CN113301974A - 在线色谱法和电喷雾电离质谱仪 - Google Patents
在线色谱法和电喷雾电离质谱仪 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113301974A CN113301974A CN202080008390.0A CN202080008390A CN113301974A CN 113301974 A CN113301974 A CN 113301974A CN 202080008390 A CN202080008390 A CN 202080008390A CN 113301974 A CN113301974 A CN 113301974A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- protein
- mass spectrometer
- electrospray ionization
- chromatography
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 title claims abstract description 79
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 title claims description 82
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 185
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 180
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 152
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 175
- 229940049595 antibody-drug conjugate Drugs 0.000 claims description 120
- 239000000611 antibody drug conjugate Substances 0.000 claims description 97
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 claims description 69
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 claims description 62
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 32
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 29
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 22
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 22
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 22
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 238000012434 mixed-mode chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 claims description 9
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 8
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 8
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 4
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims description 3
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims description 2
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 claims 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 abstract description 14
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 54
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 37
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 32
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 31
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 26
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 24
- 108091022873 acetoacetate decarboxylase Proteins 0.000 description 23
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 22
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 20
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 18
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 18
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 17
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 16
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 15
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 15
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 15
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 14
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 14
- 238000001186 nanoelectrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 11
- 101710096655 Probable acetoacetate decarboxylase 1 Proteins 0.000 description 10
- 101710096660 Probable acetoacetate decarboxylase 2 Proteins 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 7
- 239000005350 fused silica glass Substances 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- -1 chromoproteins Proteins 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 101100476210 Caenorhabditis elegans rnt-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 4
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 3
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 3
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 3
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 3
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 238000004252 FT/ICR mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 108010008177 Fd immunoglobulins Proteins 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 2
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 2
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 2
- 102000051619 SUMO-1 Human genes 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 2
- 238000004760 accelerator mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229940124691 antibody therapeutics Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000013823 prenylation Effects 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 2
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 2
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- CRDAMVZIKSXKFV-YFVJMOTDSA-N (2-trans,6-trans)-farnesol Chemical group CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CO CRDAMVZIKSXKFV-YFVJMOTDSA-N 0.000 description 1
- 239000000260 (2E,6E)-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,10-trien-1-ol Substances 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-$l^{1}-selanylpropanoate Chemical compound [Se]C[C@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GAJBPZXIKZXTCG-VIFPVBQESA-N (2s)-2-amino-3-[4-(azidomethyl)phenyl]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(CN=[N+]=[N-])C=C1 GAJBPZXIKZXTCG-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- RPLCQQYRZLXMKL-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-amino-6-(2-azidoethoxycarbonylamino)hexanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC(=O)OCCN=[N+]=[N-] RPLCQQYRZLXMKL-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- ZXSBHXZKWRIEIA-JTQLQIEISA-N (2s)-3-(4-acetylphenyl)-2-azaniumylpropanoate Chemical compound CC(=O)C1=CC=C(C[C@H](N)C(O)=O)C=C1 ZXSBHXZKWRIEIA-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- OJISWRZIEWCUBN-QIRCYJPOSA-N (E,E,E)-geranylgeraniol Chemical group CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CO OJISWRZIEWCUBN-QIRCYJPOSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 5-amino-3,5-dideoxy-D-glycero-D-galacto-non-2-ulopyranosonic acid Chemical compound N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO CERZMXAJYMMUDR-QBTAGHCHSA-N 0.000 description 1
- 230000005730 ADP ribosylation Effects 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 101000879203 Caenorhabditis elegans Small ubiquitin-related modifier Proteins 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N D-Selenocysteine Natural products [Se]C[C@@H](N)C(O)=O FDKWRPBBCBCIGA-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001057508 Homo sapiens Ubiquitin-like protein ISG15 Proteins 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N Hydroxylysine Natural products NCC(O)CC(N)CC(O)=O LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241001599018 Melanogaster Species 0.000 description 1
- 108010063312 Metalloproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010750 Metalloproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010063954 Mucins Proteins 0.000 description 1
- 102000015728 Mucins Human genes 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N N-Acetyl-D-Galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-CBQIKETKSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 241000235061 Pichia sp. Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700038981 SUMO-1 Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 102000002669 Small Ubiquitin-Related Modifier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010043401 Small Ubiquitin-Related Modifier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 102100027266 Ubiquitin-like protein ISG15 Human genes 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229940126587 biotherapeutics Drugs 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 108700010039 chimeric receptor Proteins 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006329 citrullination Effects 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 230000035071 co-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 1
