KR20210120042A

KR20210120042A - 공제형에서 이량체의 정량화 및 식별

Info

Publication number: KR20210120042A
Application number: KR1020217026949A
Authority: KR
Inventors: 위에티안 얀; 순하이 왕
Original assignee: 리제너론 파아마슈티컬스, 인크.
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2020-01-23
Publication date: 2021-10-06
Also published as: BR112021014427A2; JP2022518254A; EP3914908A1; US11536725B2; MX2021008823A; US20230070556A1; IL284829A; US20240210414A1; CN113348364A; WO2020154525A1; SG11202107588YA; US20200240998A1; AU2020212022A1; CA3126719A1; US11899023B2

Abstract

온라인 크로마토그래피와 전기분무 이온화 질량 분석법을 사용하여 이량체 종을 식별하는 방법 및 시스템이 제공된다. 또한, 면역침전과 액체 크로마토그래피-질량 분석법을 사용하여 이종이량체 종을 정량화하는 방법 및 시스템이 제공된다.

Description

공제형에서 이량체의 정량화 및 식별

본 발명은 일반적으로 온라인 크로마토그래피 및 전기분무 이온화 질량 분석법을 사용하여 이량체 종을 식별하고, 면역침전 및 액체 크로마토그래피-질량 분석법을 사용하여 이종이량체 종을 정량화하기 위한 방법 및 시스템에 관한 것이다.

단백질 바이오 의약품은 암, 자가면역 질환, 감염 및 심장 대사 장애의 치료를 위한 중요한 약물로 부상했으며, 제약 산업에서 가장 빠르게 성장하는 제품 부문 중 하나이다.

2개 이상의 치료용 단클론 항체(mAb) 및/또는 활성 단백질을 하나의 최종 약물 제품으로 공제형화하는 전략은 최근에 많은 인기를 얻어 효능 증가, 전반적인 부작용 감소 및 환자 편의성 및 순응도 개선을 포함한 여러 이점을 제공하고 있다. 단일 제형으로 2개의 서로 다른 mAb 및/또는 활성 단백질을 제형화하는 것은 문제가 될 수 있으며, 절충을 나타낼 수 있는 부형제 및 조건을 선택하는 것을 포함한다. 제형 개발에 대한 과제 외에도, 공제형화 약물은 또한 분석 특성화에 중요한 과제를 제시한다. 예를 들어, 일반 저장 또는 스트레스 조건하에 공제형화된 약물에 존재하는 다양한 이량체 형태의 차별화 및 정량화는 어려울 수 있으며, 크기 배제 크로마토그래피와 같은 전통적인 방법으로는 종종 달성할 수 없다.

공제형화된 제제를 포함하는 단백질 바이오 의약품은 매우 높은 순도 기준을 충족해야 한다. 따라서 약물 개발, 생산, 저장 및 취급의 여러 단계에서 공제형화된 약물의 모든 불순물을 모니터링하는 것이 중요할 수 있다. 특성화 분석을 위한 분석 방법은 원하는 제품을 검출하고 정량화하기에 충분한 정확도와 분해능을 나타내야 한다. 직접 분석은 분석을 위해 충분히 많은 양의 제품을 분리해야 할 수 있으며, 이는 바람직하지 않으며 선택된 경우에만 가능했다.

공제형화된 제제를 특성화하기 위한 방법 및/또는 시스템에 대한 당 업계의 오랜 요구가 있다.

단백질 바이오 의약품의 개발, 제조 및 판매가 증가함에 따라 가능한 불순물과 함께 단백질 바이오 의약품 특성화에 대한 수요가 증가하고 있다. 안정한 공제형화 제제의 개발은 항체 혼합물에 존재하는 개별 단백질의 안정성 및 분해를 결정해야 하기 때문에 추가적인 문제를 제기한다. 이러한 결정은 종종 제형 내 많은 수의 단백질, 이종이량체 종의 형성, 동종이량체 종 및 이러한 단백질 간의 유사성으로 인해 어렵다.

본원에 개시된 예시적인 구현예는 이량체 종을 식별하고/하거나 이종이량체 종을 정량화하기 위한 방법 및/또는 시스템을 제공함으로써 전술한 요구를 충족시킨다.

본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 이량체 종을 식별하는 방법을 제공한다. 하나의 예시적인 구현예에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 이량체 종을 포함하는 샘플을 크로마토그래피 수지가 있는 크로마토그래피 시스템에 접촉시키고, 이동상을 사용하여 상기 수지를 세정하여 이량체 종을 포함하는 용리액을 제공하고, 전기분무 이온화 질량 분석기를 사용하여 상기 용리액에서 이량체 종을 식별하는 단계를 포함한다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 크기 배제 크로마토그래피 수지가 있는 크로마토그래피 시스템을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 크로마토그래피 수지가 있는 크로마토그래피 시스템에 전기분무 이온화 질량 분석기를 결합시키는 것을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 전기분무 이온화 질량 분석기를 결합시키는 것을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 기본 조건하에 작동하는 전기분무 이온화 질량 분석기를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 나노-전기분무 이온화 질량 분석기를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 기본 조건하에 작동하는 나노-전기분무 이온화 질량 분석기를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 수지가 있는 크로마토그래피 시스템에 전기분무 이온화 질량 분석기를 결합시키는 적어도 3개의 경로가 있는 적어도 하나의 스플리터를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 수지가 있는 크로마토그래피 시스템에 자외선 검출기를 결합시키는 적어도 3개의 경로가 있는 적어도 하나의 스플리터를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 수지가 있는 크로마토그래피 시스템에 자외선 검출기와 전기분무 이온화 질량 분석기를 결합시키는 적어도 3개의 경로가 있는 적어도 하나의 스플리터를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 크기 배제 크로마토그래피 수지가 있는 크로마토그래피 시스템에 전기분무 이온화 질량 분석기를 결합시키는 적어도 3개의 경로가 있는 적어도 하나의 스플리터를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 크기 배제 크로마토그래피 수지가 있는 크로마토그래피 시스템에 자외선 검출기를 결합시키는 적어도 3개의 경로가 있는 적어도 하나의 스플리터를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 크기 배제 크로마토그래피 수지가 있는 크로마토그래피 시스템에 자외선 검출기와 전기분무 이온화 질량 분석기를 결합시키는 적어도 3개의 경로가 있는 적어도 하나의 스플리터를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 이동상을 사용하여 수지를 세정하여 이량체 종을 포함하는 용리액을 제공하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 용리액은 약 0.2 mL/분 내지 약 0.4 mL/분의 유속으로 적어도 3개의 경로가 있는 적어도 하나의 스플리터를 통해 자외선 검출기에 도입될 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 휘발성 염을 포함하는 이동상을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 아세트산암모늄을 포함하는 이동상을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 약 0.2 mL/분 내지 약 0.4 mL/분의 유속으로 수지를 이동상으로 세정하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 pH가 약 6.8인 이동상을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 이량체 종을 약 10 μg 내지 약 100 μg의 양으로 포함하는 샘플을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 항체를 포함하는 이량체 종을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 융합 단백질을 포함하는 이량체 종을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 유속이 약 10 nL/분 내지 약 50 nL/분인 전기분무 이온화 질량 분석기를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 전기분무의 분무 전압이 약 0.8 kV 내지 약 1.5 kV인 전기분무 이온화 질량 분석기를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종이 동종이량체 종일 수 있는 이량체 종을 식별하는 방법.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종이 이종이량체 종일 수 있는 이량체 종을 식별하는 방법.

이 구현예의 일 측면에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 이량체 종을 포함하는 샘플을 크로마토그래피 수지가 있는 크로마토그래피 시스템에 접촉시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 샘플은 단백질 단량체를 포함할 수 있다.

본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 컬럼을 포함하는 시스템을 제공한다. 하나의 예시적인 구현예에서, 상기 시스템은 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 컬럼, 및 전기분무 이온화 질량 분석기를 포함하며, 여기서 크로마토그래피 컬럼은 이동상과 단백질을 포함하는 샘플을 수용할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 상기 시스템은 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 컬럼을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 상기 시스템은 상기 크로마토그래피 컬럼에 결합될 수 있는 전기분무 이온화 질량 분석기를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 상기 시스템은 기본 조건하에 실행할 수 있는 전기분무 이온화 질량 분석기를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 상기 시스템은 나노 전기분무 이온화 질량 분석기를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 상기 시스템은 적어도 3개의 경로가 있는 스플리터를 사용하여 질량 분석기에 결합될 수 있는 크로마토그래피 컬럼을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 상기 시스템은 적어도 3개의 경로가 있는 스플리터를 사용하여 자외선 검출기에 결합될 수 있는 크로마토그래피 컬럼을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 상기 시스템은 적어도 3개의 경로가 있는 스플리터를 사용하여 자외선 검출기와 질량 분석기에 결합될 수 있는 크로마토그래피 컬럼을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 상기 시스템은 이량체 종을 식별할 수 있다.

본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 샘플과 상기 항체를 인큐베이션하고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루(flow through)를 수집하고, 침전된 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플 및 처리된 플로우 스루의 적어도 일부를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 혼합물을 분석하여 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함한다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 단백질은 단클론 항체일 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 고체 표면은 자기 비드를 포함한다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 고체 표면은 스트렙트아비딘을 포함한다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 침전된 샘플은 고체 표면상의 제1 단백질에 특이적인 항체에 결합된 이종이량체 종을 포함한다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 침전된 샘플은 고체 표면상의 제1 단백질에 특이적인 항체에 결합된 이종이량체 종으로 구성된다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 침전된 샘플을 재현탁하고, 재현탁된 침전 샘플을 가열하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 플로우 스루를 제1 화합물로 처리하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 제1 화합물은 제2 화합물의 동위원소일 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 적어도 일부를 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 적어도 일부를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 혼합물을 분해하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 적어도 일부를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 혼합물을 분해하고, 분해된 혼합물을 탈당화하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 적어도 일부를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 혼합물을 분해하고, 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 혼합물을 분석하여 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 적어도 일부를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 혼합물을 분해하고, 분해된 혼합물을 탈당화하고, 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 혼합물을 분석하여 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 분석하여 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 질량 분석기는 탠덤 질량 분석기일 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플에 환원제를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 플로우 스루에 환원제를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 약 10%를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 혼합물을 분석하여 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 약 10%를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 혼합물을 분해하고, 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 혼합물을 분석하여 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.

본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 이종이량체 종을 정량화하는 방법을 제공한다. 하나의 예시적인 구현예에서, 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 이종이량체 종을 면역침전시키고, 안정한 동위원소 표지 방법에 이어서 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함한다.

이 구현예의 일 측면에서, 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 항체를 포함하는 이종이량체 종을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 융합 단백질을 포함하는 이종이량체 종을 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면상의 항체를 사용하여 이종이량체 종을 면역침전시키는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면상의 항체를 사용하여 이종이량체 종을 면역침전시키는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 항체는 이종이량체의 단백질에 결합할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 알킬화 화합물과 함께 안정한 동위원소 표지 방법을 사용하는 단계를 포함할 수 있다.

이 구현예의 일 측면에서, 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 안정한 동위원소 표지 방법을 사용하는 것 외에도 분해를 수행하는 단계를 포함할 수 있다.

도 1은 이량체 종을 식별할 수 있는 시스템의 예시적인 구현예를 보여준다.
도 2는 공제형화 제제의 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 데 사용되는 방법의 예시적인 구현예를 보여준다.
도 3은 예시적인 구현예에 따른 음성 샘플에서 항체에 대한 단백질의 비특이적 결합을 정량화하는 방법을 보여준다.
도 4는 공제형화 제제의 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 데 사용되는 방법의 예시적인 구현예를 보여준다.
도 5는 3개의 단클론 항체를 포함하는 공제형에 존재할 수 있는 6개의 이량체를 보여준다.
도 6은 예시적인 구현예에 따른 기본 SEC-MS 분석을 사용한 3개의 단클론 항체를 포함하는 공제형에서 이종이량체 종의 식별을 보여준다.
도 7은 예시적인 구현예에 따른 기본 SEC-MS 분석을 사용한 3개의 단클론 항체를 포함하는 공제형에서 이종이량체 종의 정량화를 보여준다.
도 8은 단클론 항체와 융합 단백질을 포함하는 공제형에 존재할 수 있는 3개의 이량체를 보여준다.
도 9는 예시적인 구현예에 따라 차별화된 공제형의 추출된 이온 크로마토그램 (XIC)을 보여준다.
도 10은 예시적인 구현예에 따라 차별화된 공제형의 이량체 종의 질량 대 전하 비율 결정을 보여준다.
도 11은 예시적인 구현예에 따른 이종이량체 정량화를 위한 면역침전 및 동위원소-표지 전략의 워크플로우를 보여준다.
도 12는 예시적인 구현예에 따른 차가운 백색 스트레스 공제형 및 음성 샘플에 대해 수득된 풀다운 및 플로우 스루 분획의 질량 대 전하 비율을 보여준다.
도 13은 상이한 조건하에 스트레스가 가해진 샘플에서 발견된 융합 단백질 1의 4개의 펩티드에서 융합 단백질 1 이종이량체 %에 대한 차트를 도시하며, 여기서 정량화는 예시적인 구현예에 따라 수행되었다.
도 14는 상이한 조건하에 스트레스가 가해진 샘플에서 융합 단백질 1 펩티드 1 (가벼운 및 무거운 단편 둘 다)의 질량 대 전하 비율의 차트를 도시하며, 여기서 융합 단백질 1을 포함하는 이종이량체의 정량화는 예시적인 구현예에 따라 수행되었다.
도 15는 상이한 조건하에 스트레스가 가해진 샘플에서 융합 단백질 1 펩티드 2 (가벼운 및 무거운 단편 둘 다)의 질량 대 전하 비율의 차트를 도시하며, 여기서 융합 단백질 1을 포함하는 이종이량체의 정량화는 예시적인 구현예에 따라 수행되었다.
도 16은 상이한 조건하에 스트레스가 가해진 샘플에서 융합 단백질 1 펩티드 3 (가벼운 및 무거운 단편 둘 다)의 질량 대 전하 비율의 차트를 도시하며, 여기서 융합 단백질 1을 포함하는 이종이량체의 정량화는 예시적인 구현예에 따라 수행되었다.
도 17은 상이한 조건하에 스트레스가 가해진 샘플에서 융합 단백질 1 펩티드 4 (가벼운 및 무거운 단편 둘 다)의 질량 대 전하 비율의 차트를 도시하며, 여기서 융합 단백질 1을 포함하는 이종이량체의 정량화는 예시적인 구현예에 따라 수행되었다.
도 18은 융합 단백질 1 이종이량체 %를 이종이량체 %로 전환하기 위한 계산을 나타내며, 여기서 융합 단백질 1을 포함하는 이종이량체의 정량화는 예시적인 구현예에 따라 수행되었다.
도 19는 희석 없이 시험된 샘플에서 융합 단백질 이종이량체 %로 정규화된 시험된 샘플에서 융합 단백질 1 이종이량체 %의 차트를 도시하며, 여기서 융합 단백질 1을 포함하는 이종이량체의 정량화는 예시적인 구현예에 따라 수행되었다.
도 20은 융합 단백질 1을 정량화하기 위해 사용된 3개의 펩티드에 대한 혼합 샘플에서 융합 단백질 1 이종이량체 % 대 차가운-백색 스트레스 샘플 %의 플롯을 도시하며, 여기서 융합 단백질 1을 포함하는 이종이량체의 정량화는 예시적인 구현예에 따라 수행되었다.
도 21은 주변 조건에서 보관된 공제형화 제제로부터의 샘플에서의 융합 단백질 1 이종이량체 %를 도시하며, 여기서 융합 단백질 1을 포함하는 이종이량체의 정량화는 예시적인 구현예에 따라 수행되었다.

단백질 바이오 의약품 내 단백질의 식별 및 정량화는 제품의 생산 및 개발 동안 매우 중요할 수 있다. 모든 단백질 바이오 의약품 내 불순물의 분석은 안전하고 효과적인 제품을 개발하는 데 필수적일 수 있다. 따라서, 불순물을 특성화하는 강력한 방법 및/또는 작업 흐름이 도움이 될 수 있다.

대부분의 바이오 의약품은 단일 단백질을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단일 표적 또는 조합으로 투여되는 다중 표적에 대한 다중 단백질은 이의 진단 또는 치료 징후 및 효능을 개선할 수 있다. 이러한 공제형화된 제제의 개발은 점점 더 대중적인 투여 형태가 되고 있다(Svend Havelund et al.,　Investigation of the Physico -Chemical Properties that Enable Co-Formulation of Basal Insulin Degludec with Fast-Acting Insulin Aspart, 32　Pharmaceutical Research　2250-2258 (2015); Sanjay Kalra & Yashdeep Gupta,　Injectable Coformulations in Diabetology, 6　Diabetes Therapy101-111 (2015); Ryzodeg,　European Medicines Agency - Find medicine - Raxone, https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/ryzodeg (last visited Jan 17, 2019)).

그러나 공제형화된 제제의 개발은 잠재적인 약력학적 상호작용, 잠재적인 약동학적 상호작용, 독성학적 상호작용 가능성, 내인성 수준 또는 활성의 변화 가능성, 및 약물 중 하나의 효능을 손상시킬 가능성을 연구해야 하기 때문에 몇몇 문제가 있다(Claudia Mueller, Ulrike Altenburger & Silke Mohl,　Challenges for the pharmaceutical technical development of protein coformulations, 70　Journal of Pharmacy and Pharmacology　666-674 (2017)). 안정한 공제형화된 제제의 제조는 또한 다양한 제조 단계에서 2개 이상의 단백질의 안정성을 보장하기 위한 추가 노력이 필요할 수 있다.

저장, 운송 및 투여 동안, 최종 공제형화된 제품은 빛, 열 및 산소에 노출되어 응집(고분자량 종 동종이량체(들) 및/또는 이종이량체(들)), 전하 패턴, 단편화, 화학적 변형(예를 들어 산화, 탈아미드화) 등를 일으킬 수 있다.

우수한 분석 방법 성능 및 감도는 최종 공제형화 제품의 높은 품질과 안전성을 보장하는 데 중요하다. 그러나 공제형화 제제의 개발 및 평가를 위한 분석적 접근법은 단일 단백질을 활성 제약 성분(active pharmaceutical ingredient)으로 포함하는 제형에 적용되는 접근법보다 상당히 어렵고 복잡할 수 있다. 단일 단백질을 포함하는 제형에 사용되는 특정 표준 방법이 공제형화 제제에서 항상 단백질을 차별화할 수 있는 것은 아니기 때문에 이는 어려울 수 있다.

하나의 방법은 생명공학 산업에서 생체 분자 응집 및 단편화를 특성화하기 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC)의 사용을 포함한다(Hong Paule et al., Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates, 35 Journal of Liquid Chromatography and Related Technology 2923-2950 (2012)). SEC에 의한 분자 분리는 고정상에서 제어된 다공성 구조를 갖는 분자의 차별적 상호작용에 의존한다. SEC는 용액에서 단백질의 고유 구조를 보존하는 완충 조건을 사용하므로 이의 고유 형태를 방해하지 않고 생체 분자의 특성을 규명할 수 있다. 또한, SEC와 결합될 수 있는 다양한 검출 모드 중에서, 질량 분석법(MS)을 사용하면 복잡한 샘플의 개별 구성 요소를 정밀하고 정확하게 식별할 수 있다. SEC 피크 수집 후 직접 주입 MS 또는 온라인 SEC-MS를 포함하여, SEC와 MS의 조합이 이전에 보고되었다(

et al.,　Mass Spectrometric Analysis of Intact Human Monoclonal Antibody Aggregates Fractionated by Size-Exclusion Chromatography, 27　Pharmaceutical Research　2197-2204 (2010);

Debaene et al.,　Innovative Native MS Methodologies for Antibody Drug Conjugate Characterization: High Resolution Native MS and IM -MS for Average DAR and DAR Distribution Assessment, 86　Analytical Chemistry　10674-10683 (2014)) (Khaja Muneeruddin et al.,　Characterization of Small Protein Aggregates and Oligomers Using Size Exclusion Chromatography with Online Detection by Native Electrospray Ionization Mass Spectrometry, 86　Analytical Chemistry　10692-10699 (2014); C. F. Mcdonagh et al.,　Engineered antibody-drug conjugates with defined sites and stoichiometries of drug attachment, 19　Protein Engineering Design and Selection　299-307 (2006)). 그러나 SEC 분리로부터 생성된 고 유량을 직접 이온화하려면 종종 기본 MS 분석과 호환되지 않는 가혹한 이온화 조건이 필요하므로 비공유 상호작용 분석을 위해 이러한 기술을 결합하는 유용성이 제한된다. 또한, 질량 분석기의 감도는 SEC 버퍼에 사용되는 높은 염 농도로 인해 어려움을 겪을 수 있다.

식별 외에도, 공제형화 제품에서 형성된 이종이량체(들)의 정량화는 또한 문제를 일으킬 수 있는데, 형성되는 이종이량체(들)의 양이 단백질 단량체 및 존재하는 임의의 동종이량체(들)의 존재 하에 평가되어야 하기 때문이다.

기존 방법의 한계를 고려하여, 이량체 종의 식별 및 정량화를 위한 효과적이고 효율적인 방법이 개발되었다.

달리 설명되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 이제 특정 방법 및 재료가 설명된다. 언급된 모든 간행물은 본원에 참조로 포함된다.

용어 "하나"("a")는 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 하며; 용어 "약" 및 "대략"은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 표준 편차를 허용하는 것으로 이해되어야 하고; 범위가 제공되는 경우, 종점이 포함된다.

일부 예시적인 구현예에서, 본 개시내용은 공제형화 제제에서 이량체 종을 식별하는 방법을 제공한다.

본원에 사용된 바와 같이, "공제형화 제제"는 단일 투여 형태로 2개 이상의 활성 제약 성분을 포함한다. 이 투여 형태는 상이한 분자 표적을 표적화하여 특정 질환 상태를 치료, 예방 또는 개선하는 데 사용될 수 있으며, 단일 약물(들) 단독에 비해 부가 및/또는 상승작용 효과로 인해 환자의 전반적으로 개선된 의학적 상태를 얻을 수 있다 (Claudia Mueller, Ulrike Altenburger & Silke Mohl,　Challenges for the pharmaceutical technical development of protein coformulations, 70　Journal of Pharmacy and Pharmacology　666-674 (2017)). 이점 중 일부는 단일 약물에 비해 효능 증가, 부작용의 전반적인 감소, 환자 편의 및 순응도 향상 (환자 치료지속이행(patient adherence) 증가, 환자 안내 및 교육 간소화), 의료 비용 (제조 및 구매) 감소, 용이한 공급 과정, 및 기존 판매 제품의 수명-주기 관리 내에서 새로운 제품 기회를 포함한다.

일부 예시적인 구현예에서, 2개 이상의 활성 제약 성분은 단백질일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 공제형화 제제는 적어도 2개의 단백질을 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 공제형화 제제는 적어도 3개의 단백질을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "단백질"은 공유 결합된 아미드 결합을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 포함한다. 단백질은 일반적으로 당 업계에 "폴리펩티드"로 알려진 하나 이상의 아미노산 중합체 사슬을 포함한다. "폴리펩티드"는 아미노산 잔기, 관련된 자연 발생 구조 변이체, 및 펩티드 결합을 통해 연결된 합성 비-자연 발생 유사체, 관련된 자연 발생 구조 변이체, 및 이의 합성 비-자연 발생 유사체로 구성된 중합체를 지칭한다. "합성 펩티드 또는 폴리펩티드"는 비-자연 발생 펩티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 합성 펩티드 또는 폴리펩티드는, 예를 들면, 자동화된 폴리펩티드 합성장치를 사용하여 합성될 수 있다. 각종 고상 펩티드 합성 방법이 공지되어 있다. 단백질은 하나 또는 여러 개의 폴리펩티드를 포함하여 단일 기능 생체분자를 형성할 수 있다. 단백질은 바이오-치료 단백질, 연구 또는 요법에 사용되는 재조합 단백질, 트랩 단백질 및 기타 키메라 수용체 Fc-융합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 단클론 항체, 다클론 항체, 인간 항체, 및 이중특이적 항체를 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 측면에서, 단백질은 항체 단편, 나노바디, 재조합 키메라 항체, 사이토카인, 케모카인, 펩티드 호르몬 등을 포함할 수 있다. 단백질은 곤충 바쿨로바이러스(bacculovirus) 시스템, 효모 시스템(예를 들어, 피치아(Pichia) 종), 포유류 시스템(예를 들어, CHO 세포 및 CHO-K1 세포와 같은 CHO 유도체)과 같은 재조합 세포-기반 생산 시스템을 사용하여 생산될 수 있다. 바이오치료 단백질과 그 생산을 논하는 검토는 다음의 문헌을 참조한다: Ghaderi et al., "Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation," (BIOTECHNOL. GENET. ENG. REV. 147-175 (2012)). 일부 예시적인 구현예에서, 단백질은 변형물, 부가물 및 기타 공유 결합된 모이어티를 포함한다. 이러한 변형물, 부가물 및 모이어티에는 예를 들어 아비딘, 스트렙트아비딘, 비오틴, 글리칸(예를 들어, N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, 뉴라민산, N-아세틸글루코사민, 푸코오스, 만노오스 및 기타 단당류), PEG, 폴리히스티딘, FLAG태그, 말토오스 결합 단백질 (MBP), 키틴 결합 단백질 (CBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 (GST) myc-에피토프, 형광 표지 및 기타 염료 등이 포함된다. 단백질은 조성과 용해도를 기준으로 분류될 수 있으므로 단순 단백질, 예컨대 구형 단백질 및 섬유 단백질; 접합 단백질, 예컨대 핵단백질, 당단백질, 점액단백질, 색소단백질, 인단백질, 금속단백질, 및 지방단백질; 및 유도 단백질, 예컨대 1차 유도 단백질 및 2차 유도 단백질을 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 단백질은 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 항체 단편, 단클론 항체, 또는 Fc 융합 단백질일 수 있다. 일 측면에서, 단백질은 항-VEGF 단백질이다. 특정 측면에서, VEGF-단백질은 애플리버셉트(Aflibercept)이다.

본원에 사용된 용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 사슬, 이황화 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 면역글로불린 분자뿐만 아니라 이의 다량체 (예를 들어, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 V_H로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 C_H1, C_H2 및 C_H3의 3개의 도메인을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 V_L로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 (C_L1)을 포함한다. V_H 및 V_L 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카복시-말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된다. 상이한 예시적인 구현예에서, 항-big-ET-1 항체 (또는 이의 항원 결합 부분)의 FR은 인간 생식 계열 서열과 동일할 수 있거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 컨센서스 서열은 2개 이상의 CDR의 병렬 분석을 기반으로 정의될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 또한 전체 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생, 효소적으로 수득 가능한, 합성 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 항체 가변 및 선택적으로 불변 도메인을 인코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 단백질 분해 소화 또는 재조합 유전 공학 기술과 같은 임의의 적합한 표준 기술을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나, 예를 들어, 상업적 공급원, DNA 라이브러리 (예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함)로부터 쉽게 입수 가능하거나 합성될 수 있다. DNA는, 예를 들어, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적절한 구성으로 배열하거나 코돈을 도입하고, 시스테인 잔기를 생성하고, 아미노산을 변형, 첨가 또는 결실시키는 등을 위해 화학적으로 또는 분자 생물학 기술을 사용하여 시퀀싱 및 조작될 수 있다.

본원에 사용된 "항체 단편"은, 예를 들어, 항체의 항원-결합 또는 가변 영역과 같은 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fc 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디(diabody), dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 영역, 뿐만 아니라 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. Fv 단편은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 조합이고, ScFv 단백질은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 사슬 폴리펩티드 분자이다. 항체 단편은 다양한 수단으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 온전한 항체의 단편화에 의해 효소적으로 또는 화학적으로 생산될 수 있고/있거나 부분 항체 서열을 인코딩하는 유전자로부터 재조합적으로 생산될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 단편은 전체적인 또는 부분적인 합성으로 생산될 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 단일 사슬 항체 단편을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 단편은, 예를 들어, 이황화 결합에 의해 함께 연결된 다중 사슬을 포함할 수 있다. 항체 단편은 선택적으로 다중-분자 복합체를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "단클론 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체로 제한되지 않는다. 단클론 항체는 임의의 진핵생물, 원핵생물 또는 파지 클론을 포함하는 단일 클론, 또는 이용 가능하거나 당 업계에 공지된 임의의 수단에 의해 유도될 수 있다. 본 개시내용에 유용한 단클론 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파지 디스플레이 기술, 또는 이들의 조합의 사용을 포함하여, 당 업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "Fc 융합 단백질"은 2종 이상의 단백질의 일부 또는 전부를 포함하는데, 이중 하나는 천연 상태에서 융합되지 않는 면역글로불린 분자의 Fc 부분이다. 항체-유래 폴리펩티드 (Fc 도메인 포함)의 다양한 부분에 융합된 특정 이종 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 제조는, 예를 들어, 다음의 문헌에 설명되었다: Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. ScL USA 88: 10535, 1991; Byrn et al., Nature 344:677, 1990; and Hollenbaugh et al., "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1-10.19.11, 1992. "수용체 Fc 융합 단백질"은 Fc 모이어티에 결합된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들) 중 하나 이상을 포함하며, 일부 구현예에서는 면역글로불린의 CH2 및 CH3 도메인이 뒤따르는 힌지 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc-융합 단백질은 단일 또는 하나 이상의 리간드(들)에 결합하는 2개 이상의 별개의 수용체 사슬을 포함한다. 예를 들어, Fc-융합 단백질은, 트랩(trap), 예를 들어 IL-1 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 IL-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1 RAcP 리간드 결합 영역을 포함하는 릴로나셉트(Rilonacept); 미국 특허 번호 6,927,004 참조, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함됨), 또는 VEGF 트랩(예를 들어, hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 포함하는 애플리버셉트; 예를 들어, 서열 번호:1; 미국 특허 번호 7,087,411 및 7,279,159 참조, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)이다.

일부 예시적인 구현예에서, 공제형화 제제는 이량체 종을 포함할 수 있다. 일 측면에서, 공제형화 제제는 동종이량체 종을 포함할 수 있다. 일부 다른 특정 예시적인 구현예에서, 공제형화 제제는 이종이량체 종을 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 공제형화 제제는 동종이량체 종 및 이종이량체 종을 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 공제형화 제제는 불순물로서 이량체 종을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "불순물"은 단백질 바이오 의약품에 존재하는 임의의 바람직하지 않은 단백질을 포함할 수 있다. 불순물에는 공정 및 생성물-관련 불순물이 포함될 수 있다. 불순물은 추가로 알려진 구조이거나 부분적으로 특성화되거나 식별되지 않을 수 있다. 공정-관련 불순물은 제조 공정에서 파생될 수 있으며, 세포 기질-유래, 세포 배양-유래 및 다운스트림 유래의 3가지 주요 범주를 포함할 수 있다. 세포 기질-유래 불순물은 숙주 유기체 및 핵산 (숙주 세포 게놈, 벡터 또는 전체 DNA)에서 유래한 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 세포 배양-유래 불순물에는 유도제, 항생제, 혈청 및 기타 배지 성분이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 다운스트림-유래 불순물은 효소, 화학적 및 생화학적 처리 시약 (예를 들어, 시아노겐 브로마이드, 구아니딘, 산화제 및 환원제), 무기염 (예를 들어, 중금속, 비소, 비금속 이온), 용매, 담체, 리간드 (예를 들어, 단클론 항체) 및 기타 침출물(leachable)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 생성물-관련 불순물 (예를 들어, 전구체, 특정 분해 산물)은 활성, 효능 및 안전성과 관련하여 원하는 제품의 특성과 유사한 특성을 갖지 않는 제조 및/또는 저장 동안 발생하는 분자 변이체일 수 있다. 이러한 변이체는 변형(들)의 유형을 식별하기 위한 단리 및 특성화에 상당한 노력이 필요할 수 있다. 생성물-관련 불순물은 절단된 형태, 변형된 형태 및 응집체를 포함할 수 있다. 절단된 형태는 펩티드 결합의 절단을 촉매하는 가수분해 효소 또는 화학 물질에 의해 형성된다. 변형된 형태에는 탈아미드화; 이성질화, 미스매치된 S-S 연결, 산화 또는 변경된 접합 형태 (예를 들어, 글리코실화, 인산화)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 변형된 형태에는 임의의 번역 후 변형 형태도 포함될 수 있다. 응집체에는 원하는 생성물의 이량체 및 더 높은 다량체가 포함된다 (Q6B 사양: 생명공학/생물학적 제품에 대한 시험 절차 및 허용 기준(Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products), ICH 1999년 8월, 미국 보건사회복지부(U.S. Dept. of Health and Humans Services)).

본원에 사용된 일반적인 용어 "번역 후 변형" 또는 "PTM"은 폴리펩티드가 리보솜 합성 동안 (공-번역 변형) 또는 후에 (번역-후 변형) 폴리펩티드가 겪는 공유 변형을 지칭한다. PTM은 일반적으로 특정 효소 또는 효소 경로에 의해 도입된다. 많은 것들이 단백질 골격 내의 특정 특징적인 단백질 서열 (시그니처 서열) 부위에서 발생한다. 수백 개의 PTM이 기록되었으며, 이러한 변형은 항상 단백질의 구조 또는 기능의 일부 측면에 영향을 미친다 (Walsh, G. "Proteins" (2014) second edition, published by Wiley and Sons, Ltd., ISBN: 9780470669853). 다양한 번역 후 변형에는 절단, N-말단 확장, 단백질 분해, N-말단 아실화, 비오티닐화 (비오틴에 의한 라이신 잔기의 아실화), C-말단의 아미드화, 글리코실화, 요오드화, 보결분자단의 공유 부착, 아세틸화 (보통 단백질의 N-말단에서 아세틸 기의 첨가), 알킬화 (보통 라이신 또는 아르기닌 잔기에서 알킬기 (예를 들어 메틸, 에틸, 프로필)의 첨가), 메틸화, 아데닐화, ADP-리보실화, 폴리펩티드 사슬 내부 또는 사이의 공유 가교, 설폰화, 프레닐화, 비타민 C 의존성 변형 (프롤린 및 라이신 하이드록실화 및 카복시 말단 아미드화), 비타민 K 의존성 변형 (여기서 비타민 K는 γ-카복시글루타메이트 (glu 잔기)를 형성하는 글루탐산 잔기의 카복실화의 보조인자임), 글루타밀화 (글루탐산 잔기의 공유 결합), 글리실화 (공유 결합 글리신 잔기), 글리코실화 (당단백질을 생성하는, 아스파라진, 하이드록시라이신, 세린 또는 트레오닌에 글리코실 기의 첨가), 이소프레닐화 (파르네솔 및 게라닐게라니올과 같은 이소프레노이드 기의 첨가), 리포일화 (리포에이트 작용기의 부착), 포스포판테테이닐화 (지방산, 폴리케타이드, 비-리보솜 펩티드 및 류신 생합성에서와 같이 코엔자임 A로부터의 4'-포스포판테테이닐 모이어티의 첨가), 인산화 (일반적으로 세린, 티로신, 트레오닌 또는 히스티딘에 포스페이트 기의 첨가) 및 황산화 (일반적으로 티로신 잔기에 포스페이트 기의 첨가)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 아미노산의 화학적 성질을 변화시키는 번역 후 변형에는 시트룰린화(citrullination) (탈이민화(deimination)에 의한 아르기닌의 시트룰린으로의 전환) 및 탈아미드화 (글루타민에서 글루탐산으로 또는 아스파라진에서 아스파르트산으로의 전환)가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 구조적 변화를 수반하는 번역 후 변형은 이황화 가교 형성 (2개의 시스테인 아미노산의 공유 결합) 및 단백질 분해 절단 (펩티드 결합에서 단백질의 절단)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 특정 번역 후 변형에는 ISG일화(ISGylation) (ISG15 단백질에 대한 공유 결합 (인터페론-자극 유전자)), 수모일화(SUMOylation) (SUMO 단백질에 대한 공유 결합 (작은 유비퀴틴-관련 조절인자(Small Ubiquitin-related MOdifier))) 및 유비퀴틴화 (단백질 유비퀴틴에 대한 공유 결합)과 같은 다른 단백질 또는 펩티드의 첨가가 포함된다. 유니프로트(UniProt)에 의해 큐레이트(curate)된 PTM에 대한 보다 자세한 통제 어휘에 대해서는 문헌[참조: European Bioinformatics Institute Protein Information ResourceSIB Swiss Institute of Bioinformatics,　European Bioinformatics Institute　Drs - Drosomycin precursor - Drosophila melanogaster (Fruit fly) - Drs gene & protein, http://www.uniprot.org/docs/ptmlist (2019년 1월 15일 마지막 방문)]을 참조한다.

