CN102183637A

CN102183637A - 检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN102183637A
Application number: CN2011100264256A
Authority: CN
Inventors: 胡孔新; 咸庆杰; 郭雪; 杨鹏飞; 平芮巾; 张丽萍; 马雪征
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2011-01-25
Filing date: 2011-01-25
Publication date: 2011-09-14

Abstract

本发明公开一种检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法，本发明应用哺乳动物细胞表达系统表达的西尼罗病毒样颗粒为包被抗原建立了ELISA方法，由于病毒样颗粒(VLPs)是含有一个或多个病毒结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，而且具有与天然病毒同样的构象和抗原表位，因此对人不具有感染性，稳定性好，不易失活，有较高的安全性，免疫原性更接近于天然病毒。本发明为检测人西尼罗病毒IgG抗体提供一种安全，特异，敏感，快速，操作简单，经济的试剂盒，为预防和控制西尼罗病毒从国外输入我国方面提供了技术手段和方法。

Description

检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及病毒学、分子生物学和生物制品领域，尤其是一种检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒及其检测方法。

背景技术

西尼罗病毒（West Nile Virus，WNV）为黄病毒科黄病毒属( Flavivirus)，为单股正链RNA病毒，表达的蛋白可以分为 10 个单独的蛋白结构:3 个结构蛋白 ,囊膜蛋白( E) 、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(C) ,以及 7 个非结构蛋白 NS1、 NS2A、 NS2B、NS3、 NS4A、 NS4B 和 NS5结构与登革病毒等黄病毒相似。西尼罗病毒感染人体以后可以引起一种称之为“西尼罗热”的急性传染病。这种病毒可以引起高热、头痛、肌肉疼痛、皮疹、淋巴结肿大等症状，可侵犯中枢神经系统，产生脑膜脑炎症状，严重者危及病人生命。目前尚无有效的治疗方法和疫苗接种,因此该病一旦暴发流行极易引起人们的恐慌,已构成全球性公共卫生的新威胁。西尼罗病毒感染的主要流行地区是非洲、北美洲、欧洲，但近年来，印度、马来西亚、泰国、菲律宾、土耳其、以色列、印度尼西亚、巴基斯坦等我国周边的国家相继出现，并有向我国传入的趋势，加强西尼罗病毒传入的监测和防范工作非常必要，尤其需要加强出入境人员、动物的感染监测以及出入境血液制品、生物制品等生物物质检测工作，并尽快调查国内动物血清学感染情况。因此，急需建立一种快速、简便的西尼罗病毒诊断方法。

目前，国内建立的检测WNV抗体的方法有PCR、TaqMan RT2PCR、NASBA、SYBR Green RT-PCR 等核酸检测，病毒分离培养，补体结合实验，血凝抑制实验等等。上述技术和方法虽然可以检测WNV及其抗体水平，在实践中也取的一定的效果，但均存在试验操作复杂，耗时长，需要特定的专业技能和仪器设备等，常限于实验室内进行，很难普及和推广。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒，内设置有包被西尼罗病毒样颗粒的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液，cutoff血清，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，洗涤液，TMB底物溶液和终止液。

进一步，所述西尼罗病毒样颗粒是通过基因重组技术，以真核细胞表达系统共表达病毒衣壳的蛋白成分，通过病毒形态学和分子免疫学鉴定，蔗糖梯度离心结合超速离心纯化，获得西尼罗病毒的VLPs。

进一步，所述样品稀释液为的 0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液；所述洗涤液为含0.1%吐温-20的0.1M、pH7.4的磷酸缓冲液，所述终止液为2M硫酸溶液。

利用上述试剂盒间接ELISA诊断人西尼罗病毒的方法，具体为：

1）被检测血清、cutoff血清、标准阳性血清和标准阴性血清都用血清稀释液作1:100稀释后，按酶标板加样模式每孔加入100ul，37度放置1h；

2）倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；

3）每反应孔加入辣根过氧化物酶羊抗人IgG使用液，每孔100ul，37度放置0.5h，倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；