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000002451 electron ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940043259 farnesol Drugs 0.000 description 1
- 229930002886 farnesol Natural products 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 108091005899 fibrous proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034240 fibrous proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- XWRJRXQNOHXIOX-UHFFFAOYSA-N geranylgeraniol Chemical group CC(C)=CCCC(C)=CCOCC=C(C)CCC=C(C)C XWRJRXQNOHXIOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OJISWRZIEWCUBN-UHFFFAOYSA-N geranylnerol Chemical group CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCO OJISWRZIEWCUBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000404 glutamine group Chemical group N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000006237 glutamylation Effects 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000006238 glycylation Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-L-lysine Natural products NCCCCC(NO)C(O)=O QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000012482 interaction analysis Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000026045 iodination Effects 0.000 description 1
- 238000006192 iodination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000012633 leachable Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229940051875 mucins Drugs 0.000 description 1
- 238000012433 multimodal chromatography Methods 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N neuraminic acid Natural products NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO CERZMXAJYMMUDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000955 neuroendocrine Effects 0.000 description 1
- 229910052755 nonmetal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 description 1
- 150000003881 polyketide derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229930001118 polyketide hybrid Natural products 0.000 description 1
- 125000003308 polyketide hybrid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000006894 reductive elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N selenocysteine Natural products [SeH]CC(N)C(O)=O ZKZBPNGNEQAJSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016491 selenocysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229940055619 selenocysteine Drugs 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002548 spray ionization process Methods 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L sulfate group Chemical group S(=O)(=O)([O-])[O-] QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 150000003505 terpenes Chemical group 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- CRDAMVZIKSXKFV-UHFFFAOYSA-N trans-Farnesol Natural products CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCO CRDAMVZIKSXKFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/34—Size selective separation, e.g. size exclusion chromatography, gel filtration, permeation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/16—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
- B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/38—Flow patterns
-
- G01N30/48—
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
- G01N30/724—Nebulising, aerosol formation or ionisation
- G01N30/7266—Nebulising, aerosol formation or ionisation by electric field, e.g. electrospray
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/74—Optical detectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/80—Fraction collectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
- G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
- H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
- H01J49/02—Details
- H01J49/10—Ion sources; Ion guns
- H01J49/16—Ion sources; Ion guns using surface ionisation, e.g. field-, thermionic- or photo-emission
- H01J49/165—Electrospray ionisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/522—CH1 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Botany (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Plasma & Fusion (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Abstract
提供了用于使用在线色谱法和电喷雾电离质谱法表征蛋白质的方法和系统。
Description
技术领域
本发明总体上涉及一种用于使用在线色谱法和电喷雾电离质谱法表征蛋白质生物制剂的方法。
背景技术
蛋白质生物制剂产品已作为用于治疗癌症、自身免疫性疾病、感染和心脏代谢病症的重要药物出现,并且它们代表医药工业中增长最快的产品类中的一种。
蛋白质生物制剂产品必须满足非常高的纯度标准。因此,可能重要的是在药物开发和生产的不同阶段期间监测并表征蛋白质生物制剂。用于表征此类蛋白质生物制剂的测定的分析方法应显示出足够的准确性和分辨率,以检测并定量所需产品。由于蛋白质生物制剂与其突变形式或修饰形式或裂解形式相比在结构和物理化学性质之间存在相似性,评估可能很困难。直接分析可能要求足够大量地分离产品以用于测定,这是不希望的,并且仅在所选定的情况下是可能的。
本领域长期迫切需要一种用于表征蛋白质生物制剂的方法和/或系统。
发明内容
蛋白质生物制剂产品的开发、制造和销售的增长导致对表征蛋白质生物制剂以及可能的杂质、结合化学计量及其总体组成的需求逐渐增加。
本文公开的示例性实施方案通过提供用于表征、鉴别和/或定量蛋白质生物制剂以及其可能的杂质、结合和总体组成的方法来满足上述需求。
本公开至少部分地提供了一种用于表征蛋白质的方法。在一个示例性实施方案中,用于表征蛋白质的方法包括使包含所述蛋白质的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触,使用流动相洗涤所述树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液,以及使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述蛋白质。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括将电喷雾电离质谱仪耦接至具有色谱树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括将电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。
在一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括在天然条件下运行的电喷雾电离质谱仪。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括纳米电喷雾电离质谱仪。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括在天然条件下运行的纳米电喷雾电离质谱仪。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括至少一个三路分流器,以将电喷雾电离质谱仪耦接至具有树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括至少一个三路分流器,以将紫外光检测器耦接至具有树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括至少一个三路分流器,以将紫外光检测器和电喷雾电离质谱仪耦接至具有树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括至少一个三路分流器,以将电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括至少一个三路分流器,以将紫外光检测器耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括至少一个三路分流器,以将紫外光检测器和电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括使用流动相洗涤树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液,其中所述洗脱液通过至少一个三路分流器以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速引入到紫外光检测器中。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括包含挥发性盐的流动相。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括包含乙酸铵的流动相。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括具有小于约100mM乙酸铵的总浓度的流动相。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括用流动相以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速洗涤树脂。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括具有约6.8的pH的流动相。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括包含约10μg至约100μg蛋白质的量的蛋白质的样品。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括作为抗体的蛋白质。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括作为抗原-抗体复合物的蛋白质。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括作为抗体-药物缀合物的蛋白质。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括电喷雾电离质谱仪,其使用约10nL/min至约50nL/min的流速。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括电喷雾电离质谱仪,其电喷雾的喷雾电压为约0.8kV至约1.5kV。
在此实施方案的一个方面,用于表征的方法可包括鉴别蛋白质。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括定量蛋白质。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括定量蛋白质的相对丰度。
在此实施方案的一个方面,用于表征蛋白质的方法可包括具有至少两种蛋白质的样品。
