剂盒 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6329157B1 (en) * | 1998-05-28 | 2001-12-11 | Abbott Laboratories | Antigen cocktails and uses thereof |
IT1315254B1 (it) * | 1999-11-05 | 2003-02-03 | Diesse Diagnostica Senese Spa | Metodo per la determinazione qualitativa e quantitativa di anticorpiumani di classe igc. |
CN1340712A (zh) * | 2000-09-01 | 2002-03-20 | 许宏艳 | 风疹、巨细胞、单疱病毒及弓形虫抗体酶免联检试剂盒 |
CN1194991C (zh) * | 2003-05-09 | 2005-03-30 | 李越希 | 重组弓形虫融合蛋白抗原及其制备方法、应用 |
-
2005
- 2005-08-05 CN CNB2005100363186A patent/CN100554965C/zh active Active
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102183637A (zh) * | 2011-01-25 | 2011-09-14 | 中国检验检疫科学研究院 | 检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法 |
CN103364552A (zh) * | 2012-04-01 | 2013-10-23 | 武汉中博生物股份有限公司 | 猪细小病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和其应用 |
CN103777025A (zh) * | 2012-10-18 | 2014-05-07 | 上海铭源数康生物芯片有限公司 | 蛋白质微阵列芯片的临界值一级参考品的制备方法、临界值系数的确定和实验结果判定方法 |
CN103323604A (zh) * | 2013-06-27 | 2013-09-25 | 潍坊市康华生物技术有限公司 | 一种结核杆菌IgG抗体酶联免疫检测试剂盒及其制备和使用方法 |
CN104965086A (zh) * | 2015-05-21 | 2015-10-07 | 华南农业大学 | 一种犬弓形虫抗体间接elisa检测试剂盒 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN100554965C (zh) | 2009-10-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111303254A (zh) | 新型冠状病毒(SARS-CoV-2)抗原检测试剂盒 | |
CN103048459B (zh) | 检测呼吸道合胞病毒的免疫检测试剂 | |
JP5554247B2 (ja) | ヒト体液中のシスタチンc測定方法 | |
JP5575377B2 (ja) | 抗rsウイルスモノクローナル抗体を用いたrsウイルス検出用キット及びイムノクロマトグラフィー用試験具、並びに新規な抗rsウイルスモノクローナル抗体 | |
CN101178408A (zh) | 载脂蛋白e4 elisa试剂盒及其制备方法 | |
CN1908667A (zh) | 弓形虫IgM抗体检测试剂及应用 | |
CN102876634B (zh) | 孕马血清促性腺激素双抗体夹心elisa试剂盒 | |
CN1547027A (zh) | 用间接酶免疫吸附试验检测犬狂犬病毒IgG试剂盒及制备方法 | |
CN106226522A (zh) | 一种高尔基体蛋白73的检测方法、检测试剂和检测试剂盒 | |
CN104849251A (zh) | 一种快速检测地沟油的时间分辨荧光免疫方法及试剂盒 | |
CN101907623B (zh) | 一种检测庆大霉素和/或小诺霉素的方法及其专用量子点荧光免疫试剂盒 | |
JPS63159762A (ja) | 口内微生物の評価方法 | |
CN102445549A (zh) | 新型柱凝集玻璃微珠卡式血型检测试剂 | |
CN111018971B (zh) | 柯萨奇病毒a6型实心病毒的单克隆抗体及其应用 | |
CN1790025A (zh) | 莱克多巴胺侧流免疫层析半定量检测试纸 | |
CN114058593A (zh) | SARS-CoV-2的N抗原的单克隆抗体、检测方法及其用途 | |
CN114076825A (zh) | 检测SARS-Cov-2病毒的检测试剂条、试剂盒和方法 | |
CN101256189A (zh) | 一种人体外自身抗体放射免疫定量检测方法 | |
RU2401301C1 (ru) | Клон гибридных клеток животных mus musculus l - продуцент моноклональных антител к холерному токсину | |
CN110938141B (zh) | 柯萨奇病毒a6型空心病毒的单克隆抗体及其应用 | |
CN101806801A (zh) | 快速检测乳制品中β-内酰胺酶的试剂板制备方法 | |
EP3548899B1 (en) | Rapid semiquantitative method for determining adamts-13 activity in a patient plasma sample | |
JP2001354700A (ja) | モノクロ−ナル抗体及びヒトフィブリン分解産物の測定方法 | |
RU2401303C1 (ru) | Клон гибридных клеток g10b6 животных mus musculus l - продуцент моноклональных антител к дифтерийному токсину | |
CN106771216B (zh) | 提高免疫试剂检测特异性的方法及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |