CN102286638A - 一种鸡传染性支气管炎病毒的鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的鉴定方法，该方法是将待检样品尿囊腔接种SPF鸡胚，同时设接种PBS缓冲液的SPF鸡胚做为对照，将两组鸡胚分别于37℃孵化24-30h后接种200-2000倍鸡胚半数感染量(EID50)的鸡新城疫病毒弱毒株，之后再于37℃分别孵化48-72h后检测鸡胚尿囊液血凝价，根据血凝价判定结果。本方法利用了IBV病毒能够在鸡胚中干扰鸡新城疫病毒(NDV)增殖的特性，可用于鸡传染性支气管炎的实验室诊断、抗体检测和IBV血清型鉴定，以进行鸡传染性支气管炎疫苗免疫效果的评价、疫情监测等，为制定科学的免疫程序并有效防控该病的发生提供理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术，具体涉及一种鸡传染性支气管炎病毒的鉴定方法。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一种急性、高度接触传染性、病毒性疾病。鸡传染性支气管炎于1930年在美国北达科塔州首次发现，主要危害2日龄到3周龄雏鸡的呼吸道，特征是喘息、精神倦怠，死亡率为40％-90％。根据IBV感染鸡群后引起的临床症状，分为呼吸型、肾型、肠型等多种病型，还有一些变异的中间型。随着多种IB疫苗的广泛使用和临床混合感染的普遍发生，IBV感染鸡群后日益缺乏典型的临床症状和病理变化，必须通过实验室诊断才能最终确诊，从而采取科学、有效的防治措施。
IBV的基因组为单股正链RNA，由于RNA基因组的高突变率以及其具有的独特转录合成机制，导致了新基因型和血清型IBV毒株不断出现，而不同血清型毒株间的交叉保护力很低甚至没有，如果所用的疫苗毒株与当地流行毒株的血清型不一致，则不能产生有效的免疫保护。因此，对各地方流行病毒株的分离、鉴定和血清型划分的研究一直是IBV的研究热点，而如何快速、准确地鉴定IBV是现在亟需解决的问题。
目前IB的实验室诊断方法主要有病原分离鉴定、血清学技术以及近年来发展的分子生物学方法(核酸探针和RT-PCR技术等)。病原分离鉴定操作简单，是当前应用最为广泛的实验室诊断技术，也是IB实验室诊断的主要标准。但大多数IBV野毒不适于鸡胚生长，需要至少2-4代盲传(约12-16天)，才能使鸡胚产生典型病变，因此，常常延误最佳治疗时机。而血清学方法由于IBV血清型繁多(据报道目前有30余种)导致鉴定程序繁琐目前已很少应用。目前发展的分子生物学方法虽然能够快速诊断IBV，但需要特殊的仪器设备，一般基层实验室很难推广。
发明内容
本发明针对现有技术中IBV分离鉴定存在的费时、缺乏客观判定标准的问题，提供了一种利用IBV病毒能够在鸡胚中干扰鸡新城疫病毒(NDV)的特性而研究的快速、准确的IBV鉴定方法，本方法主要采用将待检样品尿囊腔接种鸡胚，之后接种鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)弱毒株LaSota并最终根据鸡胚尿囊液血凝价的检测结果来鉴定IBV是否存在，由于这种方法采用了间接测定的方式，较之现有技术有着检测速度快，不需特殊培养的特点，且可以广泛的用于鸡传染性支气管炎的实验室诊断、抗体检测和IBV血清型鉴定，以进行IB疫苗免疫效果的评价、疫情监测等，为制定科学的免疫程序并有效防控IB的发生提供理论依据。另外由于本方法无需特殊仪器设备，便于在一般基层实验室推广应用。
本发明提供的具体技术方案是：将待检样品尿囊腔接种SPF鸡胚，同时设接种PBS缓冲液的SPF鸡胚做为对照，将两组鸡胚分别于37℃孵化24-30h后接种200-2000EID50的鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)弱毒株，之后再于37℃分别孵化48-72h后检测鸡胚尿囊液血凝价(HA)，根据血凝价(HA)判定结果：当对照组鸡胚尿囊液HA效价为9-11log2时，若接种待检样品的鸡胚尿囊液HA效价为0-2log2，则为IBV阳性，若接种待检样品的鸡胚尿囊液HA效价为9-11log2，则为IBV阴性。
