CN102586195A

CN102586195A - 一种利用Vero传代细胞制备禽流感病毒及其灭活疫苗的方法

Info

Publication number: CN102586195A
Application number: CN2011103933168A
Authority: CN
Inventors: 丁国杰; 张杨; 付丽杰; 李东伟; 焦利红; 吴金
Original assignee: HARBIN PHARMACEUTICAL GROUP BIOLOGICAL VACCINE CO Ltd
Current assignee: HARBIN PHARMACEUTICAL GROUP BIOLOGICAL VACCINE CO Ltd
Priority date: 2011-12-01
Filing date: 2011-12-01
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2031-12-01
Also published as: CN102586195B

Abstract

本发明公开了一种利用Vero传代细胞制备禽流感病毒及其灭活疫苗的方法，本发明方法采用Vero传代细胞代替鸡胚培养流感病毒解决了鸡胚蛋白遗留物和外源病毒污染的问题，且培养的病毒免疫原性更稳定。另一方面为了避免胰蛋白酶在维持液中被抑制剂作用后失活而影响HA的裂解，本发明采用壳聚糖对胰酶进行包被后，加入到细胞维持液中，使胰酶在维持液中缓慢释放，克服了在病毒繁殖过程中由于胰酶的失活而影响血凝素的裂解。也避免了多次加入胰酶而对细胞造成污染的几率。采用本发明方法培养出的病毒滴度高，稳定性好，适合进行大规模的疫苗生产。

Description

一种利用Vero传代细胞制备禽流感病毒及其灭活疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种灭活疫苗的制备方法，特别涉及一种利用VERO传代细胞制备禽流感病毒灭活疫苗的方法。本发明属于畜牧兽医技术领域。

背景技术

禽流感是目前危害世界养禽业发展的重要疾病，特别是高致病性禽流感的暴发，给养禽业带来了毁灭性的灾难。2004年至今，中国内地相继暴发高致病性禽流感，不仅沉重打击了国内的养禽业，而且对我国的经济和贸易发展也造成了严重的影响。

自1933年鸡胚培养流感病毒获得成功以来，鸡胚就成了人们大量获得流感病毒的主要来源。但用鸡胚分离流感病毒或传代易引起病毒变异，而且鸡胚残留物还可引起过敏性反应。鸡胚作为疫苗生产基质，还存在大规模生产时供给和潜在外源病毒污染问题。近几年，随着禽流感的频繁暴发以及跨种属传播，需要一种可在流感大流行时能够替代鸡胚快速、大量生产流感病毒的细胞培养系统。本研究应用Vero细胞系培养流感病毒解决了鸡胚蛋白遗留物和外源病毒污染的问题，且培养的病毒免疫原性更稳定。

流感病毒只有当其血凝素(HA)为裂解状态时其病毒颗粒才具感染性，HA能否被蛋白酶裂解为HA1和HA2是病毒感染细胞的先决条件。但流感病毒本身不具有裂解HA的蛋白酶，而由宿主细胞的蛋白酶作用下裂解HA，由于VERO细胞不具有HA的蛋白酶所以对HA不具有裂解能力。维持液中添加适量的胰酶，能补充细胞中蛋白酶的不足，增加了HA的裂解量，增强了流感病毒感染力，流感病毒在传代细胞系中的复制可因培养液中的胰蛋白酶的快速失活而受到影响，同时胰蛋白酶抑制剂的积累也是影响胰蛋白酶活性的另一个原因。为了避免胰蛋白酶在维持液中被抑制剂作用后失活而影响HA的裂解，本研究室采用壳聚糖对胰酶进行包被后，加入到细胞维持液中，使胰酶在维持液中缓慢释放，克服了在病毒繁殖过程中由于胰酶的失活而影响血凝素的裂解。也避免了多次加入胰酶而对细胞造成污染的几率。培养出的病毒滴度高，稳定性好，适合进行大量的疫苗生产。禽流感传代细胞疫苗的研制将为我国禽流感细胞型疫苗生产提供新的思路，该疫苗株以细胞为载体，除了在增殖速度和产量上都优于目前鸡胚培养型禽流感疫苗株外，在生产疫苗的价格上也有巨大的市场优势。除此之外，利用鸡胚生产流感疫苗，在处理使用后的鸡胚残体上只能采用焚烧的办法，既增加成本，又污染环境，而利用细胞生产疫苗则摆脱了对鸡胚依赖，没有处理鸡胚残体这一环节。可以说利用传代细胞来生产禽流感疫苗既经济又环保。本试验的结果证明，流感病毒可在VERO细胞中快速繁殖，具备生产流感疫苗的潜力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中的不足，提供一种利用Vero传代细胞生产禽流感病毒及其灭活疫苗的方法。

