CN113049816A - 一种新城疫病毒滴度的测定方法 - Google Patents

一种新城疫病毒滴度的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新城疫病毒滴度的测定方法，包括以下步骤：1)将多孔细胞培养板培养的细胞洗涤后，加入细胞维持液；2)吸取处理好的不同来源的病毒液于多孔细胞培养板的首孔中，并梯度稀释，同时设置不接种病毒的正常细胞为空白对照，培养观察；3)弃去培养基，进行固定、通透、封闭及洗涤；4)避光同时加入一抗和二抗孵育；5)进行荧光检测，计算病毒滴度。本发明建立的新城疫病毒含量测定方法结合了间接免疫荧光，结果易于判定。通过荧光信号直接判定各孔的细胞是否感染病毒，不需要结合细胞病变来进行判断，减少了人为误差，对于致细胞病变不明显或不致细胞病变的弱毒株的病毒含量检测结果更为准确。

Description

一种新城疫病毒滴度的测定方法
技术领域
本发明属于病毒鉴定与检测的技术领域，具体涉及一种新城疫病毒滴度的测定方法。
背景技术
新城疫病毒为副黏病毒科副黏病毒属成员，是有囊膜的副链RNA病毒。由新城疫病毒引起的新城疫是一种严重危害养禽业的高度接触性传染病，死亡率为90％以上，被国际兽医局认定为两种A类禽病之一。根据新城疫对鸡的致病性差异，将NDV分为三种类型，即速发型(强毒株)、中发型(中等毒力株)、缓发型(弱毒株)。
新城疫弱毒株作为活病毒疫苗载体应用前景十分巨大，关于新城疫弱毒疫苗作为载体表达外源免疫原基因的科研报道很多，国内外很多学者都做了大量相关工作。以新城疫耐热活疫苗载体成功构建了表达IBV的T表位、TB 表位和H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组病毒株rTH-T/IBV、rTH-TB/IBV、 rTS-HA/M等，这些重组病毒作为耐热疫苗的疫苗株应用前景十分广阔。无论是实验室研究，还是疫苗生产，都会频繁地涉及到新城疫病毒的滴度测定。由于不同来源的新城疫病毒毒力不一，对细胞的致病程度不一，细胞病变程度不一，因此需要精确定量病毒滴度方法。
常用的新城疫病毒滴度测定方法包括鸡胚分离鉴定、荧光定量PCR、细胞半数感染剂量法等。鸡胚法应用最为广泛，但存在操作繁琐，以鸡胚为接种对象，检测成本较高等问题；荧光定量PCR方法主要定量检测病毒核酸，不能区分病毒是否有感染力。细胞半数感染剂量法(TCID50)是使用最为广泛的一种病毒含量测定方法，是以50％组织培养感染剂量(TCID50)，接毒后细胞培养3-7天，显微镜下观察细胞病变(CPE)，根据CPE判定各孔是否感染。需要病毒感染细胞后细胞出现明显CPE才能判定，无法对致细胞病变不明显或不致细胞病变的弱毒株的病毒含量进行测定，在细胞病变并不明显的情况下容易漏检，主观经验因素对检测结果的影响较大。
发明内容
本发明为解决上述技术问题提供一种针对新城疫病毒特别是弱毒疫苗株的病毒滴度的测定方法，该方法快速、敏感、特异。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种新城疫病毒滴度的测定方法，包括以下步骤：
1)将多孔细胞培养板培养的细胞洗涤后，加入细胞维持液；
2)吸取处理好的不同来源的病毒液于多孔细胞培养板的首孔中，并梯度稀释，同时设置不接种病毒的正常细胞为空白对照，培养观察；
3)弃去培养基，进行固定、通透、封闭及洗涤；
4)避光同时加入一抗和二抗孵育；
5)进行荧光检测，计算病毒滴度。
优选地，步骤4)的具体步骤为：避光同时加入一抗和二抗，37℃摇床缓慢摇动30min。
优选地，步骤1)中的细胞维持液为含2％体积浓度的双抗的无血清 DMEM，按如下配方进行配制：无血清DMEM100mL，双抗2mL。
优选地，步骤2)中的病毒液为细胞来源的病毒液处理时，处理方法为：将细胞增殖的病毒液反复冻融两次，离心，取上清即可；步骤2)中的病毒液为组织来源的病毒液处理时，处理方法为：取脑、气管和肺等组织病料于含双抗PBS中，匀浆机匀浆，反复冻融两次，离心，取上清即可。
优选地，步骤2)中的病毒液为鸡胚尿囊液时，处理方法为：取鸡胚尿囊液于5000r/min，5分钟，取上清即可。
优选地，步骤1)中的细胞为BHK-21细胞。
优选地，一抗为鸡新城疫阳性血清，为1:100 1％BSA稀释；二抗为FITC 标记的兔抗鸡lgG，1:200 1％BSA稀释。
优选地，固定液为4％多聚甲醛，常温固定10分钟。
优选地，通透液为Triton-100。