일부 예시적인 구현예에서, 이량체 종은 이량체 종을 포함하는 샘플을 크로마토그래피 시스템에 접촉하여 식별될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "크로마토그래피"는 액체 또는 기체에 의해 운반되는 화학 혼합물이 고정 액체 또는 고체상 주변 또는 위로 흐를 때 화학 엔티티(entity)의 차등 분포 결과로 구성 요소로 분리될 수 있는 공정을 지칭한다. 크로마토그래피의 비제한적인 예는 전통적인 역상 (RP), 이온 교환 (IEX), 혼합 모드 크로마토그래피 및 순상 크로마토그래피 (NP)를 포함한다.

본원에 사용된 용어 "혼합 모드 크로마토그래피 (MMC)" 또는 "다중 모드 크로마토그래피"는 용질이 하나 초과의 상호작용 모드 또는 메커니즘을 통해 정지상과 상호작용하는 크로마토그래피 방법을 포함한다. MMC는 기존의 역상 (RP), 이온 교환 (IEX) 및 순상 크로마토그래피 (NP)에 대한 대안 또는 보완 도구로 사용될 수 있다. 소수성 상호작용, 친수성 상호작용 및 이온 상호작용이 각각 지배적인 상호작용 모드인 RP, NP 및 IEX 크로마토그래피와 달리, 혼합-모드 크로마토그래피는 이러한 상호작용 모드 중 둘 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 혼합 모드 크로마토그래피 매체는 단일 모드 크로마토그래피로 재현될 수 없는 고유한 선택성을 제공할 수 있다. 혼합 모드 크로마토그래피는 또한 친화성 기반 방법에 비해 잠재적인 비용 절감 및 작업 유연성을 제공할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피는 크기 배제 크로마토그래피일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "SEC 크로마토그래피 수지" 또는 "SEC 크로마토그래피 매체"는 상호 교환적으로 사용되며, 원하는 생성물로부터 불순물 (예를 들어, 이중특이적 항체 생성물에 대한 동종이량체 오염물)을 분리하는 SEC에서 사용되는 임의의 종류의 고체상을 포함할 수 있다. 수지의 용적, 사용될 컬럼의 길이 및 직경, 및 동적 용량 및 유속은 처리될 유체의 용적, 공정을 거친 유체의 단백질 농도와 같은 여러 파라미터에 따라 달라질 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 이량체 종을 식별하는 방법은 이량체 종을 포함하는 용리액을 제공하기 위해 이동상을 사용하여 단백질 바이오 의약품을 포함하는 샘플을 크로마토그래피 시스템에 접촉시키는 단계; 및 전기분무 이온화 질량 분석기를 사용하여 상기 용리액에서 단백질을 식별하는 단계를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "질량 분석기"는 특정 분자 종을 식별하고 정확한 질량을 측정할 수 있는 장치를 포함한다. 이 용어는 검출 및/또는 특성화를 위해 폴리펩티드 또는 펩티드가 용출될 수 있는 임의의 분자 검출기를 포함하는 것을 의미한다. 질량 분석기는 이온 공급원, 질량 분석기 및 검출기의 세 가지 주요 부분을 포함할 수 있다. 이온 공급원의 역할은 기상 이온을 생성하는 것이다. 분석물 원자, 분자 또는 클러스터는 기상으로 전달되고, 동시에 이온화될 수 있다 (전기분무 이온화에서와 같이). 이온 공급원의 선택은 응용 분야에 따라 크게 달라진다.

일부 구현예에서, 질량 분석기는 전기분무-질량 분석기일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "전기분무 이온화" 또는 "ESI"는 용액 중의 양이온 또는 음이온이 용액을 포함하는 전기 분무 바늘의 팁과 상대 전극 사이에 전위차를 가하여 발생하는 고하전 액적 스트림의 대기압에서의 형성 및 탈용매화를 통해 기상으로 전달되는 분무 이온화 공정을 지칭한다. 용액의 전해질 이온으로부터 기체-상 이온을 생성하는 데는 일반적으로 세 가지 주요 단계가 있다. 여기에는 (a) ES 주입 팁에서 하전된 액적 생성; (b) 용매 증발에 의한 하전된 액적의 수축 및 기체-상 이온을 생성할 수 있는 작은 고하전 액적을 초래하는 반복적인 액적 분해; 및 (c) 기체-상 이온이 매우 작은 고하전 액적에서 생성되는 메커니즘이 있다. 단계 (a)-(c)는 일반적으로 장치의 대기압 영역에서 발생한다.

본원에 사용된 용어 "전기분무 주입 설정"은 단백질의 질량 분석에 사용되는 질량 분석기와 호환되는 전기분무 이온화 시스템을 지칭한다. 전기분무 이온화에서, 전기분무 바늘에는 분광계의 입구 구멍 가까이에 위치하는 구멍이 있다. 관심 단백질이 포함된 샘플을 주사기 바늘을 통해 펌핑할 수 있다. 주사기 바늘 구멍과 질량 분석기로 이어지는 구멍 사이의 전위는 용액의 분무 ("전기분무")를 형성한다. 전기분무는 대기압에서 수행될 수 있으며 용액의 고하전 액적을 제공한다. 전기분무 주입 설정에는 전기분무 이미터, 분무 가스, 및/또는 ESI 전원 공급기가 포함될 수 있다. 설정은 샘플 흡인, 샘플 분배, 샘플 전달 및/또는 샘플 분무를 수행하기 위해 선택적으로 자동화될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 전기분무 이온화 질량 분석기는 나노-전기분무 이온화 질량 분석기일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "나노전기분무(nanoelectrospray)" 또는 "나노분무"는 종종 외부 용매 전달을 사용하지 않고 매우 낮은 용매 유속, 전형적으로 분당 샘플 용액 수백 나노리터 이하로의 전기분무 이온화를 지칭한다. 나노전기분무기를 형성하는 전기분무 주입 설정은 정적 나노전기분무 이미터 또는 동적 나노전기분무 이미터를 사용할 수 있다. 정적 나노전기분무 이미터는 장기간에 걸쳐 소량의 샘플 (분석물) 용액 용적을 연속적으로 분석한다. 동적 나노전기분무 이미터는 모세관 컬럼과 용매 전달 시스템을 사용하여 질량 분석기로 분석하기 전에 혼합물에서 크로마토그래피 분리를 수행한다.

본원에 사용된 용어 "질량 분석기"는 질량에 따라 종, 즉, 원자, 분자 또는 클러스터를 분리할 수 있는 장치를 포함한다. 빠른 단백질 시퀀싱에 사용될 수 있는 질량 분석기의 비제한적인 예에는 비행 시간(time-of-flight; TOF), 자기 / 전기 섹터, 사중극자 질량 필터 (Q), 사중극자 이온 트랩 (QIT), 오비트랩(orbitrap), 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 (FTICR), 및 또한 가속기 질량 분석 (AMS) 기술이 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 질량 분석법은 기본 조건하에 수행될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "기본 조건" 또는 "기본 MS" 또는 "기본 ESI- MS"는 분석물에서 비공유 상호작용을 보존하는 조건하에 수행하는 질량 분석법을 포함할 수 있다. 기본 MS에 대한 자세한 검토는 다음의 검토를 참조한다: Elisabetta Boeri Erba & Carlo Petosa,　The emerging role of native mass spectrometry in characterizing the structure and dynamics of macromolecular complexes, 24　Protein Science1176-1192 (2015). 기본 ESI와 일반 ESI의 차이점 중 일부는 표 1에 설명되어 있다 (Hao Zhang et al.,　Native mass spectrometry of photosynthetic pigment-protein complexes, 587　FEBS Letters　1012-1020 (2013)).

일부 예시적인 구현예에서, 질량 분석기는 탠덤 질량 분석기일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "탠덤 질량 분석법"은 다중 단계의 질량 선택 및 질량 분리를 사용하여 샘플 분자에 대한 구조적 정보를 얻는 기술을 포함한다. 전제 조건은 샘플 분자가 기체 상으로 옮겨져 그대로 이온화될 수 있으며, 첫 번째 질량 선택 단계 후에 일부 예측 가능하고 제어 가능한 방식으로 분해되도록 유도될 수 있다는 것이다. 다단계 MS/MS, 또는 MSⁿ은 먼저 전구 이온 (MS²)을 선택 및 단리하고, 이를 단편화하고, 1차 단편 이온 (MS³)을 단리하고, 이를 단편화하고, 2차 단편 (MS⁴)을 단리하고, 의미 있는 정보를 얻을 수 있거나 단편 이온 신호를 감지할 수 있는 한 계속하여 수행될 수 있다. 탠덤 MS는 다양한 분석기 조합으로 성공적으로 수행되었다. 특정 적용을 위해 결합할 분석기는 감도, 선택성 및 속도와 같은 다양한 요인뿐만 아니라 크기, 비용 및 가용성에 의해 결정된다. 탠덤 MS 방법의 두 가지 주요 범주는 탠덤-인-스페이스(tandem-in-space) 및 탠덤-인-타임(tandem-in-time)이지만, 탠덤-인-타임 분석기가 공간 또는 탠덤-인-스페이스 분석기와 결합되는 하이브리드도 있다. 탠덤-인-스페이스 질량 분석기는 이온 공급원, 전구 이온 활성화 장치 및 적어도 2개의 비-포획 질량 분석기로 구성된다. 특정 m/z 분리 기능을 설계하여 기기의 한 섹션에서 이온을 선택하고, 중간 영역에서 해리한 다음 생성 이온이 m/z 분리 및 데이터 수집을 위해 또 다른 분석기로 전송되도록 할 수 있다. 탠덤-인-타임 질량 분석기에서 이온 공급원에서 생성된 이온은 동일한 물리적 장치에서 포획, 단리, 단편화 및 m/z 분리될 수 있다.

질량 분석기에 의해 식별된 펩티드는 온전한 단백질 및 이의 번역 후 변형의 대리 대표로서 사용될 수 있다. 이는 실험 및 이론적 MS/MS 데이터를 상호 연관시켜 단백질 특성화에 사용될 수 있으며, 후자는 단백질 서열 데이터베이스의 가능한 펩티드에서 생성될 수 있다. 특성화는 단백질 단편의 아미노산 시퀀싱, 단백질 시퀀싱 결정, 드 노보(de novo) 단백질 시퀀싱 결정, 번역 후 변형 위치 확인, 또는 번역 후 변형 식별, 또는 비교 가능성 분석, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "데이터베이스"는 데이터베이스(들)의 모든 가능한 서열에 대해 해석되지 않은 MS-MS 스펙트럼을 검색할 가능성을 제공하는 생물 정보학 도구를 지칭한다. 이러한 도구의 비제한적인 예에는 Mascot (http://www.matrixscience.com), Spectrum Mill (http://www.chem.agilent.com), PLGS (http://www.waters.com), PEAKS (http://www.bioinformaticssolutions.com), Proteinpilot (http://download.appliedbiosystems.com//proteinpilot), Phenyx (http://www.phenyx-ms.com), Sorcerer (http://www.sagenresearch.com), OMSSA (http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/), X!Tandem (http://www.thegpm.org/TANDEM/), Protein Prospector (http://www. http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm), Byonic (https://www.proteinmetrics.com/products/byonic) 또는 Sequest (http://fields.scripps.edu/sequest)가 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 본 개시내용은 이종이량체 종을 정량화하는 방법을 제공한다.

일부 구현예에서, 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키는 단계를 포함할 수 있다. 제1 단백질에 특이적인 항체는 문헌에 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "고체 표면"은 관심 항체에 결합하는 능력이 있는 임의의 표면을 포함할 수 있다. 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 샘플에 대한 일부 구현예에서, 관심 항체는 제1 단백질에 특이적인 항체일 수 있다. 고체 표면의 비제한적인 예는 친화성 수지, 자기 비드, 및 아비딘, 스트렙트아비딘 또는 뉴트르아비딘(NeutrAvidin)과 같은 고정된 단백질로 코팅된 플레이트를 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 이종이량체 종을 면역침전시키는 단계를 포함할 수 있다. 면역침전은 고체 표면에 고정된 항체를 사용하여 수행될 수 있으며, 여기서 항체는 공제형화 제제에서 많은 활성 제약 성분 중 하나에 결합할 수 있으며, 여기서 활성 제약 성분은 단백질일 수 있다.

일부 구현예에서, 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 샘플은 고체 표면에서 제1 단백질에 특이적인 고정된 항체와 함께 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 시간은 몇 분에서 몇 시간까지 다양할 수 있다.

일부 구현예에서, 고체 표면에서 제1 단백질에 특이적인 고정된 항체와 함께 인큐베이션되는 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 샘플은 풀다운(pull down)될 수 있다.

일부 구현예에서, 고체 표면에서 제1 단백질에 특이적인 고정된 항체와 함께 인큐베이션되는 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 샘플은 원심분리될 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 원심분리는 침전된 샘플 및 플로우 스루 또는 상청액을 산출할 수 있다.

일부 구현예에서, 침전된 샘플과 플로우 스루는 환원제를 사용하여 환원될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "환원"은 단백질에서 이황화 가교의 감소를 지칭한다. 단백질 환원에 사용되는 환원제의 비제한적인 예는 디티오트레이톨 (DTT), ß-머캅토에탄올, 엘만 시약(Ellman's reagent), 하이드록실아민 하이드로클로라이드, 나트륨 시아노보로하이드라이드, 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 (TCEP-HCl), 또는 이들의 조합이다.

일부 구현예에서, 침전된 샘플 및/또는 플로우 스루는 화합물 또는 화합물들을 사용하여 처리될 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 처리에는 알킬화가 포함될 수 있다. 일부 다른 특정 예시적인 구현예에서, 처리는 단백질 상의 설프하이드릴 기의 알킬화를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "처리" 또는 "동위원소 표지"는 단백질을 화학적으로 표지하는 것을 지칭할 수 있다. 단백질을 화학적으로 표지하는 방법의 비선택적 예에는 4-플렉스(plex), 6-플렉스, 및 8-플렉스와 같은 시약을 사용하는 상대 및 절대 정량화 (iTRAQ)를 위한 등압 태그; 아민의 환원적 탈메틸화, 아민의 카바밀화, 단백질의 C-말단에 ¹⁸O-표지, 또는 아민 또는 설프하이드릴 기를 표지하기 위한 단백질의 임의의 아민- 또는 설프하이드릴- 기가 포함된다.

일부 구현예에서, 침전된 샘플 및/또는 플로우 스루는 2개의 별개의 화합물을 사용하여 처리될 수 있으며, 여기서 두 화합물은 동위원소이다.

일부 구현예에서, 침전된 샘플 및 플로우 스루의 적어도 일부는 처리 또는 동위원소 표지 후에 혼합될 수 있다.

일부 구현예에서, 처리되거나 동위원소로 표지된 침전 샘플의 혼합물 및 처리되거나 동위원소로 표지된 플로우 스루의 적어도 일부가 분해될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "분해"는 단백질의 하나 이상의 펩티드 결합의 가수분해를 지칭한다. 적절한 가수분해제, 예를 들어, 효소적 분해 또는 비-효소적 분해를 사용하여 샘플에서 단백질 분해를 수행하는 방법에는 여러 가지가 있다.

본원에 사용된 용어 "가수분해제"는 단백질의 분해를 수행할 수 있는 다수의 상이한 제제 중 어느 하나 또는 조합을 지칭한다. 효소적 분해를 수행할 수 있는 가수분해제의 비제한적인 예에는 트립신, 엔도프로테이나아제 Arg-C, 엔도프로테이나아제 Asp-N, 엔도프로테이나아제 Glu-C, 외막 프로테아제 T (OmpT), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)의 면역글로불린-분해 효소 (IdeS), 키모트립신, 펩신, 서모리신(thermolysin), 파파인, 프로나아제, 및 아스퍼길러스 사이토이(Aspergillus Saitoi) 유래 프로테아제가 포함된다. 비-효소적 분해를 수행할 수 있는 가수분해제의 비제한적인 예에는 고온, 마이크로파, 초음파, 고압, 적외선, 용매 (비제한적인 예는 에탄올 및 아세토니트릴임), 고정화 효소 분해 (IMER), 자기 입자 고정화 효소, 및 온칩(on-chip) 고정화 효소의 사용이 포함된다. 단백질 분해에 사용 가능한 기술을 논의하는 최근 검토는 다음을 참조한다: Switazar et al., "Protein Digestion: An Overview of the Available Techniques and Recent Developments" (J. Proteome Research 2013, 12, 1067-1077). 가수분해제 중 하나 또는 조합은 단백질 또는 폴리펩티드 내의 펩티드 결합을 서열-특이적 방식으로 절단하여 더 짧은 펩티드의 예측 가능한 집합체를 생성할 수 있다.

일부 구현예에서, 처리되거나 동위원소로 표지된 침전 샘플 및 처리되거나 동위원소로 표지된 플로우 스루의 적어도 일부의 혼합물을 분해할 때 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 분석될 수 있다. 하나의 그러한 예시적인 구현예가 도 2에 도시된다. 도 2는 공제형화 제제에서 제1 단백질 - mAb1 및 제2 단백질 - 융합 단백질 1을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법에 대한 예시적인 구현예를 보여주며, 상기 방법은 고체 표면에서 제1 단백질에 특이적인 항체 (항-mAb1 항체)를 고정시키고, 샘플을 상기 항체와 인큐베이션하고, mAb1의 이종이량체 및 융합 단백질 1, mAb1 단량체 및 mAb1 이량체를 풀다운하여 침전된 샘플을 포획하고, 융합 단백질 1 단량체 및 융합 단백질 1 이량체를 포함하는 플로우 스루를 수집하고, 침전된 샘플을 제1 화합물 - 미표지된 아이오도아세트아미드 (IAA)로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물 - 표지된 아이오도아세트아미드 (IAA)로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 약 10%를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 상기 혼합물을 분해하고, 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 혼합물을 분석하여 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함한다. 예시적인 구현예를 사용하여 이종이량체 종을 정량화하는 동안, 샘플을 상기 항체와 인큐베이션할 때 제2 단백질의 비특이적 결합. 그와 같은 비특이적 결합은 이종이량체의 양을 과대 추정하게 할 수 있다. 따라서, 음성 샘플을 준비하고, 비특이적으로 결합된 제2 단백질의 양을 얻을 수 있다. 그와 같은 가능성의 일 예가 도 3에 도시된다.

일부 예시적인 구현예에서, 음성 샘플은 이종이량체 종이 존재하지 않는, 제1 단백질과 제2 단백질의 단량체 및 동종이량체를 포함할 수 있다.

도 3은 음성 샘플을 준비하기 위한 예시적인 구현예를 보여준다. 이는 제1 단백질 (mAb1)과 제2 단백질 (융합 단백질 1)의 단량체 및 동종이량체를 포함하는 샘플을 사용하는 것을 포함한다. 항체에 비-특이적으로 결합된 이 제2 단백질의 양은 고체 표면에서 제1 단백질에 특이적인 항체 (항-mAb1 항체)를 고정시키고, 샘플을 상기 항체와 인큐베이션하고, 비특이적으로 결합된 융합 단백질 1, mAb1 단량체 및 mAb1 이량체를 풀다운하여 침전된 샘플을 포획하고, 융합 단백질 1 단량체 및 이량체를 포함하는 플로우 스루를 수집하고, 침전된 샘플을 제1 화합물 - 미표지된 아이오도아세트아미드 (IAA)로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물 - 표지된 아이오도아세트아미드 (IAA)로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 약 10%를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 혼합물을 분석하여 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함하는 방법을 사용하여 정량화될 수 있다.

예시적인 구현예

본원에 개시된 구현예는 이량체 종의 식별 및/또는 정량화를 위한 방법 및 시스템을 제공한다.

일부 예시적인 구현예에서, 본 개시내용은 이량체 종을 포함하는 샘플을 크로마토그래피 수지가 있는 크로마토그래피 시스템에 접촉시키고, 이동상을 사용하여 상기 수지를 세정하여 이량체 종을 포함하는 용리액을 제공하고, 전기분무 이온화 질량 분석기를 사용하여 상기 용리액에서 이량체 종을 식별하는 단계를 포함하는, 이량체 종의 식별 방법을 제공한다.

일부 예시적인 구현예에서, 이량체 종은 동종이량체 종일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 이량체 종은 이종이량체 종일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피 시스템은 기존의 역상 (RP), 이온 교환 (IEX) 또는 순상 크로마토그래피 (NP)를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피 수지는 친화성 크로마토그래피 수지, 음이온-교환 수지, 양이온 교환 수지, 친화성 수지, 혼합 모드 크로마토그래피 수지, 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지 또는 크기 배제 크로마토그래피 수지로부터 선택될 수 있다. 하나의 특정 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피 수지는 크기 배제 크로마토그래피 수지일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 전기분무 이온화 질량 분석기는 크로마토그래피 수지가 있는 크로마토그래피 시스템에 온라인으로 결합될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 전기분무 이온화 질량 분석기는 기본 조건하에 실행될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피 시스템은 적어도 3개의 경로가 있는 스플리터를 사용하여 전기분무 이온화 질량 분석기에 결합될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피 시스템은 적어도 3개의 경로가 있는 스플리터를 사용하여 자외선 검출기에 결합될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피 시스템은 적어도 3개의 경로가 있는 스플리터를 사용하여 전기분무 이온화 질량 분석기 및 자외선 검출기에 결합될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피 시스템은 적어도 3개의 경로가 있는 스플리터를 사용하여 전기분무 이온화 질량 분석기 및 자외선 검출기에 결합될 수 있으며, 여기서 전기분무 이온화 질량 분석기는 나노-전기분무 이온화 질량 분석기이다.

일부 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피 시스템은 적어도 3개의 경로가 있는 스플리터를 사용하여 전기분무 이온화 질량 분석기 및 자외선 검출기에 결합될 수 있으며, 여기서 질량 분석기는 기본 조건하에 작동하는 전기분무 이온화 질량 분석기일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피 시스템은 적어도 3개의 경로가 있는 스플리터를 사용하여 전기분무 이온화 질량 분석기 및 자외선 검출기에 결합될 수 있으며, 여기서 전기분무 이온화 질량 분석기는 기본 조건하에 나노-전기분무 이온화 질량 분석기일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 수지 세정으로부터 단백질 또는 항원-항체 복합체 또는 항체-약물 접합체를 포함하는 용리액은 약 0.2 mL/분 내지 약 0.4 mL/분의 유속으로 적어도 3개의 경로가 있는 적어도 하나의 스플리터를 통해 자외선 검출기에 도입될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 세정용 이동상은 유속이 약 0.2 mL/분 내지 약 0.4 mL/분일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 이동상은 휘발성 염을 포함할 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 이동상은 아세트산암모늄, 탄산수소암모늄, 또는 포름산암모늄, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 사용된 이동상은 질량 분석기와 호환될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플은 약 10 μg 내지 약 100 μg의 이량체 종을 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 전기분무 이온화 질량 분석기의 유속은 약 10 nL/분 내지 약 50 nL/분일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 전기분무 이온화 질량 분석기는 분무 전압이 약 0.8 kV 내지 약 1.5 kV일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 식별에는 단백질 시퀀싱, 드 노보(de novo) 단백질 시퀀싱, 번역 후 변형 식별, 비교 가능성 분석, 또는 이들의 조합이 포함될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플은 또한 단백질의 단량체를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 이량체는 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함할 수 있으며, 여기서 제1 단백질 및 제2 단백질은 치료 항체, 항체, 단클론 항체, 다클론 항체, 이중특이적 항체, 항체 단편, 융합 단백질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 측면에서, 항체 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디, dAb 단편, Fd' 단편, Fd 단편, 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 영역, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일-사슬 항체 분자, 및 항체 단편으로 형성된 다중 특이적 항체를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 이량체 종은 공제형화 제제에 존재하는 생성물-관련 불순물일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 이량체는 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함할 수 있으며, 여기서 제1 단백질 및 제2 단백질은 pI가 약 4.5 내지 약 9.0 범위일 수 있다. 일 측면에서, 단백질은 pI가 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9, 약 8.0, 약 8.1 약 8.2, 약 8.3, 약 8.4, 약 8.5, 약 8.6, 약 8.7, 약 8.8, 약 8.9, 또는 약 9.0일 수 있다.

본 방법은 상기 단백질, 불순물 및 컬럼 중 어느 것에 제한되지 않으며, 식별 또는 정량화를 위한 방법은 임의의 적합한 수단에 의해 수행될 수 있음을 이해한다.

일부 예시적인 구현예에서, 본 개시내용은 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 컬럼(100), 및 전기분무 이온화 질량 분석기(110)를 포함하는 시스템을 제공하며, 여기서 크로마토그래피 컬럼은 이동상 및 단백질을 포함하는 샘플을 수용할 수 있다 (도 1 참조).

일부 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피 컬럼(100)은 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 수지, 음이온 교환 수지, 친화성 크로마토그래피 수지, 크기 배제 크로마토그래피 수지, 혼합 모드 수지, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 수지를 가질 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 전기분무 이온화 질량 분석기(110)는 상기 크로마토그래피 컬럼(100)에 결합될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 전기분무 이온화 질량 분석기(110)는 기본 조건하에 실행될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 전기분무 이온화 질량 분석기(110)는 나노 전기분무 이온화 질량 분석기일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 전기분무 이온화 질량 분석기(110)는 기본 조건하에 실행되는 나노 전기분무 이온화 질량 분석기일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피 컬럼(100)은 적어도 3개의 경로가 있는 스플리터(120)를 사용하여 전기분무 이온화 질량 분석기(100)에 결합될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피 컬럼(100)은 적어도 3개의 경로가 있는 스플리터(120)를 사용하여 자외선 검출기(130)에 결합될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 크로마토그래피 컬럼(100)은 적어도 3개의 경로가 있는 스플리터(120)를 사용하여 자외선 검출기(130) 및 전기분무 이온화 질량 분석기(110)에 결합될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 3방향 스플리터(120)는 크로마토그래피 컬럼(100)으로부터 자외선 검출기(130) 및 전기분무 이온화 질량 분석기(110)로의 흐름을 허용하도록 불균형적으로 분할될 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 시스템은 이량체 종을 식별할 수 있다.

도 1에 표시된 시스템의 예시적인 구현예. UV/MS 이중 감지를 가능하게 하기 위해 최소 3개의 경로가 있는 포스트-컬럼(post-column) 스플리터가 사용된다. 저용량 분획은 MS로 향할 수 있고 고용량 분획은 UV 검출기로 전달된다. 감지는 거의 동일한 보존 시간을 공유한다. 샘플 회수를 위해 UV 검출기의 분획을 수집할 수 있다.

상기 시스템은 상기 단백질, 크로마토그래피 컬럼, 질량 분석기, 항체-약물 접합체, 항원-항체 복합체 중 어느 것에 제한되지 않는 것으로 이해된다.

본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 샘플을 상기 항체와 인큐베이션하고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 침전된 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 적어도 일부를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 혼합물을 분석하여 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함한다.

일부 예시적인 구현예에서, 제1 단백질은 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 항체 단편, 단클론 항체, 또는 Fc 융합 단백질 단클론 항체일 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 제1 단백질은 단클론 항체일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 제2 단백질은 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 항체 단편, 단클론 항체, 또는 Fc 융합 단백질일 수 있다. 일부 예시적인 구현예에서, 제1 단백질은 Fc 융합 단백질일 수 있다.

일부 구현예에서, 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 샘플은 제1 단백질의 동종이량체 종, 제1 단백질의 동종이량체 종, 제1 단백질과 제2 단백질의 이종이량체 종, 또는 이들의 조합으로부터 선택된 종을 추가로 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 샘플은 적어도 하나 이상의 단백질을 추가로 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 고체 표면은 친화성 수지, 자기 비드 및 코팅된 플레이트로부터 선택될 수 있다. 친화성 수지의 비제한적인 예는 단백질 A 아가로오스 비드, 단백질 G 아가로오스 비드, 단백질 A 세파로오스 비드 및 단백질 G 세파로오스 비드를 포함한다.

일부 구현예에서, 자기 비드는 표면에 공유 결합된 재조합 스트렙트아비딘 단층을 가질 수 있다.

일부 구현예에서, 고체 표면의 제1 단백질에 특이적인 항체 및 샘플은 몇 분에서 몇 시간 동안 인큐베이션될 수 있다.

일부 구현예에서, 침전된 샘플은 원심분리로 얻을 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 플로우 스루는 상청액을 수집하여 얻을 수 있다.

일부 구현예에서, 침전된 샘플은 재현탁된 침전 샘플을 가열하여 재현탁될 수 있다.

일부 구현예에서, 침전된 샘플은 용출될 수 있다.

일부 구현예에서, 침전된 샘플 및 플로우 스루는 환원제를 사용하여 환원될 수 있다. 일부 특정 구현예에서, 환원제는 디티오트레이톨일 수 있다.

일부 구현예에서, 처리에는 알킬화가 포함될 수 있다.

일부 구현예에서, 제1 화합물 및 제2 화합물은 동위원소일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 처리된 플로우 스루의 적어도 일부는 처리된 플로우 스루의 약 10%를 포함할 수 있다. 일 측면에서, 처리된 플로우 스루의 적어도 일부는 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100%일 수 있다.

일부 구현예에서, 제1 화합물 및 제2 화합물은 각각 표지된 아이오도아세트아미드 및 미표지된 아이오도아세트아미드일 수 있다. 일부 다른 예시적인 구현예에서, 제1 화합물 및 제2 화합물은 각각 미표지된 아이오도아세트아미드 및 표지된 아이오도아세트아미드일 수 있다.

일부 구현예에서, 질량 분석기와 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 분석하기 전에 혼합물을 분해할 수 있다. 일 측면에서, 혼합물은 트립신, 엔도프로테이나아제 Arg-C, 엔도프로테이나아제 Asp-N, 엔도프로테이나아제 Glu-C, 외막 프로테아제 T (OmpT), 스트렙토코커스 피오게네스의 면역글로불린-분해 효소 (IdeS), 키모트립신, 펩신, 서모리신, 파파인, 프로나아제, 및 아스퍼길러스 사이토이 유래 프로테아제로부터 선택된 가수분해제를 사용하여 분해될 수 있다.

일부 구현예에서, 혼합물은 트립신을 사용하여 분해될 수 있다.

일부 구현예에서, 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 분석하기 전에 혼합물을 탈당화할 수 있다.

하나의 예시적인 구현예의 예가 도 4에 도시된다. 도 4에 도시된 바와 같이, 혼합물을 분해한 다음 반으로 나눌 수 있다. 절반은 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 분석될 수 있고 나머지 절반은 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 탈당화 및 분석될 수 있다.

일부 구현예에서, 액체 크로마토그래피는 역상 (RP), 이온 교환 (IEX), 혼합 모드 크로마토그래피 및 순상 크로마토그래피 (NP)일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 질량 분석기는 전기분무 질량 분석기일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 질량 분석기는 나노-전기분무 질량 분석기일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 적어도 일부를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 혼합물을 분해하고, 분해된 혼합물을 탈당화하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 적어도 일부를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 혼합물을 분해하고, 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 혼합물을 분석하여 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 적어도 일부를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 혼합물을 분해하고, 분해된 혼합물을 탈당화하고, 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 혼합물을 분석하여 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 분석하여 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함할 수 있으며, 여기서 질량 분석기는 탠덤 질량 분석기일 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 침전된 샘플에 환원제를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 플로우 스루에 환원제를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 약 10%를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 혼합물을 분석하여 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키고, 침전된 샘플을 포획하고, 플로우 스루를 수집하고, 포획된 침전 샘플을 제1 화합물로 처리하고, 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하고, 처리된 침전 샘플과 처리된 플로우 스루의 약 10%를 혼합하여 혼합물을 형성하고, 혼합물을 분해하고, 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 혼합물을 분석하여 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 예시적인 구현예에서, 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법은 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함할 수 있으며, 여기서 샘플은 ICH 지침에 따른 강제 분해를 포함하여, 차가운-백색광 노출, 과산화수소 노출, 자외선 노출, 열, 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 조건을 적용하여 스트레스가 가해질 수 있다.

일부 구현예에서, 제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 제2 단백질 이종이량체 %는 하기 명시된 공식을 사용하여 계산될 수 있으며, 여기서 제1 단백질은 미표지된 화합물로 처리되고, 제2 단백질은 표지된 화합물로 처리된다:

,

여기서 가벼운 면적(area light)은 미표지된 화합물로 처리된 제2 단백질에 대해 결정된 MS 피크의 곡선하 면적이고, 무거운 면적(area heavy)은 표지된 화합물로 처리된 제2 단백질에 대해 결정된 MS 피크의 곡선하 면적이다. 본 방법은 또한 제1 단백질이 표지된 화합물로 처리되고 제2 단백질이 미표지된 화합물로 처리되도록 실행될 수 있다.

,

여기서 가벼운 면적은 미표지된 화합물로 처리된 제2 단백질에 대해 결정된 MS 피크의 곡선하 면적이고, 무거운 면적은 표지된 화합물로 처리된 제2 단백질에 대해 결정된 MS 피크의 곡선하 면적이다. 본 방법은 또한 제1 단백질이 표지된 화합물로 처리되고 제2 단백질이 미표지된 화합물로 처리되도록 실행될 수 있다.

숫자 및/또는 문자로 본원에 제공된 방법 단계의 연속적인 라벨링은 상기 방법 또는 이의 임의의 구현예를 특정 지시된 순서로 제한하는 것을 의미하지 않는다.

특허, 특허 출원, 공개된 특허 출원, 수탁 번호, 기술 논문(technical article) 및 학술 논문을 포함한 다양한 간행물이 본 명세서 전체에서 인용된다. 이들 인용된 참고문헌 각각은 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.

본 개시내용은 본 개시내용을 보다 상세하게 설명하기 위해 제공되는 하기 실시예를 참조하여 보다 완전히 이해될 것이다. 이는 실시예를 설명하기 위한 것이며, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예

재료 및 시약. 물은 Honeywell (Muskegon, MI)에서 구입하였다. 아세트산암모늄은 Sigma-Aldrich (St Louis, MO)에서 구입하였다. 1 M Tris-HCl, pH 7.5는 Teknova (Hollister, CA)에서 구입하였다. 용융 실리카 튜빙 (내경 (ID) 150 μm, 외경 (OD) 360 μm), 3-방향 커넥터 및 슬리브(sleeve)는 IDEX (Oak Harbor, WA)에서 구입하였다. PicoTip EMITTER SilicaTip (FS360-20-10-D-20-7CT)은 New Objective (Woburn, MA)에서 구입하였다. ACQUITY UPLC 단백질 BEH SEC 컬럼, 200Å, 1.7 μm, 4.6 Х 300 mm는 Waters (Milford, MA)에서 구입하였다. 핫 포켓(hot pocket) 컬럼 히터는 Thermo-Fisher (Waltham, MA)에서 구입하였다. 모든 시약은 추가 정제 없이 사용하였다.

온라인 SEC-나노- ESI -MS 분석. ACQUITY UPLC I 클래스 시스템 (Waters, Milford, MA)은 모든 온라인 SEC-나노-ESI-MS 분석을 위해 Q Exactive HF 하이브리드 사중극자-Orbitrap 질량 분석기 (Thermo Scientific, Bremen, Germany)에 결합되었다. ACQUITY UPLC 단백질 BEH SEC 컬럼 (200Å, 1.7 μm, 4.6 Х 300 mm)을 30℃로 설정하고, mAb 및 ADC 분리에 사용하였다. 이동상은 pH 6.8에서 100 mM 아세트산암모늄이었다. 각각의 분리는 0.3 mL/분의 유속으로 30분이었고, 주입량은 40 μg으로 설정되었다. 3-방향 스플리터 (T-스플리터)는 SEC 컬럼 뒤에 연결되었다. 용융 실리카 튜빙 (L: 140 cm, ID: 150 μm) 및 SilicaTip (L: 5 cm, ID: 10 μm)을 T-스플리터에 연결했다. 고용량 분획은 용융 실리카 튜빙을 통해 UV 검출기로 옮겨졌고, 저용량 분획은 SilicaTip을 통해 MS로 우회되었다. 온라인 SEC-나노-ESI-MS 데이터 수집을 위해 다음의 MS 파라미터가 사용되었다. 각각의 수집은 샘플 주입 직후부터 25분이었다. 샘플은 3 kV 분무 전압, 200℃ 모세관 온도 및 70 S-렌즈 RF 레벨로 포지티브 모드에서 이온화되었다. 인-소스(In-source) CID는 75 eV로 설정되었다. 전체 MS 스캔은 m/z 2000 내지 8000 사이의 질량 범위에서 15 K 분해능으로 수집되었다. 100 ms의 최대 주입 시간, 3e6의 자동 이득 제어 목표 값, 및 10회 마이크로스캔이 전체 MS 스캔에 사용되었다.

데이터 분석. 원 데이터 디콘볼루션에는 Protein Metrics Intact Mass 소프트웨어가 사용되었다. 추출된 이온 크로마토그램 분석에는 Thermo Xcalibur Qual Browser가 사용되었다. ADC의 DAR 계산에는 Microsoft Excel이 사용되었다.

실시예 1.

1.1 온라인 SEC-나노- ESI -MS 기기

SEC 및 MS 기술은 단백질 샘플을 특성화하기 위해 일상적으로 사용된다. SEC를 통해 단백질 구조의 변화를 최소화하는 조건에서 단백질을 단리하고 특성화할 수 있는 한편, MS를 통해 복합 샘플에서 개별 구성 요소를 식별할 수 있다. SEC 및 MS의 개별 기능을 단일 플랫폼으로 결합하는 것은 매우 바람직하지만, SEC 분석에 사용되는 높은 유속 및 비휘발성 염이 기본 MS와 호환되지 않기 때문에 어려운 것으로 입증되었다. 이러한 한계를 극복하기 위해 포스트-컬럼 T-스플리터를 사용하여 SEC로부터의 용출액 흐름을 분할함으로써 MS로의 용매 및 염 흡입을 감소시켰다 (도 1 참조). 이어서 T-스플리터를 SilicaTip을 통해 MS에 연결하고, 동시에 용융 실리카 튜빙을 통해 UV 검출기로 연결했다. 이러한 배열을 통해 SEC 용출액의 동시 이중 UV/MS 검출이 가능했다. 용융 실리카 튜빙의 길이와 직경을 변경함으로써 SilicaTip을 통한 MS로의 유속을 조절할 수 있다 (예를 들어, 보다 긴/보다 좁은 튜빙은 더 높은 저항을 생성하여 SilicaTip 및 MS로의 흐름을 증가시킬 수 있음). 단백질 샘플은 0.3 mL/분 유속을 사용하여 4.6 mm SEC 컬럼으로 분리되었다. 길이가 140 cm이고 내경이 150 μm인 T-스플리터와 UV 검출기를 연결하는 용융 실리카 튜빙은 SilicaTip에 대해 약 1 μL/분의 바람직한 유속을 가져왔다. 용융 실리카 튜빙의 길이와 직경은 UV 및 MS에 의한 분자의 거의 동기식 검출을 가능하게 했다.

1.2 공제형화 제제

mAb1, mAb2, 및 mAb3을 포함하는 제형을 실험에 사용하였다. 6개의 이량체 종이 제형에 존재할 수 있다 (도 5 참조). 샘플은 광 안정성 시험 (UV 1xICH 및 CW 1xICH)과 같은 ICH 지침에 제공된 조건을 포함하여, 다양한 조건에서 스트레스가 가해졌다.

1.3 결과

도 6 및 7에 도시된 바와 같이 추출된 이온 크로마토그램 (XIC) 및 분자량 측정을 모두 사용하는 1.1에 설명된 시스템을 사용하여 5개의 이량체 (mAb1-mAb1, mAb1-mAb2, mAb2-mAb2, mAb2-mAb3, 및 mAb3-mAb3)를 성공적으로 차별화했다. 식별되지 않은 유일한 이종이량체는 mAb1-mAb3이었는데, 이의 분자량이 동종이량체 mAb2-mAb2에 매우 가깝기 때문이었다 (15 Da 차이) (도 7 참조).

실시예 2.

2.1 온라인 SEC-나노- ESI -MS 기기

1.1에 설명된 기기가 사용되었다.

2.2 공제형화 제제

mAb1 및 융합 단백질을 포함하는 제형을 실험에 사용하였다. 세 가지 이량체 종이 제형에 존재할 수 있다 (도 8 참조). 융합 단백질에 N-글리칸이 존재하면 원상태 질량 분석이 상당히 복잡해진다.

120:40의 비율로 mAb1과 융합 단백질을 포함하는 공제형, 60:40의 비율로 mAb1과 융합 단백질을 포함하는 공제형, mAb1의 제형 (120 mg/mL), mAb1의 제형 (60 mg/mL), 및 융합 단백질의 제형 (40 mg/mL)을 네 가지 스트레스 조건에 적용했다: (a) 차가운-백색광 (CW), (b) 18시간 동안 과산화수소, (c) 자외선 (UV), 및 (d) 37℃에서 28시간 동안 가열. ICH 지침에서 제공한 조건을 포함한 스트레스 조건.

37℃에서 28시간 동안 가열되고 18시간 동안 과산화수소로 처리된 제형 및 공제형은 고분자량 종 (이량체 또는 기타 응집체)을 약간 증가시켰다. 반대로, 차가운-백색광 및 자외선으로 처리된 제형 및 공제형은 높은 수준의 고분자량 종을 포함했다.

2.3 이량체 종의 식별

차가운 백색광에 노출된 120:40 비율의 mAb1 및 융합 단백질을 포함하는 공제형을 1.1에 설명된 시스템을 사용하여 분석하였다. 도 9는 SEC-나노-ESI-MS를 사용하여 분석된 공제형의 추출된 이온 크로마토그램 (XIC)을 보여준다. 이 방법을 통해 단량체 종과 이량체 종이 차별화된다.

전하 환원 기술의 적용은 도 10에 예시된 바와 같이 분자량이 매우 이질적인 단백질 성분의 질량 측정을 크게 향상시켰다.

이중 자외선 (UV) 및 MS 검출 기능을 갖춘 온라인 SEC-나노-전기분무 이온화 (나노-ESI)-MS 플랫폼이 개발되었다. 이 플랫폼의 유용성은 공제형화 제제에서 동종이량체 및 이종이량체 종을 식별함으로써 검증되었다.

3방향 스플리터를 사용하여 SEC 용출액을 MS 및 UV 검출기로 불균형하게 분할하는데, 저용량 분획은 MS로 향하고, 고용량 분획은 UV 검출기로 향하게 했다. 현재 플랫폼은 분획 수집 가능성과 함께 UV 및 기본-MS에 의한 보완적인 이중 검출을 가능하게 했으며, 이량체 종의 특성화에 적용될 수 있다. 컬럼 화학을 변경하거나 Q Exactive UHMR 기기를 사용하는 것과 같이 이 온라인 SEC-나노-ESI-MS 플랫폼에 대한 추가 수정을 통해 전하 변이체 또는 매우 큰 단백질 복합체 분석과 같은 다른 응용 분야에 적용할 수 있다. 본원에 기재된 방법은 고염 분리 기술 (즉, HIC, WCX)과 질량 분석법-기반 검출을 결합할 수 있는 가능성을 열었다. 결론적으로, 온라인 SEC-나노-ESI-MS 플랫폼은 다양한 응용 분야의 단백질 바이오 의약품 분석에 광범위하게 적용될 수 있다.

실시예 3.

3.1 샘플 준비

mAb1 및 융합 단백질 1을 포함하는 공제형이 사용되었다. 실험에 사용된 다양한 샘플 (50 μL)이 표 1에 나와 있다. 음성 대조군 (샘플 3)은 분석 직전에 스트레스 융합 단백질 1 (샘플 1)과 스트레스 mAb1 (샘플 1)을 혼합하여 준비되었고, 여기서 샘플은 ICH 지침에 따라 제공된 자외선을 사용하여 스트레스가 가해졌다. 다른 음성 대조군 (샘플 7)은 분석 직전에 스트레스 융합 단백질 1 (샘플 6)과 스트레스 mAb1 (샘플 5)을 혼합하여 준비했으며, 여기서 샘플은 ICH 지침에 따라 제공된 차가운-백색광을 사용하여 스트레스가 가해졌다.

[표 1]

3.2 면역침전

도 11에 도시된 바와 같이 면역침전을 수행하였다. 6개의 원심분리 튜브에 0.5 ml의 Dynabeads MyOne Streptavidin T1 (자기 비드)과 100 μg의 항-mAb1 항체를 첨가했다. 샘플 1, 2, 4, 5, 6 및 8을 개별 튜브에 첨가하고, 적절한 진탕기에서 부드럽게 혼합하여 실온에서 30분 동안 인큐베이션했다. 모든 비드가 수집되었는지 확인하기 위해 튜브를 자기 스탠드(magnetic stand)에 3분 동안 두었다. 상청액을 제거하고 0.4 mL의 100 mM 아세트산암모늄 완충액을 첨가하였다. 튜브를 Thermomixer에서 800 rpm으로 5분 동안 인큐베이션했다. 이 단계는 2회 (총 3회) 반복되었다. 모든 상청액인, 1.2 mL의 상청액을 1.5 mL 튜브에 수집했다 (그리고 FT1-플로우 스루로 표시됨). 자기 비드는 800 rpm에서 Thermomixer를 사용하여 0.4 mL 10% 아세토니트릴로 세정되었다. 모든 비드가 수집되었는지 확인하기 위해 비드를 자기 스탠드에 3분 동안 두었다. 세정 사이에 상청액을 제거하였다. 이 단계는 3회 반복되었다 (총 4회). 모든 상청액, 즉 1.2 mL의 상청액을 수집하였다. 1.5 mL 튜브에 FT2로 표시하고; 0.2 mL의 용출 완충액 (50% ACN, 0.1% 포름산)을 첨가하고, 1000 rpm으로 Thermomixer에서 5분 동안 실온에서 인큐베이션했다. 모든 상청액을 튜브에 수집하고 PD-풀다운으로 표시했다.

3.3 분석

샘플 분석은 다음 단계를 포함했다: 100 mM Tris-HCl (pH 7.5) 중 8 M 우레아 20 uL를 각 샘플 튜브에 첨가한다. Milli-Q 물 중 100 mM 디티오트레이톨 (DTT) 1 μL를 각 샘플에 첨가하고, 와동시켜 잘 혼합하고, 50℃에서 30분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, Milli-Q 물 중 200 mM 가벼운 표지된 아이오도아세트아미드 (가벼운-IAA) 1.1 uL를 풀다운에 첨가하고, Milli-Q 물 중 200 mM의 무거운 표지된 아이오도아세트아미드 (무거운-IAA) 1.1 uL를 플로우 스루에 첨가한다. 실온에서 30분 동안 어두운 곳에서 풀다운과 플로우 스루 둘 모두를 인큐베이션한다. 이어서, 전체 풀다운과 플로우 스루의 약 10%를 혼합하고, 4 μg의 트립신을 첨가하여 분해하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션했다. LC-MS (Waters ACQUITY UPLC 시스템 및 Thermo Q Exactive 질량 분석기)를 사용하여 분해된 혼합물을 분석하였다.

도 12는 샘플 7 및 8에 대해 얻어진 풀다운 및 플로우 스루의 질량 대 전하 비율을 보여준다. 풀다운 분획은 이종이량체에 융합 단백질 1을 포함하고, 플로우 스루 분획은 단량체와 동종이량체에 존재하는 융합 단백질 1을 포함한다. 도 13은 융합 단백질 1 이종이량체의 계산된 백분율을 보여준다. 계산은 도 4에 나타낸 공식을 사용하여 수행되었다. 융합 단백질 1을 정량화하는 데 사용되는 일부 펩티드에 대해, 샘플 3, 4, 7 및 8의 질량 대 전하 비율 차트가 도 14 내지 17에 표시된다. 도면에서 펩티드 1, 펩티드 2, 펩티드 3, 및 펩티드 4는 각각 펩티드 ²⁵ELVIPCR³¹, 펩티드 ⁷³EIGLLTCEATVNGHLYK⁸⁹, 펩티드 ¹²⁰LVLNCTAR¹²⁷, 및 펩티드 ¹⁷⁸SDQGLYTCAASSGLMTK¹⁹⁴를 나타낸다.

융합 단백질 1 이종이량체 %는 도 18에 나타낸 방법에 따라 이종이량체 %로 전환되었다. 도 18에 나타낸 이종이량체 %에 대한 계산에 기초하여, 샘플 4 및 샘플 8에서 이종이량체 %는 각각 6.4% 및 8.5%인 것으로 밝혀졌다. 음성 대조군 샘플 (샘플 3 및 7)에서 낮은 수준의 "이종이량체 신호"는 혼합 후 mAb1과 융합 단백질 1 사이의 상호작용과 mAb1과 친화성 수지 사이의 비특이적 상호작용에서 기인할 수 있다. 이종이량체 %는 전체 HMW%와 일치했다.

실시예 4.

면역침전에 의한 융합 단백질 이종이량체의 정량 한계 및 선형성을 평가하기 위해, 순차적으로 희석된 차가운-백색 스트레스 공제형 제제를 갖는 샘플을 사용하였다.

표 2에 열거된 바와 같이 제조된 시험 샘플. mAb1 및 융합 단백질 1을 포함하는 공제형을 사용하고, 차가운-백색광을 사용하여 스트레스가 가해졌다. 음성 대조 혼합 샘플은 분석 직전에 스트레스 융합 단백질 1 (샘플 6)과 스트레스 mAb1 (샘플 5)을 혼합하여 준비되었다. 실험에 사용된 다양한 시험 샘플은 표 2에 설명된 바와 같이 준비되었다.

3.2 및 3.3에 설명된 바와 같이 면역침전 및 분석을 수행하였다. 희석 없이 시험된 샘플에서 융합 단백질 이종이량체 %로 정규화된 시험된 샘플에서 융합 단백질 이종이량체 %의 차트는 도 19에 도시되어 있다. 또한, 혼합된 샘플에서 융합 단백질 이종이량체 % 대 차가운-백색 스트레스 샘플 %의 플롯은 융합 단백질 1을 정량화하는 데 사용된 3개의 펩티드에 대해 도 20에 나타나 있으며, 여기서 희석 1의 샘플은 순수한 차가운 백색-스트레스 공제형화 샘플을 나타낸다. 정량화 방법은 최소 0.8%의 이종이량체 (시험된 최저 값)만큼 낮은 우수한 선형성을 유지했다.

실시예 5.

주변 조건에서 이종이량체의 정량화를 평가하기 위해, mAb1 및 융합 단백질 1을 포함하는 공제형화 제제의 샘플을 25℃에서 12개월 동안, 5℃에서 46개월 동안 보관했다. 3.2 및 3.3에 설명된 바와 같이 면역침전 및 분석을 수행하였다. 샘플에서 계산된 정량화는 표 3 및 도 21에서 보여주며, 여기서 상이한 융합 단백질 1 펩티드가 정량화에 사용되었다.

따라서, 공제형화 제제로부터 얻은 샘플에서 이종이량체 수준의 정량화를 위한 새로운 면역침전 방법이 개발되었다. 이는 공제형화 제제에서 UV/CW 스트레스 및 주변 조건 스트레스 샘플 모두에서 이종이량체의 수준을 정량화하는 데 성공적으로 적용되었다.

Claims

적어도 하나의 이량체 종을 식별하는 방법으로서,
이량체 종을 포함하는 샘플을 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 접촉시키는 단계;
이동상을 사용하여 상기 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세정하여 이량체 종을 포함하는 용리액을 제공하는 단계; 및
기본 조건하에 전기분무 이온화 질량 분석기를 사용하여 상기 용리액에서 이량체 종을 식별하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 전기분무 이온화 질량 분석기는 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템에 온라인으로 결합되는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 전기분무 이온화 질량 분석기는 나노-전기분무 이온화 질량 분석기인, 방법.
청구항 1에 있어서, 적어도 3개의 경로가 있는 적어도 하나의 스플리터를 사용하여 전기분무 이온화 질량 분석기 및 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템과 유체 소통을 허용하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 적어도 3개의 경로가 있는 적어도 하나의 스플리터를 사용하여 자외선 검출기와 크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 시스템 사이의 유체 소통을 허용하는, 방법.
청구항 5에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피 수지 세정으로부터의 용리액은 약 0.2 mL/분 내지 약 0.4 mL/분의 유속으로 적어도 하나의 스플리터를 통해 자외선 검출기에 도입되는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세정하는 데 사용되는 이동상은 아세트산암모늄을 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세정하는 데 사용되는 이동상은 휘발성 염을 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세정하는 데 사용되는 이동상은 약 0.2 mL/분 내지 약 0.4 mL/분의 유속을 갖는, 방법.
청구항 1에 있어서, 크로마토그래피 시스템에 접촉되는 이량체 종을 포함하는 샘플의 양은 약 10 μg 내지 약 100 μg인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세정하여 제공되는 용리액은 상기 전기분무 이온화 질량 분석기에 도입되고, 여기서 전기분무 이온화로 인한 전기분무의 유속은 약 10 nL/분 내지 약 50 nL/분인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 크기 배제 크로마토그래피 수지를 세정하여 제공되는 용리액은 상기 전기분무 이온화 질량 분석기에 도입되고, 여기서 전기분무의 분무 전압은 약 0.8 kV 내지 약 1.5 kV인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 샘플은 적어도 2개의 이량체 종을 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 샘플은 동종이량체 종을 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 샘플은 이종이량체 종을 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 샘플은 공제형화 제제로부터 수득되는, 방법.
하기를 포함하는 시스템:
크기 배제 크로마토그래피 수지를 갖는 크로마토그래피 컬럼, 여기서 상기 크로마토그래피 컬럼은 이동상과 단백질을 포함하는 샘플을 수용할 수 있고, 및
전기분무 이온화 질량 분석기, 여기서 상기 전기분무 이온화 질량 분석기는 상기 크로마토그래피 컬럼에 온라인으로 결합될 수 있고 상기 전기분무 이온화 질량 분석기는 기본 조건하에 실행될 수 있음.
청구항 17에 있어서, 상기 크로마토그래피 컬럼은 스플리터를 사용하여 질량 분석기에 결합될 수 있는, 시스템.
청구항 17에 있어서, 상기 크로마토그래피 컬럼은 적어도 3개의 경로가 있는 스플리터를 사용하여 자외선 검출기에 추가로 결합될 수 있는, 시스템.
청구항 17에 있어서, 상기 전기분무 이온화 질량 분석기는 나노-전기분무 이온화 질량 분석기인, 시스템.
제1 단백질과 제2 단백질을 포함하는 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 방법으로서,
고체 표면에 제1 단백질에 특이적인 항체를 고정시키는 단계;
상기 샘플을 상기 항체와 인큐베이션하는 단계;
침전된 샘플을 포획하는 단계;
플로우 스루(flow through)을 수집하는 단계;
상기 침전된 샘플을 제1 화합물로 처리하는 단계;
상기 플로우 스루를 제2 화합물로 처리하는 단계;
상기 처리된 침전 샘플과 상기 처리된 플로우 스루의 적어도 일부를 혼합하여 혼합물을 형성하는 단계; 및
질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 상기 혼합물을 분석하여 상기 샘플에서 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 질량 분석기는 탠덤 질량 분석기인, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 침전된 샘플에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 플로우 스루에 환원제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 혼합물을 분석하기 전에 상기 혼합물을 분해하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 혼합물을 분석하기 전에 상기 혼합물을 탈당화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 처리된 침전 샘플과 상기 처리된 플로우 스루의 약 10%를 혼합하여 혼합물을 형성하는, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 제1 화합물은 상기 제2 화합물의 동위원소인, 방법.
청구항 28에 있어서, 상기 제1 화합물은 아이오도아세트아미드인, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 제1 단백질은 항체인, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 제1 단백질은 단클론 항체인, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 제1 단백질은 다클론 항체인, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 제2 단백질은 융합 단백질인, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 샘플에 차가운-백색광 노출, 과산화수소 노출, 자외선 노출, 열, 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 조건에 적용하여 스트레스가 가해지는, 방법.
청구항 21에 있어서, 상기 샘플은 공제형화 제제로부터 수득되는, 방법.
이종이량체 종을 정량화하는 방법으로서,
이종이량체 종을 면역침전시키는 단계; 및
안정한 동위원소 표지 방법에 이어서 질량 분석기에 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 이종이량체 종을 정량화하는 단계를 포함하는, 방법.