由于NDV和IBV在9-11日龄SPF鸡胚中生长良好，一般待检样品接种后需要20-30h再接种NDV，所以综合考虑，选用9-10日龄SPF鸡胚进行接种。将上述接种后的SPF鸡胚在37℃孵化24-30h，时间过短，IBV在鸡胚中尚未增殖，对NDV无干扰作用；时间过长，IBV含量过高，可能导致鸡胚死亡，无法再接种NDV，孵化时间优选24h。为了生物安全，避免强毒对环境的污染，本发明选用弱毒株疫苗，例如C30或LaSota进行接种。作为国内最常用的弱毒疫苗株，优选最具代表性的LaSota，上述的弱毒株疫苗均为市售疫苗。NDV的接种量在200-2000EID50都可以，因为本发明中和试验中的病毒量为200EID50，为了易于试验，本发明选用剂量为200EID50。接种NDV后，再在37℃孵化48-72h，优选48h，使得鸡胚尿囊液HA效价最高，从而根据HA判定结果。
由于对照组鸡胚只接种PBS缓冲液，不含有IBV，所以不会对NDV的增殖造成干扰，如果接种待检样品的鸡胚尿囊液HA效价与对照组相同，则说明待检样品中没有IBV，反之，则待检样品中有IBV。
本发明中，NDV和IBV接种的先后顺序不能颠倒，否则IBV对NDV增殖无干扰作用，无法检测。
本发明所采用的待检样品，其处理过程是：当选用病变组织作为待检样品时，将病变组织用研磨器磨碎后，加入含青霉素2000IU/mL、链霉素2mg/mL的0.01MPBS pH为7.4的缓冲液，混匀，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心后取上清，4℃作用2-4h，即可用于鸡胚接种；病变组织为临床上怀疑感染IBV的病死鸡的内脏器官，主要包括鸡的气管或肺脏或肾脏或输卵管或肠道或肝脏或脾脏。
当选用病鸡喉气管棉拭子样品和泄殖腔棉拭子样品作为待检样品时，在PBS缓冲液中加入青霉素10000IU/mL、链霉素10mg/mL、丁胺卡那霉素5000IU/mL、制霉菌素5000IU/mL后进行上述制备。
本发明所涉及的技术方案主要是针对IBV接种后鸡胚孵化时间、NDV弱毒株的选择及接种剂量、接种NDV后的鸡胚孵化时间、NDV和IBV接种的先后顺序等进行了条件优化。在此优化条件下所获得的鸡胚尿囊液的HA效价在鸡胚间的离散度最低，阳性样品HA效价为0-2log2，阴性样品HA效价为9-11log2，两者差异显著(P＜0.01)，从而使结果的判定更加准确。
综上所述，本发明的IBV鉴定方法与病毒分离、RT-PCR方法比较，本发明采用了间接测定的方式，较现有的技术有着检测速度快，结果准确度高，不需特殊的仪器设备等特点，一般72h即可获得检测结果(见表1)，可以广泛用于鸡传染性支气管炎的实验室诊断、抗体检测和IBV血清型鉴定，从而进行IB疫苗免疫效果的评价、疫情监测等，为制定科学的免疫程序并有效防控IB的发生提供理论依据。
表1 本发明方法与病毒分离、RT-PCR方法比较
注：d为天，h为小时。
具体实施方式：
实施例1
1.1 样品的采集与处理
将临床上怀疑感染IBV的病死鸡的气管、肺脏、肾脏、输卵管、肠道、肝脏、脾脏等病变组织用研磨器磨碎后，加入含青霉素(2000IU/mL)、链霉素(2mg/mL)的0.01MPBS缓冲液(PH7.4)，混匀，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心后取上清，4℃作用2h，即可用于鸡胚接种。
1.2 鸡胚接种
将上述处理的待检样品尿囊接种9日龄SPF鸡胚5枚，试验同时设预先接种PBS缓冲液的5枚SPF鸡胚为对照。将两组鸡胚分别于37℃孵化27h，弃去死亡鸡胚，存活鸡胚尿囊腔接种0.2ml(病毒含量：200EID50)NDV弱毒株LaSota，37℃孵化48h后检测鸡胚尿囊液HA效价。
1.3 结果判定
对照组鸡胚HA效价应为9-11log2，此时若试验组鸡胚HA效价为0-2log2，则待检样品中含有IBV；若HA效价为9-11log2，则待检样品中无IBV。
实施例2
2.1 IBV病毒含量(EID50)测定：
IBV标准疫苗株H120、491和MA5和分离株002、007、008、283、369、327、356(其中，标准疫苗株H120购自中国兽药监察所，491和MA5从IBV活疫苗中扩增；分离株为本实验室分离，经RT-PCR测序鉴定。)经无菌处理后分别用0.01MPBS缓冲液10倍稀释，取10-3-10-86个稀释度，每个稀释度分别接种9-10日龄SPF鸡胚5枚，37℃孵化24h，弃去死亡鸡胚，存活鸡胚尿囊腔接种0.2ml(病毒含量：200EID50)NDV弱毒株LaSota，37℃孵化，孵至48h检测鸡胚尿囊液HA效价。若鸡胚HA效价为0-2log2，则判为IBV感染。根据Reed-Muench法计算各毒株的EID50，分别为：H120：10-5.5/0.2ml，491：10-6.5/0.2ml，MA5：10-6.2/0.2ml，002：10-7.0/0.2ml，007：10-5.0/0.2ml，008：10-6.2/0.2ml，283：10-5.3/0.2ml，369：10-5.4/0.2ml，327：10-6.0/0.2ml，356：10-6.0/0.2ml。