本公开至少部分地提供了一种用于表征抗体-药物缀合物的方法。在一个示例性实施方案中,用于表征抗体-药物缀合物的方法包括使包含所述抗体-药物缀合物的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触,使用流动相洗涤所述树脂以提供包含所述抗体-药物缀合物的洗脱液,以及使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述抗体-药物缀合物。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括将电喷雾电离质谱仪耦接至具有色谱树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括将电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括在天然条件下的电喷雾电离质谱仪。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括纳米电喷雾电离质谱仪。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括在天然条件下运行的纳米电喷雾电离质谱仪。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括至少一个三路分流器,以将电喷雾电离质谱仪耦接至具有树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括至少一个三路分流器,以将紫外光检测器耦接至具有树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括至少一个三路分流器,以将紫外光检测器和电喷雾电离质谱仪耦接至具有树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括至少一个三路分流器,以将电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括至少一个三路分流器,以将紫外光检测器耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括至少一个三路分流器,以将紫外光检测器和电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括使用流动相洗涤树脂以提供包含所述抗体-药物缀合物的洗脱液,其中所述洗脱液通过至少一个三路分流器以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速引入到紫外光检测器中。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括包含挥发性盐的流动相。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括包含乙酸铵的流动相。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括具有小于约100mM乙酸铵的总浓度的流动相。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括用流动相以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速洗涤树脂。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括具有约6.8的pH的流动相。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括包含约10μg至约100μg抗体-药物缀合物的量的蛋白质的样品。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括使用流动相洗涤树脂以提供洗脱液,所述洗脱液以小于约50μl/min的流速引入到电喷雾电离质谱仪。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括电喷雾电离质谱仪,其使用约10nL/min至约50nL/min的流速。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括电喷雾电离质谱仪,其电喷雾的喷雾电压为约0.8kV至约1.5kV。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括作为位点特异性抗体-药物缀合物的抗体-药物缀合物。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括并非位点特异性抗体-药物缀合物的抗体-药物缀合物。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括作为工程化的基于半胱氨酸的抗体-药物缀合物的抗体-药物缀合物。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括作为非特异性的基于半胱氨酸的抗体-药物缀合物的抗体-药物缀合物。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括表征药物与抗体比率。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括鉴别抗体。
在此实施方案的一个方面,用于表征抗体-药物缀合物的方法可包括定量抗体。
本公开至少部分地提供了一种系统,其包括具有色谱树脂的色谱柱。在另一个示例性实施方案中,所述系统可包括具有色谱树脂的色谱柱,其中所述色谱柱能够接收流动相和包含蛋白质的样品;以及电喷雾电离质谱仪。
在此实施方案的一个方面,所述系统可包括具有尺寸排阻色谱树脂的色谱柱。
在此实施方案的一个方面,所述系统可包括能够与所述色谱柱耦接的电喷雾电离质谱仪。
在此实施方案的一个方面,所述系统可包括能够在天然条件下运行的电喷雾电离质谱仪。
在此实施方案的一个方面,所述系统可包括纳米电喷雾电离质谱仪。
在此实施方案的一个方面,所述系统可包括能够使用三路分流器耦接至质谱仪的色谱柱。
在此实施方案的一个方面,所述系统可包括能够使用三路分流器耦接至紫外光检测器的色谱柱。
在此实施方案的一个方面,所述系统可包括能够使用三路分流器耦接至紫外光检测器和质谱仪的色谱柱。
在此实施方案的一个方面,所述系统可能够表征抗体-药物缀合物的药物与抗体比率。
在此实施方案的一个方面,所述系统可能够表征蛋白质。
在此实施方案的一个方面,所述系统可能够表征抗原-抗体复合物。
附图说明
图1示出了从常规和天然电喷雾电离质谱法获得的谱图。
图2示出了能够表征蛋白质生物制剂的系统的示例性实施方案。
图3示出了能够表征蛋白质生物制剂的系统的示例性实施方案。
图4示出了根据一个示例性实施方案的能够表征蛋白质生物制剂的系统的设置。
图5A和5B示出了根据一个示例性实施方案的使用能够表征蛋白质生物制剂的系统对抗原-抗体复合物进行的分析。
图6示出了根据示例性实施方案表征的Bet v 1与Fab-1之间的抗原-抗体滴定结果。
图7A示出了根据示例性实施方案的Bet v 1与Fab-1之间的抗原-抗体相互作用作为在天然条件下通过紫外光检测器和天然电喷雾电离质谱仪获得的双重检测结果的质谱仪信号
图7B示出了根据示例性实施方案的Bet v 1与Fab-1之间的抗原-抗体相互作用作为在天然条件下通过紫外光检测器和天然电喷雾电离质谱仪获得的双重检测结果的紫外光信号结果。
图8A示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-1进行的亲本mAb-1药物与抗体比率分析的原始谱图。
图8B示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-1进行的ADC-1药物与抗体比率分析的原始谱图。
图8C示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-1进行的亲本mAb-1药物与抗体比率分析的卷积谱图。
图8D示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-1进行的ADC-1药物与抗体比率分析的卷积谱图。
图9示出了根据示例性实施方案的通过FabRICATOR消化和在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸mAb-1和ADC-1进行的药物与抗体比率分析。
图10A示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-2进行的亲本mAb-2药物与抗体比率分析的原始谱图,其中N意指所述抗体没有聚糖,S意指糖基化发生在抗体的单链上,并且D意指糖基化发生在抗体的两条链上。
图10B示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-2进行的亲本mAb-2药物与抗体比率分析的卷积谱图,其中N意指所述抗体没有聚糖,S意指糖基化发生在抗体的单链上,并且D意指糖基化发生在抗体的两条链上。
图10C示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-2进行的ADC-2药物与抗体比率分析的原始谱图,其中N意指所述抗体没有聚糖,S意指糖基化发生在抗体的单链上,并且D意指糖基化发生在抗体的两条链上。
图10D示出了根据示例性实施方案的通过在线SEC-纳米-ESI-MS仪器对位点特异性缀合半胱氨酸ADC-2进行的亲本ADC-2药物与抗体比率分析的卷积谱图,其中N意指所述抗体没有聚糖,S意指糖基化发生在抗体的单链上,并且D意指糖基化发生在抗体的两条链上。
具体实施方式
蛋白质生物制剂产品中蛋白质的鉴别和定量在产品的生产和开发期间非常重要。杂质的存在和蛋白质生物制剂产品的结合方法可能对于开发安全且有效的产品至关重要。因此,表征蛋白质生物制剂、其结合方法以及表征任何伴随杂质的稳健方法和/或工作流程可为有益的。
所述方法之一包括使用尺寸排阻色谱法(SEC)在生物技术工业中表征生物分子聚集和片段化(Hong Paule等人,Size-Exclusion Chromatography for the Analysis ofProtein Biotherapeutics and their Aggregates,35 JOURNAL OF LIQUIDCHROMATOGRAPHY AND RELATED TECHNOLOGY 2923-2950(2012))。SEC对分子的分离依赖于分子与固定相上的受控多孔结构的不同相互作用。由于SEC使用的缓冲条件可以保留溶液中蛋白质的天然结构,因此允许在不干扰其天然构象的情况下对生物分子进行表征。在可与SEC联合的各种检测模式中,质谱(MS)可以精确且准确地鉴别复杂样品中的各个组分。先前已报告了SEC和MS的组合,包括收集SEC峰,接着进行直接输注MS(Kükrer等人,Mass Spectrometric Analysis of Intact Human Monoclonal Antibody AggregatesFractionated by Size-Exclusion Chromatography,27 PHARMACEUTICAL RESEARCH 2197–2204(2010);Debaene等人,Innovative Native MS Methodologies for AntibodyDrug Conjugate Characterization:High Resolution Native MS and IM-MS forAverage DAR and DAR Distribution Assessment,86 ANALYTICAL CHEMISTRY 10674–10683(2014))或在线SEC-MS(Khaja Muneeruddin等人,Characterization of Small ProteinAggregates and Oligomers Using Size Exclusion Chromatography with OnlineDetection by Native Electrospray Ionization Mass Spectrometry,86 ANALYTICALCHEMISTRY 10692–10699(2014);C.F.Mcdonagh等人,Engineered antibody-drug conjugateswith defined sites and stoichiometries of drug attachment,19 PROTEIN ENGINEERINGDESIGN AND SELECTION 299–307(2006))。然而,直接电离由SEC分离产生的高流量需要严苛的电离条件,这些条件通常与天然MS分析不兼容,从而限制了将这些技术耦接以用于非共价相互作用分析的效用。此外,质谱仪的灵敏度可能受到SEC缓冲液中所用的高盐浓度的影响。
由于非共价蛋白质相互作用介导了如此广泛的生物功能,人们对开发有利于研究其结构、化学计量和动力学的方法越来越感兴趣。此类方法有助于研究自然界中广泛存在的非共价蛋白质相互作用,并协调蛋白质生物制剂与多种分子(包括其他蛋白质和肽、核酸、脂质以及无机和有机小分子)的相互作用。尺寸排阻色谱(SEC)允许从分子组分的异质混合物中分离生物分子,并且由于缓冲条件使蛋白质保持其天然构象,SEC为用于在分离期间保存非共价生物分子复合物的理想方法。在可与SEC分析联合的各种检测方法中,质谱(MS)允许可靠地鉴别和表征复杂混合物中的单个组分。然而,SEC中所用的高流速和非挥发性盐通常与下游MS分析不兼容。
考虑到现有方法的局限性,开发了一种用于使用在线色谱法和电喷雾电离MS平台来分析蛋白质生物制剂的有效且高效的方法。
除非另外描述,否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然在实践或测试中可使用类似或等同于本文所描述的那些方法和材料的任何方法和材料,但现在描述特定的方法和材料。提及的所有出版物特此以引用的方式并入。
术语“一个/种(a)”应理解为意指“至少一个/种”;并且术语“约”和“大约”应理解为允许如本领域普通技术人员将理解的标准变化;并且在提供范围时,则包括端点。
在一些示例性实施方案中,本公开提供了一种用于表征、鉴别和/或定量蛋白质生物制剂的方法。
如本文所用,“蛋白质生物制剂”包括完全或部分具有生物学性质的活性成分。在一些示例性实施方案中,蛋白质生物制剂可包括蛋白质、疫苗、过敏原、核酸、病毒、抗体-药物缀合物、细胞、基因、组织或其组合。在一些其他示例性实施方案中,蛋白质生物制剂可包括蛋白质、疫苗、过敏原、核酸、病毒、抗体-药物缀合物、细胞、基因、组织或其组合的重组版本、工程化版本、修饰版本、突变版本或截短版本。
如本文所用,术语“蛋白质”包括具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包含一个或多个氨基酸聚合物链,在本领域中通常称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基组成的聚合物、相关的天然存在的结构变体以及其通过肽键连接的合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物。“合成的肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成的肽或多肽可例如使用自动化多肽合成仪来合成。各种固相肽合成方法为已知的。蛋白质可含有一种或多种多肽以形成单一功能的生物分子。蛋白质可包括生物治疗性蛋白质、用于研究或治疗的重组蛋白、trap蛋白和其他嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体和双特异性抗体中的任一种。在另一个示例性方面,蛋白质可包括抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白质可使用基于重组细胞的生产系统来产生,诸如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如毕赤酵母某种(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如CHO细胞和CHO衍生物,如CHO-K1细胞)。对于讨论生物治疗性蛋白质及其生产的综述,参见Ghaderi等人,"Production platforms for biotherapeutic glycoproteins。Occurrence,impact,andchallenges of non-human sialylation,"(BIOTECHNOL.GENET.ENG.REV.147-175(2012))。在一些示例性实施方案中,蛋白质包含修饰、加合物和其他共价连接的部分。这些修饰、加合物和部分包括例如亲和素、链霉亲和素、生物素、聚糖(例如,N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖、甘露糖和其他单糖)、PEG、聚组氨酸、FLAG标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)myc表位、荧光标记和其他染料等。蛋白质可根据组成和溶解度来分类,并且因此可包括简单的蛋白质,诸如球状蛋白质和纤维状蛋白质;缀合蛋白,诸如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白;以及衍生蛋白,诸如初级衍生蛋白和次级衍生蛋白。
在一些示例性实施方案中,蛋白质可为抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体、宿主细胞蛋白或其组合。
如本文所用,术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)的免疫球蛋白分子以及其多聚体(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区,穿插有被称为框架区(FR)的较保守区。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成,从氨基端到羧基端按以下顺序排列∶FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在不同的示例性实施方案中,抗-大-ET-1抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人种系序列相同,或可为天然或人工修饰的。氨基酸共有序列可基于两个或更多个CDR的并行分析来定义。如本文所用,术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所用,术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。可使用诸如蛋白水解消化或重组基因工程化技术的任何合适的标准技术例如从完整抗体分子衍生出抗体的抗原结合片段,所述重组基因工程化技术涉及编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的DNA的操纵和表达。此类DNA为已知的和/或为从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)轻易可获得的或可为合成的。可以化学方式或通过使用分子生物学技术对DNA进行测序和操纵,例如以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型,或引入密码子;形成半胱氨酸残基;修饰、添加或去除氨基酸等。