4）每个显色孔加显色底物100ul，室温放置15min；

5）每个显色孔加终止液50ul终止反应；

6）用酶标仪测定OD值：在450nm波长下测定各孔吸光光。

进一步，所述方法检测样本的判定标准为：每板、或同一板的孔条或孔检测时，必须包括cut-off校准样和两个对照样，判定结果以待测样本OD₄₅₀值与cutoff OD₄₅₀值比值P/C，大于等于1.5判定为阳性，小于等于1.3判定为阴性，介于1.3-1.5之间为可疑，须重检，重检时P/C值大于等于1.5判定为阳性，小于等于1.3判定为阴性。

本发明应用哺乳动物细胞表达系统表达的西尼罗病毒样颗粒为包被抗原建立了ELISA方法，由于病毒样颗粒(VLPs)是含有一个或多个病毒结构蛋白的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，而且具有与天然病毒同样的构象和抗原表位，因此对人不具有感染性，稳定性好，不易失活，有较高的安全性，免疫原性更接近天然病毒。本发明为检测人西尼罗病毒IgG抗体提供一种安全，特异，敏感，快速，操作简单，经济的试剂盒，为预防和控制西尼罗病毒从国外入我国方面提供了技术手段和方法。

附图说明

图1为具有完整序列的29株西尼罗病毒资料统计图；

图2A为具有完整序列的西尼罗病毒株M氨基酸进化树比对图；

图2B为具有完整序列的西尼罗病毒株E氨基酸进化树比对图；

图2C为具有完整序的西尼罗病毒北美株与亚洲株M氨基酸进化树比对图；

图2D为具有完整序列的西尼罗病毒北美株与亚洲株E氨基酸进化树比对图；

图3A－1为正常293T细胞在10X倍下镜下图；

图3A－2为正常293T细胞在40X倍下镜下图；

图3A－3为正常293T细胞在100X倍下镜下图；

图3B－1为转染PCDNA5-WNV-JME后的293T细胞在10X倍下镜下结果图；

图3B－2为转染PCDNA5-WNV-JME后的293T细胞在40X倍下镜下结果图；

图3B－3为转染PCDNA5-WNV-JME后的293T细胞在100X倍下镜下结果图；

图4A为SDS-PAGE结果图；

图4B为用西尼罗病毒E单抗（millipore）进行Western印迹杂交图；

图5A为蔗糖密度梯度超速离心纯化后共表达西尼罗病毒M、E蛋白的真核细胞表达系统形成西尼罗病毒样颗粒电镜图；

图5B为图5A中的A部放大图；

图6为ELISA结果图。

具体实施方式

如图1至图6所示，图4A为SDS-PAGE结果，泳道1为正常293T细胞超声破碎，离心上清，过滤、超滤管浓缩后样品；泳道2为蛋白Marker；泳道3为共表达西尼罗病毒包膜蛋白的293T细胞培养上清液过滤、超滤管浓缩后样品；泳道4为共表达西尼罗病毒包膜蛋白的293T细胞超声破碎，离心上清，过滤、超滤管浓缩后样品。图4B为用西尼罗病毒E单抗（millipore）进行Western印迹杂交。泳道1为共表达西尼罗病毒包膜蛋白的293T细胞培养上清液过滤、超滤管浓缩后样品；泳道2为共表达西尼罗病毒包膜蛋白的293T细胞超声破碎，离心上清，过滤、超滤管浓缩后样品；泳道3为正常293T细胞超声破碎，离心上清，过滤、超滤管浓缩后样品；泳道2为蛋白Marker。图5A、5B显示蔗糖密度梯度超速离心纯化后共表达西尼罗病毒M、E蛋白的真核细胞表达系统形成西尼罗病毒样颗粒电镜照片。这些颗粒是由西尼罗病毒包膜M、E蛋白在293T细胞中共表达而产生于293T细胞胞内自动组装形成的。

本发明一种检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒，采用的技术策略是：通过基因重组技术，以真核细胞表达系统共表达病毒衣壳的蛋白成分，通过病毒形态学和分子免疫学鉴定，获得西尼罗病毒的VLPs，以用于抗体检测试剂盒的组装工作以及西尼罗病毒单克隆抗体的筛选工作。

在GENEBANK中检索西尼罗病毒（WNV），挑取完整全序列病毒株，用生物软件对这完整全序列病毒株M、E蛋白进行氨基酸序列分析比对，筛选出典型西尼罗病毒株NY99-crow-V76/1；