本发明的一种利用Vero传代细胞生产禽流感病毒液的方法，其特征在于首先采用壳聚糖对胰酶进行包被，得到包埋胰酶的壳聚糖纳米粒；然后将包埋胰酶的壳聚糖纳米粒加入到Vero传代细胞的细胞培养液中，继而接种病毒进行病毒培养，收获病毒液，即得。

本发明一种利用Vero传代细胞制备禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于由以上所述的方法制备得到的病毒液按照制备灭活疫苗的常规方法制备。

优选的，本发明的一种利用Vero传代细胞生产禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，具体的，包括以下步骤：

(1)制备包埋胰酶的壳聚糖纳米粒；

(2)接种：取病毒种毒，用灭菌生理盐水稀释10^-5～10^-7倍，待Vero传代细胞80％长成单层后，弃掉细胞培养液，按培养液体积的1/10接入稀释后的病毒液，37℃吸附1小时，加入维持液，在维持液中加入步骤(1)中得到的包埋胰酶的壳聚糖纳米粒，37℃培养3天，收获病毒液；

(3)病毒液收获：收获病毒液，分装，放入-20℃冰柜中反复冻融3次，测定每个分装容器中病毒的HA效价，HA效价低于1∶128者弃去；同时作无菌检验应无菌生长，收获的病毒液灭活前在2～8℃保存；

(4)病毒液灭活：将病毒液注入灭活灌，开启灭活罐的搅拌器，准确量取10％的甲醛溶液，在不断搅拌时加入至含抗原液的灭活灌中，使其充分搅拌均匀；甲醛溶液终浓度为0.1％；将灭活罐升温至37℃，维持灭活时间16小时，期间不停缓慢搅拌，灭活结束后，做灭活检验和无菌检验，灭活后的病毒液在2-8℃保存；

(5)制备灭活疫苗：将步骤(4)中制备得到的病毒灭火液加入佐剂制备成灭活疫苗。

作为参考，本发明具体实施例中包埋胰酶的壳聚糖纳米粒按照以下方法制备得到：

(1)称取脱乙酰度为85％的壳聚糖，用1％的乙酸溶解，制成浓度为0.5～2mg/mL的壳聚糖溶液，过0.22μm滤器；称取胰酶，用去离子水溶解，制成浓度为500μg/mL的胰酶溶液，过0.22μm滤器；称取三聚磷酸钠，用去离子水溶解，制成浓度为1.0～2.0mg/mL的三聚磷酸钠溶液，过0.22μm滤器。

(2)取5mL壳聚糖溶液，滴加2.5～7.5mL 500μg/mL的胰酶溶液，磁力搅拌3min，获得溶液A；

(3)溶液A在室温、无菌条件下以900～1300r/min磁力搅拌30s，然后逐滴加入2.5mL的三聚磷酸钠溶液，继续磁力搅拌10～30min，获得溶液B；

(4)将溶液B于4℃、12000r/min离心2min，取沉淀并用等体积的pH7.4的PBS洗三次，然后加入等体积的pH7.4的PBS悬浮，真空冷冻干燥24h，获得包埋胰酶的壳聚糖纳米粒。

在本发明具体实施例中，维持液中加入经壳聚糖包被的胰蛋白酶，使其终浓度为6μg/ml。

在本发明具体实施例中，所述的细胞培养液为含有质量分数为6％小牛血清的DMEM培养基，所述的维持液为含有质量分数为1％小牛血清的DMEM培养基。

2011年初，本发明人从黑龙江省双城市郊某养殖场分离得到一株H9亚型禽流感病毒病毒株HY株，并将其驯化为一株能够在Vero细胞上良好增值的VERO细胞适应株，并将其命名为H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株AIV HY株，其具有经胰酶处理后能在细胞上增殖的特性，可用于在Vero传代细胞中增殖进而制备禽流感病毒灭活疫苗。

