KR20230066025A - 수소 교환 질량 분석법을 사용하는 결합 부위의 식별 방법 - Google Patents

수소 교환 질량 분석법을 사용하는 결합 부위의 식별 방법 Download PDF

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Abstract

수소 교환 질량 분석법을 사용하여 단백질 약학적 생산물과 숙주-세포 단백질 (HCP) 사이 결합 부위를 식별하는 방법이 제공된다. 본 출원은 또한 HCP에 의한 절단 또는 변형을 제거하기 위해 단백질 약학적 생산물을 변형시키는 방법을 제공한다. 이외에도, 본 출원은 HCP에 의한 절단 또는 변형을 제거하기 위해 단백질 약학적 생산물내 식별된 결합 부위를 차단시키는 방법을 제공한다.

Description

수소 교환 질량 분석법을 사용하는 결합 부위의 식별 방법
관련된 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 2020년 9월 11일 출원된, 미국 가특허 출원 번호 63/077,220의 이익 및 이에 대한 우선권을 주장하며, 이는 본원에 참조로 편입된다.
분야
본 발명은 일반적으로 수소 교환 질량 분석법을 사용하여 관심의 단백질 또는 단백질 약학적 생산물내 숙주-세포 단백질의 결합 부위를 식별하는 방법에 관한 것이다.
배경
잔여 숙주-세포 단백질 (HCP)의 존재는 특히 효소적 활성을 갖는 HCP의 존재 하에 생체약학적 생산물에 대하여 잠재적 안전 위험 그리고 제조에서의 문제를 야기시킬 수 있다. 재조합 DNA 기술이 숙주 세포에서 생체약학적 생산물을 생산하는데 널리 사용되었기 때문에, 불순물을 제거하여 고 순도를 갖는 생체약학적 생산물을 수득하는 것이 필요하다. 정제 생물공정을 실행한 후 임의의 잔여 불순물은 임상 연구를 실행하기 전에 허용가능하게 낮은 수준으로 존재해야 한다. 특히, 포유류 발현 시스템, 예를 들어, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 유래된 잔여 HCP는 생산물 안전, 품질 및 안정성을 손상시킬 수 있다. 때때로, 심지어 미량의 특정한 HCP는 면역원성 반응 또는 바람직하지 않은 변형을 야기시킬 수 있다. 따라서, 약물 생산물에서 그리고 제조 공정 동안 숙주 세포 단백질은 모니터링될 필요가 있다.
카르복시펩티다제 (G3H8V5)는, 약물 서브스턴스에서 흔히 식별됨에도 불구하고, 단클론성 항체의 무결성에 영향을 미치는 것으로 보고된 적이 없다. 본원에, 카르복시펩티다제는 Fd' 약물 서브스턴스에서 식별되고 Fd' 약물의 안정성에 관한 이의 효과는 설명된다. Fd' 약물내 카르복시펩티다제의 양은 또한 정량화되고, 결과는 10 ppm만큼 낮은 카르복시펩티다제의 존재가 Fd' 약물 안정성을 손상시킬 수 있음을 시사한다. 이 연구의 확장은 카르복시펩티다제 (G3H8V5)가 IgG1 또는 IgG4에 의해 조작된 재조합 단클론성 항체가 아닌, Fab 단백질의 안정성에 또한 영향을 미칠 수 있음을 시사한다.
한편, HCP와 mAb 사이 상호작용은 완전히 이해되지 않았다. 가장 흔히 허용된 개념은 HCP와 mAb 사이 비-특이적 결합 때문에 HCP가 mAb와 공용출한다는 것이다. 본원에, 수소-중수소 교환 질량 분석법 (HDX-MS)은 Fd' 약물과 카르복시펩티다제 사이 상호작용을 연구하는데 적용되고 카르복시펩티다제가 Fd' 약물을 절단하도록 허용한 특이적 결합 부위는 식별된다. 유사한 결합 부위는 조작자에 의해 절단된 Fab 단백질에서 또한 발견된다. 하지만, 특이적 결합 부위는 Fd' 융합 약물 및 mAb 약물에서 식별되지 않는다.
효소적 활성을 갖는 HCP 불순물을 식별 및 특징규명하는 방법에 대한 필요가 실재함이 인식될 것이다. 특히, 이들 방법은 HCP의 결합 및/또는 효소적 기전, 예컨대 단백질 약학적 생산물에서 HCP의 결합 부위의 식별을 조사할 수 있어야 한다. 이들 방법은 생체약학적 생산물에서 그리고 제조 공정 동안 샘플에서 효소적 HCP 불순물의 강하고, 신뢰성 있고 민감한 검출 및 특징규명을 제공해야 한다. 더욱이, 이들 방법은 단백질 약학적 생산물 변형을 기반으로 HCP의 효소적 활성을 제거 또는 차단할 수 있어야 한다.
개요
HCP 불순물의 허용가능한 수준 정의하기는 생물학적 처리 시스템을 사용하여 생체약학적 생산물을 제조하는데 중요한 문제가 되었다. HCP의 결합 및/또는 효소적 기전을 조사하기 위해 잔여 HCP 불순물을 식별 및 특징규명할 필요가 있다. 본 출원은 수소 교환 질량 분석법 (HX-MS), 예를 들어, 수소/중수소 교환 질량 분석법 (HDX-MS)을 사용하여 단백질 약학적 생산물에서 HCP의 결합 부위를 식별하는 방법을 제공한다. 본 출원은 또한 효소적 HCP에 의한 절단 또는 변형을 제거하기 위해 단백질 약학적 생산물을 변형시키는 방법을 제공한다. 이외에도, 본 출원은 HCP에 의한 절단 또는 변형을 제거하기 위해 식별된 결합 부위를 차단하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 관심의 단백질과 제2 단백질 사이 결합 부위를 식별하는 방법을 제공한다. 일부 예시적 구현예에서, 본 방법은 관심의 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플을 산화중수소와 인큐베이션하는 단계, 가수분해제를 샘플에 첨가하여 적어도 하나의 소화물을 가진 혼합물을 수득하는 단계, 질량 분석계를 사용하여 혼합물에서 적어도 하나의 소화물의 분자량 데이터를 결정하는 단계, 및 적어도 하나의 소화물의 분자량 데이터를 적어도 하나의 알려진 단백질 표준으로부터 수득된 데이터와 상관시키는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 제2 단백질은 숙주-세포 단백질이다. 일 양태에서, 샘플은 실온에서 약 60 초 내지 약 24 시간 동안 산화중수소와 인큐베이션된다. 또 다른 양태에서, 본 방법은 pH를 약 2.3으로 조정하고/하거나 온도를 약 0℃로 조정함으로써 샘플을 퀀칭하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 혼합물은 질량 분석계와 온-라인(on-line)된 것인 액체 크로마토그래피 시스템에 주사된다. 더욱 또 다른 양태에서, 질량 분석계는 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링된다.
일 양태에서, 제2 단백질은 관심의 단백질을 절단시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, 절단은 산성 잔기, 예컨대 아스파르테이트 잔기 또는 글루타메이트 잔기를 포함한다. 또 다른 양태에서, 절단은 관심의 단백질의 C-말단에서 발생한다. 또 다른 양태에서, 제2 단백질은 카르복시펩티다제이다. 일 양태에서, 제2 단백질은 세린형 카르복시펩티다제이다. 더욱 또 다른 양태에서, 관심의 단백질은 VEGF 결합 단백질 또는 VEGF 미니-트랩이다. 추가 양태에서, 관심의 단백질은 Fab 또는 F(ab')2이다. 일 양태에서, 관심의 단백질은 단백질 약학적 생산물, 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 또는 약물이다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 제2 단백질에 의한 관심의 단백질의 절단을 제거하기 위한 관심의 단백질을 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 예시적 구현예에서, 본 방법은 (a) 관심의 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플을 산화중수소와 인큐베이션하는 단계, 가수분해제를 샘플에 첨가하여 적어도 하나의 소화물을 가진 혼합물을 수득하는 단계, 질량 분석계를 사용하여 혼합물에서 적어도 하나의 소화물의 분자량 데이터를 결정하는 단계, 및 적어도 하나의 소화물의 분자량 데이터를 적어도 하나의 알려진 단백질 표준으로부터 수득된 데이터와 상관시키는 단계에 의해 관심의 단백질의 제2 단백질에 의한 절단 기전에서 포함된 잔기를 식별하는 단계; 및 (b) 제2 단백질에 의한 관심의 단백질의 절단을 제거하기 위해 식별된 잔기를 제2 잔기로 돌연변이시키는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 제2 단백질은 숙주-세포 단백질이다. 일 양태에서, 샘플은 약 60 초 내지 약 24 시간 동안 산화중수소와 인큐베이션된다. 또 다른 양태에서, 혼합물은 액체 크로마토그래피 시스템에 주사된다. 또 다른 양태에서, 액체 크로마토그래피 시스템은 질량 분석계와 온-라인된 것이다. 더욱 또 다른 양태에서, 질량 분석계는 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링된다. 한 양태에서, 제2 단백질은 관심의 단백질을 절단시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, 절단은 산성 잔기, 예컨대 아스파르테이트 잔기 또는 글루타메이트 잔기를 포함한다. 또 다른 양태에서, 절단은 관심의 단백질의 C-말단에서 발생한다. 또 다른 양태에서, 아스파르테이트 잔기는 염기성 아미노산 또는 중성 아미노산으로 돌연변이된다. 더욱 또 다른 양태에서, 글루타메이트 잔기는 염기성 아미노산 또는 중성 아미노산으로 돌연변이된다. 추가 양태에서, 제2 단백질은 카르복시펩티다제이다. 일 양태에서, 제2 단백질은 세린형 카르복시펩티다제이다. 또 다른 양태에서, 관심의 단백질은 VEGF 결합 단백질 또는 VEGF 미니-트랩이다. 일 양태에서, 관심의 단백질은 Fab 또는 F(ab')2이다. 또 다른 양태에서, 관심의 단백질은 단백질 약학적 생산물, 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 또는 약물이다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 제2 단백질에 의한 관심의 단백질의 절단을 제거하기 위해 관심의 단백질을 변형시키는 방법을 제공한다. 일부 예시적 구현예에서, 본 방법은 (a) 관심의 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플을 산화중수소와 인큐베이션하는 단계, 가수분해제를 샘플에 첨가하여 적어도 하나의 소화물을 가진 혼합물을 수득하는 단계, 질량 분석계를 사용하여 혼합물에서 적어도 하나의 소화물의 분자량 데이터를 결정하는 단계, 및 적어도 하나의 소화물의 분자량 데이터를 적어도 하나의 알려진 단백질 표준으로부터 수득된 데이터와 상관시키는 단계에 의해 관심의 단백질과 제2 단백질 사이 결합 부위를 식별하는 단계; 및 (b) 제2 단백질에 의한 관심의 단백질의 절단을 제거하기 위해 식별된 결합 부위를 차단하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 제2 단백질은 숙주-세포 단백질이다. 일 양태에서, 샘플은 약 60 초 내지 약 24 시간 동안 산화중수소와 인큐베이션된다. 일 양태에서, 혼합물은 액체 크로마토그래피 시스템에 주사된다. 일 양태에서, 액체 크로마토그래피 시스템은 질량 분석계와 온-라인된 것이다. 일 양태에서, 질량 분석계는 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링된다. 일 양태에서, 제2 단백질은 관심의 단백질을 절단시킬 수 있다. 일 양태에서, 절단은 산성 잔기, 예컨대 아스파르테이트 잔기 또는 글루타메이트 잔기를 포함한다. 또 다른 양태에서, 절단은 관심의 단백질의 C-말단에서 발생한다. 일 양태에서, 제2 단백질은 카르복시펩티다제이다. 일 양태에서, 제2 단백질은 세린형 카르복시펩티다제이다. 일 양태에서, 관심의 단백질은 VEGF 결합 단백질 또는 VEGF 미니-트랩이다. 일 양태에서, 관심의 단백질은 Fab 또는 F(ab')2이다. 일 양태에서, 관심의 단백질은 단백질 약학적 생산물, 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 또는 약물이다. 일 양태에서, 본 방법은 유전자 돌연변이, 녹아웃, 화학적 변형, 효소적 변형, 또는 이들의 조합을 사용하여 식별된 결합 부위를 차단시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 이들, 및 다른, 양태는 하기 설명 및 첨부된 도면과 함께 고려된 때 더 잘 인식될 것이고 이해될 것이다. 하기 설명은, 다양한 구현예 및 이들의 수많은 구체적 상세를 나타내는 동안, 예시로서 주어지고 제한되지 않는다. 많은 대체, 수정, 추가, 또는 재배열이 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있다.
도 1은 예시적 구현예에 따라 온전한 질량 분석법을 사용하여 0 일 (T0), 1 일 (T1), 4 일 (T4), 또는 8 일 (T8)을 포함하는 상이한 중간 시점에 HCP 불순물에 의해 VEGF 미니-트랩으로부터 C-말단 결실의 분석을 도시한다.
도 2는 예시적 구현예에 따라 HCP를 식별하기 위한 프로파일링 방법으로서 면역침전의 사용을 도시한다. 스트렙타비딘-코팅된 자기 비드 및 비오틴화된 항-HCP F550 항체는 예시적 구현예에 따라 HCP를 풍부화하는데 사용되었다.
도 3은 예시적 구현예에 따라 온전한 질량 분석법을 사용하여 상이한 중간 시점에 HCP 불순물에 의해 MAB1의 F(ab')2 단편으로부터 C-말단 결실의 분석을 도시한다. HCP 불순물은 예시적 구현예에 따라 VEGF 미니-트랩 샘플에 존재하였다.
도 4는 예시적 구현예에 따라 온전한 질량 분석법을 사용하여 상이한 중간 시점에 재조합 카르복시펩티다제에 의해 MAB1의 F(ab')2 단편으로부터 C-말단 결실의 분석을 도시한다.
도 5는 예시적 구현예에 따라 HX-MS의 분석 결과를 기반으로 VEGF 미니-트랩 및 카르복시펩티다제를 함유하는 단백질 복합체의 3-차원 구조를 도시한다. 강한 보호 영역은 VEGF 미니-트랩에서 식별되었고, 이는 예시적 구현예에 따라 카르복시펩티다제의 결합 부위를 나타냈다.
생체약학적 생산물의 제조 동안, 불순물을 제거하여 고 순도를 갖는 생체약학적 생산물을 수득하는 것이 필요하다. 약물 제형의 안정성은 제조, 보관, 운송, 취급 및 투여 동안 유지되어야 한다. 생체약학적 생산물에서 잔여 숙주 세포 단백질 (HCP)은 생산물 안정성 및 품질 손상으로 인해 환자에게 잠재적 안전 위험을 초래할 수 있다. 특히, 효소적 활성을 갖는 일부 HCP 불순물, 예컨대 프로테아제는 생체약학적 생산물의 바람직하지 않은 분해, 변형 또는 변경을 유발시킬 수 있다. 특정 효소적 HCP의 식별 및 제거는 생산물 안전 및 안정성을 보장하는데 중요하다. 효소적 반응의 작업 조건, 기질에서 효소적 결합 부위의 자리, 기질에서 절단/변형 부위의 자리, 및 효소적 반응의 결과, 예컨대 최종 생산물의 화학적 구조를 포함하는 효소적 HCP의 반응 기전을 이해하는 것이 중요하다.
본 출원은 HX-MS를 사용하여 단백질 약학적 생산물에서 HCP의 결합 부위를 식별하는 방법을 제공한다. 본 출원은 또한 효소적 HCP에 의한 단백질 약학적 생산물의 절단 또는 변형을 제거하기 위한 단백질 약학적 생산물을 변형시키는 방법을 제공한다. 본 출원의 방법은 효소적 HCP에 의한 절단 또는 변형을 제거하기 위해 단백질 약학적 생산물에서 식별된 잔기 돌연변이시키는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 여기서 식별된 잔기는 식별된 결합 및/또는 효소적 기전에서 포함된다. 이외에도, 본 출원은 효소적 HCP에 의한 절단 또는 변형을 제거하기 위한 식별된 결합 부위를 차단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 출원은 HX-MS를 사용하여 단백질 약학적 생산물에서 HCP의 결합 부위를 식별하는 방법을 제공한다. 본 출원의 방법은 단백질 약학적 생산물 및 HCP를 함유하는 샘플을 산화중수소와 인큐베이션하는 단계, 가수분해제를 샘플에 첨가하여 펩티드 혼합물을 수득하는 단계, 질량 분석계를 사용하여 펩티드 혼합물의 분자량 데이터를 결정하는 단계, 및 펩티드 혼합물의 분자량 데이터를 알려진 단백질 표준의 데이터로 분석/상관시키는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 펩티드 혼합물은 액체 크로마토그래피 시스템과 온-라인 커플링되는 질량 분석계에 의해 분석된다. 또 다른 양태에서, 본 출원은 효소적 HCP에 의한 단백질 약학적 생산물의 절단을 제거하기 위한 단백질 약학적 생산물을 변형시키는 방법을 제공한다. 단백질 약학적 생산물을 변형시키는 방법은 HCP의 절단 기전에서 포함되는 아미노산 잔기 식별하는 단계, 및 HCP에 의한 단백질 약학적 생산물의 절단을 제거하기 위해 식별된 잔기를 상이한 잔기로 돌연변이시키는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 단백질 약학적 생산물을 변형시키는 방법은 HCP의 결합 부위에서 포함되는 아미노산 잔기 식별하기, 및 HCP에 의한 단백질 약학적 생산물의 절단을 제거하기 위해 식별된 결합 부위 차단하기의 단계를 포함한다. 식별된 결합 부위 차단하기의 방법은 유전자 돌연변이, 녹아웃, 화학적 변형, 효소적 변형, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일 양태에서, HCP는 C-말단에서 단백질 약학적 생산물을 절단시킬 수 있는 세린형 카르복시펩티다제이다. 또 다른 양태에서, 세린형 카르복시펩티다제의 절단 기전은 산성 잔기, 예컨대 아스파르테이트 잔기 또는 글루타메이트 잔기를 포함한다. 더욱 또 다른 양태에서, 단백질 약학적 생산물은 VEGF 결합 단백질, VEGF 미니-트랩, Fab, F(ab')2, 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 또는 약물이다.
생체약학적 생산물의 품질, 효능 및 안전을 개선하는 것의 요구는 효소적 활성을 갖는 HCP 불순물을 식별 및 특징규명하는 것에 대한 증가하는 요구로 이어졌다. 본 개시내용은 상기 언급된 요구를 만족시키는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 예시적 구현예는 단백질 약학적 생산물과 HCP 사이 결합 부위를 식별하는, HCP에 의한 절단을 제거하기 위해 단백질 약학적 생산물을 변형시키는, 그리고 HCP에 의한 절단을 제거하기 위해 식별된 결합 부위를 차단하는 방법을 제공함으로써 상기 언급된 요구를 만족시킨다.
용어 "한"은 "적어도 하나의"를 의미하도록 이해되어야 하고; 용어 "약" 및 "대략"은 당업자에 의해 이해될 바와 같이 표준 변동을 허용하도록 이해되어야 하고; 범위가 제공되는 경우, 종점이 포함된다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "포함하다(include)", "포함한다(includes)", 및 "포함하는(including)"은 비-제한되도록 의미되고 각각 "포함하다(comprise)", "포함한다(comprises)", 및 "포함하는(comprising)"을 의미하도록 이해된다.