调出其目的基因片段PrM0（preM和M）和PrE0，分别合成，合成后克隆入pET30-a载体中.以其为模板，设计合适的引物，PCR扩增M,E片段，然后设计合适的引物,以其PCR产物为模板扩增，得到重组基因WNV-ME;最后引入信号肽，再克隆到PCDNA5-FRT载体上，转化筛选、测序鉴定，即得到了重组质粒PCDNA5-WNV-JME；

采用哺乳动物细胞表达系统，将重组质粒PCDNA5-WNV-JME，转染至293T细胞，通过间接免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA)、Western blotting 等方法鉴定目的蛋白表达，透射电镜下鉴定VLPs形成，采用蔗糖梯度离心结合超速离心对表达产物进行纯化；

以表达的病毒样颗粒为基础，通过酶联免疫技术研制一种检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒。

一．筛选典型西尼罗病毒株NY99-crow-V76/1

在GENEBANK中检索西尼罗病毒（WNV），共获得102株，其中完整全序列共29株。用生物软件对这29株M、E蛋白进行氨基酸序列分析比对，着重分析北美株与印度株表达的M、E蛋白在氨基酸水平上的同源性，最终选择典型毒株NY99-crow-V76/1为研究对象（附图1和2）

二．重组质粒PCDNA5-WNV-JME的构建

1.WNV病毒的prM和E基因合成及融合PCR扩增prME基因片段根据WNV NY99-crow-V76/1毒株的基因组序列(GenBank序列号为FJ151394.1),分别合成prM和E基因片段，合成后克隆入pET30-a载体中。设计用于prM和E基因融合PCR的上下游引物,其序列为:

prM的上游引物MEMP1:

5’GAAGATCTGGATCCGAACCACCATGGATGTTACCCTCTCTAACT3’，

prMM的下游引物MEMP2:

5’ctcattccaaggcagttgaaGCTGTAAGCTGGGGCCACCA3’；

E的上游引物MEEP1:

5’TGGTGGCCCCAGCTTACAGCttcaactgccttggaatgag3’,

E的下游引物MEEP2:

5’CGGAATTCCTCGAGCCTATTAATGATGATGATGATGGTGAG3’。

划线部分分别为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。分别将prM-pET30a和E-pET30a作为模板,扩增prM和E片段，扩增条件分别是：95℃5 min，然后95℃30 s，72℃30s，72℃1 min，扩增35个循环，72℃延伸10 min; 95℃5 min，然后95℃30 s，72℃30s，72℃2 min，扩增30个循环，72℃延伸10 min。然后以扩增出的prM和E片段为模板，用prM的上游引物MEMP1和E的下游引物MEEP2通过融合PCR扩增prME基因全长，扩增条件：95℃5 min，然后95℃30 s，72℃30s，72℃2.5 min，扩增35个循环，72℃10 min。

2.引入信号肽，获得重组基因WNV-JME 设计用于信号肽和WNV-ME基因融合PCR的上下游引物，其序列为:

信号肽上游引物WJP2-1:

5’CGGGATCCGCCACCATGGGAAAACGGTCAGCG 3’；

E下游引物WWP8：

5’ CCGCTCGAGCTATTAAGCGTGCACGTTCACGGAG 3’；

划线部分分别为BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点.以信号肽和WNV-ME基因作模板，用PfuUltraⅡ高保真聚合酶拼接扩增WNV-JME片段。

PCR反应体系为(50μl)：WJP2-1 (10UM)1μl、WWP8 (10UM)lμl、dNTPmix(2.5mmol/I_tL)5μl、PfuUltraⅡ10xBuffer5μl、PfuUltraⅡ高保真聚合酶1μl、ddH20 35μl， WNVME PCR产物（稀释100倍）1μl，信号肽WNV-SignalPCR产物（10倍稀释）1μl进行PCR扩增。扩增条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，72℃退火30s，72℃延伸3 min，35个循环后72℃延伸10 min。

3.将重组基因WNV-JME克隆到PCDNA5-FRT载体上 WNV-JMEW纯化产物经BamHI和XhoI双酶切后，在T4连接酶的作用在，插入到BamHI和XhoI双酶切的载体pcDNA5/FRT上，即获得了重组质粒PCDNA5-WNV-JME。