优选地，所述病毒液的来源毒株为弱毒株。
本发明的有益效果是：
1.和新城疫传统的病毒含量检测方法相比，本发明建立的检测方法能够检测不同毒力毒株的病毒滴度。不仅可以检测可引起细胞病变的毒株的病毒滴度，还可以检测不引起细胞病变的毒株的病毒滴度，检测面更宽。
2.本发明建立的新城疫病毒含量的检测方法中，一抗二抗采用同时孵育的方式，不仅节省了工序，而且大大缩短了检测时间，检测时间更快。
3.本发明建立的新城疫病毒含量测定方法结合了间接免疫荧光，结果易于判定。通过荧光信号直接判定各孔的细胞是否感染病毒，不需要结合细胞病变来进行判断，减少了人为误差，对于致细胞病变不明显或不致细胞病变的弱毒株的病毒含量检测结果更为准确。
4.本发明用病毒感染细胞，条件均一、稳定，不需要购买实验动物，不会出现因实验动物个体差异而引起的实验结果的差异显著。
5.本发明建立的新城疫病毒含量检测方所需细胞维持液中不含TPCK胰酶，对病毒含量的检测效果更好，尤其是对于新城疫弱毒株。本领域技术人员通常认为新城疫弱毒株只能在含有胰蛋白酶的细胞中进行复制，常规的细胞维持液中含有TPCK胰酶，而本发明克服了本领域技术人员的技术偏见，采用不含TPCK胰酶的细胞维持液，取得了意料不到的技术效果。
具体实施方式
以下实施例进一步对本发明进行说明，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1
本实施例提供一种新城疫病毒滴度的测定方法，包括以下步骤：
(1)将96孔板培养的BHK-21细胞培养至90％满度，用Hank’K液洗涤3次，甩净残留液体，再加入细胞维持液于96孔板中，180μl/孔；
细胞维持液的配方为无血清细胞冻存培养基(DMEM)+2％双抗。此处 2％为体积浓度，购自GIBCO公司。
(2)吸取处理好不同来源的病毒液20μl于96孔板首孔中，每个样品设 3个重复，10倍梯度稀释，同时设不接种病毒的正常细胞为空白对照，培养观察4天；
病毒液的处理方法为：将TS09-C株的鸡胚尿囊液于5000r/min离心5分钟，取上清即可。
可以理解的是，步骤2)中的病毒液为细胞来源的病毒液处理时，处理方法为：将细胞增殖的病毒液反复冻融两次，5000r/min，5分钟，取上清即可；步骤2)中的病毒液为组织来源的病毒液处理时，处理方法为：取脑、气管和肺等组织病料于含1％双抗PBS中(组织:PBS＝1:10倍稀释)，匀浆机匀浆10min，反复冻融两次，5000r/min，5分钟，取上清即可。
(3)弃去培养基，用PBS洗涤3次，每次3min，加入预冷的4％多聚甲醛固定液100μL，常温固定10min。
(4)弃去4％多聚甲醛固定液，用PBS洗涤3次，每次3min，每孔加入100μL0.1％的Triton-100进行通透10min；0.1％Triton-100配方为10μL Triton-100加入10mL PBS中。
(5)弃去Triton-100液，用PBS洗涤3次，每次3min，加入5％BSA， 37℃封闭40min；5％BSA配方：BSA2.5g，50mL PBS。
(6)弃去封闭液，用PBS洗涤3次，每次3min，避光同时加入1:100 1％BSA稀释的一抗100μl、1:200 1％BSA稀释的荧光标记的二抗100μl，37℃摇床缓慢摇动30min；一抗为鸡新城疫阳性血清，二抗为FITC标记的兔抗鸡 lgG。
在本实施例中，一抗购自哈尔滨国生生物科技股份有限公司，二抗购自 Solarbio公司。
(7)弃去一抗、二抗，用PBS洗涤3次，用荧光显微镜逐孔观察细胞板上有无细胞脱落、特异性荧光强弱及清晰度。
(8)结果判定：阳性孔可见细胞胞浆和胞核内有特异性亮绿色荧光，而阴性对照和空白对照孔内无特异性绿色荧光。根据Reed-Mμench算法计算病毒的TCID50。本实施例得到的病毒滴度为6.50。
实施例2
本实施例与实施例1大致相同，不同之处在于步骤(2)中的病毒液的来源毒株为中等毒力毒株Mukteswar株(以下简称M疫苗株)，其滴度为 7.75。
实施例3
本实施例与实施例1大致相同，不同之处在于步骤(2)中的病毒液的来源毒株为强毒株HB0901，其滴度为8.75。
对比例1
本对比例采用传统方法来测定实施例1中的弱毒株的滴度，其结果为 3.75。
下表为用本发明的IFA法和常规的CPE观察法进行病毒含量检测结果，由检测结果可知，IFA方法可以对不同毒力毒株进行病毒含量检测；和常规的CPE观察法相比，IFA方法对于弱毒株病毒含量的检测敏感性更高、更为准确。
