CN108027371A

CN108027371A - 流感效力试验

Info

Publication number: CN108027371A
Application number: CN201680051676.0A
Authority: CN
Inventors: 温颖霞; E·C·塞滕布里; 王子豪
Original assignee: Si Qile
Current assignee: Si Qile; Seqirus UK Ltd
Priority date: 2015-07-07
Filing date: 2016-07-07
Publication date: 2018-05-11
Anticipated expiration: 2036-07-07
Also published as: AU2016290603B2; JP6830070B2; WO2017005880A1; US20180196061A1; CN108027371B; KR102576962B1; CA2990745A1; EP3320343B1; JP2022046715A; JP7069281B2; EP3764098A1; KR20180036977A; US11249088B2; JP2018533720A; US10416171B2; HUE060924T2; BR112018000296A2; JP2021036909A; HK1254342A1; EP3764098B1

Abstract

本申请公开了用于流感疫苗稳定性指示的效力试验。

Description

流感效力试验

本申请要求欧洲专利申请号15175765.5(2015年7月7日提交)和欧洲专利申请号16152829.4(2016年1月26日提交)的权益，这两项申请的全部内容出于所有目的通过引用纳入本文。

发明领域

本发明主要涉及疫苗，更具体的涉及用于流感疫苗的试验。

背景技术

近期流感的爆发强调了对于快速生产和投放足量流感疫苗以保护公众远离该疾病的需求，该疾病具有潜在致命的并发症。

灭活流感疫苗中血细胞凝集素(HA)含量的标准试验是基于单径向免疫扩散(“SRID”)(参考文献：1和2)，WHO在1978年建议用其替代基于红细胞凝集的试验。

尽管所述SRID试验已良好建立，但其进行缓慢、动态范围差、具有显著变异性，且制备并校准所需特异性抗HA血清需要很长时间。由于疫苗中流感毒株每个季节都会改变，这使得流感疫苗批次投放产生了瓶颈，因为这些参照试剂需要针对各毒株改变进行制备和校准。在需要尽快的制备流感疫苗的流感爆发情况下，这尤其成问题。

SRID试验的另一个缺点是，其可能无法可靠区分流感血细胞凝集素(HA)抗原的免疫活性形式与那些不是免疫原性的HA，因为试验中使用的抗血清可能不是完全特异性的并且可能与两种形式反应，尽管通常认为这样的抗血清能经调整以在SRID试验中优先识天然的、免疫原性的形式(参考文献125)。由于流感疫苗的免疫原性(因此，免疫保护性)是由免疫活性HA的量所确定，因此需要能够特异性地测量HA的免疫活性形式的试验。

参考文献3提出了SRID试验的一种替代方法，其中超滤后进行反向高压液相色谱(RP-HPLC)，并且参考文献4和5教导了基于高压液相色谱(HPLC)的试验。参考文献6和7开发了基于定量质谱的试验。这些试验可以准确地定量总HA，并且并不依赖于毒株特异性的抗血清，但是其无法区分免疫活性的HA和失活的HA。尽管ELISA试验能够特异性地定量免疫活性的HA，但是其依赖于生产毒株特异性抗体(参考文献8)，而这大大增加了疫苗可投放之前所需的时间。

发明内容

本发明包括用存在的流感效力试验鉴定问题的来源。因此，本发明(至少部分)是基于这样的认识，即用于定量疫苗生产的流感病毒抗原的常规方法无法准确地测量包括在疫苗中作为免疫原的流感病毒蛋白质的量。本文和其它地方所呈现的工作指出，分离的流感病毒蛋白可以在体外免疫试验中作为抗原，但是不可以作为功能性免疫原以引发体内免疫应答。人们迫切需要区别测量流感蛋白的这些功能和结构上不同的形式，从而可以制造流感疫苗以反映其中所包含功能性免疫原的精确量。为此，本公开的发明人研究开发了一种基于生物物理测量(作为免疫化学测量的对照)的试验以区分活性、免疫原性结构和其失活对应物之间的构象差异。该方法的原理包括：i)更直接地评估蛋白质/抗原本身；ii)可以进行这些试验的速度；iii)可以同时处理具有多个抗原的样品的简便性；和/或，iv)无需依赖于对应的抗血清(特别是，绵羊抗血清)的可用性。

因此，本文所提供的方法使得疫苗生产商准确地指示其各疫苗中包含了多少免疫原性抗原，而不仅仅只显示包括在产品中的蛋白质总量。从公共卫生的角度来看这是很重要的，因为需要确定存在多少免疫原性HA，并且还希望知道疫苗中存在多少非功能性HA，并且因为其有助于将焦点更多地关注于疫苗的纯度和效率。

因此，本发明的一个目的是提供比传统SRID试验更快的流感效力试验，并且还提供一种在流感疫苗中对免疫活性HA量更可靠的评估。

本发明还包括改善的SRID试验，其中对传统的SRID试验进行改良，以利用本文所述的生物蛋白水解的益处，即，区分HA免疫原性形式与HA弱免疫原性形式的能力。因此，本发明的另一个方面提供了一种在SRID之前整合了生物蛋白水解(例如，胰蛋白酶预处理)步骤的SRID试验，从而改善该试验在确定样品中免疫活性HA量中的准确性。适合的样品可以是如本文所述的样品。适合的样品可以获得自，例如，抗原批料制备物(如“单批”)、中间体制备物，生产期间和/或最终制剂，投放前的最终疫苗制剂和/或产物，储存后的疫苗产物，等。如本文所述，具有通过生物蛋白水解预处理的SRID，有利地避免了传统SRID形式中所见的对于免疫活性HA的过高估计。

本文所述的方法因此适用于在流感疫苗生产期间测量流感病毒抗原量，以及用于质量控制的目的，例如，在一段时间后(例如，储存后)评估样品的效力(包括中间体制备物、原料制备物和最终疫苗产品)。

附图的简要说明

图1显示了低pH-诱导的融合后HA1对胰蛋白酶消化敏感，而对照融合前HA1对胰蛋白酶具有抗性，即使在高蛋白酶浓度下，如降低的SDS-PAGE(A)和RP-HPLC(B)两者所示。

图2提供了流感效力试验的流程图。

图3提供了通过本发明的试验和SRID测试的pH 4-应激的四价流感疫苗(QIV)样品的结果。(A)不同处理的样品的RPLC色谱图(峰值的注释是基于标准单批的保留时间)；(B)当前试验(左图)和SRID(右图)的试验结果。各毒株在-/-对照的效力显示为100％。

图4提供了通过本发明的试验和SRID测试的pH 11-应激的四价流感疫苗(QIV)样品的结果。(A)不同处理的样品的RPLC色谱图(峰值的注释是基于标准单批的保留时间)；(B)当前试验(左图)和SRID(右图)的试验结果。各毒株在-/-对照的效力显示为100％。

图5提供了通过当前试验和SRID测试热度(56℃)-应激的四价流感疫苗(QIV)样品的结果。(A)不同处理的样品的RPLC色谱图(峰值的注释是基于标准单批的保留时间)；(B)当前试验(左图)和SRID(右图)的试验结果。各毒株在-/-对照的效力显示为100％。

图6显示了针对A/Victoria、A/Brisbane和B/Brisbane毒株的丙酮沉淀后回收的免疫原性HA的百分比。

图7提供了详述了不同洗涤方案后留下的消化的失活HA肽的百分比的表格。这样洗涤样品：i)在丙酮中洗涤三次；ii)在丙酮中洗涤两次，然后用乙醇洗涤一次；或iii)在乙醇中洗涤三次。在乙醇中洗涤三次通过去除最大量的消化的失活HA肽产生了最佳结果。

图8提供了显示两次注射1μg蛋生(egg-produced)A/Texas/50/2012(H3N2)HA的小鼠中免疫原性的图表，所述HA维持于pH 7.2或短暂暴露于pH 4.0，用和不用胰蛋白酶消化。(A)使用A/Texas/50/2012(H3N2)病毒和火鸡血细胞的HI滴定。(B)与A相同的血清组中使用A/Texas/50/2012(H3N2)病毒感染MDCK细胞的微量中和法滴定。

图9显示了蛋生A/Texas/50/2012(H3N2)HA的SDS-PAGE、RP-HPLC、ELISA和SRID分析，所述HA维持于pH 7.2或短暂暴露于pH 4.0，用和不用胰蛋白酶消化。(A)非降低的(左)和降低的(右)样品的SDS-PAGE。(B)与(A)中相同的样品组的分析RP-HPLC色谱图。(C)与(A)中相同的样品组的ELISA，使用包覆于平板的HA进行，并且通过用于SRID绵羊多克隆抗血清检测。(D)与(A)中相同的样品组的SRID凝胶成像。(E)通过RP-HPLC、ELISA和SRID与HI滴定的小鼠免疫原性的HA定量的总结。

图10显示了维持于pH 7.2或短暂暴露于pH 4.0的蛋生A/Perth/16/2009(H3N2)HA的均一样品，以及对两样品的混合物的SRID和胰蛋白酶/RP-HPLC分析。(A)分析无应激HA，低-pH应激HA，以及掺入2x、1.5x、1x和0.5x低-pH应激HA的无应激HA的SRID凝胶成像。(B)来自A中SRID凝胶以及来自应激样品和其混合物的胰蛋白酶/RP-HPLC试验的HA的相对定量。

图11显示了对于用或没用胰蛋白酶消化的维持于pH 7.2或短暂暴露于pH4.0的HA或这两种HA样品的混合物的SRID和RP-HPLC分析。(A)进行这些处理的蛋生B/Brisbane/60/2008的SRID成像。通过SRID和RP-HPLC对进行这些处理的蛋生(B)B/Brisbane/60/2008HA；(C)A/California/07/2009(H1N1)HA；(D)A/Texas/50/2012(H3N2)HA；和(E)B/Massachusetts/02/2012HA进行的HA定量。

图12提供了IRDye-标记的A/Texas/50/2012(H3N2)HA的SRID分析成像。(A)分别用IRDye800标记的无应激HA和低-pH应激HA通过SRID分析。在SRID凝胶中通过红外荧光成像追踪标记的蛋白质。未标记的HA也可以通过western印迹用抗-H3抗体在用于SRID凝胶印迹的硝化纤维素膜上检测。(B)用IRDye800标记无应激HA，用IRDye680标记低-pH应激HA。在SRID凝胶中通过成像仪的绿色和红色通道确定用或不用胰蛋白酶处理的无应激HA、应激HA、与无应激和应激HA的混合物。

优选实施方式详述

本发明提供了用于对样品中免疫原性HA定量的方法，该方法更迅速、更准确并且不需要使用抗血清。根据本发明，免疫原性HA和失活的HA可以由于其不同的构象而被分离，这反映在它们对蛋白质水解不同的敏感性。这些方法不依赖于抗血清，并且开发了一种生物物理学预处理以选择性地移除免疫失活的HA(即，弱免疫原性、应激的或融合后构象)，然后进行免疫原性HA的分离和定量。这样的方法因此显著地快于标准的SRID试验并且还更加准确，因为只测量了免疫原性HA的量。

本发明提供的方法包括以下步骤：

a)提供包括免疫原性HA、失活的HA、或其组合的样品；

b)对样品进行生物蛋白水解，其中失活的HA被消化，而免疫原性HA保持未消化；

c)将样品中消化的失活HA与未消化的免疫原性HA分离；

d)对未消化的免疫原性HA进行分析性蛋白质水解(analytical proteolysis)，从而提供消化的免疫原性HA片段；并且，

e)在存在至少一种标记的参照HA肽的情况下进行液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS)，以对样品中免疫原性HA的量进行定量。

此外，还提供了一种用于在样品中定量免疫原性流感HA的方法，其包括如下步骤：

a)对样品进行生物蛋白质水解；

b)将样品中免疫原性HA与其它组分分离；并且

c)对样品中免疫原性HA进行定量。

在特别优选的的实施方式中，步骤(c)通过使用质谱进行，特别是液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS)。

原则上，免疫原性HA的定量可以本领域已知的用于蛋白质定量的任何方法进行。上述某些实施方式也适合通过SRID的定量。

同样提供的是如本文所述的方法，其中省略了将样品中免疫原性HA与其它组分分离的步骤(例如，将样品中消化的失活HA与未消化的免疫原性HA分离)。这样的方法可以是本文所述涉及分离步骤的方法的另一种方式，特别是通过质谱进行定量的方法。这样的方法具有这样的优势，其减少处理或处理步骤的数量(例如，通过蛋白质沉淀取消分离步骤)，并且使得样品损失最小化。发明人已经发现，如果在各生物和分析性蛋白质水解步骤中使用不同的蛋白酶或不同的蛋白酶选择，人们可以进一步将免疫原性HA的量与样品中失活HA进行区分，所述不同的蛋白酶或不同的蛋白酶选择具有不同底物特异性(或底物选择特异性)。在这样的方法中，失活HA被生物蛋白质水解步骤中的一种或多种蛋白酶消化，以产生消化的失活HA，而免疫原性HA(所基本上所有免疫原性HA)保持未消化。然后，通过一种或多种蛋白酶对未消化的免疫原性HA和消化的失活HA的混合物进行分析性蛋白质水解。重要的是，分析性蛋白质水解使用不可以在一个或多个切割位点切割免疫原性HA的蛋白酶或蛋白酶选择进行，所述切割位点在生物蛋白质水解期间在失活HA中可以被切割。以此方式，分析性蛋白质水解可以提供消化的免疫原性HA的片段，所述消化的免疫原性HA包括与失活HA衍生的肽相区别的一种或多种免疫原性HA衍生的肽。例如，消化的免疫原性HA的片段将会包括一个或多个免疫原性HA衍生的肽，其包括至少一个可以被至少一种蛋白酶切割的切割位点，其中所述至少一种蛋白酶被用于生物蛋白质水解步骤，但是不用于分析性蛋白质水解步骤。

相应地，本发明还提供一种包括以下步骤的方法：

a)提供包括免疫原性HA、失活HA、或其组合的样品；

b)通过一种或多种蛋白酶对样品进行生物蛋白水解，其中失活HA被消化，而免疫原性HA保持未消化；

c)使用一种或多种蛋白酶对未消化的免疫原性HA和消化的失活HA的混合物进行分析性蛋白质水解，其中所述分析性蛋白质水解不可以在一个或多个切割位点切割免疫原性HA，从而提供消化的免疫原性HA的片段，所述切割位点在生物蛋白质水解期间在失活HA中可以被切割，所述消化的免疫原性HA的片段包括区别于失活HA衍生的肽的一种或多种免疫原性HA衍生的肽；并且，

d)在存在至少一种标记的参照HA肽的情况下进行液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS)，以对样品中免疫原性HA的量进行定量。

在这些方法的优选实施方式中，一种蛋白酶(例如，糜蛋白酶样蛋白酶)被用于生物蛋白质水解步骤，并且具有不同底物特异性的不同的蛋白酶(例如胰蛋白酶样蛋白酶)被用于分析性蛋白质水解步骤。或者，超过一种不同的蛋白酶(例如，两种)可以被用于生物蛋白质水解步骤，而单一蛋白酶被用于分析性蛋白质水解步骤。如果一组超过两种不同的蛋白酶(例如，三种、四种或更多种)被用于生物蛋白质水解步骤，那么可以将一组较少的不同的蛋白酶用于分析性蛋白质水解步骤。

例如，这样的方法可能涉及通过第一蛋白酶和第二蛋白酶对样品进行生物蛋白质水解，其中，第二蛋白酶的底物特异性不同于第一蛋白酶的底物特异性。该方面可能还涉及只通过第一蛋白酶对未消化的免疫原性HA和消化的失活HA的混合物进行分析性蛋白质水解。或者，在分析性蛋白质水解中可以使用第三蛋白酶，其具有与第一和第二蛋白酶两者不同的底物特异性。在一些实施方式中，生物蛋白质水解中使用第一和第二蛋白酶，其中第一蛋白酶是胰蛋白酶样蛋白酶(例如，胰蛋白酶)并且第二蛋白酶是糜蛋白酶样蛋白酶(例如，糜蛋白酶)。

分析性蛋白质水解可以使用单一蛋白酶。在优选的特定实施方式中，用于分析性蛋白质水解的单一蛋白酶是胰蛋白酶样蛋白酶(例如，胰蛋白酶)。

如下提供了其它适合的蛋白酶示例，并且是本领域技术人员所知的。本领域技术人员可以在预实验中容易地确定用于本发明的合适蛋白酶组合。本领域技术人员还将理解的是，可以选择用于免疫原性HA定量的参照/替代HA肽以包括HA序列，该序列包括至少一个可以被至少一种蛋白酶切割的切割位点，其中所述至少一种蛋白酶被用于生物蛋白质水解步骤，但是不用于分析性蛋白质水解步骤。例如，当糜蛋白酶样蛋白酶被用于生物蛋白质水解步骤(例如，单独或与胰蛋白酶样蛋白酶(如胰蛋白酶)一起)，但是不用于分析性蛋白质水解步骤，可以选择用于免疫原性HA定量的替代HA肽，其包括被糜蛋白酶样蛋白酶(例如，糜蛋白酶)切割的HA序列。

在另一方面，本发明提供了改善的用于在样品中定量免疫原性HA的SRID方法，其比标准SRID分析更加准确。如上所解释，免疫原性HA和失活的HA可以由于其不同的构象而被分离，这反映在它们对蛋白质水解不同的敏感性。本发明的SRID方法通常使用抗血清(即，它们并不独立于抗血清)并且还开发了一种生物物理预处理以实现免疫原性失活HA(例如，弱免疫原性、应激或融合后构象)的选择性移除。在本发明的SRID方法中，预处理(生物蛋白质水解)后进行免疫原性HA的定量。

因此，本发明还提供了一种用于在样品中定量免疫原性流感HA的方法，其包括如下步骤：

a)对样品进行生物蛋白质水解；并且，

b)通过SRID试验对来自(b)的样品中的免疫原性HA的量进行定量。

在一些实施方式中，步骤(b)的SRID试验是使用抗血清进行的，例如，多克隆抗血清(例如，绵羊多克隆抗血清)和/或单克隆抗体抗血清(例如，包含合适的单克隆抗体)。合适的一种或多种抗血清是毒株特异性的，并且可以是HA特异性的。因此，SRID试验可以使用毒株特异性、抗-HA、多克隆(绵羊)抗血清进行。

本发明还包括用于制造流感疫苗的方法，该方法包括如下步骤：

a)提供来自包含流感HA的批料制备物的样品；

b)根据本发明的方法对免疫原性HA的量进行定量；并且

c)根据样品中免疫原性HA的量，由批料制备物包装单位剂量形式。

本发明还包括用于制备流感疫苗的方法，该方法包括如下步骤：

a)根据本发明的方法对批料疫苗中HA的量进行定量；并且

b)由批料制备疫苗。

生物蛋白质水解和分析性蛋白质水解

流感病毒表面HA主要以融合前状态的低聚物(如三聚物)存在，这是最大免疫相关状态。在各种应激条件下，HA可以进行向融合后状态的不可逆转变，这将不会引起良好免疫应答。流感疫苗的制备通常导致融合后HA的存在，但是标准SRID试验不可以区分融合前(免疫原性)和融合后(失活)HA，这因此导致对疫苗中包含的免疫原性HA实际量的高估。本发明的方法通过生物蛋白质水解区分这些不同形式的HA，从而只有免疫原性形式被定量。

相应地，如本文所述，“生物蛋白质水解(biological proteolysis)”指基于酶的HA消化，借此蛋白质的免疫原性活性形式(例如，处于融合前状态的HA)保持完整(即，未消化的)，而蛋白质的失活形式(例如，处于融合后状态的HA)被消化。取决于蛋白质的构象，生物蛋白质水解的步骤因此实现了不同的消化。未经过变性步骤的HA蛋白质对生物蛋白质水解具有抗性。因此，取决于蛋白质的构象或结构完整性，如本文所使用的生物蛋白质水解的步骤实现了受控的或限制的蛋白质消化。

与之相反，如本文所述，“分析性蛋白质水解(analytical proteolysis)”指无论靶蛋白的构象，通常是出于后续分析步骤的目的，如质谱分析的靶蛋白的片段化(即消化)。分析性蛋白质水解涉及在消化之间对蛋白质进行变性的步骤。

在参考文献9中报道了，HA构象的改变取决于pH，与此同时HA的一些形式容易受到蛋白酶消化，然而一些不会。这可能是由于免疫原性HA表面致密糖基化的涂层和良好填充的结构。发明人已经确认融合前HA在其天然状态下对蛋白质降解具有高抗性，即使是在高蛋白酶浓度(HA:胰蛋白酶＝5:1)下。相反，低pH诱导的融合后HA1，即使在其天然状态时，对于蛋白酶降解也非常敏感。

通过在定量之前包括生物蛋白质水解步骤，本发明的方法允许将免疫原性HA和失活HA进行区分。具体而言，免疫原性HA对蛋白酶具有抗性，与此同时失活HA对蛋白酶敏感。这意味着当将蛋白酶加入样品时(例如，当胰蛋白酶以1:20的酶:底物比加入，并在37℃孵育2小时)，基本上所有的失活HA被消化，而基本上所有的免疫活性HA保持结构上的完整。该生物蛋白质水解步骤因此消化基本上所有的失活(融合后)HA，与此同时基本上所有的免疫原性(融合前)HA保持未消化。在这一方面，应当理解的是免疫原性HA本身并不完全对蛋白酶依赖性切割具有抗性。具体而言，HA0可以被某些蛋白酶(如胰蛋白酶)切割成HA1和HA2，但是蛋白质并不解离成片段。此外，HA1和HA2仍然以复合物的形式关联，其保持相同的结构完整性(例如，融合前状态)。这些HA1/HA2复合物仍然被认为是免疫原性的。切割的融合前HA可以与失活HA的消化产物相区分，所述失活HA的消化产物中基本上所有的失活HA被蛋白酶片段化成肽。

“基本上”在蛋白质水解(消化)上下文中表示存在于样品中的至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的失活(融合后)HA被消化。此外，“基本上”在免疫原性HA上下文中表示至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％的免疫原性(融合前)HA保持未消化。

免疫原性HA是以这样的形式：融合前HA三聚体、融合前HA寡聚体(例如，所谓玫瑰花结)或其组合。失活HA是HA单体、融合后HA三聚体、变性的蛋白质、聚合的蛋白质或其组合。例如，可以使用本领域已知的方法，如结晶学鉴定融合前和融合后HA构象。

相较于失活HA，免疫原性HA通常会引起更高的免疫应答。例如，从用免疫原性HA注射受试者获得的几何平均滴度(GMT)，可以与失活HA相比至高少2倍，至少4倍，至少8倍或至少16倍。因此，本领域技术人员应当已经理解的是，本文所用“失活HA”(例如，融合后，或应激形式的HA)并不一定表示其完全缺乏免疫原性，而是指相较于具有胰蛋白酶抗性的融合前、非应激形式的HA，其免疫原性较差。

生物蛋白质水解可以用任何能够消化失活HA的蛋白酶进行。这样的酶是本领域已知的并包括，例如，丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶)、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。示例性的丝氨酸酶包括但不限于胰蛋白酶样蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、弹性蛋白酶样蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶。预期所有这些酶将用于本发明的方法，因为关于免疫原性HA和非活性HA的不同蛋白水解活性是由于免疫原性HA表面良好填充的结构和致密糖基化的涂层，其物理防止蛋白酶消化蛋白质。事实上，发明人还示出糜蛋白酶可以在生物蛋白质水解步骤中消化失活(融合后)HA。因此，生物蛋白质水解可以使用胰蛋白酶和/或糜蛋白酶。本发明的方法可以使用两种、三种、四种或多种蛋白酶进行。

用于检测蛋白酶是否可以消化失活HA的方法是本领域所熟知的。例如，本领域技术人可以使用如参考文献9中所述的方法提供失活HA，并且测试不同的蛋白酶以确定何种蛋白酶可以消化失活HA。

已知消化失活HA的一组蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。这些是切割蛋白质中肽键的酶，其中丝氨酸在活性位点作为亲核性氨基酸。这样的蛋白酶是流感病毒感染体内宿主细胞所需的，并且通过将前体HA0分裂成HA1和HA2形式作用，因此使得流感病毒通过促进膜融合感染宿主细胞。由于已知丝氨酸蛋白酶消化流感HA，因此优选它们用于本发明。

消化流感HA最常用的丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶，并且在本发明的方法中使用该蛋白酶是特别优选的。然而，还可以使用可以消化HA的其它丝氨酸蛋白酶。这样的蛋白酶的示例包括TMPRSS2和HAT(参考文献10)。

蛋白酶优选直接加入样品。这样是优选的是因为其使得定量过程更简便并且还避免由于样品操作对免疫原性HA量的任何过高估计。然而，在一些情况中，可能需要在添加蛋白酶之前对样品中生物蛋白质水解的条件进行优化。这可能是必需的，例如，当样品中的缓冲液不运行最佳蛋白酶活性。在这些实施方式中，样品中缓冲液可以通过本领域的标准方法交换，例如，透析。还可以用其它缓冲液稀释样品。应当理解的是，必须小心谨慎以防止形成其它失活HA的条件产生，例如，通过降低缓冲液的pH，因为这可能导致不准确的定量。在这是不可避免的情况下，通过进行预试验以确定免疫原性HA中的相对损失并且由此量对获得自定量的结果进行校正，仍然可以使用本发明的方法对HA进行定量。

在流感病毒是在细胞培养物中生长的情况下，如胰蛋白酶的蛋白酶在流感病毒生长期间日常添加。流感疫苗的生产过程包括纯化步骤，因此只有可忽略量的残留蛋白酶将会存在于由流感病毒制备的流感疫苗中。为避免疑义，生物蛋白水解步骤不能依赖于可能存在的残留蛋白酶，而是需要添加到样品中的蛋白酶。

本领域技术人员可以容易地确定对消化合适的条件。例如，本发明的方法可以使用约2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、或50U/mL的蛋白酶，如胰蛋白酶进行。本发明的方法可以使用约2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、或100U/mL的蛋白酶，如胰蛋白酶进行。许多蛋白酶需要位于32℃和40℃之间、34℃和38℃之间或约37℃的最佳温度，从而使得消化可以在该温度下进行。消化的具体时间可以不同，但是反应通常会进行直到基本上所有的失活HA已经被消化。例如，样品可以与蛋白酶孵育10分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、100分钟、110分钟、120分钟、130分钟、140分钟、150分钟、160分钟或170分钟。本领域技术人员可以在预实验中容易地确定消化所需要的时间。

如上所讨论的生物蛋白质水解步骤在疫苗制造过程中同样是有益的。具体而言，可以将这样的步骤包括在疫苗制造过程中，其具有的优势是获得的疫苗将主要包含免疫原性HA，因为失活HA将会被选择性地移除。这样的方法将会涉及纯化步骤以在疫苗配制之前去除蛋白酶。

相应地，本发明包括制造疫苗中间体的方法，该方法包括制备包含抗原的批料制备物(如HA单批料)的步骤，将批料制备物或其部分进行生物蛋白质水解，从而消化抗原的应激或失活形式。获得的中间体可以被后续用于配制疫苗产品，对其用蛋白酶具有抗性的免疫原性活性形式的抗原进行富集。因此，本发明包括用于制造疫苗产品的方法，所述方法包括如下步骤：制备包含抗原的批料制备物(如HA单批料)，将批料制备物或其部分进行生物蛋白质水解；并且，使用已经进行生物蛋白质水解的批料制备物或其部分配制疫苗。抗原可以是流感抗原。然而，本发明可以用于任何抗原，其可以多种构象存在，从而使得蛋白酶敏感性(或蛋白酶抗性)与感兴趣的生物活性(例如，免疫原性)相关联。在一些实施方式中，疫苗产品包含至少60％的处于免疫活性构象的抗原，例如，至少60％、至少70％、至少80％和至少90％。在一些实施方式中，相较于并不是用抗原的免疫活性形式富集的标准产品，用免疫活性抗原富集的这样的疫苗产品可以包含少于标准量的抗原，但是其能够在对象中引起等效或更强的免疫应答。例如，相较于具有15μg HA/毒株/剂量的标准流感疫苗，本发明的疫苗产物可以较少的总抗原具有等效或更好的功效或效果，例如，少于12μg、少于9μg、少于7.5μg、少于5μg、少于3.75μg HA/毒株/剂量。

蛋白酶消化步骤还可以提供这样一个额外益处，即逆转可能存在于抗原制备物中的一些聚合，从而降低损失并增加各制备抗原的产率。

如上所讨论，在一些实施方式中，本发明的方法可以使用超过一种蛋白酶。本文所述的各种生物和分析性蛋白质水解步骤可以使用不同的蛋白酶，或不同的蛋白酶组。各种不同的蛋白酶可以具有不同的底物特异性。例如，胰蛋白样蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、弹性蛋白酶样蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶通常具有彼此不同的底物特异性。在相同的条件下，如果一种蛋白酶能够在给定的切割位点切割给定的肽，而其它的蛋白酶不可以，那么可以认为蛋白酶具有不同的底物特异性。例如，胰蛋白酶样蛋白酶通常在氨基酸赖氨酸或精氨酸的羧基侧切割肽(除了当其中任一一个之后是脯氨酸)。糜蛋白酶样蛋白酶通常在大的疏水性氨基酸的羧基侧切割肽(例如，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸)。弹性蛋白酶样蛋白酶通常在小的疏水性氨基酸的羧基侧切割肽(例如，甘氨酸、丙氨酸和缬氨酸)。

在某些实施方式中，定量是通过质谱的情况下，分析性蛋白质水解步骤中可以使用超过一种不同的蛋白酶。如本文所述，分析性蛋白质水解之前可以进行分离步骤。在本文所述的另一个实施方式中，分离步骤可以省略。无论何种情况，分析性蛋白质水解可以使用超过一种的不同的蛋白酶，其具有不同底物特异性(即，不同切割位点)。在分析性蛋白质水解阶段中使用超过一种不同的蛋白酶可以产生包含免疫原性HA衍生的肽的消化的免疫原性HA的片段，所述免疫原性HA衍生的肽比当使用较少不同的蛋白酶产生的免疫原性HA衍生的肽短。有利的是，较短的参照/替代肽可以因此被用于定量，因此为选择具有这样的序列的一种或多种参照肽提供了更大的自由，所述序列在待定量的免疫原性HA中是保守的。这项技术还可以被用于增加参照肽的可用性，所述参照肽不包含易于修饰(例如，可能非所期待地影响定量结果的化学或翻译后修饰)的氨基酸。在一些优选实施方式中，在分析性蛋白质水解之前进行分离步骤的情况下，生物蛋白质水解使用一种蛋白酶(例如，胰蛋白酶样蛋白酶，如胰蛋白酶)并且分析性蛋白质水解使用生物蛋白质水解中相同类型的蛋白酶以及具有不同底物特异性的一种或多种蛋白酶(例如，糜蛋白酶样蛋白酶，如糜蛋白酶)。

分离

消化后，优选地是未消化的免疫原性HA与样品中的其它组分分离。具体而言，特别优选地是未消化的免疫原性HA与消化的失活HA分离。这是有利的，因为这样使得下游定量更简单。具体而言，将免疫原性HA与消化的失活HA分离允许通过如质谱的方法对免疫原性HA进行定量。

此外，如上所讨论，在本发明的一些实施方式中，可以省略分离步骤，例如，在分析性蛋白质水解提供消化的免疫原性HA的片段的情况下，所述消化的免疫原性HA的片段包括与失活HA衍生的肽相区别的一种或多种免疫原性HA衍生的肽。

