CN106018780A - 一种基于f1蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒 - Google Patents

一种基于f1蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于F1蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒。该试剂盒包括表达F1蛋白的293T细胞，FITC标记的羊抗鸡抗体，样品稀释液，洗涤液。本发明试剂盒具有良好的特异性；该试剂盒不仅能用于血清4型禽腺病毒感染状况流行病学调查，而且能有效用于监测免疫鸡群血清4型禽腺病毒抗体水平，用于评价免疫保护性抗体水平等。

Description

一种基于F1蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试 剂盒
技术领域
本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种基于F1蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒。
背景技术
禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)，12个血清型。虽然在世界各地均有报道，FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdV引起的包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年，FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前FAdV爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给国内养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现，目前高致病性4型FAdV在国内鸡群流行较广泛。然目前尚无针对4型FAdV血清学抗体检测的快速方法及其试剂盒。在FAdV的编码蛋白中，F1纤突蛋白为FAdV的表面蛋白，在介导FAdV病毒感染宿主细胞中起重要作用，能有效刺激机体产生体液免疫，甚至中和抗体。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种基于F1蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒。本发明的原理和最核心的关键技术是构建了血清4型禽腺病毒F1蛋白基因真核表达质粒，并将转染该质粒的表达F1蛋白的293T细胞作为抗原建立试剂盒，检测血清4型禽腺病毒特异性抗体。
本发明所述的一种基于F1蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒，包括表达F1蛋白的293T细胞，FITC标记的羊抗鸡抗体，样品稀释液，洗涤液。
其中，所述表达F1蛋白的293T细胞，是转染F1蛋白真核表达质粒的表达4型禽腺病毒F1蛋白的293T细胞；
其中，所述稀释液及洗涤液是10mM pH7.2的磷酸缓冲液。
所述表达F1蛋白的293T细胞，通过下述步骤得到：
(1)禽腺病毒F1蛋白真核表达质粒构建：以pcDNA3.1真核表达载体以及血清4型禽腺病毒基因组为模板，分别以SEQ ID NO.1-2和SEQ ID NO.3-4的序列为引物，分别PCR扩增出线性化的pcDNA3.1载体以及血清4型禽腺病毒F1蛋白基因(SEQ ID No.5)；随后利用重组酶ExnaseTM II将线性化的pcDNA 3.1载体以及血清4型禽腺病毒F1蛋白基因的PCR产物进行快速体外重组克隆(参见图1，图2)，重组克隆经序列验证后，命名为pcDNA3.1-FAdV_F1(参见图3)。并血清4型禽腺病毒阳性鸡血清通过western blot验证F1蛋白在293T细胞中的表达(参见图4)。
(2)制备检测血清4型禽腺病毒抗体的抗原:将pcDNA3.1-FAdV_F1重组质粒，用MIRUS转染液转染293T细胞。细胞转染48小时后，用丙酮乙醇固定液固定细胞5分钟；固定的表达细胞血清4型禽腺病毒F1蛋白的293T细胞自然干燥后置-20度待用，即为检测血清4型禽腺病毒抗体的抗原。
检测血清4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒：该试剂盒成分包括固定在96孔中的表达F1蛋白的293T细胞，商品化的FITC标记的羊抗鸡抗体，样品稀释液以及洗涤液。该试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：固定在96孔中的表达F1蛋白的293T细胞用PBS洗涤一遍后，加入稀释的血清样品，37度反应1小时；PBS洗涤3遍后，加入稀释的FITC标记的羊抗鸡抗体，37度反应1小时；PBS洗涤3遍后，进行倒置荧光显微镜下观察。若出现细胞核内亮绿色特异荧光，则该样品判为阳性(图5A)；否则为阴性(图5C)。
本发明的有益效果体现在：本发明建立的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒能特异性的检查出抗血清4型禽腺病毒抗体，而不能检测出抗其它病原的抗体(图5A-H)。因此，该试剂盒具有良好的特异性。该试剂盒不仅能用于血清4型禽腺病毒感染状况流行病学调查，而且能有效用于监测免疫鸡群血清4型禽腺病毒抗体水平，用于评价免疫保护性抗体水平等。
附图说明
图1，PCR扩增线性化pcDNA3.1载体
1：线性化的pcDNA3.1载体；M：1Kb DNA Ladder。
图2，PCR扩增F1基因
1：血清4型禽腺病毒F1蛋白基因；M：1Kb DNA Ladder。
图3，pcDNA3.1-FAdV_F1重组表达载体鉴定
1：pcDNA3.1-FAdV_F1重组质粒F1基因PCR；M:DL5000DNA Marker。
图4，pcDNA3.1-FAdV_F1在293T细胞表达效果
1：正常293T细胞裂解产物；2：转染pcDNA3.1-FAdV_F1的293T细胞裂解产物；M：1KbProtein Marker。
图5，检测4型FAdV抗体的间接免疫荧光试剂盒检测效果
A：转染pcDNA3.1-FAdV_F1的293T细胞与FAdV血清反应；B：未转染质粒的293T细胞与FAdV血清反应；C：转染pcDNA3.1-FAdV_F1的293T细胞与SPF鸡血清反应；D：转染pcDNA3.1-FAdV_F1的293T细胞与抗马立克氏病病毒血清反应；E:转染pcDNA3.1-FAdV_F1的293T细胞与抗禽白血病病毒血清反应；F:转染pcDNA3.1-FAdV_F1的293T细胞与抗禽流感病毒血清反应；G：转染pcDNA3.1-FAdV_F1的293T细胞与抗鸡新城疫病毒血清反应；H:转染pcDNA3.1-FAdV_F1的293T细胞与抗传染性法氏囊病病毒血清反应。