2.2 鸡胚中和试验：
根据上述EID50测定结果，将IBV标准疫苗株(491、H120和MA5)和分离株分别进行10倍稀释，取含200EID50的IBV病毒液与等体积的经2倍系列稀释的IBV标准阳性血清混匀，室温作用60min，接种9-10日龄SPF鸡胚5枚，37℃孵化24h，弃去死亡鸡胚，存活鸡胚尿囊腔接种0.2ml(病毒含量：200EID50)NDV弱毒株LaSota，37℃孵化48h后检测鸡胚尿囊液HA效价。试验同时设接种0.2ml 0.01MPBS缓冲液的5枚9-10日龄鸡胚为对照组，37℃孵化24h，弃去死亡鸡胚，存活鸡胚尿囊腔接种0.2ml(病毒含量：200EID50)NDV弱毒株LaSota，37℃孵化48h后检测鸡胚尿囊液HA效价，若试验组鸡胚HA效价与对照组HA效价相同，为9-11log2，则说明血清有中和作用，若试验组鸡胚HA效价为0-2log2，与对照组HA效价不同，则没有中和作用。
表2 血清中和试验结果
注：[1]“+”表示阳性反应，即IBV毒株能被阳性血清中和。[2]“-”表示阴性反应，即IBV毒株不能被阳性血清中和。
实施例3
3.1 样品的采集与处理
将临床上怀疑感染IBV的病死鸡的气管、肺脏、肾脏、输卵管、肠道、肝脏、脾脏等病变组织用研磨器磨碎后，加入含青霉素(2000IU/mL)、链霉素(2mg/mL)的0.01MPBS缓冲液(PH7.4)，混匀，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心后取上清，4℃作用4h，即可用于鸡胚接种。
3.2 鸡胚接种
将上述处理的待检样品尿囊接种10日龄SPF鸡胚5枚，试验同时设预先接种PBS缓冲液的5枚SPF鸡胚为对照。将两组鸡胚分别于37℃孵化30h，弃去死亡鸡胚，存活鸡胚尿囊腔接种0.2ml(病毒含量：2000EID50)NDV弱毒株LaSota，37℃孵化72h后检测鸡胚尿囊液HA效价。
3.3 结果判定
对照组鸡胚HA效价应为9-11log2，此时若试验组鸡胚HA效价为0-2log2，则待检样品中含有IBV；若HA效价为9-11log2，则待检样品中无IBV。
实施例4
4.1 样品的采集与处理
将临床上怀疑感染IBV的病死鸡的喉气管和泄殖腔棉拭子样品用研磨器磨碎后，加入含青霉素10000IU/mL、链霉素10mg/mL、丁胺卡那霉素5000IU/mL、制霉菌素5000IU/mL的0.01MPBS，pH为7.4的缓冲液，混匀，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心后取上清，4℃作用2h，即可用于鸡胚接种。
4.2 鸡胚接种
将上述处理的待检样品尿囊接种9日龄SPF鸡胚5枚，试验同时设预先接种PBS缓冲液的5枚SPF鸡胚为对照。将两组鸡胚分别于37℃孵化24h，弃去死亡鸡胚，存活鸡胚尿囊腔接种0.2ml(病毒含量：200EID50)NDV弱毒株LaSota，37℃孵化60h后检测鸡胚尿囊液HA效价。
4.3 结果判定
对照组鸡胚HA效价应为9-11log2，此时若试验组鸡胚HA效价为0-2log2，则待检样品中含有IBV；若HA效价为9-11log2，则待检样品中无IBV。
实施例5
5.1 样品的采集与处理
将临床上怀疑感染IBV的病死鸡的喉气管和泄殖腔棉拭子样品用研磨器磨碎后，加入含青霉素10000IU/mL、链霉素10mg/mL、丁胺卡那霉素5000IU/mL、制霉菌素5000IU/mL的0.01MPBS pH为7.4的缓冲液，混匀，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心后取上清，4℃作用3h，即可用于鸡胚接种。
5.2 鸡胚接种
将上述处理的待检样品尿囊接种9日龄SPF鸡胚5枚，试验同时设预先接种PBS缓冲液的5枚SPF鸡胚为对照。将两组鸡胚分别于37℃孵化27h，弃去死亡鸡胚，存活鸡胚尿囊腔接种0.2ml(病毒含量：2000EID50)NDV弱毒株LaSota，37℃孵化72h后检测鸡胚尿囊液HA效价。
5.3 结果判定
对照组鸡胚HA效价应为9-11log2，此时若试验组鸡胚HA效价为0-2log2，则待检样品中含有IBV；若HA效价为9-11log2，则待检样品中无IBV。
实施例6
6.1 样品的采集与处理