用于将免疫原性HA与样品中其它组分分离的方法是本领域已知的，并且包括，例如，逆相色谱、尺寸排阻色谱和离子交换色谱。

虽然这些现有技术的分离方法适合用于本发明的一些实施方式中(特别是在那些不依赖于质谱进行免疫原性HA定量的实施方式中)，发明人发现使用逆向和尺寸排阻色谱的最初尝试并不尽人意，这是由于：1)这两种色谱都不能够实现最佳的基线分辨率；2)在柱上观察到大量样品损失；3)在分馏收集期间引入了显著的变异；4)与分馏收集、缓冲液交换和体积减少相关的试验输出降低和大量的劳动。

因此，优选通过蛋白质沉淀将样品中的免疫原性HA与样品中的其它组分(特别是消化的失活HA)分离。该方法的优势包括以相同管进行的样品制备/处理，这使得样品损失最小化；减少人工制品的引入；以及将回收的蛋白质沉淀重悬于所需体积相容缓冲液用于下游样品制备的便利性。发明人发现蛋白质沉淀几乎100％持续地回收样品中的免疫原性HA。

用于将蛋白质沉淀的各种方法是本领域已知的。它们包括盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、非离子亲水聚合物和聚电解质絮凝。因此，在一些实施方式中，分离步骤包括将消化的失活HA片段从保持完整、未消化的免疫原性HA的样品中去除。

发明人已经用有机溶剂观察到良好结果，特别是用丙酮，其产生了几乎100％的从样品的免疫原性HA回收。在优选的实施方式中，分离(未消化的)免疫原性HA的步骤包括添加有机溶剂的步骤，特别是丙酮或醇。有机溶剂可以是丙酮、乙醇或甲醇。本发明的方法还包括用醇洗涤沉淀的蛋白质的步骤。添加的醇的温度可以是低于4℃。醇优选是乙醇。发明人发现该步骤实现了完全去除从失活HA衍生的消化的肽。然后可以干燥沉淀，例如，通过空气干燥或真空离心。

蛋白质沉淀后，将沉淀的蛋白质重悬。例如，这可以通过添加引入强变性条件的缓冲液实现，如强变性胍缓冲液。可以进一步加热样品以促进蛋白质重悬。这样的方法是本领域的标准方法，并且本领域的技术人员可以容易地将其纳入操作。

如下述实施例所示，在使用SRID试验对免疫原性流感HA进行定量步骤的情况下，SRID试验其自身可以使得免疫原性HA与样品中的其它组分(例如，失活HA)分离。

定量

原则上，免疫原性HA的定量可以使用本领域已知的用于蛋白质定量的任何方法进行。例如，本发明的方法将与通过SRID的定量相匹配，如上所述，因为消化失活HA的步骤允许更准确地确定样品中免疫原性HA的量。因此，在本发明的方法中，定量免疫原性HA的步骤可以包括使用SRID。然而，如上所述，SRID具有这样的缺点，其依赖于需要耗费数周甚至数月生产的毒株特异性抗血清的使用。因此，优选的是，定量免疫原性HA的步骤不包括使用SRID。

因此，本发明优选利用不需要使用毒株特异性抗血清的定量方法。这样的方法避免了当前流感疫苗生产的瓶颈，因为其不需要随着季节制备和校准参照抗原。这样的方法包括诸如高效液相色谱(HPLC)的色谱方法，特别是反相高效液相色谱(RP-HPLC)，以及质谱方法，如液相色谱-质谱(LC-MS)和液相色谱-质谱/质谱(LC-MS-MS)和双向凝胶电泳(2-DE)。

RP-HPLC

RP-HPLC是这样一种形式的色谱分析法，其将液体(流动相，如溶剂)应用于色谱柱(固定相)，并根据固定相和样品中存在的组分之间的相互作用保留于柱上。泵将液相移动通过柱，并且随着条件的改变，可以在不同的时间从柱洗脱不同的分子。RP-HPLC具有非极性固定相，以及水性、中等极性移动相。RP-HPLC保留时间通常可通过增加流动相中水的比例增加(因此使疏水分析物对疏水固定相的亲合力比当前更亲水的流动相更强)；相反其可通过增加非极性或较低极性有机溶剂(例如，甲醇、乙腈)的比例降低。

对RP-HPLC柱和洗脱条件进行选择从而使得HA1可以从这些其他蛋白质中解析出。从例如，参见参考文献11已知RP-HPLC实现该分辨率的能力。

可以使用各种形式的RP-HPLC。在使用RP-HPLC的情况下，其可容易地在具有孔径的l0μm聚苯乙烯二乙烯基苯(PSDVB)颗粒柱进行，但也可使用其他支持材料(例如，其他疏水聚合物，如与二氧化硅中硅烷醇基共价结合的十八烷基、癸基或丁基的正烷基疏水链)、粒度(例如，3-50μm)和孔径(例如，)，且PSDVB的特性可通过在共聚合或β-衍生期间(例如，磺基乙酰化作用)期间改变PS和DVB比而改变。合适的RP-HPLC支持物可容易地基于其保留和洗脱HA的能力和从样品中存在的其他材料中分离HA的能力而选择。可使用的支持物含具有两种级别孔的珠：能通过颗粒自身产生对流的大“穿透孔”，快速携带样品分子到内部短“扩散”孔。这种孔排列降低了发生扩散所需的距离并减少了样品分子与结合位点相互作用所需的时间。因此，扩散可以不受限制，并且可以提高流速(例如，1000-5000cm/小时)，不会影响分辨率或容量。

可以使用各种洗脱缓冲液，例如，使用乙腈梯度。可在例如0.1和5ml/分钟之间容易地选择合适的流速(例如，0.5和1.5ml/分钟之间，或约0.8ml/分钟)。可在室温下进行洗脱，但是在50-70℃范围内洗脱是有用的，例如，在55-65℃之间，或约60℃。

可监控RP-HPLC洗脱(例如，约214nm处UV吸收，或使用约290nm激发和约335nm发射的固有荧光)以检测样品中的任何HA。HPLC洗脱色谱HA峰下的面积可用于定量所述HA。通过使用已知体积的样品，由这些方法确定的HA量可用于计算获取样品的初始材料中，例如，批料抗原制备物中或单一疫苗剂量中的HA浓度。由于单个毒株潜在的峰值重叠，该测量技术对单价疫苗制备物是最可靠的，而不是多价疫苗制备物。

质谱

根据本发明，定量HA最优选的方法是质谱(MS)，特别是液相色谱质谱(LC-MS)技术，如液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS)。

使用LC-MS的显著优势是其允许对样品中的蛋白质进行特异的定量。此外，其允许在相同时间对来自多种流感毒株的HA进行同时测量。在分析多价流感疫苗的情况下这是特别有利的，因为其避免了单独分析各HA的需要。该方法还具有其它益处，即其与佐剂的存在相容，如可能干扰传统SRID试验的MF59。

通过质谱对蛋白质进行定量的方法是本领域众所周知的，并且已经在例如参考文献12中描述。这些方法通常涉及蛋白酶消化变性样品的初始步骤，以提供待定量的蛋白质的肽。这些肽然后通常被色谱分离，并且其后通过MS进行分析。

分析性蛋白质水解的初始步骤可以使用内切蛋白酶进行。合适的内切蛋白酶已经在参考文献13中描述，并且包括胰蛋白酶，糜蛋白酶，内切蛋白酶Asp-N，内切蛋白酶Arg-C，内切蛋白酶Glu-C，内蛋白酶Lys-C，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，弹性蛋白酶，木瓜蛋白酶，蛋白酶K，枯草杆菌蛋白酶，梭菌蛋白酶，外肽酶，羧肽酶A、B、P或Y，组织蛋白酶C，酰基氨基酸释放酶，焦谷氨酸氨基肽酶或其组合。

免疫原性HA通常在水性溶液中消化，这使得HA变性。水性溶液可包括无机酸或有机酸。无机酸可选自：盐酸胍，硝酸，磷酸，硫酸，氯化铵，碳酸氢铵，及其组合。在使用有机酸的情况下，其可选自：草酸，丙二酸，酒石酸，乙酸，甲酸，乳酸，丙酸，邻苯二甲酸，苯甲酸，柠檬酸，琥珀酸，其盐，及其组合。酸的确切性质无关紧要，因为其主要目的是将蛋白质变性以促进消化。

在本发明的方法涉及蛋白质沉淀步骤的情况下，可以将沉淀的蛋白质直接重悬于用于分析性蛋白质水解的缓冲液。或者，可以将其重悬于不同的缓冲液，并且后续可以将其它组分(如无机酸或有机酸)添加到重悬的蛋白质。

消化后，使用已知的猝灭剂可以将反应淬灭，如，例如，三氟乙酸。

通过MS分析获得的肽之前，可将标记的替代肽添加到反应混合物。这些替代肽的使用具有这样的优势，即其促进免疫原性HA的定量，因为其不需要平行进行对照实验。因此，出于定量的目的，替代肽可以用作与目标片段比较的参照肽(即，对照)。通常，替代肽是预定氨基酸序列的合成多肽。可使用任何合适的替代肽作为参照，这提供了其已知的质量偏移，从而可以容易地将其检测。例如，除了核心氨基酸段，替代肽可以包括一个或多个已知质量的化学部分。在一些实施方式中，替代肽可以包含一个或多个修饰的氨基酸，从而使其与其天然对应物相比具有稍微不同的质量。在一些实施方式中，替代肽可以是同位素标记的。优选地，同位素标记选自：¹⁵N和¹³C。

制备替代肽的方法为本领域熟知。优选这些替代肽，从而使其在液相色谱(LC)上具有良好的保留时间，在ESI上具有可接受的离子化效率，并且免于潜在的翻译后修饰(如N-连接的聚糖和蛋氨酸)。

在对超过一种流感抗原的数量进行评估的情况中，可以添加多个毒株特异性替代肽。例如，在包括来自n种流感毒株的抗原的样品中，可以添加n种类型的毒株特异性替代肽。毒株特异性替代肽的数量也可以不同于样品中来自不同毒株的抗原的数量。例如，本领域技术人员可能只希望分析四价样品中的两个抗原。

替代肽合适的标签包括氟，荧光标签，如若丹明，Oregon绿或其它本领域已知物质，放射性标签，质量标签(参考文献13)。任选地使用校准曲线并且表示至少一种免疫原性抗原片段肽的已知量与比例之间的数学关系；其中所述比例是至少一种肽的已知量与至少一种标准肽的恒定量的商。

样品的分析可以使用液相色谱(LC)，然后进行质谱(MS)过程。适合的LC方法是本领域已知的，并且包括高效LC(HPLE)、超高效LC(UPLC)、和标准柱或平板凝胶色谱技术。优选地，使用UPLC分离肽。

进行色谱后，可以使用质谱检测肽。这样所具有的优势是其允许对目标肽的特异性检测，并且因此提供更准确的定量。具体而言，来自色谱柱的洗脱物常常包含污染物，并且添加MS步骤避免了由于这些污染物所导致的样品中免疫原性HA的过高定量。

本发明的方法可用任何MS技术实施。合适的检测和定量系统包括：电喷雾、基质辅助激光电离(MALDI)、飞行时间(TOF)，多重四极(multiple quadrupole)、以及本领域已知的其他类型的质谱系统。示例性地，购自Waters集团(Waters,Corp.)的Waters Q-TofPremier TOF四级杆串联质谱仪或API 4000-Q trap三重四极杆串联质谱仪(加利福尼亚州福斯特城的应用生物系统公司(Applied Biosystems))各自适合用于本发明。

根据本发明，特别优选的用于定量免疫原性HA的方法是液相色谱选择反应监测(LC-SRM)试验(参考文献14)。

修饰的单径向免疫扩散(SRID)试验

如上所述，抗原样品的蛋白酶消化选择性地降解失活形式的抗原，因此可以使用其它对构象不敏感的生物物理定量技术，如反相高压液相色谱(RP-HPLC)对蛋白酶抗性、免疫原性活性抗原进行特异性定量(同样参见如下实施例)。部分基于可以使用蛋白酶对不希望的抗原形式进行选择性地降解的认识，本发明在另一方面提供了实现改善的准确性的“修饰的”SRID试验。

根据本发明的这一方面，生物蛋白质水解(例如，蛋白酶消化)可以被纳入其它标准的SRID方案之中以实现更准确的试验结果。如在下述实施例中详述，胰蛋白酶消化可以改善SRID的特异性，因此其可以在免疫活性的融合前HA与免疫失活的融合后HA混合的时候对免疫活性的融合前HA进行定量。SRID试验仍然是本领域标准的体外效率试验，其被认为特异性地检测免疫活性的HA。如实施例中所证实，对于构象均一的HA制备物，可以使用SRID试验以特异性地检测天然的融合后HA，其在小鼠中引发流感中和以及血凝抑制抗体，并且其不检测低pH应激的融合后HA，所述低pH应激的融合后HA在印迹步骤中被选择性地从SRID凝胶中移除并且不具有免疫活性。本文所公开的工作惊讶地揭示了这种选择性检测是由于SRID形式自身，而不是由于SRID中使用的绵羊抗血清的构象特异性，因为当用于ELISA形式的时候，同样的抗血清可以相似地检测非应激的和低pH应激的HA。然而，当低pH应激的HA与非应激的HA混合之时，SRID可以检测两种形式，这导致免疫活性HA的过高定量。

相应地，本发明提供了涉及改善的SRID试验的方法和中间体。本发明因此包括这样的方法，所述方法包括在通过SRID对HA进行定量之前，对包含HA的样品进行生物蛋白质水解(例如，胰蛋白酶消化)步骤。本发明还包括将已经进行了生物蛋白质水解(如本文所定义)的样品用于进行SRID试验(例如，以对样品中免疫原性HA进行定量)。

样品

样品通常是流感疫苗或流感批料抗原制备物。这可以是获得自批料疫苗的样品或疫苗的单位剂量，尽管该方法通常在批料疫苗上进行，因为使用定量以确保完整的HA剂量(对于季节性流感疫苗的成人剂量通常是15μg/毒株)存在于疫苗的剂量体积中(通常是0.5mL)。

本发明的方法可以在批料疫苗或最终疫苗上进行。其也可以在生产过程中的中间体产物上进行。

可以对最终疫苗进行测试，以确保存在准确量的免疫原性HA。本发明的方法还可以在批料疫苗上进行，以确保正确量的免疫原性HA被添加到最终疫苗。批料或疫苗可以是单价的。其也可以是多价的，例如，在混合两个、三个、四个、五个或六个单批后。由于季节性流感疫苗通常是三价的或四价的，所以多价批料或疫苗通常是三价的或四价的。本发明的方法可以在批料或疫苗无菌过滤之前或之后进行。其还可以在添加佐剂之前或之后进行。在样品是疫苗的情况下，所述方法可以在包装之前或之后进行。

对批料疫苗(单价或多价)或已经储存的疫苗进行本发明的方法也是有用的。批料或疫苗可以已经存储于10℃(例如4℃)以下或0℃(例如，-20℃)的温度，例如超过1周、超过2周、超过3周、超过4周等一段时间。存储有可能导致HA从免疫原性状态到失活HA的构象变化。通过对已经储存的样品进行本发明的方法，可以确保最终疫苗中存在准确量的免疫原性HA。本发明的方法同样允许对样品的保质期进行评估。具体而言，样品可以被储存，并且可以使用本发明的方法在若干时间点对样品部分的免疫原性HA的量进行测试，以评估免疫原性HA的量在哪一个时间点下降。样品的稳定性越高，免疫原性HA的量显著降低所需时间将会更长。花费更长时间的样品被认为具有更高的稳定性。