如本文所用,“抗体片段”包括完整抗体的一部分,例如像抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fc片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd′片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域,以及三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段为免疫球蛋白重链和轻链可变区的组合,并且ScFv蛋白为重组单链多肽分子,其中免疫球蛋白轻链可变区和重链可变区通过肽接头连接。抗体片段可通过各种方式产生。例如,抗体片段可通过使完整抗体片段化来酶促或化学产生,且/或其可由编码部分抗体序列的基因重组产生。可替代地或另外,抗体片段可全部或部分合成产生。抗体片段可任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外,抗体片段可包含例如通过二硫键连接在一起的多条链。抗体片段可任选地包括多分子复合物。
如本文所用,术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可通过本领域可获得的或已知的任何方式衍生自单个克隆,包括任何真核、原核或噬菌体克隆。可用于本公开的单克隆抗体可使用本领域已知的多种技术来制备,包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。
如本文所用,术语“抗体-药物缀合物”或“ADC”可以是指通过具有不稳定键的接头连接至生物活性药物的抗体。ADC可包含若干个生物活性药物分子(或有效载荷),这些分子可以共价连接到抗体氨基酸残基的侧链(Siler Panowski等人,Site-specific antibodydrug conjugates for cancer therapy,6MABS 34–45(2013))。用于ADC的抗体可能够以足够的亲和力结合,以选择性积累和持久保留在靶位点处。大多数ADC可具有在纳摩尔范围内的Kd值。有效载荷可具有在纳摩尔/皮摩尔范围内的效价并且可能够达到在ADC分布到靶组织中后可达到的细胞内浓度。最后,在有效载荷与抗体之间形成连接的接头可能够在循环中足够稳定以利用抗体部分的药代动力学特性(即长半衰期)并允许有效载荷在抗体分布到组织中时保持连接至抗体,一旦ADC被吸收到靶细胞中,也应允许生物活性药物d有效释放。
接头可为:在细胞加工期间不可裂解的接头和一旦ADC到达靶位点后就可裂解的接头。对于不可裂解的接头,在细胞内释放的生物活性药物包括有效载荷和接头的所有元件,所述元件在ADC在溶酶体内完全蛋白水解降解之后,仍连接至抗体的氨基酸残基,通常为赖氨酸或半胱氨酸残基。可裂解接头为其结构包含有效载荷与抗体上的氨基酸连接位点之间的裂解位点的那些接头。裂解机制可包括在酸性细胞内隔室中水解酸不稳定键、由细胞内蛋白酶或酯酶酶促裂解酰胺键或酯键以及由细胞内的还原性环境还原性裂解二硫键。
在一些特定实施方案中,本公开还提供了一种用于鉴定抗体-药物缀合物的药物与抗体比率(DAR)的方法。
ADC可通过与抗体的内源性氨基酸残基缀合来制备,从而仔细控制平均修饰度以产生最佳药物与抗体比率(DAR)。可以基于(a)最小化非缀合抗体的量和(b)避免混合物中的物质具有非常高DAR(这在制造和配制中可能由于疏水性更高且溶解度更低而成为问题,并可能导致药代动力学特性较差)来选择此比率。连接太少生物活性药物分子会导致疗效降低,而连接太多药物分子会使ADC不稳定且使药代动力学特性发生改变、血浆清除率增加、半衰期缩短和全身毒性增加。最佳DAR通常是不确定的,并且高度依赖于其他ADC变量;然而,更常见的是,ADC旨在获得接近4的DAR。生物活性药物与抗体的缀合的非限制性实例可包括生物活性药物与抗体上的赖氨酸或半胱氨酸残基的缀合。赖氨酸缀合可导致每个抗体有0-8个缀合的生物活性药物分子,并且可以在不同赖氨酸残基的重链和轻链上发生。生物活性药物与抗体的缀合的另一个非限制性实例可以包括在四个链间二硫键还原之后发生的半胱氨酸缀合,并且因此缀合仅限于八个暴露的巯基,并因此每个抗体连接的生物活性药物分子范围为0-8个。ADC混合物异质性的多样性为2倍,因为这些ADC物质在载药量和缀合位点方面不同。因此,每种物质可具有不同的特性,这可能导致广泛范围的体内PK特性。此外,ADC生产中的批次间一致性可能具有挑战性,并且可能需要勤奋的制造能力。
位点特异性抗体-药物缀合为克服这些挑战的一种方式,其中已知数量的生物活性药物分子始终缀合至限定位点。使异质性最小化并且ADC特性为更可预测,其中批次间的缀合物生产为一致的。药物与抗体比率(DAR)得到精确控制并且可以针对各种连接的生物活性药物进行定制,从而产生2-DAR或4-DAR位点特异性ADC。位点特异性缀合的非限制性实例包括通过工程化半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基、非天然氨基酸(例如,对乙酰苯丙氨酸、N6-((2-叠氮乙氧基)羰基)-L-赖氨酸、对叠氮甲基-L-苯丙氨酸、硒代半胱氨酸)、聚糖或短肽标签将生物活性药物分子连接至抗体,如Qun Zhou在综述“Site-Specific AntibodyConjugation for ADC and Beyond”中所教导的,所述综述以引用的方式并入(Qun Zhou,Site-Specific Antibody Conjugation for ADC and Beyond,5 BIOMEDICINES 64(2017))。
在一些示例性实施方案中,本公开提供了一种用于表征、鉴别和/或定量蛋白质生物制剂产品中的至少一种杂质的方法。
如本文所用,术语“杂质”可包括存在于蛋白质生物制剂产品中的任何不期望的蛋白质。杂质可包括过程相关杂质和产品相关杂质。杂质可以进一步具有部分表征或未鉴别的已知结构。过程相关杂质可来源于制造过程,并且可包括三个主要类别:细胞底物来源、细胞培养物来源和下游来源。细胞底物来源的杂质包括但不限于源自宿主生物的蛋白质和核酸(宿主细胞基因组、载体或总DNA)。细胞培养物来源的杂质包括但不限于诱导剂、抗生素、血清和其他培养基成分。下游来源的杂质包括但不限于酶、化学试剂和生物化学处理试剂(例如,溴化氰、胍、氧化剂和还原剂)、无机盐(例如,重金属、砷、非金属离子)、溶剂、载体、配体(例如单克隆抗体)和其他可浸出物。产品相关杂质(例如前体、某些降解产物)可为制造和/或储存期间产生的分子变体,其具有在活性、功效和安全性方面与所需产品相当的特性。此类变体在分离和表征方面可能需要大量的努力,以便鉴别一种或多种修饰的类型。产品相关杂质可包括截短形式、修饰形式和聚集体。截短形式由催化肽键裂解的水解酶或化学物质形成。修饰形式包括但不限于脱酰胺基形式、异构化形式、错配性S-S连接形式、氧化形式或改变的缀合形式(例如,糖基化、磷酸化)。修饰形式也可包括任何翻译后修饰形式。聚集体包括所需产物的二聚体和更高聚体。(Q6BSpecifications:Test Proceduresand Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products,ICH 1999年8月,U.S.Dept.of Health and Humans Services)。
如本文所用,通用术语“翻译后修饰”或“PTM”是指多肽在其核糖体合成期间(共翻译修饰)或之后(翻译后修饰)经历的共价修饰。PTM通常通过特定的酶或酶途径引入。许多PTM发生在蛋白质主链内的特定特征性蛋白质序列(签名序列)位点。已记录了数百个PTM,并且这些修饰总是影响蛋白质的结构或功能的一些方面(Walsh,G.“Proteins”(2014)第二版本,由Wiley and Sons,Ltd.出版,ISBN:9780470669853)。各种翻译后修饰包括但不限于裂解、N末端延伸、蛋白质降解、N末端的酰化、生物素化(用生物素使赖氨酸残基酰化)、C末端的酰胺化、糖基化、碘化、辅基的共价连接、乙酰化(通常在蛋白质的N末端处添加乙酰基)、烷基化(通常在赖氨酸或精氨酸残基处添加烷基(例如甲基、乙基、丙基))、甲基化、腺苷酸化、ADP-核糖基化、在多肽链内或多肽链之间的共价交联、磺化、异戊二烯化、维生素C依赖性修饰(脯氨酸和赖氨酸羟基化和羧基末端酰胺化)、维生素K依赖性修饰(其中维生素K为谷氨酸残基羧化过程中的辅助因子,从而导致形成γ-羧基谷氨酸(glu残基))、谷氨酰化(谷氨酸残基的共价键)、甘氨酰化(glycylation)(甘氨酸残基的共价键)、糖基化(将糖基加到天冬酰胺、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸,从而产生糖蛋白)、异戊二烯基化(添加类异戊二烯基团,诸如法尼醇和香叶基香叶醇)、脂基化(连接脂酸酯官能团)、磷酸泛锡基化(添加来自辅酶A的4'-磷酸泛亚锡基部分,诸如在脂肪酸、聚酮化合物、非核糖体肽和亮氨酸生物合成中)、磷酸化(通常向丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸添加磷酸基团)和硫酸化(通常向酪氨酸残基添加硫酸酯基团)。改变氨基酸化学性质的翻译后修饰包括但不限于瓜氨酸化(通过脱氨基将精氨酸转化为瓜氨酸)和脱酰胺基(将谷氨酰胺转化为谷氨酸或将天冬酰胺转化为天冬氨酸)。涉及结构变化的翻译后修饰包括但不限于形成二硫键(两个半胱氨酸氨基酸的共价连接)和蛋白水解裂解(蛋白质在肽键处的裂解)。某些翻译后修饰涉及添加其他蛋白质或肽,例如ISG化(与ISG15蛋白(干扰素刺激基因)共价连接)、SUMO化(与SUMO蛋白(小泛素相关性修饰物)共价连接)和泛素化(与蛋白质泛素共价连接)。对于由UniProt展示的PTM的更详细受控词表,参见European Bioinformatics InstituteProteinInformation ResourceSIB Swiss Institute of Bioinformatics、EUROPEAN BIOINFORMATICSINSTITUTE DRS-DROSOMYCIN PRECURSOR-DROSOPHILA MELANOGASTER(FRUIT FLY)-DRS GENE&PROTEIN,http://www.uniprot.org/docs/ptmlist(2019年1月15日最后访问)。
如本文所用,术语“所需产品”是指具有所需结构、功能或功效特征的蛋白质生物制剂。
在一些示例性实施方案中,本公开还提供了一种用于表征蛋白质生物制剂的结合的方法。例如,抗体可以通过高度特异性、高亲和力的非共价相互作用来结合抗原,所述相互作用为能够开发靶向疾病特异性抗原的治疗多种疾病的治疗性抗体(Andrew C.Chan和Paul J.Carter,Therapeutic antibodies for autoimmunity and inflammation,10NATURE REVIEWS IMMUNOLOGY 301–316(2010))。为了开发有效的抗体治疗剂,了解抗体结合如何影响靶蛋白的功能至关重要。
在一些示例性实施方案中,本公开还提供了一种用于鉴定抗原-抗体复合物中的抗体与抗原的结合比率的方法。
在一些特定示例性实施方案中,本公开还提供了一种用于鉴别与抗体结合的抗原的方法。在一些其他示例性实施方案中,所述方法可包括确定抗原和/或抗体的裂解版本、修饰版本或突变版本是否负责形成抗原-抗体复合物。
在一些示例性实施方案中,本公开还提供了一种用于定量溶液中单个蛋白质的相对丰度的方法。
在一些示例性实施方案中,用于表征、鉴别和/或定量蛋白质生物制剂、其可能的杂质、结合或组成的方法可包括使包含所述蛋白质生物制剂的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触。
如本文所用,术语“色谱法”是指一种过程,其中由于化学实体在固定液相或固相周围或上方流动时的差异分布,可将由液体或气体携带的化学混合物分离成组分。色谱法的非限制性实例包括传统反相色谱法(RP)、离子交换色谱法(IEX)、混合模式色谱法和正相色谱法(NP)。
如本文所用,术语“混合模式色谱法(MMC)”或“多模式色谱法”包括其中溶质通过超过一种相互作用模式或机制与固定相相互作用的色谱法。MMC可用作传统反相色谱(RP)、离子交换色谱(IEX)和正相色谱(NP)的替代或补充工具。与分别以疏水相互作用、亲水相互作用和离子相互作用为主要相互作用模式的RP、NP和IEX色谱不同,混合模式色谱可采用这些相互作用模式中两种或更多种的组合。混合模式色谱介质可提供无法通过单一模式色谱法重现的独特选择性。与基于亲和力的方法相比,混合模式色谱也可提供潜在的成本节约和操作灵活性。
在一些示例性实施方案中,色谱法可以是尺寸排阻色谱法。
如本文所用,术语“SEC色谱树脂”或“SEC色谱介质”可互换使用,并且可包括在SEC中使用的从所需产物分离杂质(例如,对于双特异性抗体产物为同源二聚体污染物)的任何种类的固相。树脂的体积、待使用的柱的长度和直径以及动态容量和流速可取决于几个参数,诸如待处理的流体体积、待经受过程的流体中蛋白质的浓度。
在一些示例性实施方案中,用于表征、鉴别和/或定量蛋白质生物制剂、其可能的杂质、结合或组成的方法可包括使包含所述蛋白质的样品与具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触,使用流动相洗涤所述尺寸排阻色谱树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液,以及使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述蛋白质。
如本文所用,术语“质谱仪”包括能够鉴别特定分子物质并测量其准确质量的装置。所述术语意在包括可在其中洗脱多肽或肽以进行检测和/或表征的任何分子检测器。质谱仪可包括三个主要部分:离子源、质量分析器和检测器。离子源的作用是产生气相离子。可将分析物的原子、分子或簇转移到气相中并同时进行电离(如电喷雾电离)。离子源的选择在很大程度上取决于应用。
如本文所用,术语“电喷雾电离”或“ESI”是指喷雾电离的过程,其中溶液中的阳离子或阴离子通过形成高电荷液滴流并在大气压下使其去溶剂来转移到气相中,所述液滴流通过在含有溶液的电喷雾针尖端与反电极之间施加电势差来产生。由溶液中的电解质离子生产气相离子通常需要三个主要步骤。这些步骤为:(a)在ES注入尖端产生带电荷液滴;(b)由于溶剂蒸发而使带电荷液滴收缩,并且液滴反复崩解,从而形成能够产生气相离子的高电荷小液滴;以及(c)由非常小的高电荷液滴产生气相离子的机制。阶段(a)-(c)通常发生在设备的大气压区域。
如本文所用,术语“电喷雾注入装置”是指与用于蛋白质质量分析的质谱仪兼容的电喷雾电离系统。在电喷雾电离中,电喷雾针的孔口靠近谱图仪的入口孔口。可以将包含感兴趣蛋白质的样品泵送穿过注射器针。注射器针孔口与通向质量分析器的孔口之间的电势形成溶液的喷雾(“电喷雾”)。电喷雾可以在大气压下进行,并提供溶液的高电荷液滴。电喷雾注入装置可以包括电喷雾发射器、雾化气体和/或ESI电源。可以任选地使所述装置自动化,以执行样品抽吸、样品分配、样品递送和/或用于喷涂样品。
在一些示例性实施方案中,电喷雾电离质谱仪可为纳米电喷雾电离质谱仪。
如本文所用,术语“纳米电喷雾”或“纳米喷雾”是指在通常不使用外部溶剂递送的情况下在非常低的溶剂流速(通常每分钟数百纳升样品溶液或更低)下的电喷雾电离。形成纳米电喷雾的电喷雾注入装置可使用静态纳米电喷雾发射器或动态纳米电喷雾发射器。静态纳米电喷雾发射器在延长的时间段内对小样品(分析物)溶液体积进行连续分析。动态纳米电喷雾发射器使用毛细管柱和溶剂递送系统对混合物进行色谱分离,然后通过质谱仪进行分析。
如本文所用,术语“质量分析器”包括可根据质量分离物质(即,原子、分子或簇)的装置。可用于快速蛋白质测序的质量分析器的非限制实例为飞行时间(TOF)、扇形磁场/扇形电场、四极滤质器(Q)、四极离子阱(QIT)、轨道阱、傅立叶变换离子回旋共振(FTICR)以及还有加速器质谱(AMS)技术。
在一些示例性实施方案中,质谱法可以在天然条件下进行。
如本文所用,术语“天然条件”或“天然MS”或“天然ESI-MS”可包括在保留分析物中的非共价相互作用的条件下进行质谱分析。对于关于天然MS的详细评论,参见以下综述:Elisabetta Boeri Erba&Carlo Petosa,The emerging role of native massspectrometry in characterizing the structure and dynamics of macromolecularcomplexes,24 PROTEIN SCIENCE1176–1192(2015)。表1和图1中示出了天然ESI与常规ESI之间的一些区别(Hao Zhang等人,Native mass spectrometry of photosynthetic pigment-protein complexes,587FEBS Letters 1012–1020(2013))。
表1.