三．表达产物的表达及鉴定

将重组质粒PCDNA5-WNV-JME通过PEI或脂质体转染法转染至293T细胞，48h后收集细胞和细胞培养上清，通过间接免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA)、Western blotting 等方法鉴定。

1、间接免疫荧光法初步检测西尼罗病毒蛋白在293T细胞中的表达。收集转染48h后的细胞，用预冷的1xPBS清洗细胞两遍，取适量细胞滴到八孔显微镜载玻片上，晾干，冷丙酮固定10min，加入稀释的抗WNV 抗体(使用PBS 1:40稀释)37度孵育1 h，漂洗液洗涤5次,每次3min; 加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗小鼠IgG 室温结合40min(使用伊文思兰 1:50 稀释)。漂洗液洗涤5 次后于荧光显微镜下观察。结果转染的293T细胞出现绿色荧光，为转染的293T细胞未出现绿色荧光，表明西尼罗病毒蛋白转染后的293T细胞中表达了（附图3)。

2、表达产物的SDS-PAGE和蛋白印迹鉴定。将收集到细胞上清过滤和超滤管浓缩进行初步纯化，电泳前将初步纯化的表达产物3体积加入1体积的4X SDS样品处理液，100度水浴10min，冷却后加样行12% SDS-PAGE.蛋白分离后经考马斯亮蓝染色，脱色液脱色后GL200凝胶成像系统分析结果，行Western blotting 时，蛋白分离后，电转至PVDF膜，37℃ 5%脱脂奶粉封闭1.5h，一抗（鼠抗西尼罗病毒E 1:100）4℃ 过夜，二抗37℃孵育 1h，增强化学发光法（ECL)显影，暗室压片。结果既表明西尼罗病毒包膜蛋白E的表达又表明表达产物保持了西尼罗病毒的抗原性（附图4）。

3、纯化产物的TEM电镜观察

取少量纯化产物，经磷酸钨负染后，TEM(透射电镜)电镜下观察可见到直径大约50nm左右，圆形的颗粒物，表面有类似刺突样的结构，结构类似天然WNV颗粒(附图5）。

4、酶联免疫吸附试验（ELISA)鉴定。

（1）试剂配制

包被液：Na2CO3 1.59克，NaHCO3 2.93克，加蒸馏水至1000mL。

PBS：KH2PO4 0.24克，Na2HPO4·12H2O 3.58克，NaCl 8.0克，KCl 0.2克，加蒸馏水至1000mL，pH7.4。

PBST：KH2PO4 0.24克，Na2HPO4·12H2O 3.58克，NaCl 8.0克，KCl 0.2克，加蒸馏水至1000mL，pH7.4，再加1ml的吐温-20，用于洗涤。

封闭液：PBS中加入15%胎牛血清，用于封闭。

终止液：2M硫酸溶液

（2）操作过程

1）将初步纯化的抗原用ELISA包被液稀释，反应板每孔加100ul，4℃冰箱过夜；

3）加封闭液300ul，37℃放置2h；

4）倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；

5）将西尼罗病毒阳性血清和阴性血清用封闭液1:200倍稀释，反应板每孔100ul，同时作稀释液对照，37℃放置1h；

6）倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；

7）加辣根过氧化物酶羊抗人IgG（1:5000倍稀释）, 每孔100ul， 37℃放置0.5h；

8）倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；

9）加底物：加TMB100ml，室温暗处放置15min；

10）加终止液：每孔50ul；

11）观察结果：用酶联免疫检测仪记录450nm读数

（3）结果阳性血清OD_450nm和阴性血清OD_450nm有明显的差异。（附图6)

至此，通过间接免疫荧光、Western blotting、TEM电镜以及酶联免疫吸附试验（ELISA)鉴定，表明了西尼罗病毒包膜蛋白（PrM/M，E）在哺乳动物细胞系统中的表达并且在细胞中自动组装而形成病毒样颗粒，保持其完整的抗原性及其颗粒形态，ELISA的结果说明该表达产物具有开发西尼罗病毒检测ELISA试剂盒的潜力。

四．人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒的制备、组装及使用

本试剂盒应用哺乳动物细胞表达系统表达的病毒样颗粒作为包被抗原。

1. 试剂盒的组分

①　ELISA板条：每个试剂盒装有1块锡箔真空包装的ELISA板，每个ELISA板含有可拆卸的已包被抗原的ELISA板条，包被抗原为哺乳动物细胞表达系统表达的西尼罗病毒样颗粒，规格8孔x12条

②　洗涤液和血清稀释液：洗涤液为10倍浓缩的PH 7.4 PBST溶液100ml，血清稀释液为含有PH 7.4 PBS，万分之一的硫柳汞和保护蛋白的溶液100ml.