目前可以获得各种形式的流感病毒疫苗，并且疫苗通常是基于活病毒或灭活病毒。灭活疫苗可基于全病毒颗粒、裂解病毒颗粒或基于纯化的表面抗原。流感抗原也可以各种病毒体的形式存在，或者也可以在重组宿主(例如，使用杆状病毒载体在昆虫细胞系中)中表达并以纯化形式使用(参考文献15)。本发明可以与任何类型的疫苗使用，但优选与灭活疫苗使用。

抗原可以采取完整减毒病毒或灭活病毒的形式。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种试剂处理：去污剂、甲醛、过氧化物、福尔马林，β丙内酯、或UV光。β丙内酯所具有的优势是可以将其轻易的从制备物中移除，因此该试剂是优选的。用于灭活的其他化学方法包括使用亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)或其任意组合处理。其他病毒灭活的方法是本领域已知的，例如二元乙胺、乙酰基乙烯亚胺或γ射线辐射。INFLEXAL^TM产品是全病毒颗粒灭活疫苗。

使用灭活病毒的情况下，该疫苗可包含全病毒颗粒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血细胞凝集素，且通常也包括神经氨酸酶)。

可通过各种方法从含病毒的流体中收获病毒颗粒。例如，纯化方法可包括用含有去污剂以破坏病毒颗粒的线性蔗糖梯度溶液进行区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。

用去污剂(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三N-丁基磷酸盐、曲通(Triton)X100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵等)处理病毒颗粒来获得裂解病毒颗粒，从而产生亚病毒颗粒制备物，包括‘吐温-醚’裂解方法。裂解流感病毒的方法是本领域熟知的，例如，参见参考文献16-21等。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化完整病毒来裂解病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白质的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如，阳离子)表面活性剂，例如，烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N,N-二烷基-葡糖酰胺、6-O-(N-庚甲酰)-甲基-α-D-葡萄糖苷(Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、三正丁基磷酸酯、塞弗伦(Cetavlon)、十四烷基三甲铵盐、脂质转染试剂、脂质体转染试剂(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒颗粒初始纯化期间进行(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)。可将裂解病毒颗粒重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。AFLURIA^TM、BEGRIVAC^TM、FLUARIX^TM、FLUZONE^TM和FLUSHIELD^TM产品是裂解疫苗。

纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原HA，并且通常还包含神经氨酸酶。制备这些纯化形式的蛋白质的方法是本领域熟知的。FLUVIRIN^TM、AGRIPPAL^TM、FLUAD^TM、FLUCELVAX^TM和INFLUVAC^TM产品是亚基疫苗。

流感抗原也可以病毒体(参考文献22)(无核酸的病毒样脂质体颗粒)的形式存在，如在INFLEXAL V^TM和INVAVAC^TM产品中。

本发明还可以与重组流感疫苗使用。这样的疫苗的示例是Flublok^TM。

流感病毒可以是被减毒的。流感病毒可以是温度敏感型。流感病毒可以是冷适应性病毒。这三种可能性特别适用于活病毒。

用于疫苗的流感病毒株随季节变化。在目前的大流行间期，疫苗通常包括两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种或两种乙型流感毒株，一般是三价或四价疫苗。本发明可与这些疫苗使用。其也可用于来自大流行毒株(即疫苗接受者5和普通人群没有发生过免疫接触的毒株)的病毒，如H2、H5、H7或H9亚型毒株(特别是甲型流感病毒)，大流行毒株的流感疫苗可以是单价疫苗，或者可以基于补充有大流行毒株的正常三价疫苗。然而，根据季节和疫苗中包括的抗原的性质，本发明可与这样的疫苗使用，所述疫苗保护抵御一种或多种甲型流感病毒血细胞凝集素亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。本发明可与这样的疫苗使用，所述疫苗保护抵御甲型流感病毒NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中的一种或多种。

可用于包括在疫苗组合物中的其它毒株是对抗病毒治疗有抗性(例如，对奥塞米韦(参考文献23)和/或扎那米韦有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株(参考文献24)。

如上所述，由于天然稳定性限制或由于生产疫苗时所需制造步骤(如灭活)，在疫苗生产过程中，HA可以经历向融合后状态的转变。本发明可使用这样的样品，所述样品中至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、80％、至少85％；至少90％、至少95％或至少99％的HA是活化/免疫原性(融合前)形式和/或少于20％、15％、10％、5％或1％的HA是失活(融合后)形式。样品中活化的HA与失活的HA的比例可以是至少4:1、10:1、20:1、50:1或100:1。

通常，对于样品而言，其包含等于或大于各毒株30μg/mL活化的HA是有用的，因为流感疫苗标准的成人剂量要求各毒株每0.5mL抗原15μg HA。因为抗原不需要被浓缩以提供人剂量，具有各毒株活化的HA为≥30μg/mL的HA浓度的样品使得疫苗的生产过程更容易。也可以使用具有各毒株活化的HA小于30μg/mL的HA浓度的样品，例如，各毒株至少25μg/mL的活化的HA，各毒株至少20μg/mL活化的HA，各毒株至少15μg/mL的活化的HA，各毒株至少10μg/mL活化的HA等。在这种情况中，最终疫苗可以具有更大的剂量体积以适应各剂量15μg HA的最终量，可以使用本领域的标准方法浓缩抗原，或者最终疫苗可能包含较低量的HA。较低量的HA可以用于大流行流感疫苗，例如，在这种情况下，疫苗可以是佐剂化的。样品可以包含少于4μg、3μg、2μg、1μg、0.5μg或0.25μg的失活的HA。

最终疫苗产品可以包含各剂量各毒株不超过15μg的总HA，例如，各毒株不超过14μg、不超过13μg、不超过12μg、不超过11μg、不超过10μg、不超过9μg、不超过8μg、不超过7μg、不超过6μg、不超过5μg的总HA。在一些实施方式中，在这些产品中的总HA，至少50％的抗原处于免疫活性形式，例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％。在一些实施方式中，最终疫苗产品中包含的不超过50％的总HA处于胰蛋白敏感形式，例如，不超过40％、不超过30％、不超过20％、不超过10％的总HA。

可以在鸡蛋或细胞培养物上培养用作抗原来源的病毒。目前培养流感病毒的标准方法采用含胚的鸡蛋由鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒，所述含胚的鸡蛋可以是无特异性病原的(SPF)。然而，更近一段时间以来，已经在动物细胞培养物上培养病毒，出于速度和患者过敏的原因，优选这种培养方法。如果使用基于鸡蛋的病毒培养，则可将一种或多种氨基酸和/或类固醇与病毒一起导入鸡蛋的尿囊液中(参考文献25)。

使用细胞培养时，病毒生长底物通常是真核细胞，如哺乳动物来源的细胞系。合适的哺乳动物细胞包括但不限于仓鼠、牛、灵长类(包括人类和猴)以及犬细胞。可以使用各种细胞类型，例如成纤维细胞和上皮细胞。合适的细胞类型的非限制性示例包括肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的示例是名为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是，例如，非洲绿猴细胞，如Vero细胞系中肾细胞。合适的犬细胞是，例如，肾细胞，如MDCK细胞系。因此，合适的细胞系包括但不限于：MDCK、CHO、293T、BHK、Vero、MRC-5、PER.C6、WI-38等。用于培养流感病毒的优选哺乳动物细胞系包括：MDCK细胞(参考文献26-29)，衍生自马达二氏(Madin Darby)犬肾；Vero细胞(参考文献30-32)，衍生自非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)肾；或PER.C6细胞(参考文献33)，衍生自人胚视网膜母细胞。这些细胞系可广泛获得，例如，来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(参考文献34)、Coriell细胞库(参考文献35)或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同Vero细胞，目录号为CCL 81、CCL 81.2、CRL 1586和CRL-1587，并且其提供MDCK细胞，目录号为CCL34。PER.C6可获自ECACC，保藏号为96022940。

流感病毒也可以在禽细胞系(例如，参考文献36-38)上培养，包括禽胚胎干细胞(参考文献36和39)和衍生自鸭(例如，鸭视网膜)或鸡的细胞系。合适的禽胚胎干细胞包括衍生自鸡胚胎干细胞的EBx细胞系，EB45、EB14和EB14-074(参考文献40)。也可使用鸡胚成纤维细胞(CEF)。最优选的禽细胞系是EB66细胞系，其衍生自鸭胚胎干细胞。已经报道该细胞系对于生产流感抗原很有效(参考文献41)。

用于培养流感病毒的最优选细胞系是MDCK细胞。原始MDCK细胞系可获自ATCC(CCL34)，但也可利用该细胞系的衍生细胞系。例如，参考文献26公开了适合悬浮培养生长的MDCK细胞系('MDCK 33016'，保藏号DSM ACC 2219)。类似地，参考文献42公开了在无血清培养基中悬浮培养的MDCK衍生细胞系(‘B-702’，保藏号FERM BP-7449)。参考文献43公开了非致瘤性MDCK细胞，包括‘MDCK-S’(ATCC PTA-6500)、‘MDCK-SF101’(ATCC PTA-6501)、‘MDCK-SF102’(ATCC PTA-6502)和‘MDCK-SF103’(PTA-6503)。参考文献44公开了具有高感染易感性的MDCK细胞系，包括‘MDCK.5F1’细胞(ATCC CRL 12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。

在细胞系上培养病毒时，该组合物将有利的不含鸡蛋蛋白质(例如，卵清蛋白和卵类粘蛋白)和鸡DNA，从而降低变应原性。

在细胞系上培养病毒时，生长培养物以及用于起始培养的病毒接种物优选不含(即经污染检测且得到阴性污染结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒(特别是猪环病毒)和/或细小病毒(参考文献45)。特别优选不存在单纯疱疹病毒。

在细胞系上培养病毒时，组合物优选包含小于10ng(优选小于1ng，更优选小于100pg)的残留宿主细胞DNA/剂量(通常对于儿童是0.25mL，或对于成人是0.5mL)，尽管可能存在痕量的宿主细胞DNA。通常，需要从本发明组合物中排除的宿主细胞DNA是长于100bp的DNA。

测量残留的宿主细胞DNA是目前生物制品的常规管理要求，它在技术人员的普通能力范围内。用于测量DNA的试验一般是已验证的实验(参考文献46和47)。可通过数学和可量化的条件来描述经验证的试验的性能特征，并鉴定其可能的误差来源。通常测试该试验的某些特征，如精确性、准确性、特异性。一旦试验经校正(例如，针对已知标准量的宿主细胞DNA校正)并测试，则可按常规进行定量DNA测量。可采用三种DNA定量的主要技术：杂交方法，如Southern印迹或狭线印迹(参考文献48)；免疫试验方法，如Threshold^TM系统(参考文献49)；和定量PCR(参考文献50)。本领域技术人员熟悉这些方法，尽管各方法的准确特征可能取决于所研究的宿主细胞，例如，杂交探针的选择、引物的选择和/或用于扩增的引物等。来自分子设备公司(Molecular Devices)的Threshold^TM系统是皮克水平总DNA的定量实验，并且已用于监测生物药品中污染DNA的水平(参考文献49)。典型试验包括生物素化ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗ssDNA抗体和DNA之间以非序列特异性方式形成反应复合物。购自生产商的总DNA测定试剂盒(Total DNA Assay Kit)中包括所有的试验组分。多个商业生产商均提供用以检测残留宿主细胞DNA的定量PCR实验，例如AppTec^TM实验室服务公司(AppTec^TMLaboratory Services)、BioReliance^TM公司、奥西科技公司(AltheaTechnologies)等。对测定人病毒疫苗的宿主细胞DNA污染的化学发光杂交实验和总DNAThreshold^TM系统的比较参见参考文献51。

在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法去除污染的DNA，例如，色谱法等。可通过核酸酶处理提高对残留的宿主细胞DNA的移除，例如，使用DNA酶。参考文献52和53公开了一种减少宿主细胞DNA污染的便捷方法，该方法包括两步处理，首先使用DNA酶(例如，Benzonase)处理(可以在病毒生长过程中使用)，然后使用阳离子去污剂(如CTAB)处理(可以在病毒颗粒破坏过程中使用)。也可采用烷化剂，如β-丙内酯处理来去除宿主细胞DNA，该方法也宜用于灭活病毒颗粒(参考文献54)。人们已经描述了使用烷化剂或DNA酶以及烷化剂的组合进行两步处理的方法(参考文献55)。

优选各剂量包含不超过10ng残留的宿主细胞DNA的疫苗。例如，优选每15μg血细胞凝集素包含<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主细胞DNA的疫苗，以及每0.25ml体积包含<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主细胞DNA的疫苗。优选每50μg血细胞凝集素包含<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主细胞DNA的疫苗，以及每0.5ml体积包含<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主细胞DNA的疫苗。

任何残留的宿主细胞DNA的平均长度优选小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp等。

为了在细胞系，如MDCK细胞上生长，病毒可以悬浮(参考文献26、56和57)或贴壁培养的方式在细胞上培养。一种适合悬浮培养的MDCK细胞系是MDCK33016(保藏号为DSM ACC2219)。或者，可采用微载体培养。

优选在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养支持流感病毒复制的细胞系。在本发明的上下文中，培养基是指无血清培养基，其中没有人或动物来源血清的添加剂。无蛋白应理解为在不含蛋白质、生长因子、其它蛋白添加剂和非血清蛋白质的情况下发生细胞增殖的培养物，但可任选包括诸如胰蛋白酶和其它蛋白酶等可能是病毒生长所必需的蛋白质。在这类培养物中生长的细胞本身天然含有蛋白质。

例如，在病毒复制期间，支持流感病毒复制的细胞系优选在低于37℃生长(参考文献58)(例如，30 36℃，或约30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃)。

在培养细胞中增殖病毒的方法通常包括以下步骤：用待培养的毒株接种培养的细胞，将感染细胞培养一段所需时间以增殖病毒，如根据病毒效价或抗原表达进行测定(例如，接种后24和168小时之间)，并收集增殖的病毒。用1:1000-1:1、1:500-1:1、1:100-1:5、或1:50-1:10的病毒(由PFU或TCID₅₀测定)与细胞比接种培养的细胞。将病毒加入细胞悬液，或应用于单层细胞，病毒在25-40℃，优选28-37℃吸附到细胞上至少60分钟，但通常短于300分钟，优选90-240分钟。可通过冻融或酶作用除去感染的细胞培养物(例如单层)，以提高所收获培养物上清中的病毒含量。然后，可灭活或冷冻储存收获的液体。可以约0.0001-10、优选0.002-5、更优选0.001-2的感染复数(“m.o.i.”)感染培养的细胞。更优选地，以约0.01的m.o.i.感染细胞。可以在感染后30-60小时收获感染的细胞。优选地，在感染后34-48小时收获细胞，例如，在感染后38-40小时。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(一般为胰蛋白酶)以释放病毒，可在培养期间任何合适的阶段加入蛋白酶。

流感病毒可以是再造毒株，并可通过逆向遗传学技术获得。反向遗传学技术(例如，参考文献59-63)允许使用质粒或线性表达构建体在体外制备具有所需基因组区段的流感病毒。通常，该技术涉及表达(a)例如，由polI启动子编码所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如，由polII启动子编码病毒蛋白的DNA分子，因此在细胞中两种类型的DNA的表达导致组装成完整的感染性病毒颗粒。DNA优选提供所有病毒RNA和蛋白质，但也可能用辅助病毒提供一些RNA和蛋白质。优选采用不同质粒生产各病毒RNA的质粒方法(参考文献64-66)，并且这些方法也包括使用质粒表达所有或一些(例如，仅PB1、PB2、PA和NP蛋白)病毒蛋白，一些方法中至多使用12种质粒。也可能采用线性表达构建体(参考文献67)。

为了降低所需质粒的数量，近期方法(参考文献68)将多个RNA聚合酶I转录盒(用于病毒RNA合成)合并到同一质粒(例如，编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种甲型流感vRNA区段的序列)上，并且将多个具有RNA聚合酶II启动子的蛋白编码区合并到另一个质粒(例如，编码1、2、3、4、5、6、7或所有8种甲型流感mRNA转录本的序列)上。参考文献68方法的优选方面包括：(a)在单一质粒上的PB1、PB2和PA mRNA编码区域；和(b)在单一质粒上的所有8种vRNA编码区段。一个质粒上包含NA和HA区段而位于另一质粒上的另外六个区段也可能是有利的。

作为使用polI启动子来编码病毒RNA区段的另一种替代方式，可利用噬菌体聚合酶启动子(参考文献69)。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的启动子。因为polI启动子的物种特异性，对于许多细胞类型(例如MDCK)更宜使用噬菌体聚合酶启动子，尽管必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。

在其它技术中，可能使用polI和polII双启动子由单一模板同时编码病毒RNA和可表达的mRNA(参考文献70和71)。

因此，甲型流感病毒可以包括来自A/PR/8/34病毒(一般是来自A/PR/8/34的6个区段，以及来自疫苗毒株的HA和N区段，即6:2再造毒株)的一个或多个RNA区段，特别是当病毒在鸡蛋中生长时。其也可包括来自A/WSN/33病毒、或用于产生疫苗制备物的重配病毒的任何其它毒株的一个或多个RNA区段。参考文献72和73也讨论了重配甲型流感毒株和乙型流感毒株合适的骨架。

本发明一般保护免受能够在人之间传播的毒株的感染，因此该毒株的基因组通常包括在哺乳动物(例如，人)流感病毒中起源的至少一个RNA区段。其可包括在禽流感病毒中起源的NS区段。

血细胞凝集素(HA)是灭活流感疫苗中的主要免疫原，并且参照一般由(SRID)试验测定的HA水平来标准化疫苗剂量。疫苗一般包含约15μg HA/毒株，但也使用更低的剂量，例如用于儿童或在大流行情况下。人们已经使用了诸如1/2(即7.5μg HA/毒株)、1/4和1/8(参考文献74和75)的分数剂量，以及较高剂量(例如，3x或9x剂量(参考文献76和77))。因此，疫苗可以包括0.1-150μg HA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如，0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg等。具体剂量包括，例如，各毒株约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5等。在本发明疫苗中存在佐剂时这些较低剂量最有用。可以选择本发明的方法、药盒和疫苗的组分(例如，其体积和浓度)以在最终产品中提供这些抗原剂量。

对于活疫苗，利用组织培养感染剂量中值(TCID₅₀)而非HA含量来衡量剂量，且TCID₅₀一般为10⁶至10⁸(优选为10^6.5-10^7.5)/株。

本发明所用HA可以是天然HA，如病毒中发现的天然HA，或者可以是经修饰的HA。例如，已知修饰HA以去除使病毒在禽类和其它物种中具有高致病性的决定簇(例如，HA1与HA2切割位点周围的多碱性区域(poly-basic region))，因为这些决定簇可防止病毒在鸡蛋中生长。

组合物可包含去污剂，例如，聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(称为“吐温”)、辛苯聚醇(如辛苯聚醇-9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、溴化十六烷基三甲铵(‘CTAB’)或脱氧胆酸钠，特别适用于裂解疫苗或表面抗原疫苗。去污剂可仅以痕量存在。因此，疫苗可以包括各自少于1mg/ml的中辛苯聚醇10、α-生育酚琥珀酸氢盐和聚山梨醇酯80。其它痕量残留组分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。

灭活但非完整的细胞疫苗(例如，裂解病毒疫苗或纯化的表面抗原疫苗)可包括基质蛋白，以获益于位于此抗原内部的其它T细胞表位。因此，包含血细胞凝集素和神经氨酸酶的非完整细胞疫苗(特别是裂解疫苗)还可以包括M1和/或M2基质蛋白。在基质蛋白存在的情况下，优选包括可检测水平的M1基质蛋白。也可存在核蛋白。

样品中的抗原通常由流感病毒颗粒制备，但作为另一种方式，可以在重组宿主(例如，在使用质粒表达系统的酵母中，或在使用杆状病毒载体的昆虫细胞系中)中表达诸如血细胞凝集素的抗原，并以纯化形式使用(参考文献78和79)。然而，抗原通常来自病毒颗粒。

样品可能已经，或被怀疑是已经暴露于应激条件。当样品已经暴露于一系列应激条件的一种或多种时，本发明的方法可以用于保证样品中存在准确量的免疫原性HA。在一些实施方式中，应激条件选自低于6.5的pH、冻融和涡旋。在一些实施方式中，应激条件选自低于6.5的pH、冻融和涡旋，并且使用如本文所述的RP-HPLC进行定量。在一些实施方式中，应激条件选自低于6.5的pH、高于7.5的pH、高于50℃的温度或冻融。在一些实施方式中，应激条件选自低于6.5的pH、高于7.5的pH、高于50℃的温度或冻融，并且使用如本文所述的质谱进行定量。质谱方法可以是如本文所述的方法，其中将分离步骤(例如，沉淀)省去。低于6.5的pH包括4-6的pH(例如，pH 4.0和pH 6.0之间)。冻融可以在PBS缓冲液中。冻融可以在Tris缓冲液中。在优选的实施方式中，应激条件是pH低于6.5(例如，pH 4至pH6)。优选地，样品包括，或被怀疑包括失活HA(例如，融合后HA)。

药物组合物

如本发明制备的疫苗是药学上可接受的。除抗原和佐剂外，其可包括其它组分，例如，其通常包括一种或多种药物运载体和/或赋形剂。对这类组分的充分讨论参见参考文献80。用于粘膜疫苗中的运载体/赋形剂可与胃肠外疫苗中所使用的运载体/赋形剂相同或不同。

组合物可包括防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞(参考文献20和81)。更优选无汞的疫苗。

为了控制张力，特别是在可注射的疫苗中，优选包括生理盐，如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其浓度可以是1-20mg/ml。其它可以存在的盐包括，氯化钾、磷酸二氢钾、无水合磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。

用于注射的组合物通常具有200mOsm/kg-400mOsm/kg之间的渗透压，优选240-360mOsm/kg之间，更优选在290-310mOsm/kg的范围之间。虽然之前已经报道渗透压对疫苗接种引起的疼痛无影响(参考文献82)，但仍优选地将渗透压保持在此范围内。

组合物可含有一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲剂的浓度一般为5-20mM的范围。

组合物的pH通常为5.0-8.1，更常为6.0-8.0，例如，6.5-7.5，或7.0-7.8。因此，本发明方法可包括在包装前调整散装疫苗pH的步骤。

组合物优选是无菌的。该组合物优选无热原，例如，每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。该组合物优选不含谷蛋白。

组合物可包括用于单次免疫的物质，或者可包括用于多次免疫的物质(即“多剂”药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。作为多剂量组合物中包含防腐剂的替代方案(或补充方案)，该组合物可包含在装有无菌接头以取出物质的容器中。

流感疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。对于鼻内给药，可以将总剂量体积在鼻孔之间分开，例如，各鼻孔中给予1/2。

组合物和药盒优选储存于2℃-8℃。其不应冷冻。理想情况下应避直射光保存。

佐剂

本发明方法的优点之一是其允许在含佐剂流感疫苗中进行免疫原性HA的HA定量。因此，用于本发明方法中的样品可以是含佐剂流感疫苗。佐剂优选为水包油乳液佐剂，因为其已经被证明与流感抗原配合良好。

水包油乳液佐剂

发现水包油乳液特别适用于含佐剂的流感病毒疫苗。已知多种这类乳液，它们通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，所述油和表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容的。乳液中的油滴直径通常小于5μm，甚至可具有亚微米直径，通过微流化床实现这种小尺寸以提供稳定乳液。优选平均尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。

在优选的实施方式中，水包油微乳液是均匀的。均匀乳液的特征在于分散在其中的大部分液滴(颗粒)在规定尺寸范围内(例如，直径)。合适的规定尺寸范围可以是，例如，50-220nm之间、50-180之间、80-180nm之间、100-175nm之间、120-185之间、130-190nm之间、135-175nm之间、150-175nm之间。在一些实施方式中，均匀乳液包含≤10％数量的规定直径范围外的液滴(颗粒)。在一些实施方式中，通过动态光散射测量，水包油乳液制备物中油滴的平均粒度在135-175nm之间，例如，155nm±20nm，并且由光学颗粒感应测量，这样的制备物包含每mL制备物不超过1x 10⁷的大颗粒。本文所用“大颗粒”指那些具有＞1.2μm直径的颗粒，通常在1.2-400μm之间。在优选的实施方式中，均匀乳液包含少于10％、少于5％、或少于3％处于优选尺寸范围外的液滴。在一些实施方式中，水包油乳液制备物中颗粒的平均液滴尺寸在125-185nm之间，例如，约130nm、约140nm、约150nm、约155nm、约160nm、约170nm、或约180nm，并且该水包油乳液是均匀的，其中该制备物中少于5％数量的液滴处于125-185nm范围外。

本发明可使用如动物(如鱼)或植物来源的油。植物油的来源包括坚果、种籽和谷物。最常见的坚果油的示例有花生油、大豆油、椰子油和橄榄油。可以采用例如获自霍霍巴豆的霍霍巴油。种籽油包括红花油、棉花籽油、葵花籽油、芝麻籽油等。在谷物油中，最常见的是玉米油，但也可以使用其它谷类的油，如小麦、燕麦、黑麦、稻、画眉草、黑小麦等。甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯虽然不天然存在于种籽油中，但可从坚果和种籽油开始，通过水解、分离和酯化合适物质来制备。来源于哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可以用于实施本发明。获得动物来源的纯油所必需的分离、纯化、皂化和其它方法的过程是本领域中熟知的。大多数鱼类含有容易回收的可代谢油。例如，可用于本文的鱼油的几种示例有鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油(诸如鲸蜡)。通过生化途径以5-碳异戊二烯单位合成许多支链油，其总称为萜类。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯的支链不饱和萜类化合物，2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，其是本文特别优选的。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的油。包括角鲨烯和角鲨烷在内的鱼油易于从市售来源获得，或可以通过本领域已知的方法获得。其它优选的油是生育酚(参见下文)。可以使用油的混合物。

表面活性剂可以按其“HLB”(亲水/亲脂平衡)分类。本发明优选的表面活性剂的HLB值为至少10，优选至少15，更优选至少16。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWF AX出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；以及去水山梨糖醇酯(总称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中包含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(脱水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。

可使用表面活性剂的混合物，例如，吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯(吐温80))和辛苯聚醇(如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100))的组合也是适用的。另一种有用的组合包括月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

优选的表面活性剂含量(重量百分比)为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基-苯氧基聚氧乙醇(如曲通X100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。

最优选的水包油乳液是水包角鲨烯乳液，优选亚微米水包角鲨烯乳液。

可用于本发明的具体水包油乳液包括但不限于如下所述，其中包含角鲨烯的乳液是优选的：

角鲨烯、聚山梨酯80和山梨糖醇三油酸酯的亚微米乳液。乳液可以包括处于水相的柠檬酸根离子，例如，10mM柠檬酸钠缓冲液。乳液可以包括3.2-4.6mg/ml角鲨烯、4.1-5.3mg/ml聚山梨酯80和4.1-5.3mg/ml山梨糖醇三油酸酯。该乳液的体积组成可以是约4.6％鲨烯、约0.45％聚山梨酯80和约0.5％山梨糖醇三油酸酯。这种佐剂称为“MF59”(参考文献83-85)在参考文献86的第10章和参考文献87的第12章有更详细地描述。角鲨烯、聚山梨酯80和山梨糖醇三油酸酯可以9750:1175:1175的重量比存在。典型的浓度是约39mg/mL角鲨烯、约4.7mg/mL聚山梨酯80和约4.7mg/mL山梨糖醇三油酸酯。优选155-185nm之间的Z-平均液滴尺寸，具有<0.2多分散性。

包括角鲨烯、生育酚(具体是DL-α-生育酚)和聚山梨酯80的乳液。该乳液可包含磷酸盐缓冲盐水。这些乳液可含有(以体积计)2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％聚山梨酯80，且角鲨烯:生育酚的重量比优选<1(例如0.90)，因为这能提供更稳定的乳液。角鲨烯和聚山梨酯80可以约5:2的体积比或者约11:5的重量比存在。因此，这三种组分(角鲨烯、生育酚、聚山梨酯80)可以1068:1186:485或约55:61:25的重量比存在。一种这样的乳液(“AS03”)包括(以重量计)4.3％角鲨烯、(以重量计)4.8％生育酚、和(以重量计)2％聚山梨酯80。典型的浓度是约42.7mg/mL角鲨烯、约47.4mg/mL DL-α-生育酚和约19.4mg/mL聚山梨酯80。优选140-170nm之间的Z-平均液滴尺寸。该乳液也可含有3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3d-MPL)。此种类型的另一有用乳液可包含(每人剂量)0.5-10mg角鲨烯、0.5-11mg生育酚和0.1-4mg聚山梨酯80(参考文献88)，例如，采用上述比例。

含有角鲨烯、水溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(例如，聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(例如，失水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如失水山梨糖醇单油酸酯或“司盘80”)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90％油滴(以体积计)尺寸小于200nm(参考文献89)。该乳液还可包括一种或多种以下物质：糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。该乳液可包含TLR4激动剂(参考文献90)。可将这类乳液冻干。优选的乳液包括角鲨烯、脱水山梨糖醇油酸酯、聚氧乙烯鲸蜡硬脂基醚和甘露糖醇(例如，32.5％角鲨烯、4.82％脱水山梨糖醇油酸酯、6.18％聚氧乙烯鲸蜡硬脂基醚和6％甘露糖醇；重量百分比)，平均液滴尺寸低于150nm。典型的浓度是约49.6mg/mL角鲨烯、约7.6mg/mL脱水山梨糖醇油酸酯和约9.6mg/mL聚氧乙烯鲸蜡硬脂基醚、和9.2mg/mL甘露糖醇。

包括角鲨烯、磷脂酰胆碱、泊洛沙姆188、甘油和磷酸铵缓冲剂的乳液(参考文献91)，任选还包含α-生育酚(‘SE’)。

角鲨烯、生育酚和曲通去污剂(例如，曲通X-100)的乳液。该乳液还可包括3d-MPL(见下文)。该乳液可包含磷酸盐缓冲液。

包括聚山梨酯(例如，聚山梨酯80)、曲通去污剂(例如，曲通X-100)和生育酚(例如，琥珀酸α-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10(例如，750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X-100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。该乳液还可包括角鲨烯。水相可包含磷酸盐缓冲液。

角鲨烷、聚山梨酯80和泊洛沙姆401的乳液(“普朗尼克(Pluronic)^TML121”)。该乳液可用pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水配制。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载剂，已与苏氨酰-MDP一起用于“SAF-I”佐剂(参考文献92)(0.05-1％Thr-MDP、5％角鲨烷、2.5％普朗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)中。其也可不与Thr-MDP一起使用，如“AF”佐剂(参考文献93)(5％角鲨烷、1.25％普朗尼克L121和0.2％聚山梨酸酯80)。优选微流体化。

角鲨烯、泊洛沙姆105和Abil-Care的乳液(参考文献94)。含佐剂疫苗中这些组分的终浓度(重量)是5％鲨烯、4％泊洛沙姆105(普朗尼克多元醇)和2％Abil-Care 85(双-PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。

具有0.5-50％油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子型表面活性剂的乳液。如参考文献95所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴尺寸。

不可代谢油(如轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(如卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包括添加剂，如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂体偶联物(诸如通过葡糖醛酸的羧基将脂族胺加到脱酰基皂苷上而产生的GPI-0100，如参考文献96所述)、二甲基二-十八烷基溴化铵和/或N,N-二-十八烷基-N,N-双(2-羟乙基)丙二胺。

这样一种乳液，其中皂苷(例如，QuilA或QS21)和固醇(例如，胆固醇)结合成螺旋胶束(参考文献97)。

包括矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液(参考文献98)。

包括矿物油、非离子亲水性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液(参考文献98)。

为了制造用于注射这些乳液的疫苗，常常将其与水性免疫原制备物混合。该混合通常包括1:1体积比例的水性形式的乳液与水性形式的免疫原，在这样的情况中，乳液组分的比例将会在最终疫苗中减半。例如，含(按体积)5％角鲨烯的乳液可以1:1的比例与抗原溶液混合，以得到具有最终(按体积)2.5％最终浓度的疫苗。当然，也可能是其它混合比例，例如，使用两种液体在5:1和1:5之间的体积比混合。因此，在疫苗组合物中，上述乳液组分的浓度可以通过稀释(例如，通过整数，如2或3)改变，其中它们的比例保持不变。例如，儿科疫苗可包含较低浓度的佐剂，例如，4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、或1％体积的角鲨烯。

在抗原与佐剂混合后，血细胞凝集素抗原常常保留在水溶液中，但其本身可分布于油/水界面附近。总之，很少(如果有)血细胞凝集素会进入该乳液的油相。

在组合物包含生育酚的情况中，可以使用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任一种，但是优选α-生育酚。生育酚可取多种形式，例如，不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。可同时使用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。用于老年患者(例如，年龄大于60岁或更大)的疫苗中宜包含生育酚，因为据报道维生素E在此患者群体中对免疫应答有正面作用(参考文献99)。它们也具有协助稳定该乳液的抗氧化特性(参考文献100)。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，该生育酚的优选盐是琥珀酸盐。发现琥珀酸盐在体内可与TNF相关配体协作。此外，已知α-生育酚琥珀酸盐与流感疫苗相容，并且是有用的替代含汞化合物的防腐剂(参考文献20)。特别优选不含防腐剂的疫苗。

概述

术语“包含”涵盖“包括”以及由“……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。

词语“基本上”不排除“完全”，例如，“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。需要时，词语“基本上”可从本发明的定义中略去。

与数值x相关的术语“约”是可任选的，并且表示，例如，x+10％。

除非另有明确说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的过程不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。在有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将组合与第三种组分合并等。

将动物(特别是牛)材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)的来源，具体是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源材料的情况下培养细胞。

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和构思内。本发明包括如下非限制性实施方式：

1)一种方法，其包括如下步骤：(a)提供包括免疫原性HA、失活HA、或其组合的样品；(b)对样品进行生物蛋白质水解，其中失活HA被消化，而免疫原性HA保持未消化；(c)将样品中消化的失活HA与未消化的免疫原性HA分离；(d)对未消化的免疫原性HA进行分析性蛋白质水解，从而提供消化的免疫原性HA片段；并且(e)在存在至少一种标记的参照HA肽的情况下进行液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS)，以对样品中免疫原性HA的量进行定量。

2)一种方法，其包括如下步骤：(a)提供包括免疫原性HA、失活HA、或其组合的样品；(b)通过一种或多种蛋白酶对样品进行生物蛋白水解，其中失活HA被消化，而免疫原性HA保持未消化；(c)使用一种或多种蛋白酶对未消化的免疫原性HA和消化的失活HA的混合物进行分析性蛋白质水解，其中所述分析性蛋白质水解不可以在一个或多个切割位点切割免疫原性HA，从而提供消化的免疫原性HA的片段，所述切割位点在生物蛋白质水解期间在失活HA中可以被切割，所述消化的免疫原性HA的片段包括区别于失活HA衍生的肽的一种或多种免疫原性HA衍生的肽；并且，(d)在存在至少一种标记的参照HA肽的情况下进行液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS)，以对样品中免疫原性HA的量进行定量。

3)如实施方式1的方法，其中，步骤(d)所述的未消化的免疫原性HA处于应激形式。

4)如实施方式3的方法，其中，未消化的免疫原性HA的应激形式通过暴露于低于6.5的pH、高于7.5的pH、高于50℃的温度；或冻融获得。

5)如实施方式4所述的方法，其中，所述较低pH低于6.0。

6)如实施方式5所述的方法，其中，所述较低pH位于4.0和6.0之间。

7)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，述分析性蛋白质水解步骤包括在足以生成免疫原性HA的片段的条件下用丝氨酸蛋白酶进行消化。

8)如实施方式7所述的方法，其中，所述分析性蛋白质水解在约37℃进行至多18小时。

9)如前述实施方式中任一项所述的方法，依赖于实施方式1，其中，步骤(b)中所述蛋白酶和步骤(d)中所述蛋白酶是相同的，或不同的。

10)一种用于在样品中定量免疫原性流感HA的方法，其包括如下步骤：

对样品进行生物蛋白质水解；将免疫原性HA与样品中其它组分分离；并且，

对样品中免疫原性HA进行定量。

11)如前述实施方式中任一项所述的方法，依赖于实施方式1，其中，所述生物蛋白质水解包括用蛋白酶进行的蛋白质水解。

12)如实施方式11所述的方法，其中所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。

13)如实施方式12所述的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶是胰蛋白酶。

14)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述生物蛋白质水解在37℃进行。

15)如实施方式10-14中任一项所述的方法，其中，所述生物蛋白质水解进行30分钟、60分钟、90分钟或120分钟。

16)如实施方式10-15中任一项所述的方法，其中，所述免疫原性HA通过液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS)定量。

17)如前述实施方式中任一项所述的方法，依赖于实施方式1或10，其中，所述分离免疫原性HA的步骤包括蛋白质沉淀。

18)如实施方式17所述的方法，其中，所述蛋白质沉淀包括添加有机溶剂的步骤。

19)如实施方式18所述的方法，其中，所述有机溶剂是丙酮或醇。

20)如实施方式19所述的方法，其中，所述有机溶剂是丙酮、乙醇或甲醇。

21)如前述实施方式中任一项所述的方法，依赖于实施方式1或10，其中，所述方法包括用醇洗涤所述沉淀的蛋白质的步骤。

22)如实施方式21所述的方法，其中，所述醇是乙醇。

23)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述样品选自：全病毒颗粒流感疫苗、裂解流感疫苗、亚基流感疫苗、和重组流感疫苗。

24)如实施方式23所述的方法，其中，所述样品包括佐剂。

25)如实施方式24所述的方法，其中，所述佐剂是水包油乳液佐剂。

26)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述样品包括来自一种、两种、三种、四种或更多种流感病毒株的HA。

27)如前述实施方式中的任一项所述的方法，其中，所述样品取自单价批料制备物、多价批料制备物、单价产物、或多价产物。

28)如实施方式1-9或16-27中任一项所述的方法，其中，所述LC-ESI-MS是同位素稀释质谱(IDMS)。

29)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述标记的参照HA包括同位素标记。

30)如实施方式29所述的方法，其中，所述同位素标记选自¹⁵N和¹³C。

31)一种用于在样品中定量免疫原性流感HA的方法，其包括如下步骤：(a)对样品进行生物蛋白质水解；并且(b)通过SRID试验对来自(a)的样品中免疫原性HA的量进行定量。

32)如实施方式31所述的方法，其中，步骤(b)使用抗血清进行，例如，多克隆抗血清(例如，绵羊抗血清)和/或合适的单克隆抗体。

33)如实施方式32所述的方法，其中，所述生物蛋白质水解包括用蛋白酶(例如，丝氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶)的蛋白质水解。

34)如实施方式31-33中任一项所述的方法，其中，所述生物蛋白质水解在37℃进行。

35)如实施方式31-34中任一项所述的方法，其中，所述样品选自：全病毒颗粒流感疫苗、裂解流感疫苗、亚基流感疫苗、和重组流感疫苗。

36)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中，所述样品包括来自一种、两种、三种、四个或更多种流感病毒株的HA。

37)如前述实施方式中的任一项所述的方法，其中，所述样品取自单价批料制备物、多价批料制备物、单价产物、或多价产物。

38)如前述实施方式中任一项所述的方法，其中：样品/疫苗中至少60％的HA是活性/免疫原性形式；和/或，样品/疫苗中小于20％的HA是失活形式；和/或样品中活性:失活HA的比例是至少4:1。

39)一种制造流感疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：提供来自批料制备物的样品，所述批料制备物包括流感HA；根据前述实施方式中任一项所述的方法对免疫原性HA的量进行定量；并且，根据样品中免疫原性HA的量，由批料制备物包装单位剂量形式。

40)一种制备流感疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：根据实施方式1-38中任一项所述的方法对批料疫苗中HA的量进行定量；并由批料制备疫苗。

41)如实施方式39或40所述的方法，其还包括过滤步骤，从而提供无菌制备物。

42)如实施方式39-41中任一项中所述的方法，其还包括与佐剂组合的步骤。

43)如实施方式39-42中任一项所述的方法，其中，所述单位剂量以液体、冻干固体、冻干分泌或鼻气溶胶的形式。

44)如实施方式39-43中任一项所述的方法，其还包括在步骤(c)之后重复实施方式1的方法的步骤。

45)如实施方式39-44中任一项所述的方法，其中，所述批料是单价的或多价的。

实施例

还通过以下实施例说明本发明，这些实施例不应构成限制。

实施例1：藉由生物胰蛋白酶消化的预处理

流感病毒表面HA在融合前状态中主要以三聚物存在，这是最大免疫相关状态。HA可以在各种应激条件下进行向为融合后状态的不可逆转变。融合后HA不引起强烈的中和免疫应答。

通过向样品添加新鲜制备的胰蛋白酶(酶:底物比为1:20)并在37℃孵育2小时，比较融合前HA和融合后HA对胰蛋白酶消化的敏感性。

如降低条件下SDS-PAGE所示(图1A)，即使在高蛋白酶浓度下(HA:胰蛋白酶＝5:1)，对照融合前HA(HA1和HA2)对于胰蛋白酶消化具有高抗性。相反，低pH诱导的融合后HA1，其经历了构象改变，变成了对胰蛋白酶非常敏感。然而，融合后HA2仍然保留其蛋白酶抗性。

通过反相高效液相色谱法(NP-HPLC)对样品进行分析。对于RP-HPLC，使用ProsR1/10柱(应用生物公司(Applied Biosystems))和30-35％ACN的梯度(0.1％TFA)，通过具有UV检测的Waters Alliance HPLC解析DTT还原的样品。

RP-HPLC清晰地显示，HA1峰在对照条件(融合前对照，仅pH 4.0处理，并且仅胰蛋白酶处理)中保持不变。然而，HA1峰在低pH和胰蛋白酶双重处理的样品中显著地下降。

通过将预处理步骤(称为生物胰蛋白酶消化)与定量质谱相结合开发了效力测定。生物胰蛋白酶消化的优化聚焦于实现短时间内消化融合后HA1成短肽的最大水平，并且不影响融合前HA1。

实施例2：蛋白质沉淀、分析性消化和IDMS

生物胰蛋白酶消化后，消化的融合后HA1肽与完整的融合前HA分子分离。开发并优化了蛋白质沉淀方法。对于蛋白质沉淀，将新鲜配制的1mM HCl中的10mM Nα-甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮盐酸盐(TLCK)添加到已经进行生物胰蛋白酶消化的样品至100μM最终浓度，并在室温孵育10分钟。将4倍体积的冷丙酮加入溶液，并在-20℃孵育2小时。随后将混合物在约21k RCF离心以沉淀沉淀物。小心地移除上清液。然后在1mL冷乙醇中洗涤沉淀物三次。注意不要破坏沉淀物。最终，风干沉淀物10分钟。

该方法的优势包括样品制备是在相同管中，这使得样品损失最小化。该方法还实现了回收的蛋白质沉淀在所需体积的相容缓冲液中方便的重悬，用于下游样品制备。该方法使得较少的人工制品被引入。

藉由该优化的方案，在大多数用丙酮蛋白质沉淀的情况中(参见图6)，持续回收了几乎100％完整的HA分子，并且用乙醇洗涤移除了97-100％消化的肽(参见图7)。

分离后，将回收的蛋白质沉淀重悬在6M盐酸胍(在50mM Tris中，pH 8.0)中，并在70℃加热5分钟以完全重溶。消化前，通过加入100mM Tris(pH 8.0)，将胍缓冲液稀释至0.6M。然后加入胰蛋白酶/Lys-C混合物(酶:底物比为1:5)并在37℃孵育，以开始分析性消化，其生成用于直接同位素稀释质谱(IDMS)分析的肽。时程研究显示，在选定条件下，大部分(如果不是全部)靶向的替代肽信号在4小时后达到平台。通过添加20％TFA至2％最终浓度淬灭消化。

将标记的替代肽的混合物添加到反应混合物，并在消化缓冲液中制备标准替代肽的系列浓度以生成标准校准曲线。使用装配有电喷雾电离源(ESI)并偶联Dionex Ultimate3000UHPLC的Thermo TSQ Endura三重四极MS进行液相色谱标准反应监测(LC-SRM)。使用沃特斯公司(Waters)的Acquity BEH C18(2.1x 50mm，1.7μm颗粒)以0.25mL/分钟的流量在50℃柱温进行色谱。基本上如文献(参考文献14)所述进行SRM，其中对各肽监测3次转变。数据通过Skyline软件和ThermoQual Browser分析。

因为HA2亚基对蛋白质水解具有抗性，替代肽仅选自HA1序列。取决于试验的目的，对替代肽的选择标准不同。如果目标是定量总HA，那么将整个毒株的保守序列选为替代肽。如果目标是在多价样品中定量特定毒株，那么将对各感兴趣的毒株独特的序列选为替代肽。总之，各毒株使用至少2个替代肽。

图2示出了整个试验的总结流程图。

实施例3：与佐剂的试验相容性

佐剂已广泛的应用于疫苗以提高其效率。水包油乳液佐剂MF59是已经被用于流感疫苗的几种佐剂之一，并且其与改善免疫缺陷/受损群体中显著改善的保护相关联(参看文献101)。因此，如果替代的效力试验与佐剂相容将是有利的。

使用本发明的方法，在MF59佐剂存在或不存在的情况下，对三个不同的HA单批进行测试，以确定该试验是否与佐剂相容。数据显示，MF59的存在并不干扰该试验(表1)。

表1：效力试验与MF59相容。

实施例4：在应激的多价疫苗中定量HA

该试验用于测试在低pH、高pH和升高的温度下应激的流感疫苗，以确认试验的稳定的指示特征。由于基于LC-SRM定量的性质，即具有高度选择性并且能够在单次运行期间对数千个SRM转变进行定量，只要针对各毒株使用独特的替代肽，当前的试验在对多价疫苗中不同毒株的同时定量中具有固有优势。因此，在该试验中使用了四价疫苗，该疫苗包括各30μg(基于SRID值)的A/Victoria/210/2009、A/Brisbane/59/2007、B/Brisbane/60/2008和B/Wisconsin/1/2010。通过PR-HPLC、SRID和当前的试验平行地，对各自经过或没有经过预处理的(生物胰蛋白酶消化)应激或非应激的对照样品进行测试。

低pH应激

低pH激发HA由融合前向融合后的构象改变(参考文献9)。通过向QIV样品(约120μg/mL HA，最终pH约4.1)添加0.5M乙酸钠(pH 4.0)引起低pH应激，并且将样品在室温下进一步孵育1小时。通过添加1M Tris(pH 8.5)将pH中和至约7.1以淬灭应激。“低pH阴性”对照样品以相同的方式处理，除了在其中使用H₂O，而不是乙酸钠。

对于低pH应激实验，RP-HPLC显示，对应所有4个毒株的HA1峰在pH 4.0和生物胰蛋白酶消化双重处理的样品(低pH+/胰蛋白酶+)中几乎消失，这表明生物胰蛋白酶消化去除了融合后HA。对于“低pH-/胰蛋白酶+”样品，HA1峰很大程度上完整，这表明生物胰蛋白酶消化并不影响融合前HA。

对于未经生物胰蛋白酶消化的样品，无论是否存在低pH应激，HA1峰仍然未改变，这是可以预期的，因为RP-HPLC不可以区分融合前和融合后HA(参见图3A)。

当前试验的定量结果显示，在双重处理的样品中，所有4个毒株急剧下降，而对于“低pH+/胰蛋白酶-”样品的结果保持不变，这表明了生物胰蛋白酶消化步骤的必要性。

对于“低pH-/胰蛋白酶+”样品，仅检测到选定毒株的轻微降低，可能是由于对照样品中预先存在低水平的融合后HA(图3B)。

无论生物胰蛋白酶水解存在与否，相同样品组的SRID测试显示在低pH处理的样品中的急剧下降(图3B)，这确认了低pH诱导融合后转变。

这些数据集表明，来自不同毒株的HA蛋白质对于低pH应激非常敏感。此外，当采用生物胰蛋白酶消化步骤时，本发明的试验可以容易的区分免疫活性的融合前HA与免疫失活的融合后HA。

高pH和热应激

在高pH应激(脱酰胺)和热应激(56℃)条件下进行相同的试验方案。

通过向QIV样品添加0.2M的N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)缓冲液(最终pH约11)引起高pH应激，并在37℃孵育2小时，此后，加入乙酸钠(pH 4.0)以中和pH。使用H₂O，而非CAPS缓冲液以包括“高pH阴性”对照样品。对于热应激，在56℃处理样品6小时。对于“胰蛋白酶阴性”样品，添加空白缓冲液，而非胰蛋白酶。

对于低pH应激，本发明的试验和RP-HPLC/SRID结果之间极佳的相关性证实了生物胰蛋白酶消化步骤为所提出的替代效力试验提供了稳定的指示特征(图4-5)。

在这些条件下，数据表明HA蛋白质对于高pH和热应激较不敏感，并且敏感性似乎是菌株特异性。例如，A/Victoria/210/2009(H3N2)对升高的温度高度敏感，而A/Brisbane/59/2007(H1N1)效力并不受到6小时56℃加热的显著影响。

此外，该数据集合证实了当前试验在多价疫苗中定量特定毒株的能力，并且没有交叉干扰。

实施例5：测量混合的单批

使用本发明的试验测试B/Brisbane、A/Brisbane和A/Vitoria单批样品，并与以1:1:1比例混合的相同毒株的混合单批样品比较。

混合单批样品中HA的定量与单一单批样品中HA的定量相同(参见表2)。这表明该试验能够在多价样品中定量特定毒株。

表2：单一或混合毒株消化物中特征肽的比较。

实施例6：胰蛋白酶预处理校正由混合的免疫沉淀素环所导致的免疫活性HA的过高估计。

由二硫键连接的HA1和HA2片段组成的各单体HA亚基具有暴露在病毒包膜(或细胞膜)外的两个结构域：球状“头部”完全由HA1残基组成，延长的“茎部”由来自HA1和HA2的残基组成，并且跨膜和胞质结构域由HA2残基组成(Wiley和Skehel 1977)。HA常常在中性pH下维持“亚稳态的”融合前构象。一旦能量屏障通过低pH被克服，HA不可逆地重新折叠成更加稳定的融合后构象(Ruigrok,Aitken等.1988,Bullough,Hughson等.1994,Skehel和Wiley2000)。高温同样也触发HA重排(Ruigrok,Martin等.1986,Wharton,Skehel等.1986)。用融合前构象的HA的免疫引发针对流感的显著免疫力；用融合后构象的HA的免疫无法在小鼠中引起抗体的结合和中和(Quan,Li等.2011)。

原则上，该灭活的流感疫苗(“IIV”)的保护效力和免疫原性可以通过免疫实验动物进行评估，但是这样的体内效力测试耗时且并不精确。相反，已经开发了更加实用的体外效力实验以确定IIV中具有免疫活性的HA的量(能够引起中和或血凝抑制[HI]抗体应答)。作为流感疫苗抗原含量的体外替代效力测试，单径向免疫扩散(SRID)在20世纪70年代开发并验证(Schild,Wood等1975,Wood,Schild等.1977,Williams 1993)。该改良的奥氏(Ouchterlony)测试基于免疫沉淀素环的直径对HA进行定量，所述免疫沉淀素环在疫苗抗原(或与疫苗中精确毒株同源的抗原标准物)从圆形孔径向扩散到琼脂糖凝胶时形成，所述琼脂糖凝胶已经涂有均匀浓度的毒株特异性绵羊抗血清。在游离的抗原和抗体通过用滤纸的印迹移除后，通过考马斯蓝染色检测免疫沉淀素环。尽管IIV中的HA形成玫瑰花结和其它复合物，将两性洗涤剂(Zwittergent)添加至抗原以将HA分散成均匀的三聚体，从而使得环尺寸与HA浓度更直接地成比例(Williams 1993)。

琼脂糖SRID凝胶中的毒株特异性抗血清通过用由菠萝蛋白酶从全病毒切割的HA多次免疫绵羊产生(Brand和Skehel 1972)。SRID被认为仅与天然形式的HA产生可读的免疫沉淀素环，因为抗血清是针对从病毒颗粒切割的HA培养的，并推测是天然的(Minor 2015)。临床实验中疫苗免疫原性和SRID测量的疫苗效力之间的关联性已经示出，尽管该关联性相对较弱(Ennis,Mayner等.1977,La Montagne,Noble等.1983,Rowlen 2015)。SRID已经被监管机构接受，并且用于流感疫苗生产40余年以实现IIV制剂、释放、以及稳定性测试。

相反，用于HA定量的生物物理试验，如反相高压液相色谱(RP-HPLC)、同位素稀释质谱(IDMS)和SDS-PAGE在定量之前将HA变性，从而使其不区分不同构象状态的HA。上述实施例已经表明胰蛋白酶消化可以作为预选择步骤，以赋予不需要毒株特异性抗体并且不是构象敏感性的其它生物物理流感效力试验构象特异性(Wen,Han等.2015)。该预处理的基础是天然的融合前HA的胰蛋白酶抗性，以及融合后HA的胰蛋白酶敏感性和受到其它应激的HA的胰蛋白酶敏感性(Skehel,Bayley等.1982,Ruigrok,Martin等.1986)。胰蛋白酶选择性地降解免疫失活的HA。

该实施例进一步证明了，对于构象均一的HA制备物，SRID确实检测并定量了在小鼠中具有免疫原性的未应激的、可能是融合前的HA，并且确实未检测到在小鼠中不具有免疫原性的低pH应激的、可能是融合后的HA。在印迹步骤中，将融合后HA选择性地从SRID凝胶移除。当以ELISA形式使用时，用于SRID中的绵羊抗血清等效的检测两种形式的HA，这表明SRID的构象选择性是由于SRID形式，而不是由于抗血清的任何构象选择性。当低pH应激的HA与非应激的HA混合时，SRID并不区分融合前和融合后形式，在混合的免疫沉淀素环中等效地检测两种构象异构体，并且高估样品中免疫活性HA的含量。正如胰蛋白酶预处理允许RP-HPLC特异性定量免疫活性HA，胰蛋白酶消化也改善了SRID的准确性，当与免疫失活HA混合时，其允许该试验对免疫活性HA定量。

结论

暴露于小鼠中降低的pH的HA的免疫原性

为了评估融合前和融合后构象的HA的免疫原性，用在pH 4.0缓冲液中孵育的0.1μg蛋生A/Texas/50/2012(H3N2)HA免疫小鼠两次，然后返回至pH 7.2(假定处于融合后构象)或维持在恒定的pH 7.2(假定处于融合前构象)。进行HI以评价存在于小鼠免疫血清中能够通过A/Texas/50/2012(H3N2)病毒阻断火鸡红血细胞血凝的抗体的效价。维持在pH 7.2的HA引起3x10²的GMT HI效价，并且瞬时暴露于pH 4.0的HA引起<10的GMT HI效价(图8A)。微量中和试验也用于对用A/Texas/50/2012(H3N2)病毒阻断MD狗肾(MDCK)细胞感染的中和抗体效价进行定量，其也显示了相似的结果(图8B)。通过低pH应激的HA并不引起可检测的中和应答，并且维持在中性pH的HA引起显著的中和抗体效价。因此，处于融合前构象的HA在小鼠中相较于处于融合后构象的HA具有显著更高的免疫原性，这与先前的研究结果一致(Quan,Li等.2011)。HA样品也在天然条件下用胰蛋白酶消化，并用于免疫小鼠。HI和微量中和试验都显示对HA的中和抗体应答和HI并不受胰蛋白酶消化影响(图8)。

通过SDS-PAGE、RP-HPLC、ELISA和SRID表征暴露于降低的pH的HA

在非降低或降低条件下，通过SDS-PAGE对相同的A/Texas/50/2012(H3N2)HA样品进行进一步的表征。维持在pH 7.2的SDS-PAGE条带强度与瞬时暴露于pH 4.0相当(图9A)。与我们之间的发现一致(Wen,Han等.2015)。在天然条件下用胰蛋白酶处理后，对于HA(具有非降低的样品)和通过低pH应激的HA1(具有降低的样品)的SDS-PAGE条带消失，而对于维持在pH 7.2的HA的SDS-PAGE条带未改变。相似地，来自用或不用低pH处理的未消化的HA的RP-HPLC HA1峰几乎相同(图9B)。然而，在胰蛋白酶消化后，只有低pH处理的HA的HA1峰消失。在这些HA样品上进行具有针对A/Texas/50/2012(H3N2)HA的SRID参照抗血清的ELISA。通过ELISA形式中的SRID抗血清，类似地识别未应激或用低pH应激的未消化的HA(图8C)。对于维持在pH 7.2的HA，胰蛋白酶消化轻微地降低ELISA信号(下降<15％)，但是对于低pH应激的HA，其显著地降低ELISA信号(下降>50％)。这些结果表明，当与胰蛋白酶消化联合时，对于低pH应激的和非应激的HA，尽管SDS-PAGE、RP-HPLC和ELISA显示了相似的结果，这些试验能够将维持在中性pH的HA与通过低pH应激的HA区分，获得与来自免疫原性研究的结果相关联的结果(图9E)。

同样对这些HA样品进行SRID。如预期，对于经过和没有经过胰蛋白酶消化的维持在中性pH的HA，检测到明显的SRID环，并且无论样品是否被胰蛋白酶消化，对于暴露于低pH的HA都没有检测到SRID环(图9D)。因此，SRID自身充分地区分了在小鼠中具有免疫原性的非应激的HA与具有显著较少免疫原性的低pH应激的HA(图8)，一旦与胰蛋白酶消化步骤(例如，生物蛋白质水解)结合，SDS-PAGE、RP-HPLC和ELISA也是如此(图9E)。

对掺入低pH应激的HA的非应激的HA进行SRID定量

通过SRID评价蛋生A/Perth/16/2009(H3N2)HA，并针对A/Texas/50/2102(H3N2)获得相同的结果：检测到具有阳性SRID环的非应激的HA，并且低pH应激的HA不产生环(图10A)。令人惊讶的是，当非应激的HA掺入低pH值应激的HA时，SRID环强度降低，但随着添加的低pH处理的HA量的增加，其以剂量反应的方式扩大(图10A)。环尺寸的定量确认，0.5至2倍量的低pH值应激的HA添加至非应激的HA使得检测到的HA量增加25％至70％(图10B)。该组样品还在胰蛋白酶消化后用RP-HPLC进行定量，并且相较于单独的非应激的HA，相对HA量维持在100％(图10B)。这些结果表明，当应激的和非应激的HA混合时，SRID检测两种形式的HA，失去了其对于免疫活性HA的特异性。

我们接下来研究了SRID对于应激的和非应激的HA混合物中免疫活性HA的这种过高估计是否会在不同流感毒株的其它HA样品中重复。蛋生B/Brisbane/60/2008HA通过SRID评价，并且当分别对非应激的和应激的HA制备物分析时，其产生了针对非应激的HA的阳性SRID环以及针对低pH应激的HA的阴性环(图11A)。然而，当非应激的B/Brisbane/60/2008HA与等量的低pH应激的HA混合时，其SRID环被扩大，相较于单独测量的非应激的HA，这导致150％的相对HA测量量(图11B)。SRID之前的胰蛋白酶处理并未改变单独测量的非应激的HA和应激的HA的相对HA量，但是降低了非应激的和应激的HA的混合物的测量HA含量至单独非应激的HA的量，并且使免疫沉淀素环更加明显(图11A)。如预期，RP-HPLC对混合物中总HA的定量是单独进行非应激定量的200％；藉由胰蛋白酶预处理，通过RP-HPLC对混合物的定量同样降至仅非应激的HA的量。

同样用SRID和RP-HPLC对蛋生A/California/07/2009(H1N1)、A/Texas/50/2012(H3N2)、B/Massachusetts/02/2012等其它HA样品进行了定量(图11C、11D和11E)。在各种情况中，将等量的低pH应激的HA添加到非应激的HA导致通过SRID测量的HA量升高30-50％。作为预先步骤的胰蛋白酶消化使相对SRID定量回到非应激样品的样品的100％。单独使用RP-HPLC对混合物中总HA进行定量，其相对量是非应激样品的200％。胰蛋白酶消化也将通过RP-HPLC的定量降至100％。这些结果证明，当低pH应激的HA与非应激的HA混合时，SRID对应激的HA进行定量，其中20-50％，而非0％是非应激的HA。相反，体内效力测试表明，低pH应激的HA是免疫失活的(图8)。胰蛋白酶处理不但使得RP-HPLC选择性定量非应激的HA，而还校正了SRID对免疫活性HA的过高估计。

SRID定量HA的机制

为了更好的理解SRID的机制，我们标记了HA，并追踪其在SRID凝胶中的扩散。将蛋生A/Texas/50/2012(H3N2)HA瞬时暴露于低pH或维持在pH 7.2，然后通过位于各HA2上一个游离的半胱氨酸与IRDye 800CW马来酰亚胺偶联。用红外荧光扫描SDS-PAGE确认HA2特异性标记以及对非应激的和应激的HA相等的标记效率(数据未显示)。通过SRID试验评价IRDye-标记的HA和非标记的HA。将HA样品上样至SRID凝胶的孔中，并允许其在室温下扩散至凝胶16小时。IRDye-标记的HA(非应激的或应激的)在凝胶中扩散至与孔相似的距离(图12A)。使用硝酸纤维素膜代替滤纸去除游离抗原和抗体。低pH应激的HA在膜上的荧光信号比非应激的HA强。对印迹膜进行用抗-H3抗体的针对未标记的HA的western印迹确认，比非应激的HA更多的低pH应激的HA被移到印迹膜上。印迹后SRID凝胶的荧光信号显示对非应激的HA样品独特的免疫沉淀环，以及对低pH应激的HA微弱、模糊的信号。对相同SRID凝胶的考马斯蓝染色确认，对非应激HA出现预期的SRID环，而低pH应激的HA未出现环。这些结果表明，针对低pH应激的HA的阴性SRID信号是由于其在SRID试验期间通过印迹移除所产生。针对标记的和未标记的HA的SRID凝胶的考马斯蓝染色显示出相同的SRID环概况，这确认了HA的标记对通过SRID的HA定量没有可检测的影响。

接下来，我们用具有绿色荧光信号的IRDye800SW标记了非应激的HA，并用具有红色荧光信号的IRDye680CT标记了低pH应激的HA，并且通过SRID分析样品(图12B)。绿色信号显示了由包含非应激的HA的免疫复合物形成的SRID环，但是对应包含低pH应激的HA的免疫复合物的红色环并不可见。考马斯蓝染色显示相同的结果。对于包含1比1比例的非应激的和应激的HA的混合样品，非应激的HA形成绿色环，其大于在不存在低应激的HA中观察到的绿色环。混合物中的低pH应激的HA同样形成清晰的大红色环。重叠的图像显示针对非应激的HA的环和低应激的HA的环重叠，这表示非应激的和应激的HA在混合的免疫沉淀素环中直接地或间接地相关联。通过考马斯蓝染色还检测到更大的环，这表明更多的HA扩散至离孔更远的位置，其反映了应激的和非应激的HA的结合量。当混合样品通过胰蛋白酶消化时，由非应激的HA形成的绿色环返回其原始尺寸，而由应激的HA形成的红色环消失。考马斯染色的环也返回其单独由非应激的HA形成的环的尺寸。这些结果表明，胰蛋白酶消化了能够与非应激的HA形成混合的免疫沉淀素环的应激的HA。