在一些示例性实施方案中,质谱仪可为串联质谱仪。
如本文所用,术语“串联质谱法”包括通过使用质量选择和质量分离的多个阶段获得关于样品分子的结构信息的技术。先决条件是样品分子可被转移到气相中并被完整电离,并且可在第一质量选择步骤之后以某种可预测且可控制的方式诱导它们分解。多阶段MS/MS或MSn可通过以下方法进行:首先选择并分离前体离子(MS2)、使其片段化、分离出初级片段离子(MS3)、使其片段化、分离出次级片段(MS4),以此类推,只要人们可获得有意义的信息或片段离子信号是可检测的。串联MS已成功地与多种分析器组合一起使用。对于某个应用,要组合哪些分析器取决于许多不同的因素,诸如灵敏度、选择性和速度,还取决于尺寸、成本和可用性。串联MS方法的两个主要类别为空间串联和时间串联,但也存在时间串联分析器在空间中耦接或与空间串联分析器耦接的混合方法。空间串联质谱仪包括离子源、前体离子活化装置和至少两个非捕获质量分析器。可以设计特定m/z分离功能,以便在仪器的一个区段中选择离子,在中间区域解离,并且然后将产物离子传输到另一个分析器中进行m/z分离和数据采集。在时间串联质谱仪中,离子源中产生的离子可以在同一个物理设备中被捕获、分离、片段化和m/z分离。
由质谱仪鉴定的肽可用作代表完整蛋白质及其翻译后修饰的替代物。它们可以用于通过将实验和理论MS/MS数据相关联来进行蛋白质表征,所述理论数据由蛋白质序列数据库中可能的肽产生。表征可包括但不限于对蛋白质片段的氨基酸进行测序、确定蛋白质测序、确定蛋白质从头测序、定位翻译后修饰、或鉴别翻译后修饰、或相似性分析、或其组合。
如本文所用,术语“数据库”是指生物信息学工具,其提供针对数据库中的所有可能序列搜索未解释的MS-MS谱图的可能性。此类工具的非限制性实例为Mascot(http://www.matrixscience.com)、Spectrum Mill(http://www.chem.agilent.com)、PLGS(http://www.waters.com)、PEAKS(http://www.bioinformaticssolutions.com)、Proteinpilot(http://download.appliedbiosystems.com//proteinpilot)、Phenyx(http://www.phenyx-ms.com)、Sorcerer(http://www.sagenresearch.com)、OMSSA(http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/)、X!Tandem(http://www.thegpm.org/TANDEM/)、Protein Prospector(http://www.http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm)、Byonic(https://www.proteinmetrics.com/products/byonic)或Sequest(http://fields.scripps.edu/sequest)。
示例性实施方案
本文所公开的实施方案提供了用于快速表征样品中的蛋白质的组合物、方法和系统。
本公开提供了一种用于表征蛋白质的方法,其包括使包含所述蛋白质的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触,使用流动相洗涤所述树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液,以及使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述蛋白质。
本公开提供了一种用于表征抗体-药物缀合物的方法,其包括使包含所述抗体-药物缀合物的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触,使用流动相洗涤所述树脂以提供包含所述抗体-药物缀合物的洗脱液,以及使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述抗体-药物缀合物。
本公开提供了一种用于表征抗原-抗体复合物的方法,其包括使包含所述抗原-抗体复合物的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触,使用流动相洗涤所述树脂以提供包含所述抗原-抗体复合物的洗脱液,以及使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述抗原-抗体复合物。
在一些示例性实施方案中,所述色谱系统可以包括传统反相色谱(RP)、离子交换色谱(IEX)或正相色谱(NP)。
在一些示例性实施方案中,色谱树脂可以选自亲和色谱树脂、阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、亲和树脂、混合模式色谱树脂、疏水相互作用色谱树脂或尺寸排阻色谱树脂。
在一些示例性实施方案中,电喷雾电离质谱仪可为纳米电喷雾电离质谱仪。
在一些示例性实施方案中,电喷雾电离质谱仪可以耦接至具有色谱树脂的色谱系统。
在一些示例性实施方案中,电喷雾电离质谱仪可以在天然条件下运行。
在一些示例性实施方案中,色谱系统可以使用三路分流器耦接至电喷雾电离质谱仪。
在一些示例性实施方案中,色谱系统可以使用三路分流器耦接至紫外光检测器。
在一些示例性实施方案中,色谱系统可以使用三路分流器耦接至电喷雾电离质谱仪和紫外光检测器。
在一些示例性实施方案中,色谱系统可以使用三路分流器耦接至电喷雾电离质谱仪和紫外光检测器,其中电喷雾电离质谱仪为纳米电喷雾电离质谱仪。
在一些示例性实施方案中,色谱系统可以使用三路分流器耦接至电喷雾电离质谱仪和紫外光检测器,其中质谱仪为在天然条件下运行的电喷雾电离质谱仪。
在一些示例性实施方案中,色谱系统可以使用三路分流器耦接至电喷雾电离质谱仪和紫外光检测器,其中电喷雾电离质谱仪为在天然条件下的纳米电喷雾电离质谱仪。
在一些示例性实施方案中,通过洗涤树脂得到的包含蛋白质或抗原-抗体复合物或抗体-药物缀合物的洗脱液通过至少一个三路分流器以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速引入到紫外光检测器中。
在一些示例性实施方案中,用于洗涤的流动相具有约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速。
在一些示例性实施方案中,流动相可包含挥发性盐。在一些特定实施方案中,流动相可包含乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵或其组合。
在一些示例性实施方案中,所用流动相可以与质谱仪兼容。
在一些示例性实施方案中,流动相可具有约6.0-8.0的pH。
在一些示例性实施方案中,样品可以约10μg至约100μg蛋白质或抗原-抗体复合物或抗体-药物缀合物的量使用。
在一些示例性实施方案中,电喷雾电离质谱仪中的流速可为约10nL/min至约50nL/min。
在一些示例性实施方案中,电喷雾电离质谱仪可具有约0.8kV至约1.5kV的喷雾电压。
在一些示例性实施方案中,表征可包括鉴别和/或定量蛋白质。在一个方面,表征可包括蛋白质测序、蛋白质从头测序、鉴别翻译后修饰或相似性分析或其组合。在另一个方面,表征可包括定量蛋白质的相对丰度。
在一些示例性实施方案中,表征可包括鉴别和/或定量抗体-药物缀合物中的抗体。在一个方面,表征可包括蛋白质测序、蛋白质从头测序、鉴别翻译后修饰或相似性分析或其组合。在另一个方面,表征可包括定量抗体-药物缀合物中抗体的相对丰度。
在一些示例性实施方案中,表征可包括鉴别和/或定量抗原-抗体复合物中的抗体和/或抗原。在一个方面,表征可包括对抗体或抗原进行的蛋白质测序、蛋白质从头测序、鉴别翻译后修饰或相似性分析或其组合。在另一方面,表征可以包括定量抗原-抗体复合物中的抗体和/或抗原的相对丰度。
在一些示例性实施方案中,样品可包含至少两种蛋白质。
在一些示例性实施方案中,抗体-药物缀合物可包括位点特异性ADC或非位点特异性ADC。在一个方面,抗体-药物缀合物可包括通过抗体上的半胱氨酸或赖氨酸残基连接的非位点特异性ADC。在另一个方面,抗体-药物缀合物可包括通过天然氨基酸、非天然氨基酸、聚糖、短肽标签或其组合连接的位点特异性ADC。
在一些示例性实施方案中,电喷雾电离质谱仪可为串联质谱仪。
在一些示例性实施方案中,蛋白质可为治疗性抗体、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段、融合蛋白或其组合。在一个方面,抗体片段可包括Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd′片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在一些示例性实施方案中,蛋白质可为抗体的消化产物。消化产物可通过水解剂形成。消化产物可为产品相关杂质。
在一些示例性实施方案中,蛋白质可为生物制剂中存在的产品相关杂质。
在一些示例性实施方案中,蛋白质可具有在约4.5至约9.0范围内的pI。在一个方面,蛋白质可具有以下pI:约4.5、约5.0、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0。
在一个示例性实施方案中,样品可包含至少两种蛋白质。
应当理解,所述方法不限于上述蛋白质、杂质和柱中的任一种,并且可通过任何合适的方式进行用于鉴别或定量的方法。
在一些示例性实施方案中,本公开提供了一种系统,所述系统可包括具有色谱树脂的色谱柱100,其中所述色谱柱能够接收流动相和包含蛋白质的样品;以及电喷雾电离质谱仪110(参见图2)。
在一些示例性实施方案中,色谱柱100可具有选自以下的树脂:疏水相互作用色谱树脂、阴离子交换树脂、阴离子交换树脂、亲和色谱树脂、尺寸排阻色谱树脂、混合模式树脂或其组合。
在一些示例性实施方案中,电喷雾电离质谱仪110可能够与所述色谱柱100耦接。
在一些示例性实施方案中,电喷雾电离质谱仪110可能够在天然条件下运行。
在一些示例性实施方案中,电喷雾电离质谱仪110可为纳米电喷雾电离质谱仪。
在一些示例性实施方案中,电喷雾电离质谱仪110可为在天然条件下运行的纳米电喷雾电离质谱仪。
在一些示例性实施方案中,色谱柱100可能够使用三路分流器120耦接至电喷雾电离质谱仪100。
在一些示例性实施方案中,色谱柱100可能够使用三路分流器120耦接至紫外光检测器130。
在一些示例性实施方案中,色谱柱100可能够使用三路分流器120耦接至紫外光检测器130和电喷雾电离质谱仪110。
在一些示例性实施方案中,三路分流器120可能够不成比例地分流以允许从色谱柱100流动到紫外光检测器130和电喷雾电离质谱仪110。
在一些示例性实施方案中,所述系统可能够表征抗体-药物缀合物的药物与抗体比率。
在一些示例性实施方案中,所述系统可能够表征蛋白质。
在一些示例性实施方案中,所述系统可能够表征抗原-抗体复合物。
在图3中展示的系统的一个示例性实施方案中,柱后三路分流器用于启动UV/MS双重检测。低体积级分可以引导至MS,而高体积级分可以转移至UV检测器。检测几乎共享相同的保留时间。可以收集来自UV检测器的级分以进行样品回收。
图4中示出了根据一个示例性实施方案的设置的另一个图。
应当理解,所述系统不限于上述蛋白质、色谱柱、质谱仪、抗体-药物缀合物、抗原-抗体复合物中的任一种。
用数字和/或字母连续标记如本文提供的方法步骤并不意味着将方法或其任何实施方案局限于特定的指示顺序。
不同的出版物(包括专利、专利申请、公布的专利申请、登录号、技术文献和学术文章)在整个说明书中引用。这些引用的参考文献各自整体并出于所有目的以引用的方式并入本文。
通过参考以下实施例,将更充分地理解本公开,提供所述实施例以更详细地描述本公开。它们旨在说明而不应解释为限制本公开的范围。
实施例