表1不同毒力毒株病毒含量测定
Figure BDA0002975197880000051
对比例2
本对比例与实施例1和实施例2大致相同，不同之处在于将步骤(2) 中的观察天数调整为1d、2d、3d、5-7d，得到的病毒滴度的结果如表2所示。由表2可知，由于4-7d病毒滴度结果差异较小，因此病毒感染细胞后最佳培养时间确定为4d。
表2 96孔板中不同毒力毒株在不同培养时间对检测病毒滴度的影响
Figure BDA0002975197880000052
Figure BDA0002975197880000061
对比例3
本对比例与实施例1大致相同，不同之处在于将步骤(1)中的细胞维持液的配方中加入0.20μg/mL的TPCK胰酶，并进行CPE观察，计算TCID50。试验结果可知，新城疫TS09-C株在不含0.20μg/mLTPCK胰酶的细胞维持液可以进行复制，由于TPCK胰酶对细胞有一定毒性，所以新城疫弱毒株病毒含量的测定用不含0.20μg/mLTPCK胰酶的细胞维持液效果更好。从节约时间和成本、细胞状态和病毒含量测定等方面综合考虑，选择用不加TPCK胰酶的细胞维持液进行病毒含量测定获得了意料不到的技术效果。结果如表3所示。
表3细胞维持液的选择
Figure BDA0002975197880000062
对比例4
本对比例与实施例1大致相同，不同之处在于将一抗的工作浓度分别调整为：一抗稀释1:50、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200，37℃摇床缓慢摇动15min。结果如表4所示。
表4一抗在不同稀释度下作用15min工作浓度的确定
Figure BDA0002975197880000071
对比例5
本对比例与对比例4大致相同，不同之处在于37℃摇床缓慢摇动60min。结果如表5所示。
表5一抗在不同稀释度下作用60min工作浓度的确定
Figure BDA0002975197880000072
Figure BDA0002975197880000081
对比例6
本对比例与对比例4大致相同，不同之处在于37℃摇床缓慢摇动30min。结果如表6所示。
表6一抗在不同稀释度下作用30min工作浓度的确定
Figure BDA0002975197880000082
由表4至表6可以看出：一抗稀释1:50、1:100，一抗作用时间30min、 60min，均有亮绿色荧光。从节约时间和免疫荧光效果等方面综合考虑，选择一抗的最佳稀释倍数为1:100，最佳作用时间是30min。
对比例7
本对比例与实施例1大致相同，不同之处在于将二抗的工作浓度分别调整为：二抗稀释1:50、1:100、1:400、1:800、1:1600、1:3200，37℃摇床缓慢摇动15min。结果如表7所示。
表7二抗作用15min工作浓度的确定
Figure BDA0002975197880000091
对比例8
本对比例与对比例7大致相同，不同之处在于37℃摇床缓慢摇动30min。结果如表8所示。
表8二抗作用30min工作浓度的确定
Figure BDA0002975197880000092
Figure BDA0002975197880000101
对比例9
本对比例与对比例7大致相同，不同之处在于37℃摇床缓慢摇动60min。结果如表9所示。
表9二抗作用60min工作浓度的确定
Figure BDA0002975197880000102
Figure BDA0002975197880000111
由表7至表9可以看出：二抗稀释1:50、1:100、1:200，二抗作用时间 30min、60min，均有亮绿色荧光。从节约时间和免疫荧光效果等方面综合考虑，选择二抗的最佳稀释倍数为1:200，最佳作用时间是30min。
对比例10
本对比例与实施例1大致相同，不同之处在于步骤(6)中的加入一抗和二抗同时孵育调整为“一抗孵育30min后PBS洗涤三次，再加二抗孵育 30min”即“两步法孵育”。试验结果表明：一抗二抗孵育方式采用“一抗二抗同时加入，37℃摇床缓慢摇动30min”敏感性更高，免疫荧光效果和病毒含量测定更好。因此，一抗二抗孵育方式采用“一抗二抗同时加入，37℃摇床缓慢摇动30min”取得的效果最佳。
表10一抗二抗孵育条件的优化
Figure BDA0002975197880000112
Figure BDA0002975197880000121
表11三种孵育方法的敏感性试验结果
Figure BDA0002975197880000122
注明：阳性“+”，阴性“-”。
对比例11
本对比例与实施例1大致相同，不同之处在于将步骤(3)中的固定时间调整为5min、15min、20min；将固定温度调整为4℃和-20℃。结果如表 12所示。由表12可知：4％多聚甲醛常温固定10min-15min或4℃固定20min 效果均好。在不影响结果判定的条件下，为了快速检测的需要，选择用4％多聚甲醛常温固定10min。
表12 4％多聚甲醛在不同固定温度和固定时间固定情况
Figure BDA0002975197880000123
实施例4
本实施例与实施例1和实施例2大致相同，不同之处在于将步骤(2) 中的病毒液的来源调整为弱毒株LaSota株，并用无血清DMEM培养液按10-1、10-2、10-3……10-10进行倍比稀释，用IFA法对梯度稀释病毒液进行检测，病毒稀释10-9倍数时仍能检测到特异性亮绿色荧光，即阳性。
对比例12
本对比例采用传统方法来测定实施例4中的倍比稀释病毒液，常规CPE 法观察7天，病毒稀释10-3为阳性。
下表为本实施例和对比例检测结果，有结果可知，和传统的CPE观察法相比，本发明的IFA方法敏感性更高。
表13灵敏性试验结果
Figure BDA0002975197880000131
对比例13
本对比例与实施例1和实施例2大致相同，不同之处在于将步骤(2) 中的病毒液的来源调整为禽流感和腺病毒其它病毒，结果没有出现特异性亮绿色荧光，表明本发明的IFA方法具有较好的特异性。
表格14特异性试验
Figure BDA0002975197880000132
用PBS代替一抗进行IFA试验，在显微镜下观察也没有出现亮绿色荧光，说明新城疫病毒与二抗之间没有非特异性结合。

Claims (10)

1.一种新城疫病毒滴度的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将多孔细胞培养板培养的细胞洗涤后，加入细胞维持液；
2)吸取处理好的不同来源的病毒液于多孔细胞培养板的首孔中，并梯度稀释，同时设置不接种病毒的正常细胞为空白对照，培养观察；
3)弃去培养基，进行固定、通透、封闭及洗涤；
4)避光同时加入一抗和二抗孵育；
5)进行荧光检测，计算病毒滴度。
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤4)的具体步骤为：避光同时加入一抗和二抗，37℃摇床缓慢摇动30min。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤1)中的细胞维持液为含2％体积浓度的双抗的无血清DMEM，按如下配方进行配制：无血清DMEM100mL，双抗2mL。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤2)中的病毒液为细胞来源的病毒液处理时，处理方法为：将细胞增殖的病毒液反复冻融两次，离心，取上清即可；步骤2)中的病毒液为组织来源的病毒液处理时，处理方法为：取脑、气管和肺等组织病料于含双抗PBS中，匀浆机匀浆，反复冻融两次，离心，取上清即可。
5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤2)中的病毒液为鸡胚尿囊液时，处理方法为：取鸡胚尿囊液于5000r/min，5分钟，取上清即可。
6.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤1)中的细胞为BHK-21细胞。
7.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，一抗为鸡新城疫阳性血清，为1:100 1％BSA稀释；二抗为FITC标记的兔抗鸡lgG，1:200 1％BSA稀释。
8.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，固定液为4％多聚甲醛，常温固定10分钟。
9.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，通透液为Triton-100。
10.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述病毒液的来源毒株为弱毒株。
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