具体实施方式
实施例：
1,血清4型禽腺病毒分离:取疑似4型禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后用按1:5的比例加入PBS制成悬液；5000r/min离心15min，取上清；加入青霉素和链霉素各1000IU/ml，37℃反应30min；经0.45um微孔滤器过滤后，以0.2ml/胚的剂量，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后96-120小时后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为4型禽腺病毒后，－20℃保存。
2，设计扩增出含pcDNA3.1线性化载体与血清4型禽腺病毒F1蛋白基因片段的引物：具体引物序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
表1.PCR扩增线性化pcDNA3.1及血清4型禽腺病毒F1蛋白基因引物
3，血清4型禽腺病毒基因组的制备：取血清4型禽腺病毒分离毒株病毒上清400uL于1.5mL指形管内，加入400uL细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20mmol/L EDTA pH8.0，2％SDS和蛋白酶K)，充分混匀后放置56℃水浴锅作用4小时；加入400uLTris平衡酚，充分混匀后10000r/min离心10分钟，取上清于另一1.5mL指形管；加入400uL酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后10000r/min离心5分钟，取上清于另一1.5mL指形管；加入800uL无水乙醇，颠倒混匀后放入-20℃孵育30分钟，12000r/min离心15分钟，弃尽上清；室温自然干燥后向沉淀加入30uL灭菌超纯水和2uLRNA酶，充分溶解后，即得血清4型禽腺病毒基因组，置-20℃备用。
4，PCR扩增pcDNA3.1线性化载体以及血清4型禽腺病毒F1蛋白基因片段：分别以pcDNA3.1载体质粒(Invitrogen公司)以及以上制备的4型禽腺病毒基因组为模板，表1所述相应引物为引物分别进行PCR扩增出线性化的pcDNA3.1载体以及血清4型禽腺病毒F1蛋白基因(SEQ ID No.4)。PCR扩增反应体系为：模板1uL，5×Buffer10uL，10mM dNTP Mix 1uL，上游引物为10μmol 2uL，下游引物为10μmol 2uL，高保真酶1uL，加入灭菌超纯水至50uL。PCR扩增反应循环参数为：95℃预变性4分钟，随后进行30个循环(95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸3分钟)，72℃延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳分析(如图1，图2所示)。
5，pcDNA3.1-FAdV_F1重组表达载体构建：将以上纯化的线性化载体pcDNA3.1以及血清4型禽腺病毒F1蛋白基因片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTMⅡ的作用下进行重组克隆。具体重组反应体系如下：纯化的血清4型禽腺病毒F1蛋白基因片段PCR产物50-100ng，纯化的pcDNA3.1线性化载体50ng，2μL商品化的ExnaseTMⅡ酶，4μL5倍的缓冲液，其它补加水至20μL。反应物于37℃作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20μL反应物转化到常规感受态细菌，涂LB板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，并进行PCR鉴定(如图3所示)。利用血清4型禽腺病毒阳性鸡血清通过western blot验证F1蛋白在293T细胞中的表达(如图4)。
6，制备检测血清4型禽腺病毒抗体的抗原：在96孔细胞板中培养293T细胞至形成80％-90％单层；随即参照转染试剂TransIT-LT1说明书的步骤进行pcDNA3.1-FAdV_F1重组表达质粒转染。具体步骤：先将48ug质粒溶于1.6ml的OPTI-MEM培养基，然后加入72uL的TransIT-LT1转染试剂，混匀后室温放置；45分钟后加入6.4ml的OPTI-MEM培养基；混匀后滴加到96孔细胞板，每孔80ul。细胞转染48小时后，弃去96孔细胞板中培养基，并用丙酮乙醇固定液固定细胞5分钟；固定的表达细胞血清4型禽腺病毒F1蛋白的293T细胞自然干燥后置-20度待用，即为检测血清4型禽腺病毒抗体的抗原。
7，检测血清4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒组装及应用：该试剂盒成分包括1块固定的表达F1蛋白的293T细胞96孔板，1ml商品化的FITC标记的羊抗鸡抗体，200ml样品稀释液以及洗涤液(PBS)，1ml阳性血清及1ml阴性血清。该试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：先用PBS洗涤一遍固定有表达F1蛋白的293T细胞96孔板，然后加入1:100稀释的血清样品(同时设立1:100的阳性血清及阴性血清对照)，50ul/孔，37度反应45min；PBS洗涤3遍后，加入1:100稀释的FITC标记的羊抗鸡抗体，50ul/孔，37度反应30min；PBS洗涤3遍后，进行倒置荧光显微镜下观察。若出现细胞核内亮绿色特异荧光，则该样品判为阳性(图5A)；否则为阴性(图5C)。试剂盒特异性试验发现，4型腺病毒血清可与表达F1的293T细胞呈现特异性亮绿色荧光(图5A)，与不表达F1的正常293T细胞不反应(图5B)；而SPF鸡血清、抗马立克氏病病毒血清、抗鸡新城疫病毒抗体、抗禽白血病病毒抗体、抗禽流感病毒抗体以及抗传染性法氏囊病病毒抗体均与表达F1的293T细胞不反应(分别为图5中C、D、E、F、G、H)。

Claims (3)

1.一种基于F1蛋白的检测4型禽腺病毒抗体的间接免疫荧光试剂盒，其特征在于，包括表达F1蛋白的293T细胞，FITC标记的羊抗鸡抗体，样品稀释液，洗涤液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述表达F1蛋白的293T细胞，是转染F1蛋白真核表达质粒的表达4型禽腺病毒F1蛋白的293T细胞。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于稀释液及洗涤液是10mM pH7.2的磷酸缓冲液。
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