일부 예시적 구현예에서, 본 출원은 수소 교환 질량 분석법을 사용하여 관심의 단백질과 제2 단백질 사이 결합 부위를 식별하는 방법으로서, 관심의 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플을 산화중수소와 인큐베이션하는 단계, 가수분해제를 샘플에 첨가하여 적어도 하나의 소화물을 가진 혼합물을 수득하는 단계, 질량 분석계를 사용하여 혼합물에서 적어도 하나의 소화물의 분자량 데이터를 결정하는 단계, 및 적어도 하나의 소화물의 분자량 데이터를 적어도 하나의 알려진 단백질 표준으로부터 수득된 데이터와 상관시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 양태에서, 제2 단백질은 숙주-세포 단백질이다. 또 다른 양태에서, 관심의 단백질은 VEGF 결합 단백질, VEGF 미니-트랩, 또는 Fab 또는 F(ab')2이다. 추가 양태에서, 관심의 단백질은 단백질 약학적 생산물, 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 또는 약물이다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "수소 교환 질량 분석법", "HX-MS", "수소/중수소 교환 질량 분석법", 또는 "HDX-MS"는 질량 분석법 (MS)을 사용하여 단백질 분자에 중수소의 편입의 측정을 지칭한다. 산화중수소 (산화이중수소, D2O, 또는 중수)에 단백질 분자의 노출이 안정한 수소-결합이 부족한 비구조 영역(disordered region)의 아미드 H (수소)에서 아미드 D (중수소)로의 신속 교환, 예를 들면, 수소 교환 반응, 수소/중수소 교환 반응 또는 HDX 반응 실행을 유도할 수 있으므로, HX-MS는 용액내 단백질 분자의 구조적 및 동적 양태를 모니터링하는데 사용될 수 있다. 후속적으로, 질량 분석법 (MS)-기반 펩티드 맵핑은 개별 단백질 세그먼트의 질량 시프트를 측정하는데 사용될 수 있다. (Konermann 등, 단백질 구조 및 역학 연구를 위한 수소 교환 질량 분석법, Chem Soc Rev. March 2011, 40(3), 1224-1234 페이지) 수소 교환 반응을 퀀칭한 후, 단백질은 단백질분해되어 펩티드 혼합물을 수득한다. 후속적으로, 이들 펩티드내 중수소 교환의 자리 및 상대량은 MS를 사용하여 개별 펩티드의 질량 시프트를 기반으로 결정 및 분석될 수 있다. 중수소는 중성자 뿐만 아니라 양성자를 함유한다. 중수소 핵이 수소 핵보다 2배 만큼 무거우므로, 단백질 분자는 이의 수소가 중수소로 대체되는 때 더 무거워진다. 단백질 분자의 백본 아미드 수소 교환율 (H/D 교환율)의 측정은 단백질 구조, 역학, 및 상호작용에 관한 상세한 정보를 제공할 수 있다. 온전한 단백질 분자에 아미드 중수소의 편입은 MS의 전기분무 이온화 소스에 커플링된 액체 크로마토그래피를 사용하여 유래된 펩티드 혼합물을 분석함으로써 측정될 수 있다. 단백질 분자의 자연 구조 내에서, 수소 교환율은 몇배 정도 다양할 수 있다. 수소 교환율은 용매 접근성 및 수소 결합의 함수이다. 단백질 분자의 표면 상에서 아미드 수소는 물에 결합되고, 이는 높은 수소 교환율을 나타낸다. 단백질 분자의 안정한 2차 구조 내에서 자리잡은 아미드 수소는 낮은 수소 교환율을 나타낸다. (Johnson 등, 아포- 및 홀로-미오글로빈의 단백질 아미드 수소 교환의 질량 분석적 측정". Protein Science, 1994, 3 (12): 2411-2418)
본원에 사용된 경우에, 용어 "단백질"은 공유 결합된 아미드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함한다. 단백질은 "폴리펩티드"로서 당업계에서 일반적으로 알려진, 하나 이상의 아미노산 중합체 쇄를 포함한다. "폴리펩티드"는 아미노산 잔기, 관련된 자연 발생 구조적 변이체, 및 자연 발생 구조적 변이체 관련된 펩티드 결합을 통해 결합된 이들의 합성 비-자연 발생 유사체, 및 이들의 합성 비 자연 발생 유사체로 구성된 중합체를 지칭한다. "합성 펩티드 또는 폴리펩티드"는 비-자연 발생 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 합성 펩티드 또는 폴리펩티드는, 예를 들어, 자동화된 폴리펩티드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다. 다양한 고체상 펩티드 합성 방법은 당업자에 알려진다. 단백질은 하나 또는 여러 폴리펩티드를 함유하여 단일 기능 생체분자를 형성할 수 있다. 단백질은 임의의 생체-치료적 단백질, 조사 또는 요법에 사용된 재조합 단백질, 트랩 단백질 및 기타 키메라 수용체 Fc-융합 결합 분자, 키메라 단백질, 항체, 단클론성 항체, 다클론성 항체, 인간 항체, 및 이중특이적 항체를 포함할 수 있다. 또 다른 예시적 양태에서, 단백질은 항체 단편, 나노바디, 재조합 항체 키메라, 사이토카인, 케모카인, 펩티드 호르몬, 및 기타 등등을 포함할 수 있다. 단백질은 재조합 세포-기반 생산 시스템, 예컨대 곤충 바큘로바이러스 시스템, 효모 시스템 (예를 들면, 피치아(Pichia) sp.), 및 포유류 시스템 (예를 들면, CHO 세포 및 CHO 유도체 유사 CHO-K1 세포)을 사용하여 생산될 수 있다. 생체치료적 단백질 및 그들의 생산을 논의하는 검토의 경우, Darius Ghaderi 등,　Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation, 28　Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 147-176 (2012)을 참조한다. 일부 예시적 구현예에서, 단백질은 변형, 부가물, 및 기타 공유로 결합된 모이어티를 포함한다. 그들 변형, 부가물 및 모이어티는 예를 들어 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 글리칸 (예를 들면, N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 뉴라민산, N-아세틸글루코사민, 푸코스, 만노스 및 기타 단당류), PEG, 폴리히스티딘, FLAG 태그, 말토스 결합 단백질 (MBP), 키틴 결합 단백질 (CBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) myc-에피토프, 형광성 표지 및 기타 염료, 및 기타 등등을 포함한다. 단백질은 조성 및 용해도의 기준으로 분류될 수 있고 그래서 단순 단백질, 예컨대, 구형 단백질 및 섬유질 단백질; 접합된 단백질, 예컨대, 핵단백질, 당단백질, 점액단백질, 색소단백질, 인단백질, 금속단백질, 및 지단백질; 및 유래된 단백질, 예컨대, 1차 유래된 단백질 및 2차 유래된 단백질을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "가수분해제"는 단백질 분자의 소화를 수행할 수 있는 다수의 상이한 제제의 어느 하나 또는 조합을 지칭한다. 효소적 소화를 실시할 수 있는 가수분해제의 비-제한 예는 트립신, 엔도프로테이나제 Arg-C, 엔도프로테이나제 Asp-N, 엔도프로테이나제 Glu-C, 외막 프로테아제 T (OmpT), 화농연쇄상구균의 면역글로불린-분해 효소 (IdeS), 키모트립신, 펩신, 서모리신, 파파인, 프로나제, 및 아스페르길루스 사이토이(Aspergillus Saitoi)로부터 프로테아제를 포함한다. 비-효소적 소화를 실시할 수 있는 가수분해제의 비-제한 예는 고온, 마이크로파, 초음파, 고압, 적외선, 및 용매 (비-제한 예는 에탄올 및 아세토니트릴임)의 사용을 포함한다. 비-효소적 소화의 예는 또한 고정화된 효소 소화 (IMER), 자기 입자 고정화된 효소, 및 온-칩(on-chip) 고정화된 효소를 포함할 수 있다. 단백질 소화에 대하여 이용가능한 기법을 논의하는 검토의 경우 Linda Switzar, Martin Giera & Wilfried M. A. Niessen,　Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments, 12　Journal of Proteome Research　1067-1077 (2013)을 참조한다. 가수분해제의 하나 또는 조합은 펩티드 결합을 단백질 또는 폴리펩티드에서, 서열-특이적 방식으로 절단시켜, 더 짧은 펩티드의 예측가능한 수집을 생성할 수 있다. 단백질 분자를 소화시키는데 사용될 수 있는 몇몇 접근법은 이용가능하다. 샘플에서 단백질 분자의 소화를 위하여 널리 허용된 방법들 중 하나는 프로테아제의 사용을 포함한다. 많은 프로테아제는 이용가능하고 이들의 각각은 특이성, 효율성, 및 최적 소화 조건의 측면에서 그들의 고유한 특징을 갖는다. 프로테아제는 펩티드 내에 비-말단 또는 말단 아미노산에서 절단하는 프로테아제의 능력을 기반으로 분류된 경우에, 양쪽 엔도펩티다아제 및 엑소펩티다아제를 지칭한다. 대안적으로, 프로테아제는 또한 촉매화의 기전에 의해 분류된 경우에, 6개 별개 부류 - 아스파르트산, 글루탐산, 및 메탈로프로테아제, 시스테인, 세린, 및 트레오닌 프로테아제를 지칭한다. 용어 "프로테아제" 및 "펩티다제"는 펩티드 결합을 가수분해하는 효소를 지칭하기 위해 호환적으로 사용된다. 프로테아제는 특이적 및 비-특이적 프로테아제로 또한 분류될 수 있다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "특이적 프로테아제"는 펩티드의 특정 아미노산 측쇄에 펩티드 기질을 절단하는 능력을 가진 프로테아제를 지칭한다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "비-특이적 프로테아제"는 펩티드의 특정 아미노산 측쇄에 펩티드 기질을 절단하는 감소된 능력을 가진 프로테아제를 지칭한다. 절단 선호도는 단백질 서열에서 절단된 아미노산의 총 수에 대한 절단의 부위로서 특정한 아미노산의 수의 비를 기반으로 결정될 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "소화물"은 가수분해제를 사용하여 단백질의 하나 이상의 펩티드 결합 가수분해로부터 수득된, 유래된 생산물, 예컨대 펩티드를 지칭한다. 적절한 가수분해제를 사용하여 샘플에서 단백질의 가수분해 또는 소화, 예를 들어, 효소적 소화 또는 비-효소적 소화 실시하기에 대한 몇몇 접근법이 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "숙주-세포 단백질"은 숙주 세포에서 유래된 단백질을 포함하고 바람직한 관심의 단백질에 무관될 수 있다. 숙주-세포 단백질은 제조 공정에서 유래될 수 있는 공정-관련된 불순물일 수 있고 3개 주요 범주를 포함할 수 있다: 세포 기질-유래, 세포 배양-유래 및 다운스트림 유래. 세포 기질-유래 불순물은, 비제한적으로, 숙주 유기체에서 유래된 단백질 및 핵산 (숙주 세포 게놈, 벡터, 또는 총 DNA)을 포함한다. 세포 배양-유래 불순물은, 비제한적으로, 유도제, 항생제, 혈청, 및 기타 배지 구성요소를 포함한다. 다운스트림-유래 불순물은, 비제한적으로, 효소, 화학적 및 생화학적 처리 시약 (예를 들면, 브롬화시안, 구아니딘, 산화제 및 환원제), 무기 염 (예를 들면, 중금속, 비소, 비금속성 이온), 용매, 담체, 리간드 (예를 들면, 단클론성 항체), 및 기타 침출물을 포함한다.