将临床上怀疑感染IBV的病死鸡的喉气管和泄殖腔棉拭子样品用研磨器磨碎后，加入含青霉素10000IU/mL、链霉素10mg/mL、丁胺卡那霉素5000IU/mL、制霉菌素5000IU/mL的0.01MPBS pH为7.4的缓冲液，混匀，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心后取上清，4℃作用4h，即可用于鸡胚接种。
6.2 鸡胚接种
将上述处理的待检样品尿囊接种10日龄SPF鸡胚5枚，试验同时设预先接种PBS缓冲液的5枚SPF鸡胚为对照。将两组鸡胚分别于37℃孵化30h，弃去死亡鸡胚，存活鸡胚尿囊腔接种0.2ml(病毒含量：1000EID50)NDV弱毒株LaSota，37℃孵化48h后检测鸡胚尿囊液HA效价。
6.3 结果判定
对照组鸡胚HA效价应为9-11log2，此时若试验组鸡胚HA效价为0-2log2，则待检样品中含有IBV；若HA效价为9-11log2，则待检样品中无IBV。
实施例7
7.1 样品的采集与处理
将临床上怀疑感染IBV的病死鸡的气管、肺脏、肾脏、输卵管、肠道、肝脏、脾脏等病变组织用研磨器磨碎后，加入含青霉素(2000IU/mL)、链霉素(2mg/mL)的0.01MPBS缓冲液(PH7.4)，混匀，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心后取上清，4℃作用3h，即可用于鸡胚接种。
7.2 鸡胚接种
将上述处理的待检样品尿囊接种10日龄SPF鸡胚5枚，试验同时设预先接种PBS缓冲液的5枚SPF鸡胚为对照。将两组鸡胚分别于37℃孵化24h，弃去死亡鸡胚，存活鸡胚尿囊腔接种0.2ml(病毒含量：1000EID50)NDV弱毒株LaSota，37℃孵化60h后检测鸡胚尿囊液HA效价。
7.3 结果判定
对照组鸡胚HA效价应为9-11log2，此时若试验组鸡胚HA效价为0-2log2，则待检样品中含有IBV；若HA效价为9-11log2，则待检样品中无IBV。
Claims (8)
1.一种鸡传染性支气管炎病毒的鉴定方法，其特征在于：步骤如下：
将待检样品尿囊腔接种SPF鸡胚，同时设接种PBS缓冲液的SPF鸡胚做为对照，将两组鸡胚分别于37℃孵化24-30h后接种200-2000EID50的鸡新城疫病毒弱毒株，之后再于37℃分别孵化48-72h后检测鸡胚尿囊液血凝价，根据血凝价判定结果：当对照组鸡胚尿囊液血凝价效价为9-11log2时，若接种待检样品的鸡胚尿囊液血凝价效价为0-2log2，则为IBV阳性；若接种待检样品的鸡胚尿囊液血凝价效价为9-11log2，则为IBV阴性。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：所述的SPF鸡胚为9-10日龄鸡胚。
3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：所述的接种待检样品或PBS缓冲液后鸡胚的孵化时间为24h。
4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：所述的鸡新城疫病毒弱毒株采用C30或LaSota，优选LaSota。
5.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：所述的鸡新城疫病毒弱毒株的接种量为200EID50。
6.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：所述的接种鸡新城疫病毒后孵化的时间为48h。
7.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：所述的待检样品处理过程是：
当选用病变组织作为待检样品时，将病变组织用研磨器磨碎后，加入含青霉素2000IU/mL、链霉素2mg/mL的0.01MPBS pH为7.4的缓冲液，混匀，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心后取上清，4℃作用2-4h，即可用于鸡胚接种；
当选用病鸡喉气管棉拭子样品和泄殖腔棉拭子样品作为待检样品时，在PBS缓冲液中加入青霉素10000IU/mL、链霉素10mg/mL、丁胺卡那霉素5000IU/mL、制霉菌素5000IU/mL后进行上述制备。
8.根据权利要求7所述的鉴定方法，其特征在于：所述的病变组织为临床上怀疑感染IBV的病死鸡的内脏器官，主要包括鸡的气管或肺脏或肾脏或输卵管或肠道或肝脏或脾脏。
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Granted publication date: 20150826 Termination date: 20160727 |