方法和试剂。水购自Honeywell(Muskegon,MI)。乙酸铵购自Sigma-Aldrich(StLouis,MO)。1M Tris-HCl,pH 7.5购自Teknova(Hollister,CA)。熔融石英管(内径(ID)150μm,外径(OD)360μm)、3路连接器和套管购自IDEX(Oak Harbor,WA)。PicoTip EMITTERSilicaTip(FS360-20-10-D-20-7CT)购自New Objective(Woburn,MA)。ACQUITY UPLCProtein BEH SEC柱(1.7μm,4.6×300mm)购自Waters(Milford,MA)。热袋式色谱柱加热器购自Thermo-Fisher(Waltham,MA)。所有试剂在无需额外纯化的情况下使用。
在线SEC-纳米-ESI-MS分析。ACQUITY UPLC I类系统(Waters,Milford,MA)耦接至Q Exactive HF混合四极轨道阱质谱仪(Thermo Scientific,Bremen,Germany),以用于所有在线SEC-纳米-ESI-MS分析。ACQUITY UPLC Protein BEH SEC柱(1.7μm,4.6×300mm)被设定为30℃并且用于mAb和ADC分离。流动相为pH 6.8的100mM乙酸铵。每次分离为30分钟且流速为0.3mL/min,并且进样量设定为40μg。三路分流器(T型分流器)连接在SEC柱之后。熔融石英管(L:140cm,ID:150μm)和SilicaTip(L:5cm,ID:10μm)连接到T型分流器。高体积级分通过熔融石英管转移至UV检测器,而低体积级分通过SilicaTip转移至MS。以下MS参数用于在线SEC-纳米-ESI-MS数据采集。每次采集都是在样品注入后立即开始的25分钟。样品以使用3kV喷雾电压、200℃毛细管温度和70S-lens RF水平的正模式电离。源内CID被设定为75eV。在15K分辨率下获得全MS扫描,质量范围在m/z 2000-8000之间。将最大进样时间100ms、自动增益控制目标值3e6和10次微扫描用于全MS扫描。
数据分析。Protein Metrics Intact Mass软件用于原始数据去卷积。ThermoXcalibur Qual Browser用于提取离子色谱图分析。Microsoft Excel用于对ADC进行DAR计算。
实施例1.使用在线SEC-纳米-ESI-MS研究抗原-抗体相互作用
为了开发有效的抗体治疗剂,了解抗体结合如何影响靶蛋白的功能至关重要。
1.1在线SEC-纳米-ESI-MS仪器
SEC和MS技术通常用于表征蛋白质样品。SEC允许在使蛋白质结构变化最小化的条件下分离和表征蛋白质,而MS允许鉴别复杂样品中的单个组分。将SEC和MS的单个功能组合到单一平台中是非常期望的,但已证明是具有挑战性的,因为用于SEC分析的高流速和非挥发性盐与天然MS不兼容。为了克服此限制,通过使用柱后T型分流器分流来自SEC的洗脱液流来减少进入MS的溶剂和盐的摄入量(参见图3)。装置的图片示出在图4中。然后通过SilicaTip将T型分流器连接到MS,并通过熔融石英管并联连接到UV检测器。此安排能够对SEC洗脱液进行同时双重UV/MS检测。通过改变熔融石英管的长度和直径,可以调节通过SilicaTip进入MS的流速(例如较长/较窄的管可产生更高的阻力,从而导致通向SilicaTip和MS的流量增加)。采用4.6mm SEC柱使用0.3mL/min流速分离蛋白质样品。连接T型分流器和UV检测器且长度为140cm、内径为150μm的熔融石英管产生通向SilicaTip的约1μL/min理想流速。熔融石英管的长度和直径也使得UV和MS能够近乎同步地检测分子。
1.2抗原-抗体复合物
在天然MS条件下在先前报告的抗体(Qian Zhang等人,Epitope Mapping by HDX-MS Elucidates the Surface Coverage of Antigens Associated with High BlockingEfficiency of Antibodies to Birch Pollen Allergen,90 ANALYTICAL CHEMISTRY 11315–11323(2018))与重组Bet v 1和Bet v 1抗原之间形成复合物。
除了裸形式以外,如图5所示,对于Bet v 1观察到两种主要的糖基化形式,包括G2S1F和G2S2F。在与等摩尔量的Fab-1抗体一起孵育后,所有三种Bet v 1形式(裸形式、G2S1F和G2S2F)都结合Fab-1,作为一个抗原与一个Fab的复合物。在图5A中,单独Bet v 1抗原的去卷积天然MS谱图揭示了三种不同的Bet v 1物质:裸Bet v 1和两种主要的糖基化形式Bet v 1G2S1F和Bet v 1G2S2F。将Bet v 1抗原与等摩尔量的Bet v 1Fab-1抗体一起孵育证明,所有三种Bet v 1形式(裸形式、G2S1F和G2S2F)与Fab-1以一个抗原与一个Fab的比率形成复合物(图5B)。似乎糖基化不影响抗体/抗原复合物的形成,因为所有Bet v 1形式的MS信号的相对丰度在未结合条件与Fab-1结合条件之间是相似的。
为了进一步表征抗原-抗体相互作用,在MS和UV双检测平台上进行滴定实验。如图6所示,通过UV检查Bet v 1与Fab-1的几种不同比率。单独的Bet v 1(黑色)在8.5min时洗脱,而单独的Fab-1(蓝绿色)和Bet v 1:Fab-1复合物分别在9.8min和7.9min时洗脱。Bet v1:Fab-1复合物的化学计量揭示了1:1结合比率。对于过量的抗原或抗体,未观察到额外的化学计量。此外,将Bet v 1抗原与Fab-1以精确的1比1摩尔比混合可使游离抗原和抗体(蓝色)的量最小化。
虽然UV峰可表示溶液中单个蛋白质的相对丰度,但MS允许鉴别复杂样品中的单个组分。通过UV和MS双重检测,可以确定在同一UV峰内或跨不同UV峰共洗脱的所有物质。如图7所示,对7.9分钟洗脱的UV峰的MS分析揭示了由Fab-1与三种不同Bet v 1物质(裸物质、G2S1F和G2S2F)中的每一种结合所形成的三种不同复合物。发现在Fab-1与糖基化的Bet v1物质形成复合物之后洗脱出Fab-1:裸物质复合物,这可能归因于由聚糖所提供的更大流体动力学半径。使UV与MS之间的检测延迟最小化能够从UV检测器收集级分以进行样品回收。此方法尤其可用于确定抗原和/或抗体的裂解版本、修饰版本或突变版本是否保留结合而无需纯化所研究蛋白质的特定形式。
实施例2.使用在线SEC-纳米-ESI-MS表征半胱氨酸ADC
抗体药物缀合物(ADC)为高度强效的治疗剂,其可通过与抗体缀合将小分子药物特异性递送至靶组织(Debaene等人,Innova tive Native MS Methodologiesfor Antibody Drug Conjugate Charact erization:High Resolution Native MS andIM-MS for Average DAR and DAR Distribution Assessment,86ANALYTICAL CHEMISTRY106 74–10683(2014))。ADC的效力、功效和毒性在很大程度上取决于与每个抗体缀合的小分子药物的数量。因此,确定每个ADC的药物与抗体比率(DAR)可能至关重要。通过链间半胱氨酸进行缀合是用于将小分子药物缀合到抗体的最常用方法之一。对于基于链间半胱氨酸的ADC,未配对链间半胱氨酸残基可以通过使一级序列突变(位点特异性的基于链间半胱氨酸的缀合物)工程化或通过使抗体(随机的基于链间半胱氨酸的缀合物)部分还原来引入。工程化mAb的位点特异性缀合可更好地控制ADC的DAR,而对部分还原的mAb进行的缀合将产生更可变范围的DAR(零至八)。然而,仍有必要确定由任一种方法产生的ADC的DAR,以理解并解释这些药物缀合物的生物学效应。用于确定基于半胱氨酸的ADC的DAR的最常用方法是在还原/变性条件下通过HIC-UV(Laura R.Saunders等人,A DLL3-targeted antib ody-drug conjugate eradicates high-grade pulmonary neuroendocrine tumor-initiating cells in vivo,7SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE(2015)或RPLC-MS来进行。然而,最近,Debaene等人报告了一种与高分辨率天然MS和IM-MS联合用于平均DAR测量的离线脱盐SEC方法。天然MS分析是在不破坏完整分子的情况下分析半胱氨酸缀合的ADC的DAR的唯一方式。
1.1在线SEC-纳米-ESI-MS仪器
使用如1.1中所示的仪器。
1.2基于半胱氨酸的位点特异性缀合ADC
使用在线SEC-纳米-ESI-MS系统评估基于半胱氨酸的位点特异性缀合ADC的DAR。mAb重链上链间半胱氨酸的突变在mAb的轻链上引入了两个未配对的半胱氨酸,它们与药物缀合以产生DAR 2抗体物质。如图8所示,亲本mAb-1和ADC-1的原始谱图和去卷积谱图表明ADC样品中仅存在DAR 2形式。图8A-8C中的去卷积谱图显示各种聚糖存在于亲本mAb-1和缀合的ADC-1两者上。与非糖基化mAb-1一起,部分和完全糖基化mAb-1物质(具有G0F、G1F和G2F的各种组合)都与2种药物缀合。这些结果通过分析fabricator消化的mAb-1和ADC-1得到证实,如图9所示。已测试一些具有类似缀合化学的ADC,并且其仅显示DAR 2形式(数据未示出)。
1.3非位点特异性半胱氨酸缀合的ADC
除了分析位点特异性ADC以外,还研究了与部分还原mAb的链间半胱氨酸缀合的药物的DAR。使用类似化学方法产生的非位点特异性半胱氨酸缀合的ADC的原始谱图和去卷积谱图示出在图10中。用具有正常糖基化的未修饰亲本抗体产生ADC-2。亲本mAb-2(图10A-10B)和ADC-2(图10C-10D)的原始谱图和去卷积谱图显示ADC-2的DAR值在2-8之间变化。去卷积谱图还显示存在于mAb-2(图10B)和ADC-2(图10D)上的各种聚糖。
开发了使用双重紫外(UV)和MS检测的在线SEC-纳米电喷雾电离(纳米-ESI)-MS平台。此平台的效用通过检查非共价蛋白质相互作用,通过使用所述平台表征由滴定实验产生的抗原-抗体复合物并确定基于半胱氨酸的抗体-药物缀合物(ADC)的药物与抗体比率(DAR)来验证。此平台可容易修改,并且因此可适用于分析其他天然MS项目,例如单克隆抗体(mAb)电荷变体或大型聚集蛋白质复合物的表征。
三路分流器用于将SEC洗脱液不成比例地分流到MS和UV检测器,其中低体积级分引导到MS,而高体积级分引导到UV检测器。当前平台通过UV和天然MS实现互补双重检测且具有级分收集的可能性,并且可应用于抗原-抗体复合物的表征和链间半胱氨酸缀合ADC的DAR分析。对此在线SEC-纳米-ESI-MS平台的进一步修改(例如更改柱化学或使用QExactive UHMR仪器)将使其适用于其他应用,例如分析电荷变体或非常大的蛋白质复合物。本文所述的方法开启了将高盐分离技术(即HIC、WCX)与基于质谱的检测组合的可能性。总之,在线SEC-纳米-ESI-MS平台可广泛应用于分析用于各种应用的蛋白质生物制剂。
Claims (34)
1.一种用于表征蛋白质的方法,所述方法包括:
使包含所述蛋白质的样品与具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触;
使用流动相洗涤所述尺寸排阻色谱树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液;和
在天然条件下使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述电喷雾电离质谱仪耦接至具有所述尺寸排阻色谱树脂的所述色谱系统。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述电喷雾电离质谱仪为纳米电喷雾电离质谱仪。
4.如权利要求1所述的方法,其中使用至少一个三路分流器将所述电喷雾电离质谱仪耦接至具有所述尺寸排阻色谱树脂的所述色谱系统。