③　酶标二抗：辣根过氧化物酶羊抗人IgG使用液，15ml/瓶

④　底物显色液：直接使用，15ml/瓶

⑤　终止液：2molH2SO4 15ml/瓶

⑥　cutoff血清：0.1ml

⑦　标准阳性血清：0.1ml

⑧　标准阴性血清：0.1ml

2. 组分的制备

①　抗原的制备

细胞培养上清10000 rpm离心10min去除细胞碎片，澄清后的上清通过0.45um的过滤器过滤，滤过液经100KD超滤管浓缩至5ml，样品做进一步的超速离心纯化。将样品转入Ultra-clear离心管，50000rpm，3h，4℃，（SW 55Ti转子）弃去上清，200 ulPBS重悬。超离心管加入4.8ml的10%-60%的连续性蔗糖溶液（离心缓冲液配制，w/w)，顶端加入初步纯化的样品200 ul，30000rpm，2.5h，4 ℃（ SW 55Ti转子），从上往下每管400ul收集样品，共收集13管。ELISA法确定并收集富含目的蛋白的样品，将样品转入Ultra-clear离心管，50000rpm，3h，4℃，（SW 55Ti转子）弃去上清，200 ulPBS重悬，分装保存。

②　阳性对照、阴性对照与cutoff对照的制备

将筛选获得的西尼罗病毒阳性血清按1000U/ml加入青霉素和链霉素，按万分之一的比例加入硫柳汞，无菌过滤，作为阳性对照；将筛选获得的西尼罗病毒阳性血清按1000U/ml加入青霉素和链霉素，按万分之一的比例加入硫柳汞，无菌过滤，作为阳性对照；应用建立的检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA方法对100份已知阴性的血清样品进行检测。对于这些血清数据经统计学分析，确定一个能区分阴性和阳性血清的校准值，这个校正值即定义为cutoff校正值，接近cutoff校正值的血清作为cutoff血清。将按筛选得到的cutoff血清，按1000U/ml加入青霉素和链霉素，按万分之一的比例加入硫柳汞，无菌过滤，作为cutoff对照。

③　试剂配制

1) 包被液为pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液（Na2CO3 1.59克，NaHCO3 2.93克，加蒸馏水至1000mL。

2) 样品稀释液为的 0.01M的磷酸缓冲液（KH2PO4 0.24克，Na2HPO4·12H2O 3.58克，NaCl 8.0克，KCl 0.2克，加蒸馏水至1000mL，pH7.4）。

3) 10倍浓缩的洗涤液为含0.1%吐温-20的0.1M的磷酸缓冲液（KH2PO4 2.克，Na2HPO4·12H2O 35.8克，NaCl 80克，KCl 2克，加蒸馏水至1000mL，pH7.4,取990ml再加10ml的吐温-20）

4) 封闭液为含15%胎牛血清的 0.01M的磷酸缓冲液（KH2PO4 0.24克，Na2HPO4·12H2O 3.58克，NaCl 8.0克，KCl 0.2克，加蒸馏水至1000mL，pH7.4，取850ml加150ml的胎牛血清）

5) 终止液为2M硫酸溶液，即量取111.2ml浓硫酸（18M)稀释定容至1000ml。

④ ELISA检测板条的制备

1) 将抗原用包被液按一定浓度稀释后，包被ELISA板，每孔包被100ul，4度包被过夜。

2) 将包被了抗原的微孔板用PBST（PBS+0.1%Tween-20）洗涤3次，每次3min，最后一次拍干。

3) 用封闭液进行封闭，每孔300ul，37度放置2h

4) 用PBST洗涤3次，室温晾干，每次3min，最后一次甩干，室温晾干，真空包装，4度保存。

3. 使用

①　被检测血清、cutoff血清、标准阳性血清和标准阴性血清都用血清稀释液作1:100稀释后，按酶标板加样模式每孔加入100ul，37度放置1h，倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；