在本发明具体实施例中，所述的病毒种毒为禽流感病毒Vero细胞适应株，优选的所述的Vero细胞适应株为以上所述的H9亚型禽流感病毒Vero细胞适应株AIVHY株，分类命名为禽流感病毒(H9亚型)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC 5409，保藏日期为2011年10月28日；

利用Vero细胞生产新方法与利用鸡胚生产的老方法的比较：

1、维持液中加入的胰蛋白酶是经过壳聚糖包被后，起到缓慢释放的作用；

2、细胞苗在增殖速度和产量上都优于目前鸡胚培养的禽流感疫苗；

3、降低生产成本；

4、细胞苗的免疫效力不低于利用鸡胚生产的流感灭活苗。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

试剂和材料：

毒株：H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株AIV HY株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC 5409。

H9亚型禽流感病毒HY株(未驯化)由哈药集团生物疫苗有限公司保存，提供。

材料：10～11日龄SPF鸡胚为哈药集团生物疫苗有限公司SPF鸡场种蛋在本研发中心孵化、vero细胞购自中国兽药监察所、0.22μm滤器购自PALL公司。

试剂：优质白油购自美国索尼泊尔公司、司本-80、吐温-80购自新加坡禾大公司、硬脂酸铝购自沈阳东兴试剂厂、脱乙酰度为85％的壳聚糖购自Sigma公司、胰酶购自GIBICO公司、三聚磷酸钠购自天津市光复精细化工研究所。H5和H9亚型AI标准阳性血清购买自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；H7亚型AI标准阳性血清及ND、EDS-76病毒标准阳性血清购买中国兽医药品监察所。

实施例1利用VERO传代细胞生产流感病毒灭活疫苗

1、壳聚糖纳米粒包埋法固定化胰酶的制备

(1)称取脱乙酰度为85％的壳聚糖，用1％的乙酸溶解，制成浓度为0.5～2mg/mL的壳聚糖溶液，过0.22μm滤器。称取胰酶，用去离子水溶解，制成浓度为500μg/mL的胰酶溶液，过0.22μm滤器。称取三聚磷酸钠，用去离子水溶解，制成浓度为1.0～2.0mg/mL的三聚磷酸钠溶液，过0.22μm滤器。

(4)将溶液B于4℃、12000r/min离心2min，取沉淀并用等体积的PBS(pH7.4)洗三次，然后加入等体积的PBS(pH7.4)悬浮，真空冷冻干燥24h，获得包埋胰酶的壳聚糖纳米粒。

2、H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株AIV HY株细胞病毒液的制备

(1)接种：取H9亚型禽流感病毒VERO细胞适应株AIV HY株作为种毒，用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-5～10^-7)，待细胞80％长成单层后，弃掉细胞培养液，按培养液体积的1/10接毒，37度吸附1小时，在维持液中加入经壳聚糖包被的胰蛋白酶，终浓度为6μg/ml，37度培养3天，收获病毒液。

(2)病毒液收获：收获病毒液，放入-20度冰柜中反复冻融3次，测定每个容器中病毒的HA效价，HA效价低于1∶128者弃去。同时作无菌检验应无菌生长。收获的病毒液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

(3)病毒液灭活

将病毒液注入灭活灌，开启灭活罐的搅拌器，准确量取10％的甲醛溶液，在不断搅拌时加入至含抗原液的灭活灌中，使其充分搅拌均匀。甲醛溶液终浓度为0.1％。

将灭活罐升温至37℃(以罐内温度达到37℃开始计时)，维持灭活时间16小时，期间不停缓慢搅拌。

灭活结束后，取样10ml，用于做灭活检验和无菌检验。灭活后的病毒液在2-8℃保存不超过15天。

(4)半成品检验

无菌检验：取已经灭活的病毒胚液，按《中国兽药典》附录15页，对灭活的AIV病毒液进行检验，应无菌生长。

灭活检验：取经甲醛灭活的AIV(H9)病毒胚液，分别接种10～11日龄SPF鸡胚尿囊腔内，每种病毒液接种6枚鸡胚，每胚0.2mL，置36～37℃孵育，每日照胚2次，非特异死亡应不超过1个。培养96小时，全部取出。分别测每个鸡胚液的HA效价，HA效价均应小于2log2，收获的鸡胚液再传一代，HA效价均应小于2log2，认为AIV(H9)灭活完全。

(5)病毒含量测定

将灭活前取出的浓缩病毒胚液10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-8、10^-94个稀释度分别接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚尿囊腔内接种0.1mL，24小时前死亡鸡胚弃去不记，每日照蛋2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定血凝价，血凝价≥1∶16(微量法)者判为感染。按Reed-Muench法计算EID₅₀，每0.1mL病毒含量≥10^7.0EID₅₀，方可用于制苗。

3、油乳剂灭活疫苗的制备

油相制备：取优质白油94份(以毫升为单位)，加司本-806份(以毫升为单位)，混合后加热，另加硬脂酸铝2份(以克为单位)，一边加一边搅拌，直至透明为止，高压灭菌，冷却后备用。

水相制备：将灭活的病毒细胞液，取4份吐温-80，加入到混合后的抗原液96份中，使吐温-80充分溶解。

配苗及乳化：取2份油相加入乳化灌内，开动电机慢速搅拌，同时徐徐加入上述1份水相，加完后继续搅拌，同时加入1％硫柳汞溶液，使其最终浓度为0.01％；然后通过均质机乳化。制成禽流感(H9亚型)灭活疫苗。乳化后，取样3～5mL，以3000r/min离心15分钟，若有分层现象，应重复乳化1次。

4、分装：将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封和标签，于2～8℃保存，待检。

实施例2利用本发明方法生产的疫苗与利用鸡胚生产的疫苗比较

为了验证新方法的生产性能，故在利用鸡胚制备禽流感灭活疫苗(按照实验例1所述的方法制备。)的同时，还采用VERO细胞制备了10批灭活疫苗(按照实施例1所述的方法制备。)，现将其中一些指标的比较结果总结如下，如表1-6所述：

表1两种生产方法半成品红细胞凝集价比较

表2两种生产方法半成品EID₅₀比较(lg EID₅₀)

批次	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											胚苗	7.4	7.5	7.7	8.0	8.2	8.4	8.0	6.8	6.9	8.1
细胞苗	7.7	7.6	8.2	8.1	7.5	8.1	8.1	8.3	8.4	8.2

[0063] 表3两种生产方法半成品杂检阳性率比较

批次	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											胚苗	0.3％	0.2％	0	1.4％	0	0.6％	1.3％	2.0％	1.5％	2.3％
细胞苗	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

表4两种生产方法产品合格率比较

批次

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

胚苗

99.7％

99.8％

100％

98.6％

100％

99.4％

98.7％

98％

98.5％

97.7％

细胞苗

100％

表5两种生产方法产品成本比较(单位：元/ml)

批次	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											胚苗	1.20	1.20	1.20	1.21	1.21	1.24	1.24	1.25	1.25	1.25
细胞苗	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60	0.60

21～28日龄SPF鸡30只，由购自哈药集团生物疫苗有限公司SPF鸡场的SPF鸡胚自行孵化后使用。疫苗免疫组为2组，每组10只鸡，分别免疫细胞毒灭活苗和组织毒灭活苗，各皮下注射疫苗0.3ml，另10只作对照组。接种后21～28日，所有鸡只各静脉注射H9亚型禽流感病毒HY株0.2ml(≥10^7.0EID₅₀)，攻毒后第5日，采集每只鸡的泄殖腔拭子进行病毒分离。将每只鸡的样品经尿囊腔内接种9～11日龄SPF鸡胚5枚。孵育观察5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液血凝价，以5枚鸡胚中至少有1枚鸡胚的鸡胚液血凝价不低于1∶16(微量法)判为病毒分离阳性。对病毒分离为阴性的样品，应盲传1次，再次测定HA价，两种方法生产产品免疫效力比较如表6所示。

表6两种方法生产产品免疫效力比较

批次

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

胚苗保护率

90％

95％

98％

95％

90％

85％

98％

细胞苗保护率

95％

98％

100％

95％

98％

100％

如上表所示，利用细胞生产的疫苗与鸡胚生产的疫苗相比，半成品红细胞凝集价、病毒含量(EID₅₀)、产品合格率和免疫攻毒保护率都有显著的提高；而半成品阳性杂检率和单位体积的生产成本都有明显的降低，故细胞苗更能提升产品质量，节约生产费用，此方法在国内尚无在生产中使用的记载，处于国内领先水平。