5.如权利要求1所述的方法,其中使用至少一个三路分流器将紫外光检测器耦接至具有所述尺寸排阻色谱树脂的所述色谱系统。
6.如权利要求5所述的方法,其中通过洗涤所述尺寸排阻色谱树脂得到的所述洗脱液通过所述至少一个三路分流器以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速引入到所述紫外光检测器中。
7.如权利要求1所述的方法,其中用于洗涤所述尺寸排阻色谱树脂的所述流动相包含乙酸铵。
8.如权利要求1所述的方法,其中用于洗涤所述尺寸排阻色谱树脂的所述流动相包含挥发性盐。
9.如权利要求1所述的方法,其中用于洗涤所述尺寸排阻色谱树脂的所述流动相具有约100mM的总浓度。
10.如权利要求1所述的方法,其中用于洗涤所述尺寸排阻色谱树脂的所述流动相具有约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速。
11.如权利要求1所述的方法,其中用于洗涤所述尺寸排阻色谱树脂的所述流动相具有约6.8的pH。
12.如权利要求1所述的方法,其中与所述色谱系统接触的包含所述蛋白质的所述样品的量为约10μg至约100μg。
13.如权利要求1所述的方法,其中所述蛋白质为抗体。
14.如权利要求1所述的方法,其中所述蛋白质为单克隆抗体。
15.如权利要求1所述的方法,其中所述蛋白质为治疗性抗体。
16.如权利要求1所述的方法,其中所述蛋白质为抗原-抗体复合物。
17.如权利要求1所述的方法,其中所述蛋白质包括抗体-药物缀合物中所包含的抗体。
18.如权利要求1所述的方法,其中通过洗涤所述尺寸排阻色谱树脂提供的所述洗脱液以小于约50μl/min的流速引入到所述电喷雾电离质谱仪中。
19.如权利要求1所述的方法,其中通过洗涤所述尺寸排阻色谱树脂提供的所述洗脱液引入到所述电喷雾电离质谱仪中,其中来自所述电喷雾电离的电喷雾的流速为约10nL/min至约50nL/min。
20.如权利要求1所述的方法,其中通过洗涤所述尺寸排阻色谱树脂提供的所述洗脱液引入到所述电喷雾电离质谱仪中,其中电喷雾的喷雾电压为约0.8kV至约1.5kV。
21.一种用于表征抗体-药物缀合物的方法,所述方法包括:
使包含所述抗体-药物缀合物的样品与具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触;
使用流动相洗涤所述尺寸排阻色谱树脂以提供包含所述抗体-药物缀合物的洗脱液;和
在天然条件下使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述抗体-药物缀合物。
22.如权利要求21所述的方法,其中所述抗体-药物缀合物为工程化的基于半胱氨酸的抗体-药物缀合物。
23.如权利要求21所述的方法,其中所述抗体-药物缀合物为非特异性的基于半胱氨酸的抗体-药物缀合物。
24.如权利要求21所述的方法,其中表征所述抗体-药物缀合物包括表征药物与抗体比率。
25.一种用于鉴别蛋白质的方法,所述方法包括:
使包含所述蛋白质的样品与具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触;
使用流动相洗涤所述尺寸排阻色谱树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液;和
在天然条件下使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述蛋白质。
26.一种用于定量蛋白质的方法,所述方法包括:
使包含所述蛋白质的样品与具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触;
使用流动相洗涤所述尺寸排阻色谱树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液;和
在天然条件下使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述蛋白质。
27.一种系统,其包括:
具有尺寸排阻色谱树脂的色谱柱,其中所述色谱柱能够接收流动相和包含蛋白质的样品,以及
电喷雾电离质谱仪,其中所述电喷雾电离质谱仪能够耦接至所述色谱柱,并且其中所述电喷雾电离质谱仪能够在天然条件下运行。
28.如权利要求27所述的系统,其中所述系统能够表征抗体-药物缀合物的药物与抗体比率。
29.如权利要求27所述的系统,其中所述色谱柱能够使用T型分流器耦接至所述质谱仪。
30.如权利要求27所述的系统,其中所述色谱柱还能够使用T型分流器耦接至紫外光检测器。
31.如权利要求27所述的系统,其中所述电喷雾电离质谱仪为纳米电喷雾电离质谱仪。
32.一种用于表征蛋白质的方法,所述方法包括:
使包含所述蛋白质的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触;
使用流动相洗涤所述色谱树脂以提供包含所述蛋白质的洗脱液;和
在天然条件下使用电喷雾电离质谱仪表征所述洗脱液中的所述蛋白质。
33.如权利要求32所述的方法,其中所述色谱树脂选自由以下组成的组:亲和色谱树脂、阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、亲和树脂、混合模式色谱树脂、疏水相互作用色谱树脂或尺寸排阻色谱树脂。
34.如权利要求32所述的方法,其中所述色谱系统选自反相色谱(RP)、离子交换色谱(IEX)或正相色谱(NP)。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201962796771P | 2019-01-25 | 2019-01-25 | |
US62/796,771 | 2019-01-25 | ||
PCT/US2020/014721 WO2020154465A1 (en) | 2019-01-25 | 2020-01-23 | Online chromatography and electrospray ionization mass spectrometer |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113301974A true CN113301974A (zh) | 2021-08-24 |
Family
ID=69726754
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202080008390.0A Pending CN113301974A (zh) | 2019-01-25 | 2020-01-23 | 在线色谱法和电喷雾电离质谱仪 |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US11630092B2 (zh) |
EP (1) | EP3914371A1 (zh) |
JP (1) | JP2022517776A (zh) |
KR (1) | KR20210118854A (zh) |
CN (1) | CN113301974A (zh) |
AU (1) | AU2020211998A1 (zh) |
BR (1) | BR112021012533A2 (zh) |
CA (1) | CA3125040A1 (zh) |
EA (1) | EA202192036A1 (zh) |
IL (1) | IL284844A (zh) |
MX (1) | MX2021008822A (zh) |
SG (1) | SG11202107294YA (zh) |
WO (1) | WO2020154465A1 (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019144199A1 (en) | 2018-01-29 | 2019-08-01 | Ion Opticks Research Pty Ltd | Capillary fitting |
CA3125040A1 (en) * | 2019-01-25 | 2020-07-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Online chromatography and electrospray ionization mass spectrometer |
CA3126719A1 (en) * | 2019-01-25 | 2020-07-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Quantitation and identification of dimers in co-formulations |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020037532A1 (en) * | 2000-05-05 | 2002-03-28 | Regnier Fred E. | Affinity selected signature peptides for protein identification and quantification |
CN101796408A (zh) * | 2007-06-29 | 2010-08-04 | 奎斯特诊断投资公司 | 用液相层析-质谱法分析体液内的氨基酸 |
CN105758953A (zh) * | 2016-02-29 | 2016-07-13 | 吉林大学 | 一种单克隆抗体药物糖基化修饰的质谱定量分析方法 |
CN107315053A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-11-03 | 南京威尔药业股份有限公司 | 一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法 |
CN108027371A (zh) * | 2015-07-07 | 2018-05-11 | 思齐乐 | 流感效力试验 |
CN108152513A (zh) * | 2011-09-29 | 2018-06-12 | 西雅图基因公司 | 蛋白偶联的试剂化合物的整体分子量测定 |
CN108603828A (zh) * | 2015-11-30 | 2018-09-28 | 因塔生物公司 | 用于样品表征的装置和方法 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6737634B2 (en) * | 2002-01-16 | 2004-05-18 | The University Of Chicago | Use of multiple optical vortices for pumping, mixing and sorting |
JP4861308B2 (ja) * | 2004-04-07 | 2012-01-25 | ジェネンテック, インコーポレイテッド | 抗体結合体の質量分析 |
JP4643290B2 (ja) * | 2005-01-31 | 2011-03-02 | ジーエルサイエンス株式会社 | 微小流量の流体制御方法及び装置 |
KR101358098B1 (ko) * | 2012-07-13 | 2014-02-05 | 재단법인 멀티스케일 에너지시스템 연구단 | 3차원 형상의 나노입자 조립 구조물 및 이를 이용한 가스센서 |
WO2016118821A1 (en) * | 2015-01-23 | 2016-07-28 | California Institute Of Technology | Integrated hybrid nems mass spectrometry |
US10180383B2 (en) * | 2016-03-31 | 2019-01-15 | Purdue Research Foundation | System and method for sensing and trapping nanoparticles with plasmonic nanopores |