②　每反应孔加入辣根过氧化物酶羊抗人IgG使用液，每孔100ul，37度放置0.5h，倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静置3min，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽；

③　每个显色孔加显色底物100ul，室温放置15min；

④　每个显色孔加终止液50ul终止反应；

⑤　用酶标仪测定OD值：在450nm波长下测定各孔吸光光度值。

4. 结果判定

每板检测时（或同一板的孔条或孔）必须包括cut-off校准样和两个对照样，判定结果以待测样本OD₄₅₀值（去除空白OD₄₅₀值）与cutoff OD₄₅₀值（去除空白OD₄₅₀值）比值（P/C），大于等于1.5判定为阳性，小于等于1.3判定为阴性。介于1.3-1.5之间为可疑，须重检，重检时P/C值大于等于1.5判定为阳性，小于等于1.3判定为阴性。

本发明中所用的诊断抗原为西尼罗病毒样颗粒，它是由西尼罗病毒包膜蛋白（PrM/M，E）在哺乳动物细胞系统中的表达并在细胞中自动组装而形成的空心颗粒，没有病毒的核酸，不能自主复制，而在形态结构、抗原性等方面具有与原病毒非常相似。与其他免疫诊断抗原相比较：①西尼罗病毒样颗粒在形态结构、空间构像、抗原性等方面都接近于天然病毒，它既能解决具有病毒抗原表位的合成肽抗原的抗原表位少的问题，又能克服基因重组抗原只有线性抗原表位而无（或者含有很少）构象抗原表位的缺陷。②灭活的病毒作为抗原，提取的抗原纯度相对较差，影响测定的特异性和灵敏性，且存在散毒的危险，病毒样颗粒，是空心颗粒，无核酸，不能自主复制，不存在散毒的危险，且能保证测定的特异性和灵敏性。

哺乳动物细胞表达系统相对于原核表达系统和杆状病毒表达系统：产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白最接近，糖基化后加工更准确。本发明中所用的诊断抗原是采用基因重组技术，通过哺乳动物表达系统获得，保证了抗原的特异性和敏感性。

用西尼罗病毒样颗粒建立ELISA诊断方法，具有操作简便、快捷，所需试剂及实验条件简单的优点，并具有良好的特异性与敏感性，为西尼罗病毒感染的诊断及免疫评价提供了良好的方法。

Claims

1.检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，该试剂盒内设置有包被西尼罗病毒样颗粒的可拆96孔酶标板，酶结合物工作液，cutoff血清，阳性对照，阴性对照，样品稀释液，洗涤液，TMB底物溶液和终止液。

2. 如权利要求1所述的检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述西尼罗病毒样颗粒是通过基因重组技术，以真核细胞表达系统共表达病毒衣壳的蛋白成分，通过病毒形态学和分子免疫学鉴定，蔗糖梯度离心结合超速离心纯化，获得西尼罗病毒的VLPs。

3. 如权利要求1所述的检测人西尼罗病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为的 0.01M、pH7.4的磷酸缓冲液；所述洗涤液为含0.1%吐温-20的0.1M、pH7.4的磷酸缓冲液，所述终止液为2M硫酸溶液。

4.利用上述试剂盒间接ELISA诊断人西尼罗病毒的方法，其特征在于，该方法具体为：

4）每个显色孔加显色底物100ul，室温放置15min；

5）每个显色孔加终止液50ul终止反应；

6）用酶标仪测定OD值：在450nm波长下测定各孔吸光光。

5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法检测样本的判定标准为：每板、或同一板的孔条或孔检测时，必须包括cut-off校准样和两个对照样，判定结果以待测样本OD₄₅₀值与cutoff OD₄₅₀值比值P/C，大于等于1.5判定为阳性，小于等于1.3判定为阴性，介于1.3-1.5之间为可疑，须重检，重检时P/C值大于等于1.5判定为阳性，小于等于1.3判定为阴性。