본원에 사용된 경우에, "미니-트랩" 또는 "미니-트랩 결합 분자"는 미니-트랩을 생성하는데 사용될 수 있는 융합 결합 분자와 동일한 표적에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다. 이러한 미니-트랩은 (i) 키메라 폴리펩티드 뿐만 아니라 (ii) 비-공유적으로 또는 공유적으로, 예를 들어, 하나 이상의 디술피드 브릿지에 의해 결합되는 둘 이상의 폴리펩티드를 포함하는 다량체성 (예를 들면, 이량체성) 분자를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, "VEGF 미니-트랩" 또는 "VEGF 미니-트랩 결합 분자"는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)에 결합할 수 있고 VEGF (예를 들면, VEGF110, VEGF121 또는 VEGF165)의 억제에 의해 치료가능하거나 예방가능한 병태 및 질환 예컨대 혈관신생 눈 장애 및 암을 치료하기 또는 예방하기에 치료적으로 유용하다. 이러한 미니-트랩은 (i) 하나 이상의 VEGF 수용체 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩티드 뿐만 아니라 (ii) 비-공유로, 예를 들어, 하나 이상의 디술피드 브릿지에 의해 결합되는 둘 이상의 폴리펩티드를 포함하는 다량체성 (예를 들면, 이량체성) 분자를 포함한다. VEGF의 억제는, 예를 들어, VEGF 수용체에 결합하는 VEGF의 길항작용을 포함한다. 본 출원의 VEGF 미니-트랩의 VEGF 수용체 도메인 구성요소는 VEGFR1의 면역글로불린-유사 (Ig) 도메인 2 (Flt1) (R1D2), VEGFR2의 Ig 도메인 3 (Flk1 또는 KDR) (Flk1D3) (R2D3), 및/또는 VEGFR3의 Ig 도메인 3 (Flt4) (Flt1D3 또는 R3D3)을 포함한다. 본원에 지칭되는 Ig 도메인, 예를 들어, R1D2, R2D3, R2D4 및 R3D3은 완전 야생형 Ig 도메인 뿐만 아니라, 야생형 도메인의 기능적 특징을 실질적으로 보유하는, 예를 들어, VEGF 미니-트랩에 편입될 때 기능 VEGF 결합 도메인을 형성하는 능력을 보유하는 이들의 변이체를 포괄하도록 의도된다. 야생형 도메인과 실질적으로 동일한 기능적 특징을 보유할, 상기 Ig 도메인의 무수한 변이체가 수득될 수 있음이 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다. 일부 양태에서, 미니-트랩 결합 분자는 미니-트랩 결합 분자의 변이체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 경우에 "변이체" 또는 "결합 분자 변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형 또는 번역후 변형 덕분에 표적 결합 분자와 상이한 결합 분자를 포함할 수 있다. 변이체는 결합 분자 자체, 결합 분자를 포함하는 조성물, 또는 이를 인코딩하는 아미노 서열을 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 결합 분자 변이체는 모체 결합 분자와 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형, 예를 들어, 모체와 비교하여 약 1 내지 약 10개 아미노산 변형, 및 바람직하게는 약 1 내지 약 5개 아미노산 변형을 갖는다. 본원의 결합 분자 변이체 서열은 바람직하게는 모체 결합 분자 서열과 적어도 약 80% 상동성, 및 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 상동성을 소유할 것이다. 일부 양태에서, 미니-트랩 결합 분자는 융합 결합 분자를 소화시킴으로써 생성될 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "Fab" 또는 "F(ab')2"는 일부 특이적 항체 단편, 예컨대 프로테아제를 사용하여 생성되는 항체 단편을 지칭한다. 항체 단편의 생성에 적합한 프로테아제, 예컨대 Fab 또는 F(ab')2 단편, 또는 VEGF 미니-트랩 결합 분자는 엔도프로테이나제, 예컨대 트롬빈, 파파인, 피신, 시스테인 프로테아제 SpeB (FabULOUS) 또는 시스테인 프로테아제 IdeS (FabRICATOR®)를 포함한다. 바람직하게는 엔도프로테이나제는 시스테인 프로테아제 IdeS (FabRICATOR®)이다. 예를 들어, IdeS는 불변 서열 ELLGGPS의 2개 글리신 잔기 사이 힌지 영역에서 인간 IgG를 특이적으로 절단하고 SpeB는 서열 KTHTCPPC 내에서 트레오닌과 시스테인 사이 힌지 영역에서 절단한다. FabRICATOR® (Genovis #A0-FR1-020)는 상업적으로 이용가능하다.
본원에 사용된 경우에, "단백질 약학적 생산물"은 자연에서 완전히 또는 부분적으로 생물학적일 수 있는 활성 성분을 포함한다. 일 양태에서, 단백질 약학적 생산물은 펩티드, 단백질, 융합 단백질, 항체, 단클론성 항체, 이중특이적 항체, 항원, 백신, 펩티드-약물 접합체, 항체-약물 접합체, 단백질-약물 접합체, 세포, 조직, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 단백질 약학적 생산물은 펩티드, 단백질, 융합 단백질, 항체, 항원, 백신, 펩티드-약물 접합체, 항체-약물 접합체, 단백질-약물 접합체, 세포, 조직, 또는 이들의 조합의 재조합, 조작된, 변형된, 돌연변이된, 또는 절단된 버전을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호-연결된 4개 폴리펩티드 쇄, 2개 중 (H) 쇄 및 2개 경 (L) 쇄로 이루어지는 면역글로불린 분자를 지칭하도록 의도된다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 중쇄 불변 영역은 3개 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 함유한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 불변 영역은 1개 도메인 (CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은, 프레임워크 영역 (FR)이라고 하는, 더욱 보존되는 영역으로 산재된, 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 하는, 초가변성의 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된, 3개 CDR 및 4개 FR로 구성될 수 있다. 용어 "항체"는 임의의 아이소타입 또는 서브클래스의 양쪽 글리코실화된 및 비-글리코실화된 면역글로불린에 대한 참조를 포함한다. 용어 "항체"는, 비제한적으로, 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 창출 또는 단리된 것들, 예컨대 항체를 발현시키도록 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체를 포함한다. IgG는 항체의 서브세트를 포함한다.
용어 "항체"는, 본원에 사용된 경우에, 또한 전체 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 용어 항체의 "항원-결합 부문", 항체의 "항원-결합 단편", 및 기타 등등은, 본원에 사용된 경우에, 항원을 특이적으로 결합시켜 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성, 또는 유전적으로 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 임의의 적합한 표준 기법 예컨대 항체 가변 및 임의로 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조종 및 발현을 포함하는 단백질분해 소화 또는 재조합 유전적 조작 기법을 사용하여 전체 항체 분자에서 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 알려지고/지거나, 예를 들어, 상업적 출처, DNA 라이브러리 (예를 들면, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 용이하게 이용가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는, 예를 들어, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 구성으로 배열, 또는 코돈 도입, 시스테인 잔기 생성, 아미노산 변형, 부가 또는 결실 등을 하기 위해 화학적으로 또는 분자 생물학 기법을 사용하여 시퀀싱 및 조종될 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 어구 "이중특이적 항체"는 둘 이상의 에피토프를 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로 2개 상이한 중쇄를 포함하고, 각 중쇄는 상이한 에피토프를―어느 한쪽 2개 상이한 분자 (예를 들면, 항원) 상에서 또는 동일한 분자 상에서 (예를 들면, 동일한 항원 상에서) 특이적으로 결합한다. 이중특이적 항체가 2개 상이한 에피토프 (제1 에피토프 및 제2 에피토프)를 선택적으로 결합할 수 있다면, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화성은 일반적으로 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화성보다 적어도 1 내지 2 또는 3 또는 4배 더 낮을 것이고, 반대도 마찬가지이다. 이중특이적 항체에 의해 인식된 에피토프는 동일한 또는 상이한 표적 상 (예를 들면, 동일한 또는 상이한 단백질 상)에 있을 수 있다. 이중특이적 항체는, 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄를 조합시킴으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 상이한 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현시키는 세포에서 발현될 수 있다.
전형적 이중특이적 항체는 3개 중쇄 CDR을 각각 갖는 2개 중쇄, 이어서 CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인, 그리고 어느 한쪽 항원-결합 특이성을 부여하지 않지만 각 중쇄와 회합할 수 있는, 또는 각 중쇄와 회합할 수 있고 중쇄 항원-결합 영역에 의해 결합된 에피토프 중 하나 이상을 결합시킬 수 있는, 또는 각 중쇄와 회합할 수 있고 한쪽 또는 양쪽 에피토프에 중쇄의 또는 한쪽 또는 양쪽 결합하는 것을 가능하게 하는 면역글로불린 경쇄를 갖는다. BsAb는 2개 주요 부류, Fc 영역 (IgG-유사)을 갖는 것들 및 Fc 영역이 부족한 것들로 분할될 수 있고, 후자는 정상적으로 Fc를 포함하는 IgG 및 IgG-유사 이중특이적 분자보다 더 작다. IgG-유사 bsAb는 상이한 형식, 예컨대, 비제한적으로 트리오맙, 놉 인투 홀(knobs into holes) IgG (kih IgG), 크로스맙, 오르토-Fab IgG, 이중-가변 도메인 Ig (DVD-Ig), 투-인-원(two-in-one) 또는 이중 작용 Fab (DAF), IgG-단일-쇄 Fv (IgG-scFv), 또는 κλ-바디를 가질 수 있다. 비-IgG-유사 상이한 형식은 탠덤 scFv, 디아바디 형식, 단일-쇄 디아바디, 탠덤 디아바디 (TandAb), 이중-친화성 재표적화 분자 (DART), DART-Fc, 나노바디, 또는 독-앤드-록(dock-and-lock) (DNL) 방법에 의해 생산된 항체를 포함한다 (Gaowei Fan, Zujian Wang & Mingju Hao,　Bispecific antibodies and their applications, 8　Journal of Hematology & Oncology 130; Dafne Muller & Roland E. Kontermann,　Bispecific Antibodies,　Handbook of Therapeutic Antibodies 265-310 (2014)).
본원에 사용된 경우에, "항체 단편"은 온전한 항체의 한 부문, 예컨대, 예를 들어, 항체의 항원-결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예는, 비제한적으로, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디, dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 영역, 뿐만 아니라 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다. Fv 단편은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 조합이고, ScFv 단백질은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결되는 재조합 단일 쇄 폴리펩티드 분자이다. 일부 예시적 구현예에서, 항체 단편은 모체 항체와 동일한 항원에 결합하는 단편인 모체 항체의 충분한 아미노산 서열을 함유하고; 일부 예시적 구현예에서, 단편은 모체 항체의 것에 비교가능한 친화성을 가진 항원에 결합하고/하거나 항원에 대한 결합에 대하여 모체 항체와 경쟁한다. 항체 단편은 임의의 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생산될 수 있고/거나 부분적 항체 서열을 인코딩하는 유전자로부터 재조합으로 생산될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성적으로 생산될 수 있다. 항체 단편은 단일 쇄 항체 단편을 임의로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 단편은, 예를 들어, 디술피드 결합에 의해 함께 결합되는 다중 쇄를 포함할 수 있다. 항체 단편은 다분자성 복합체를 임의로 포함할 수 있다. 기능적 항체 단편은 전형적으로 적어도 약 50개 아미노산을 포함하고 더욱 전형적으로 적어도 약 200개 아미노산을 포함한다.
일 양태에서, 본 출원의 샘플은 실온에서 약 60 초 내지 약 24 시간 동안 산화중수소와 인큐베이션된다. 일 양태에서, 본 방법은 추가로 pH를 약 2.3으로 조정하고/하거나 온도를 약 0℃로 조정함으로써 샘플을 퀀칭하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 혼합물은 질량 분석계와 온-라인된 것인 액체 크로마토그래피 시스템에 주사된다. 일 양태에서, 질량 분석계는 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링된다. 또 다른 양태에서, 본 출원의 방법에서 질량 분석계는 전기분무 이온화 질량 분석계, 나노-전기분무 이온화 질량 분석계, 또는 삼중 사중극자 질량 분석계이고, 여기서 질량 분석계는 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링된다.
본원에 사용된 경우에, "질량 분석계"는 특이적 분자 종을 식별할 수 있고 그들의 정확한 질량을 측정할 수 있는 장치를 포함한다. 본 용어는 폴리펩티드 또는 펩티드가 검출 및/또는 특징규명을 위하여 용리될 수 있는 임의의 분자성 검출기를 포함하도록 의미된다. 질량 분석계는 3개 주요 파트를 포함할 수 있다: 이온 소스, 질량 분석기, 및 검출기. 이온 소스의 역할은 기상 이온을 생성하는 것이다. 분석물 원자, 분자, 또는 클러스터는 기상으로 전환될 수 있고 동시에 이온화될 수 있다(전기분무 이온화에서 처럼). 이온 소스의 선택은 적용에 크게 의존한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "전기분무 이온화" 또는 "ESI"는 용액내 어느 한쪽 양이온 또는 음이온이 용액을 함유하는 전기분무 바늘의 끝과 카운터 전극 사이 전위차 적용하기에서 비롯하는 고도로 하전된 액적의 스트림의 대기압에서 형성 및 탈용매화를 통해 기상으로 전환되는 분무 이온화의 공정을 지칭한다. 용액내 전해질 이온으로부터 기상 이온의 생산에서 일반적으로 3개 주요 단계가 있다. 이들은 다음과 같다: (a) ES 주입 팁에서 하전된 액적의 생산; (b) 기상 이온을 생산할 수 있는 작은 고도로 하전된 액적을 유발하는 용매 증발 및 반복된 액적 분해에 의한 하전된 액적의 수축; 및 (c) 기상 이온이 매우 작고 고도로 하전된 액적에서 생산되는 기전. 단계 (a)-(c)는 일반적으로 기구의 대기압 영역에서 발생한다. 일부 예시적 구현예에서, 전기분무 이온화 질량 분석계는 나노-전기분무 이온화 질량 분석계일 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "삼중 사중극자 질량 분석계"는, 충돌-유도 해리를 위한 세포로서 작용하기 위해 이들 사이 (비-질량 분해) 무선 주파수 (RF)-전용 사중극자를 가진, 직렬로 2개 사중극자 질량 분석기로 이루어지는 탠덤 질량 분석계를 지칭한다. 삼중 사중극자 질량 분석계에서, 펩티드 샘플은 MS 계기와 커플링된 액체 크로마토그래피 시스템에 주사된다. 제1 사중극자는 표적된 m/z를 가진 펩티드를 단리시키기 위해 질량 필터로서 사용될 수 있다. 제2 사중극자는 펩티드를 단편으로 파괴하기 위한 충돌 세포의 역할을 한다. 제3 사중극자는 초기 모체 펩티드로부터 특정된 m/z　단편에 대하여 제2 질량 필터의 역할을 한다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "탠덤 질량 분석법"은 샘플 분자 상에서 구조적 정보가 질량 선택 및 질량 분리의 다단계를 사용함으로써 수득될 수 있는 기법을 포함한다. 전제조건은 샘플 분자가 기상으로 전환될 수 있고 온전하게 이온화될 수 있다는 것 그리고 제1 질량 선택 단계 후 일부 예측가능한 및 제어가능한 방식으로 분리하도록 유도될 수 있다는 것이다. 다단계 MS/MS, 또는 MSn은 의미있는 정보를 수득할 수 있거나 단편 이온 신호가 검출될 수 있는 한 먼저 전구체 이온 (MS2)을 선택 및 단리하고, 이를 단편화하고, 1차 단편 이온 (MS3)을 단리하고, 이를 단편화하고, 2차 단편 (MS4)을 단리하고, 기타 등등으로써 수행될 수 있다. 탠덤 MS는 매우 다양한 분석기 조합으로 성공적으로 수행되었다. 특정 적용을 위하여 조합하기 위한 분석기는 많은 상이한 인자, 예컨대 감도, 선택성, 및 스피드, 뿐만 아니라 크기, 비용, 및 이용가능성에 의해 결정될 수 있다. 탠덤 MS 방법의 2개 주요 범주는 탠덤-인-스페이스 및 탠덤-인-타임이지만, 탠덤-인-타임 분석기가 공간에서 또는 탠덤-인-스페이스 분석기와 커플링되는 하이브리드가 또한 있다. 탠덤-인-스페이스 질량 분석계는 이온 소스, 전구체 이온 활성화 장치, 및 적어도 2개 비-포획 질량 분석기를 포함한다. 특정 m/z 분리 기능은 계기의 1 구획에서 이온이 선택되고, 중간 영역에서 해리되고, 생산물 이온이 그 다음 m/z 분리 및 데이터 획득을 위하여 또 다른 분석기로 전송되도록 설계될 수 있다. 탠덤-인-타임 질량 분석계에서 이온 소스에서 생산된 이온은 동일한 물리적 장치에서 포획, 단리, 단편화, 및 m/z 분리될 수 있다.
질량 분석계에 의해 식별된 펩티드는 온전한 단백질 및 그들의 번역후 변형의 대체 표현으로서 사용될 수 있다. 이들은 상관하는 실험적 및 이론적 MS/MS 데이터에 의해 단백질 특징규명에 사용될 수 있고, 후자는 단백질 서열 데이터베이스에서 가능한 펩티드로부터 생성된다. 특징규명은, 비제한적으로, 단백질 단편의 아미노산을 시퀀싱하는 단계, 단백질 시퀀싱을 결정하는 단계, 단백질 드 노보 시퀀싱을 결정하는 단계, 번역후 변형을 찾는 단계, 또는 번역후 변형을 식별하는 단계, 또는 비교가능성 분석, 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "액체 크로마토그래피 시스템" 또는 "크로마토그래픽 시스템"은 액체 또는 기체에 의해 운반된 화학적 혼합물이 주위에서 또는 고정된 액체상 또는 고체상에서 유동하는 경우 화학적 실체의 차별적 분포의 결과로서 성분으로 분리될 수 있는 공정을 지칭한다. 크로마토그래피의 비-제한 예는 전통적 역상 (RP), 이온 교환 (IEX), 혼합된 모드 크로마토그래피 및 순상 크로마토그래피 (NP)를 포함한다.
예시적 구현예
본원에 개시된 구현예는 HCP의 결합 및/또는 효소적 기전을 조사하기 위해 수소 교환 질량 분석법을 사용하여 단백질 약학적 생산물과 HCP 사이 결합 부위를 식별하는 방법을 제공한다.
일부 예시적 구현예에서, 본 출원은 수소 교환 질량 분석법을 사용하여 관심의 단백질과 제2 단백질 사이 결합 부위를 식별하는 방법으로서, 관심의 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플을 산화중수소와 인큐베이션하는 단계, 가수분해제를 샘플에 첨가하여 적어도 하나의 소화물을 가진 혼합물을 수득하는 단계, 질량 분석계를 사용하여 혼합물에서 적어도 하나의 소화물의 분자량 데이터를 결정하는 단계, 및 적어도 하나의 소화물의 분자량 데이터를 적어도 하나의 알려진 단백질 표준으로부터 수득된 데이터와 상관시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일 양태에서, 본 출원의 가수분해제는 트립신, 엔도프로테이나제 Arg-C, 엔도프로테이나제 Asp-N, 엔도프로테이나제 Glu-C, 외막 프로테아제 T (OmpT), 화농연쇄상구균의 면역글로불린-분해 효소 (IdeS), 키모트립신, 펩신, 서모리신, 파파인, 프로나제, 및 아스페르길루스 사이토이로부터의 프로테아제를 포함하는 효소적 소화를 수행할 수 있다.
일 양태에서, 본 출원의 제2 단백질은 HCP, 효소적 HCP, 카르복시펩티다제, 세린형 카르복시펩티다제, 또는 카르복시펩티다제 G3H8V5이다.
일 양태에서, 본 출원의 관심의 단백질은 VEGF 결합 단백질, VEGF 미니-트랩, 항체의 Fab 영역, 항체의 F(ab')2 영역, 단백질 약학적 생산물, 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 또는 약물이다.
일부 예시적 구현예에서, 본 출원의 방법은 실온에서 약 60 초 내지 약 24 시간 동안 산화중수소와 샘플 인큐베이션하는 단계 및 pH를 약 2.3으로 조정하고/하거나 온도를 약 0℃로 조정함으로써 샘플 퀀칭하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 출원의 방법은 약 60 초 내지 약 24 시간, 약 1 분, 약 2 분, 약 3 분, 약 5 분, 약 8 분, 약 10 분, 약 15 분, 약 20 분, 약 30 분, 약 40 분, 약 50 분, 약 55 분, 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 8 시간, 약 10 시간, 약 12 시간, 약 15 시간, 약 18 시간, 약 20 시간, 약 22 시간, 약 24 시간, 약 36 시간, 또는 약 72 시간 동안 관심의 단백질 및 제2 단백질을 함유하는 샘플을 산화중수소와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 본 출원의 방법은 실온에서, 약 18℃에서, 약 25℃에서, 약 30℃에서, 또는 약 37℃에서 약 60 초 내지 약 24 시간, 약 1 분, 약 2 분, 약 3 분, 약 5 분, 약 8 분, 약 10 분, 약 15 분, 약 20 분, 약 30 분, 약 40 분, 약 50 분, 약 55 분, 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 8 시간, 약 10 시간, 약 12 시간, 약 15 시간, 약 18 시간, 약 20 시간, 약 22 시간, 약 24 시간, 약 36 시간, 또는 약 72 시간 동안 관심의 단백질 및 제2 단백질을 함유하는 샘플을 산화중수소와 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 출원의 방법은 반응 혼합물의 pH를 약 2.3, 약 2.0, 약 2.1, 약 2.2, 약 2.4, 약 2.5, 약 2.6, 약 2.7, 약 2.8, 또는 약 2.9로 조정함으로써 샘플 퀀칭하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 본 출원의 방법은 반응 혼합물의 온도를 약 0℃, 약 1℃, 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 또는 약 5℃로 조정함으로써 샘플 퀀칭하는 단계를 포함한다.
본 방법이 임의의 전술한 HCP 불순물, 효소적 결합 부위, 수소 교환 질량 분석법, VEGF 결합 단백질, VEGF 미니-트랩, Fab 단편, F(ab')2 단편, 단백질 약학적 생산물, 펩티드, 단백질, 액체 크로마토그래피 시스템, 또는 질량 분석계에 제한되지 않음이 이해된다.
숫자 및/또는 문자로 본원에 제공된 경우에 방법 단계의 연속 표지화는 방법 또는 이의 임의의 구현예를 특정한 지시된 순서로 제한하도록 의미되지 않는다. 특허, 특허 출원, 공개된 특허 출원, 수탁 번호, 기술 논문 및 학술 논문을 포함하는 다양한 간행물이 명세서 전반에 걸쳐 인용된다. 이들 인용된 참고문헌의 각각은 참고로, 이 전체로 그리고 모든 목적으로 본원에 편입된다. 달리 기재되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 기술자에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 개시내용은 본 개시내용을 더욱 상세히 설명하기 위해 제공되는 하기 실시예를 참조로 더욱 완전히 이해될 것이다. 이들은 예시하기 위한 것이고 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1. 효소적 HCP의 식별 및 특징규명
VEGF 미니-트랩 및 HCP 불순물을 함유하는 샘플은 약 2 주 이상 동안 37℃에서 인큐베이션되었다. 시험 샘플은 상이한 중간 시점, 예컨대 0 일 (T0), 1 일 (T1), 4 일 (T4), 또는 8 일 (T8)에 수집되었고, 온전한 질량 분석법을 사용하여 분석되었다. 도 1은 온전한 질량 분석법을 사용하여 상이한 중간 시점에 VEGF 미니-트랩으로부터 C-말단 결실의 분석을 도시한다. 도 1에 도시된 대로, VEGF 미니-트랩으로부터의 1개 글리신 잔기 (G)의 결실은 시점 T1에서 관찰되었다. 글리신 (G), 류신-글리신 (LG) 및 류신-류신-글리신 (LLG)의 결실은 시점 T4에서 관찰되었다. 류신-류신-글리신 (LLG)의 결실은 시점 T8에서 관찰되었다. 데이터는 시점 T16까지 수집되었다. 추가 절단은 시점 T16에서 관찰되지 않았다. 결과는 효소적 HCP에 의해 VEGF 미니-트랩으로부터 C-말단 잔기의 단계화된 절단의 존재를 나타낸다.
면역침전은 VEGF 미니-트랩으로부터 단계화된 C-말단 결실을 유발시킨 HCP를 식별하기 위한 프로파일링 방법으로서 수행되었다. 스트렙타비딘-코팅된 다이나비드 (자기 비드) 및 비오틴화된 항-HCP F550 항체는 HCP를 풍부화하는데 사용되었다. 도 2는 HCP를 식별하기 위한 프로파일링 방법으로서 면역침전의 사용을 도시한다. 카르복시펩티다제 G3H8V5는 면역침전 및 LC-MS/MS 분석에 의해 VEGF 미니-트랩으로부터 C-말단 잔기의 단계화된 절단에 기여하는 것으로 식별되었다. 구체적으로, 5 μL의 1 M 아세트산은 10 mg의 단백질 샘플에 첨가되었고 실온에서 30 분 동안 인큐베이션되었다. 110 μL의 10x TBS 및 20 μL의 과량 1 M Tris-HCl (pH 8)은 첨가되어 pH를 7.5로 되돌렸고, 그 다음 25 μg의 F550 비오틴화된 항-HCP 항체는 각 샘플에 즉시 첨가되었다. 샘플은 밤새 4℃에 부드럽게 흔들면서 인큐베이션되었다. 1.5 mg의 자기 비드는 세척된 후 각 샘플에 첨가되었고 1x TBS에서 현탁되었고 2 시간 동안 부드럽게 회전하면서 실온에서 인큐베이션되었다. 비드는 그 다음 HBS-T 및 1x TBS로 세척되었고, 800 rpm으로 5 분 동안 2회 진탕함으로써 100 μL의 50% 아세토니트릴, MilliQ 수중 0.1 M 아세트산으로 용리되었다. 각 항체 샘플은 건조되었고 20 μL의 요소 변성 및 환원 용액 (8M 요소, 10 mM DTT, 0.1 M Tris-HCl, pH 7.5)에 재현탁되었고, 56℃에서 500 rpm으로 30 분 동안 인큐베이션되었다. 6 μL의 50 mM 요오도아세트아미드는 그 다음 각 샘플에 첨가되어 실온에서 어둠 속에 30 분 동안 혼합 및 반응시켰다. 50 μL의 20 ng/μL 트립신은 750 rpm으로 밤새 진탕하면서, 37℃에서 소화를 위하여 각 샘플에 첨가되었다. 소화된 샘플은 4 μL 10% 포름산으로 산성화되었고 20 μL는 LC-MS/MS 분석을 위하여 유리 바이알로 옮겨졌다. 나머지는 -80℃에 보관되었다.
카르복시펩티다제는 약물 서브스턴스에서 흔히 식별될 수 있는 HCP이다. 카르복시펩티다제 G3H8V5는 단백질 기질의 C-말단으로부터 3개 이하 아미노산 잔기를 잘라냄으로써 펩티드 결합의 가수분해를 촉매화시킬 수 있는 세린형 카르복시펩티다제이다. 카르복시펩티다제 G3H8V5의 절단 기전은 산성 잔기, 예컨대 아스파르테이트 잔기 또는 글루타메이트 잔기를 수반한다. 카르복시펩티다제 G3H8V5의 존재는 표 1에서 나타난 대로 면역침전 풍부화된 샘플 및 미풍부화된 샘플 둘 모두를 사용하여 추가로 정량화되었다. GAGHMVPTDKPR [m/z 633.32462+], LFPEYK [m/z 398.71562+] 및 LYQSMNSQYLK [m/z 687.83972+]를 포함하는, 최고 풍부도 G3H8V5의 3개 펩티드의 피크 면적을 사용하여 IP 풍부화후 카르복시펩티다제의 정량화를 위하여 스파이크-인된(spiked-in) hPLBD2 (숙주 단백질, 인간 추정 포스포리파제 B-유사 2) 펩티드 GLEDSYEGR [m/z 1139.36982+], QNLDPPVSR [m/z 1139.36902+] 및 SVLLDAASGQLR [m/z 1448.47352+]의 피크 면적과 비교하였으며 15 ppm의 농도를 나타냈다. 미풍부화된 샘플은 VEGF 미니-트랩 FLSTLTIDGVTR [m/z 661.86942+], SDQGLYTCAASSGLMTK [m/z 895.40842+] 및 SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGR [m/z 1397.66242+]의 최고 풍부도 3개 펩티드의 피크 면적과 비교하여 GAGHMVPTDKPR [m/z 633.32462+], LFPEYK [m/z 398.71562+] 및 LYQSMNSQYLK [m/z 687.83972+] 최고 풍부도 카르복시펩티다제의 3개 펩티드의 피크 면적을 사용하는 PRM 방법에 이어 직접 소화에 의해 정량화되었고, 24.5 ppm의 농도를 나타냈다.
Figure pct00001
실시예 2. VEGF 미니-트랩 샘플에서 카르복시펩티다제의 활성의 확인
VEGF 미니-트랩 샘플내 HCP 불순물로서 존재하는 카르복시펩티다제의 활성은 상이한 단백질 기질, MAB1의 F(ab')2 단편을 사용하여 추가로 확인되었다. 단클론성 항체 MAB1은 FabRICATOR®, 예를 들어, 시스테인 프로테아제 IdeS를 사용하여 소화되어 VEGF 미니-트랩과 유사한 C-말단 잔기를 공유한 특이적 F(ab')2 단편을 생성하였다. 시스테인 프로테아제 IdeS는 힌지 아래 특이적 부위에서 항체를 소화시켜 F(ab')2 및 Fc/2 단편을 생성할 수 있다. 이 특이적 F(ab')2 단편은 카르복시펩티다제에 의한 절단을 위한 기질의 역할을 할 수 있는 이의 C-말단에서 특정한 영역을 함유한다. VEGF 미니-트랩 샘플 및 MAB1의 F(ab')2 단편은 1:1의 비로 함께 혼합되었고, 여기서 VEGF 미니-트랩 샘플은 HCP 불순물을 함유하였다. 혼합물은 37℃에서 약 2 주 이상 동안 인큐베이션되었다. 시험 샘플은 상이한 중간 시점, 예컨대 0 일 (T0), 3 일 (T3), 5 일 (T5), 또는 10 일 (T10)에 수집되었고 온전한 질량 분석법을 사용하여 분석되었다. 도 3은 온전한 질량 분석법을 사용하여 상이한 중간 시점에서 MAB1의 F(ab')2 단편으로부터 C-말단 결실의 분석을 도시한다. 도 3에 도시된 대로, 글리신 (G), 류신-글리신 (LG) 및 페닐알라닌-류신-글리신 (FLG)의 결실은 상이한 분율로 시점 T3 및 T5에서 관찰되었다. 페닐알라닌-류신-글리신 (FLG)의 결실은 시점 T10에서 관찰되었다. 결과는 카르복시펩티다제에 의해 MAB1의 F(ab')2 단편으로부터 C-말단 잔기의 단계화된 절단의 존재를 나타낸다. 결과는 HCP 불순물내 카르복시펩티다제가 VEGF 미니-트랩 및 MAB1의 F(ab')2 단편 둘 모두의 C-말단을 잘라냈음을 나타내고, 여기서 HCP 불순물은 VEGF 미니-트랩 샘플에서 존재하였다.
MAB1의 F(ab')2 단편 및 재조합 카르복시펩티다제는 카르복시펩티다제의 잘라내기 기전의 추가 조사를 위하여 함께 혼합되었다. 혼합물은 37℃에서 약 2 주 동안 인큐베이션되었다. 시험 샘플은 상이한 중간 시점, 예컨대 0 일 (T0), 3 일 (T3), 5 일 (T5), 또는 10 일 (T10)에 수집되었고, 온전한 질량 분석법을 사용하여 분석되었다. 도 4는 온전한 질량 분석법을 사용하여 상이한 중간 시점에 재조합 카르복시펩티다제에 의해 MAB1의 F(ab')2 단편으로부터 C-말단 결실의 분석을 도시한다. 도 4에 도시된 대로, 글리신 (G), 류신-글리신 (LG) 및 페닐알라닌-류신-글리신 (FLG)의 결실은 상이한 분율로 시점 T3 및 T5에서 관찰되었다. 페닐알라닌-류신-글리신 (FLG)의 결실은 시점 T10에서 관찰되었다. 결과는 재조합 카르복시펩티다제에 의해 MAB1의 F(ab')2 단편으로부터 C-말단 잔기의 단계화된 절단을 나타낸다.
실시예 3. 수소 교환 질량 분석법 (HX-MS)을 사용하는 결합 부위 식별
수소 교환 질량 분석법 (HX-MS)은 카르복시펩티다제 G3H8V5의 결합 및 잘라내기 기전을 이해하기 위해 VEGF 미니-트랩내 카르복시펩티다제의 결합 부위를 식별하는데 사용되었다. VEGF 미니-트랩내 카르복시펩티다제 G3H8V5의 결합 부위의 자리 및 아미노산 서열은 추가로 조사되었다. 산화중수소에 단백질 분자의 노출이 안정한 수소-결합 (Konermann 등)이 부족한 비구조 영역 또는 보호 없는 영역에서 아미드 H에서 아미드 D로의 신속 교환을 유도할 수 있으므로, 단백질 분자의 특정 부위에 중수소의 편입의 측정은 질량 시프트로 인해 질량 분석법 (MS)을 사용하여 결정될 수 있다.
카르복시펩티다제를 포함하는 VEGF 미니-트랩 샘플은 수소 교환 반응, 예를 들어, 수소/중수소 교환 반응을 실행하기 위하여 산화중수소의 첨가로 용액내 제조되었다. 샘플은 실온에서 약 60 초 내지 약 24 시간 동안 산화중수소와 인큐베이션되었다. 후속적으로, 수소 교환 반응은 pH를 약 2.3으로 조정하고/하거나 온도를 약 0℃로 조정함으로써 퀀칭되었다. 수소 교환 반응을 퀀칭한 후, 샘플은 단백질분해, 예컨대 트립신 소화되어 펩티드 혼합물을 수득하였다. 펩티드 혼합물은 질량 분석계와 온-라인 커플링된 액체 크로마토그래피 시스템에 주사되었다. 펩티드 혼합물의 분자량 데이터는 분석되었고 결정되었다. 후속적으로, 펩티드 혼합물내 중수소 교환의 자리 및 상대량은 결정되었고 펩티드의 질량 시프트를 기반으로 MS를 사용하여 분석되었다. 중수소 핵이 수소 핵보다 2배 만큼 무거우므로, 펩티드 분자는 이의 수소가 중수소로 대체되는 때 더 무거워진다.
VEGF 미니-트랩 및 카르복시펩티다제를 함유하는 단백질 복합체의 백본 아미드 수소 교환율의 측정은 단백질 복합체의 구조, 역학, 및 상호작용을 조사하기 위해 수행되었다. 단백질 복합체의 구조 내에서, 수소 교환율이 용매 접근성 및 수소 결합의 함수이었으므로, 수소 교환율은 몇 배 정도 다양하였다. 단백질 복합체의 표면 상에서 아미드 수소는 높은 수소 교환율을 나타냈다. 단백질 복합체의 안정한 구조 내에서 2개 단백질 분자 사이 결합 부위에서 자리잡은 아미드 수소는 검출불가능한 또는 낮은 수소 교환율을 나타냈다. 단백질 분자의 영역이 묻힌 때, 이 영역에서 아미드 수소는 수소 교환으로부터 보호되었다. 도 5는 HX-MS의 분석 결과를 기반으로 VEGF 미니-트랩 및 카르복시펩티다제를 함유하는 단백질 복합체의 3-차원 구조를 도시한다. 도 5에 도시된 대로, 강한 보호 영역은 VEGF 미니-트랩에서 식별되었고, 이는 카르복시펩티다제의 결합 부위를 나타냈다. 결합 부위에서 수반된 아미노산은 LTIDGVTRSDQGLYTCA의 서열을 가진, VEGF 미니-트랩의 위치 170-186의 아미노산이었다. VEGF 미니-트랩내 글루타메이트 잔기는 카르복시펩티다제에 의해 VEGF 미니-트랩의 C-말단으로부터 3개 아미노산 잔기의 잘라내는 단계에서 이의 수반됨을 위하여 식별되었다.
카르복시펩티다제의 결합 부위 및 잘라내기 기전을 성공적으로 식별하는 것은 VEGF 미니-트랩의 C-말단 절단을 제거하는 방법을 개발하는 것을 초래할 수 있다. 절단 기전과 포함된 특정 글루타메이트 잔기는 염기성 또는 중성 아미노산으로 돌연변이되어 카르복시펩티다제에 의해 VEGF 미니-트랩의 절단을 제거할 수 있다. 이외에도, 식별된 결합 부위는 유전자 돌연변이, 녹아웃, 화학적 변형, 효소적 변형, 또는 이들의 조합을 사용하여 카르복시펩티다아제에 의한 VEGF 미니-트랩의 절단을 제거하기 위해 차단될 수 있다.
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Claims (48)

  1. 관심의 단백질과 제2 단백질 사이 결합 부위를 식별하는 방법으로서,
    관심의 단백질 및 상기 제2 단백질을 포함하는 샘플을 산화중수소와 인큐베이션하는 단계;
    가수분해제를 상기 샘플에 첨가하여 적어도 하나의 소화물을 가진 혼합물을 수득하는 단계;
    질량 분석계를 사용하여 상기 혼합물에서 상기 적어도 하나의 소화물의 분자량 데이터를 결정하는 단계; 및
    상기 적어도 하나의 소화물의 상기 분자량 데이터를 적어도 하나의 알려진 단백질 표준으로부터 수득된 데이터와 상관시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1 항에 있어서, 상기 제2 단백질이 숙주-세포 단백질인, 방법.
  3. 제1 항에 있어서, 상기 샘플이 약 60 초 내지 약 24 시간 동안 산화중수소와 인큐베이션되는, 방법.
  4. 제3 항에 있어서, 상기 샘플이 실온에서 인큐베이션되는, 방법.
  5. 제1 항에 있어서, pH를 약 2.3으로 조정함으로써 상기 샘플을 퀀칭하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제1 항에 있어서, 온도를 약 0 ℃로 조정함으로써 상기 샘플을 퀀칭하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제1 항에 있어서, 상기 혼합물이 액체 크로마토그래피 시스템에 주사되는, 방법.
  8. 제7 항에 있어서, 상기 액체 크로마토그래피 시스템이 질량 분석계와 온-라인(on-line)된 것인, 방법.
  9. 제7 항에 있어서, 질량 분석계가 상기 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링되는, 방법.
  10. 제1 항에 있어서, 상기 제2 단백질이 관심의 상기 단백질을 절단시킬 수 있는, 방법.
  11. 제10 항에 있어서, 상기 절단이 산성 잔기를 수반하는, 방법.
  12. 제10 항에 있어서, 상기 절단이 아스파르테이트 잔기 또는 글루타메이트 잔기를 수반하는, 방법.
  13. 제1 항에 있어서, 상기 제2 단백질이 카르복시펩티다제인, 방법.
  14. 제1 항에 있어서, 상기 제2 단백질이 세린형 카르복시펩티다제인, 방법.
  15. 제1 항에 있어서, 관심의 상기 단백질이 VEGF 결합 단백질 또는 VEGF 미니-트랩인, 방법.
  16. 제1 항에 있어서, 관심의 상기 단백질이 시스테인 프로테아제 IdeS를 사용하여 생성된 Fab 또는 F(ab')2인, 방법.
  17. 제1 항에 있어서, 관심의 상기 단백질이 단백질 약학적 생산물, 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 또는 약물인, 방법.
  18. 제2 단백질에 의해 관심의 단백질의 절단을 제거하기 위한 관심의 단백질을 변형시키는 방법으로서,
    관심의 상기 단백질 및 상기 제2 단백질을 포함하는 샘플을 산화중수소와 인큐베이션하고;
    가수분해제를 상기 샘플에 첨가하여 적어도 하나의 소화물을 가진 혼합물을 수득하고;
    질량 분석계를 사용하여 상기 혼합물에서 상기 적어도 하나의 소화물의 분자량 데이터를 결정하고;
    상기 적어도 하나의 소화물의 상기 분자량 데이터를 적어도 하나의 알려진 단백질 표준으로부터 수득된 데이터와 상관시킴으로써
    제2 단백질에 의한 관심의 단백질의 절단 기전에 수반된 잔기를 식별하는 단계; 및
    제2 단백질에 의한 관심의 단백질의 절단을 제거하기 위해 상기 식별된 잔기를 제2 잔기로 돌연변이시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  19. 제18 항에 있어서, 상기 제2 단백질이 숙주-세포 단백질인, 방법.
  20. 제18 항에 있어서, 상기 샘플이 약 60 초 내지 약 24 시간 동안 산화중수소와 인큐베이션되는, 방법.
  21. 제18 항에 있어서, 상기 혼합물이 액체 크로마토그래피 시스템에 주사되는, 방법.
  22. 제21 항에 있어서, 상기 액체 크로마토그래피 시스템이 질량 분석계와 온-라인된 것인, 방법.
  23. 제21 항에 있어서, 질량 분석계가 상기 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링되는, 방법.
  24. 제18 항에 있어서, 상기 제2 단백질이 관심의 상기 단백질을 절단할 수 있는, 방법.
  25. 제18 항에 있어서, 상기 절단이 산성 잔기를 수반하는, 방법.
  26. 제18 항에 있어서, 상기 절단이 아스파르테이트 잔기 또는 글루타메이트 잔기를 수반하는, 방법.
  27. 제26 항에 있어서, 상기 잔기가 아스파르테이트이고 염기성 아미노산 또는 중성 아미노산으로 돌연변이되는, 방법.
  28. 제26 항에 있어서, 상기 잔기가 글루타메이트이고 염기성 아미노산 또는 중성 아미노산으로 돌연변이되는, 방법.
  29. 제18 항에 있어서, 상기 제2 단백질이 카르복시펩티다제인, 방법.
  30. 제18 항에 있어서, 상기 제2 단백질이 세린형 카르복시펩티다제인, 방법.
  31. 제18 항에 있어서, 관심의 상기 단백질이 VEGF 결합 단백질 또는 VEGF 미니-트랩인, 방법.
  32. 제18 항에 있어서, 관심의 상기 단백질이 시스테인 프로테아제 IdeS를 사용하여 생성된 Fab 또는 F(ab')2인, 방법.
  33. 제18 항에 있어서, 관심의 상기 단백질이 단백질 약학적 생산물, 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 또는 약물인, 방법.
  34. 관심의 단백질의 제2 단백질에 의한 절단을 제거하기 위한 관심의 단백질을 변형시키는 방법으로서,
    관심의 상기 단백질 및 상기 제2 단백질을 포함하는 샘플을 산화중수소와 인큐베이션하고,
    가수분해제를 상기 샘플에 첨가하여 적어도 하나의 소화물을 가진 혼합물을 수득하고,
    질량 분석계를 사용하여 상기 적어도 하나의 소화물의 분자량 데이터를 결정하고,
    결합 부위를 식별하기 위해 상기 적어도 하나의 소화물의 상기 분자량 데이터를 적어도 하나의 알려진 단백질 표준으로부터 수득된 데이터와 상관시킴으로써
    관심의 상기 단백질과 제2 단백질 사이 결합 부위를 식별하는 단계; 및
    상기 제2 단백질에 의한 관심의 상기 단백질의 절단을 제거하기 위해 상기 식별된 결합 부위를 차단시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  35. 제34 항에 있어서, 상기 제2 단백질이 숙주-세포 단백질인, 방법.
  36. 제34 항에 있어서, 상기 샘플이 약 60 초 내지 약 24 시간 동안 산화중수소와 인큐베이션되는, 방법.
  37. 제34 항에 있어서, 상기 혼합물이 액체 크로마토그래피 시스템에 주사되는, 방법.
  38. 제37 항에 있어서, 상기 액체 크로마토그래피 시스템이 질량 분석계와 온-라인된 것인, 방법.
  39. 제37 항에 있어서, 질량 분석계가 상기 액체 크로마토그래피 시스템에 커플링되는, 방법.
  40. 제34 항에 있어서, 상기 제2 단백질이 관심의 상기 단백질을 절단할 수 있는, 방법.
  41. 제34 항에 있어서, 상기 절단이 산성 잔기를 수반하는, 방법.
  42. 제34 항에 있어서, 상기 절단이 아스파르테이트 잔기 또는 글루타메이트 잔기를 수반하는, 방법.
  43. 제34 항에 있어서, 상기 제2 단백질이 카르복시펩티다제인, 방법.
  44. 제34 항에 있어서, 상기 제2 단백질이 세린형 카르복시펩티다제인, 방법.
  45. 제34 항에 있어서, 관심의 상기 단백질이 VEGF 결합 단백질 또는 VEGF 미니-트랩인, 방법.
  46. 제34 항에 있어서, 관심의 상기 단백질이 시스테인 프로테아제 IdeS를 사용하여 생성된 Fab 또는 F(ab')2인, 방법.
  47. 제34 항에 있어서, 관심의 상기 단백질이 단백질 약학적 생산물, 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 항체의 Fab 영역, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 또는 약물인, 방법.
  48. 제34 항에 있어서, 유전자 돌연변이, 녹아웃, 화학적 변형, 효소적 변형, 또는 이들의 조합을 사용하여 상기 식별된 결합 부위를 차단시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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