讨论

HA的完整性可能会受到许多应激条件的影响，这些应激条件常在疫苗生产和储存过程中影响生物制品。此外，因为HA将在相对低的pH下重排(以在病毒进入细胞期间进行其膜融合功能)，所以流感疫苗中的HA对于低pH暴露特别敏感。尽管尚未探索受到所有应激条件的HA的免疫原性，在本研究(图8)和其它研究(Quan,Li等.2011)已经显示，比起通过低pH触发重排至融合后状态的HA，处于融合前状态的HA在小鼠中引起更高效的抗体中和。因此，基于HA的疫苗效力试验应该对HA构象敏感。

SRID是IIV效力的“金标准”替代试验(Williams 1993)，其依赖于绵羊抗血清进行效力测定(Wood,Schild等.1977)。用从纯化的全病毒中提取的HA培养绵羊抗血清，其可能或不完全处于天然、融合前构象。在我们的研究中，用于SRID的绵羊多克隆抗血清在ELISA形式中等效地结合处于融合前构象和融合后构象的HA(图9C)，这表明大部分的抗体并不对天然、融合前HA具有特异性。因此，通过SRID选择性检测融合前HA，而不是融合后HA必须通过SRID形式，而不是单独通过绵羊抗血清的特异性确定。

SRID强调的前体是该试验仅基于免疫沉淀素环的尺寸(直径)对HA进行定量，因此环越大，分配到的HA浓度越高(Williams 1993)。在试验解释中，并不考虑环的强度和清晰度。IIV中的HA通过HA-HA、HA-其它病毒蛋白质、和HA-细胞膜相互作用形成玫瑰花结和其它聚集体(Tay,Agius等.2015)。用两性洗涤剂预处理用于SRID分析的疫苗抗原将HA分散成较小的寡聚体，而非完全均一的HA三聚体(数据未显示)。因此，在SRID凝胶中，非均相形式的HA扩散至孔的各种距离，从而使得估计的HA量并不仅仅简单地与HA浓度相关联。

对于低pH应激的或非应激的HA的纯净制备物，SRID的确显示了对于免疫活性、非应激形式的特异性。进一步的研究表明，融合后HA像融合前HA一样扩散到SRID凝胶中，但是在通过考马斯染色检测之前，通过印迹步骤将其从凝胶中选择性地移除。对于融合后HA的选择性印迹的原因尚不完全清楚。这可能是由于比起融合前HA的纯净制备物，绵羊抗血清与融合后HA的纯净制备物更少广泛地交联(尽管在ELISA形式中相似检测到形式)。

在疫苗制备物中，希望存在较少或较多比例的变性的、受损的或融合后HA，以及天然、完整的、融合前HA。在我们的实验中，当与天然HA混合时，SRID检测低pH应激的HA，即使该试验单独并不检测低pH应激的HA。该观察结果在来自许多其它毒株的HA中重复。用其它荧光信号差异性标记非应激的和低pH应激的HA显示，低pH应激的融合后HA与天然的融合前HA形成混合的免疫沉淀素环，这表明这两种HA直接或间接相关联。绵羊抗血清在ELISA中同样与两种形式的HA结合，它们显然也可以与两种HA构象异构体交联并形成在SRID上可检测的三组分复合物。混合环在考马斯染色后比纯融合前环更不明显，这可能反映了绵羊抗血清削弱了HA混合物的交联。尽管如此，当复合物具有较高HA浓度，将会产生比天然HA和抗血清单独形成的环更大尺寸的环，这导致免疫活性HA含量的过高估计。

在天然条件下，胰蛋白酶选择性消化受到低pH、升高的温度和脱氨作用影响的HA(Wen,Han等.2015)。通过移除免疫失活的HA，胰蛋白酶消化可以被用作高效且准确的生物物理HA定量技术之前的预处理，从而增加试验对构象的敏感性，所述生物物理HA定量技术使得HA变性。此处，我们发现胰蛋白酶预处理将扩大的混合SRID环返回至单独对应天然HA浓度的尺寸。并未在由胰蛋白酶消化的低pH应激的和非应激的HA的混合物形成的SRID环中检测到针对融合后HA的荧光信号，这表明消化移除了能够形成可检测的三组分免疫沉淀素环的融合后HA。

SRID被WHO和国家监管机构正式批准用于流感疫苗效力的定量，并且作为HA定量的“金标准”被流感疫苗制造商广泛使用。事实上，在HA定量中匹配SRID的需要是引入可能更准确、精确和有效的流感疫苗效力试验的障碍。我们已经在本文中表明，当与融合后HA混合时，SRID系统性地过高估计了免疫活性HA。正如胰蛋白酶预处理可以赋予生物物理HA定量试验构象选择性，胰蛋白酶预处理也可以校正由SRID对免疫活性HA的过高估计，其中所述生物物理HA定量试验并不需要针对各毒株变化生成绵羊抗血清。该校正可以改善通过SRID的疫苗配置和投放，并且也可以通过提供更“纯金的”标准来匹配以促进改善的效力试验的引入。

方法

流感参照试剂

针对A/California/07/2009(H1N1)、A/Texas/50/2012(H3N2)、A/Perth/16/2009(H3N2)、B/Massachusetts/02/2012和B/Brisbane/60/2008的绵羊多克隆参照抗血清和校准的参照抗原由美国食品和药物管理局生物制品评估与研究中心(FDACBER，马里兰州银泉市)和生物标准和控制国家研究所(NIBSC，英国伦敦)提供。

流感疫苗

A/California/07/2009(H1N1)、A/Texas/50/2012(H3N2)、A/Perth/16/2009(H3N2)、B/Massachusetts/02/2012和B/Brisbane/60/2008的单批(亚基疫苗抗原未参合的批号)由诺华疫苗公司(Novartis Vaccines)生成。蛋生单批由胚胎期鸡蛋通过来自试验或工程批次的亚基流感疫苗产生。

通过低pH应激的样品

用50mM柠檬酸盐以pH 4.0在室温处理流感单批30分钟。以pH 8.5的添加10％(体积/体积)的1M Tris以中和pH至7.2。样品储存于4℃待分析。

胰蛋白酶消化

将样品与胰蛋白酶(50U/100μg HA，美国密苏里州圣路易斯市的西格玛公司(Sigma))在PBS中以37℃孵育120分钟。胰蛋白酶消化通过添加0.1mM的N-α-甲苯磺酰基-L-赖氨酰氯甲基酮(TLCK；西格玛公司)停止。样品储存于4℃待分析。

SDS-PAGE、RP-HPLC、ELISA和SRID

SDS-PAGE、RP-HPLC和SRID已经在(Wen,Han等.2015)中描述。对于直接ELISA，用1μg/ml A/Texas/50/2012(H3N2)HA在PBS中以室温包覆平板过夜，用含0.05％吐温20的PBS(PBST)洗涤4次，并用含1％BSA的PBS(PBSB)封闭60分钟。然后，绵羊血清在PBSB中的连续稀释液在平板上孵育90分钟。用PBST洗涤平板4次，并用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-绵羊IgG(英杰公司(Invitrogen))对捕获的IgG进行60分钟的检测，然后用PBST洗涤4次，并用四甲基联苯胺底物孵育30分钟。通过Infinite M200NanoQuant(Tecan)读取平板。

免疫原性研究

8-10周龄雌性BALB/c小鼠(查尔斯河实验室(Charles River Labs)，美国马萨诸塞州威尔明顿)通过这样免疫(10小鼠/组)，在第0天和第21天，用0.1μg的HA在后四头肌中进行双侧50μl肌肉注射。血清样品通过第20天的眼球后放血获得，并有第42天安乐死的动物出血搜集血清样品。所有研究获得诺华研究院生物医疗研究动物护理和使用委员会(Novartis Institutes for Biomedical Research Animal Care and Use Committee)的批准。

血清学分析

通过HI和流感微量中和试验测试血清样品的中和抗体。

对于HI，对用受体破坏酶(RDE)在56℃进行30分钟热灭活的血清样品进行连续稀释，然后与A/Texas/50/2012(H3N2)病毒在96孔板以2-8℃孵育60分钟。添加火鸡红血细胞(Lampire生物实验室(Lampire Biological labs))并在各孔中混合，然后将混合物以2-8℃孵育90分钟。

对于微量中和，灭活的血清样品进行连续稀释，然后与A/Texas/50/2012(H3N2)病毒以37℃孵育2小时。将这些血清和病毒混合物添加到在96孔板中制备的MDCK细胞，并在37℃孵育过夜。感染的细胞用冰冷的1:1丙酮：甲醇溶液固定，用PBSB封闭，并用原代抗-甲型流感抗体(密理博公司(Millipore))孵育。在与偶联Alexa Fluor 488的第二山羊抗-小鼠IgG(英杰公司)孵育后，使用Immunospot S5UV分析仪(CTL)对荧光细胞进行计数。

HA的IRDye标记

将PBS中的HA与在水中重建的IRDye 800CW马来酰亚胺或IRDye 680CT(LI-COR)以室温孵育2小时。按照供应商提供的方法，通过Zeba脱盐旋转柱(皮尔斯公司(Pierce))移除游离的IRDye。通过Odyssey CLx imager(Licor)检测IRDye。

实施例7：RP-HPLC和SRID效力试验之间的关联性，以及使用暴露于一组应激条件的流感抗原的免疫原性研究

使用来自暴露于各种应激条件的甲型和乙型病毒亚型的抗原，本发明的流感疫苗效力试验可以提供与SRID和免疫原性研究(血细胞凝集素抑制(HI)和免疫中和(MN)效价)具有极好关联性的结果。例如，参见实施例4和6，以及图3-5和8-9。

发明人已经使用来自N3N2和N1N1亚型甲型流感病毒毒株的抗原进行了进一步的研究。将抗原单批分成相同的组，然后将各组暴露于不同的应激条件，包括低pH(pH 4.0，30分钟)、冷冻/解冻(5x，在Tris缓冲液中)、脱酰胺(pH 11.0，以37℃进行24小时)和涡旋应激(以室温涡旋30分钟)，或暴露于非应激条件下(对照)。在不进行或进行胰蛋白酶消化预处理的情况下，使用RP-HPLC和SRID对来自各组的样品中的HA量进行测量。发明人发现，对于所有测试的应激条件，通过不进行胰蛋白酶消化预处理的RP-HPLC测量的相对HA量(例如，相对于针对不进行胰蛋白酶消化预处理的对照组的SRID结果)并不与SRID结果(进行或不进行胰蛋白酶预处理)良好相关。相反，通过进行胰蛋白酶预处理的RP-HPLC测量的相对HA量与SRID结果良好相关，特别是对进行胰蛋白酶消化预处理的SRID。例如，通过SRID(进行或不进行胰蛋白酶消化)测量到低pH(显著地)和脱酰胺(轻微地)降低HA量，并且通过进行胰蛋白酶消化预处理的RP-HPLC测量到该结果。通过SRID(进行或不进行胰蛋白酶消化)或进行胰蛋白酶消化预处理的RP-HPLC测量到冷冻/解冻和涡旋应激并不显著降低HA量。

使用HI和MN试验对相同应激的和对照N3N2抗原样品组的免疫原性进行进一步的测试。使用第42天血(第二次免疫后3周)，各组的抗血清通过将来自各组的抗原(0.1μg HA剂量)在第0天和第21天给予各组8只BALB/c雌性小鼠生成。然后，将抗血清用于H1和MN试验。初步的结果确认，至少对低pH、冷冻/解冻和涡旋应激组，通过HI和MN测量的免疫原性与通过RP-HPLC和SRID并进行胰蛋白酶消化预处理确定的相对HA量相关。

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124)Zambon,M.C.(1999)."流感的流行病学和发病机理(Epidemiology andpathogenesis of influenza)."J Antimicrob Chemother 44Suppl B:3-9.

125)Minor,Philip D.(2015).“测试流感疫苗的效力(Assaying the potency ofinfluenza vaccines).”Vaccines 3:90-104.

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和构思内。

Claims

1.一种方法，其包括如下步骤：

a)提供包括免疫原性HA、失活HA、或其组合的样品；

b)对样品进行生物蛋白水解，其中，所述失活HA被消化，所述免疫原性HA保持未消化；

c)将所述样品中消化的失活HA与未消化的免疫原性HA分离；

d)对所述未消化的免疫原性HA进行分析性蛋白酶水解，从而提供消化的免疫原性HA的片段；

2.一种方法，其包括如下步骤：

a)提供包括免疫原性HA、失活HA、或其组合的样品；

b)通过一种或多种蛋白酶对样品进行生物蛋白水解，其中，所述失活HA被消化，所述免疫原性HA保持未消化；

c)使用一种或多种蛋白酶对未消化的免疫原性HA和消化的失活HA的混合物进行分析性蛋白质水解，其中，所述分析性蛋白质水解无法在一个或多个切割位点切割所述免疫原性HA，从而提供消化的免疫原性HA的片段，所述一个或多个切割位点在生物蛋白质水解期间在所述失活HA中能够被切割，所述消化的免疫原性HA的片段包括区别于所述失活HA衍生的肽的一种或多种免疫原性HA衍生的肽；并且，

d)在存在至少一种标记的参照HA肽的情况下进行液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS)，以对所述样品中免疫原性HA的量进行定量。

3.一种用于在样品中定量免疫原性流感HA的方法，其包括如下步骤：

a)对样品进行生物蛋白质水解；

b)将所述样品中所述免疫原性HA与其它组分分离；

c)对样品中免疫原性HA进行定量。

4.如权利要求1或权利要求3所述的方法，其中，所述生物蛋白质水解包括用蛋白酶进行的蛋白质水解。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶。

6.如权利要求3-5中任一项所述的方法，其中，所述免疫原性HA通过液相色谱-电喷雾电离-串联质谱(LC-ESI-MS)定量。

7.如权利要求1和3-6中任一项所述的方法，其中，所述分离所述免疫原性HA的步骤包括蛋白质沉淀。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述蛋白质沉淀包括添加有机溶剂的步骤。

9.如权利要求8所述的方法，其中，所述有机溶剂是丙酮、乙醇或甲醇。

10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中，所述方法包括用醇，例如乙醇洗涤所述沉淀的蛋白质的步骤。

11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述样品选自：全病毒颗粒流感疫苗、裂解流感疫苗、亚基流感疫苗、和重组流感疫苗。

12.如权利要求11所述的方法，其中，所述样品包括佐剂，例如，水包油乳液佐剂。

13.如权利要求1、2或6-12中任一项所述的方法，其中，所述LC-ESI-MS是同位素稀释质谱(IDMS)。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述标记的参照HA肽包括同位素标记，例如，同位素标记选自¹⁵N和¹³C。

15.一种用于在样品中定量免疫原性流感HA的方法，其包括如下步骤：

a)对样品进行生物蛋白质水解；并且，

b)通过SRID试验对来自(a)的样品中的免疫原性HA的量进行定量。

16.一种制造流感疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供来自包含流感HA的批料制备物的样品，

b)根据前述权利要求中任一项所述的方法对免疫原性HA的量进行定量，

c)根据所述样品中免疫原性HA的量，由批料制备物包装得到单位剂量形式。

17.一种制备流感疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：

a)根据如权利要求1-15中任一项所述的方法对批料疫苗中HA的量进行定量；并且

b)由所述批料制备疫苗。