实验例1利用鸡胚生产流感病毒

1、H9亚型禽流感病毒HY株病毒液的制备

(1)接种：取H9亚型禽流感病毒HY株作为生产用种毒，用灭菌生理盐水作适当稀释(10^-3～10^-4)，每胚尿囊腔内接种0.1mL，接种后密封针孔，置36～37℃继续孵育，不必翻蛋。

(2)鸡胚孵育与观察：鸡胚接种后，将48小时前死亡的鸡胚弃去不用。此后，每6小时照蛋1次，死亡的鸡胚随时取出，直至96小时，取出所有胚，置于2～8℃中冷却4～24小时。

(3)病毒液收获：将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后无菌剥除气室部卵壳，揭去卵壳膜，吸取胚液。注意：在吸取胚液前，注意对每个鸡胚检查，凡胎儿腐败、胚液混浊及有任何可疑污染者，弃去不用；吸取的胚液存放于不同的灭菌容器中，测定每个容器中病毒的HA效价，HA效价低于1∶128者弃去。同时作无菌检验应无菌生长。收获的胚液灭活前在2～8℃保存，应不超过5日。

(4)病毒液灭活：将病毒液注入灭活灌，开启灭活罐的搅拌器，准确量取10％的甲醛溶液，在不断搅拌时加入至含抗原液的灭活灌中，使其充分搅拌均匀。甲醛溶液终浓度为0.1％。

将灭活罐升温至37℃(以罐内温度达到37℃开始计时)，维持灭活时间16小时，期间不停缓慢搅拌。灭活结束后，取样10ml，用于做灭活检验和无菌检验。灭活后的病毒液在2-8℃保存不超过15天。

(5)半成品检验

(6)病毒含量测定

将灭活前取出的浓缩病毒胚液10倍系列稀释，取10^-6、10^-7、10^-8、10^-94个稀释度分别接种10～11日龄SPF鸡胚5个，每胚尿囊腔内接种0.1mL， 24小时前死亡鸡胚弃去不记，每日照蛋2次，观察5日，无论死胚、活胚均应测定血凝价，血凝价≥1∶16(微量法)者判为感染。按Reed-Muench法计算EID₅₀，每0.1mL病毒含量≥10^7.0EID₅₀，方可用于制苗。

2、油乳剂灭活疫苗的制备

水相制备：将灭活的病毒胚液，取4份吐温-80，加入到混合后的抗原液96份中，使吐温-80充分溶解。

3、分装：将乳化好的疫苗定量分装，加盖密封和标签，于2～8℃保存，待检。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种利用Vero传代细胞生产禽流感病毒液的方法，其特征在于首先采用壳聚糖对胰酶进行包被，得到包埋胰酶的壳聚糖纳米粒；然后将包埋胰酶的壳聚糖纳米粒加入到Vero传代细胞的细胞培养液中，继而接种病毒进行病毒培养，收获病毒液，即得。

2.一种利用Vero传代细胞制备禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于由权利要求1所述的方法制备得到的病毒液按照制备灭活疫苗的常规方法制备。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，具体的，包括以下步骤：

(1)制备包埋胰酶的壳聚糖纳米粒；

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于包埋胰酶的壳聚糖纳米粒按照以下方法制备得到：

(1)称取脱乙酰度为85％的壳聚糖，用1％的乙酸溶解，制成浓度为0.5～2mg/mL的壳聚糖溶液，过0.22μm滤器；称取胰酶，用去离子水溶解，制成浓度为500μg/mL的胰酶溶液，过0.22μm滤器；称取三聚磷酸钠，用去离子水溶解，制成浓度为1.0～2.0mg/mL的三聚磷酸钠溶液，过0.22μm滤器；

5.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于在维持液中加入经壳聚糖包被的胰蛋白酶，使其终浓度为6μg/ml。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述的细胞培养液为含有质量分数为6％小牛血清的DMEM培养基，所述的维持液为含有质量分数为1％小牛血清的DMEM培养基。

7.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于病毒种毒为禽流感病毒Vero细胞适应株。