US10500796B1 (en) * | 2016-04-20 | 2019-12-10 | Isac Lazarovits | Dynamic tissue microfabrication through digital photolithography system and methods |
US11215563B2 (en) * | 2016-06-29 | 2022-01-04 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Photonic apparatus, methods, and applications |
IT201600104601A1 (it) * | 2016-10-18 | 2018-04-18 | Menarini Silicon Biosystems Spa | Sistema microfluidico |
EP3425386B1 (en) * | 2017-07-07 | 2022-04-13 | Université de Strasbourg | Online apparatus for in-depth characterization of antibody drug conjugates |
AU2019215363A1 (en) * | 2018-01-31 | 2020-07-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | System and method for characterizing size and charge variant drug product impurities |
BR112020017726A2 (pt) * | 2018-03-02 | 2020-12-22 | Genzyme Corporation | Análise espectral multivariada e monitoramento de biofabricação |
BR112021008210A2 (pt) * | 2018-10-31 | 2021-08-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | método e sistema de identificação e quantificação de uma proteína |
US11318471B2 (en) * | 2019-01-23 | 2022-05-03 | The Hong Kong University Of Science And Technology | Method and system for optofluidic stretching of biological cells and soft particles |
CA3126719A1 (en) * | 2019-01-25 | 2020-07-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Quantitation and identification of dimers in co-formulations |
CA3125040A1 (en) * | 2019-01-25 | 2020-07-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Online chromatography and electrospray ionization mass spectrometer |
AU2020212040A1 (en) * | 2019-01-25 | 2021-07-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Protein a chromatography - electrospray ionization mass spectrometer |
-
2020
- 2020-01-23 CA CA3125040A patent/CA3125040A1/en active Pending
- 2020-01-23 CN CN202080008390.0A patent/CN113301974A/zh active Pending
- 2020-01-23 US US16/750,287 patent/US11630092B2/en active Active
- 2020-01-23 BR BR112021012533-7A patent/BR112021012533A2/pt unknown
- 2020-01-23 EA EA202192036A patent/EA202192036A1/ru unknown
- 2020-01-23 AU AU2020211998A patent/AU2020211998A1/en active Pending
- 2020-01-23 SG SG11202107294YA patent/SG11202107294YA/en unknown
- 2020-01-23 WO PCT/US2020/014721 patent/WO2020154465A1/en unknown
- 2020-01-23 KR KR1020217025479A patent/KR20210118854A/ko unknown
- 2020-01-23 MX MX2021008822A patent/MX2021008822A/es unknown
- 2020-01-23 EP EP20708302.3A patent/EP3914371A1/en active Pending
- 2020-01-23 JP JP2021539902A patent/JP2022517776A/ja active Pending
-
2021
- 2021-07-14 IL IL284844A patent/IL284844A/en unknown
-
2023
- 2023-03-06 US US18/117,634 patent/US11932684B2/en active Active
-
2024
- 2024-02-08 US US18/436,259 patent/US20240174737A1/en active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20020037532A1 (en) * | 2000-05-05 | 2002-03-28 | Regnier Fred E. | Affinity selected signature peptides for protein identification and quantification |
CN101796408A (zh) * | 2007-06-29 | 2010-08-04 | 奎斯特诊断投资公司 | 用液相层析-质谱法分析体液内的氨基酸 |
CN108152513A (zh) * | 2011-09-29 | 2018-06-12 | 西雅图基因公司 | 蛋白偶联的试剂化合物的整体分子量测定 |
CN108027371A (zh) * | 2015-07-07 | 2018-05-11 | 思齐乐 | 流感效力试验 |
CN108603828A (zh) * | 2015-11-30 | 2018-09-28 | 因塔生物公司 | 用于样品表征的装置和方法 |
CN105758953A (zh) * | 2016-02-29 | 2016-07-13 | 吉林大学 | 一种单克隆抗体药物糖基化修饰的质谱定量分析方法 |
CN107315053A (zh) * | 2017-05-31 | 2017-11-03 | 南京威尔药业股份有限公司 | 一种乳糖中有关物质的电喷雾检测器液相色谱分析方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ALEXANDRU C.LAZAR.ET AL: "使用与质谱联用的尺寸排阻色谱法分析免疫偶联物的组成", 《RAPID COMMUNICATIONS IN MASS SPECTROMETRY》 * |
MARKUS HABERGER.ET AL: "尺寸排阻色谱与天然质谱联用快速表征生物治疗性蛋白质", 《MABS》 * |
MARYANN L.ET AL: "在线尺寸排阻色谱-微电喷雾电离质谱法测定酶抑制剂对蛋白质四级结构的影响", 《AMERICAN SOCITY FOR MASS SPECTROMETRY》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20240174737A1 (en) | 2024-05-30 |
EA202192036A1 (ru) | 2021-10-18 |
EP3914371A1 (en) | 2021-12-01 |
US11630092B2 (en) | 2023-04-18 |
KR20210118854A (ko) | 2021-10-01 |
US20230204546A1 (en) | 2023-06-29 |
AU2020211998A1 (en) | 2021-07-22 |
MX2021008822A (es) | 2021-09-08 |
BR112021012533A2 (pt) | 2021-09-14 |
US11932684B2 (en) | 2024-03-19 |
IL284844A (en) | 2021-08-31 |
US20200240965A1 (en) | 2020-07-30 |
SG11202107294YA (en) | 2021-08-30 |
CA3125040A1 (en) | 2020-07-30 |
JP2022517776A (ja) | 2022-03-10 |
WO2020154465A1 (en) | 2020-07-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11932684B2 (en) | Online chromatography and electrospray ionization mass spectrometer | |
US11536725B2 (en) | Quantitation and identification of dimers in co-formulations | |
US20200240999A1 (en) | Protein a chromatography - electrospray ionization mass spectrometer | |
JP2023116475A (ja) | 液体クロマトグラフィー-質量分析を用いるタンパク質分析のシステムおよび方法 | |
US20240110924A1 (en) | Hydrophobic interaction chromatography-coupled native mass spectrometry for antibody analysis | |
US20230045769A1 (en) | Mass spectrometry-based strategy for determining product-related variants of a biologic | |
EA044417B1 (ru) | Количественное определение и идентификация димеров в совместных составах | |
KR20230066025A (ko) | 수소 교환 질량 분석법을 사용하는 결합 부위의 식별 방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |