CN113348364A - 共同制剂中二聚体的定量和鉴别 - Google Patents
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Abstract
提供了使用在线色谱法和电喷雾电离质谱法鉴别二聚体物质的方法和系统。还提供了使用免疫沉淀和液相色谱法‑质谱法定量异二聚体物质的方法和系统。
Description
技术领域
本发明总体上涉及使用在线色谱法和电喷雾电离质谱法鉴别二聚体物质以及使用免疫沉淀和液相色谱法-质谱法定量异二聚体物质的方法和系统。
背景技术
蛋白质生物药物产品已作为用于治疗癌症、自身免疫性疾病、感染和心脏代谢病症的重要药物出现，并且其代表药物行业中增长最快的产品类中的一种。
将两种或多种治疗性单克隆抗体(mAb)和/或活性蛋白共同配制成一种最终药物产品的策略最近广受欢迎，提供了多种优势，包括增加功效、总体上减少不良事件以及提高患者便利性和依从性。在单一制剂中配制两种不同的mAb和/或活性蛋白可能会有问题，并且涉及选择可能代表折衷的赋形剂和条件。除了关于制剂研发方面的挑战外，共同配制的药物也对分析表征提出了重大挑战。举例来说，在正常储存或加压条件下，共同配制的药物中存在的不同二聚体形式的区分和定量可能具有挑战性，并且通常无法通过传统方法(例如尺寸排阻色谱法)实现。
包括共同配制的制剂的蛋白质生物药物产品必须满足非常高的纯度标准。因此，在药物研发、生产、储存和处理的不同阶段监测共同配制的制剂中的任何杂质可能很重要。用于表征测定的分析方法应显示足够的准确度和分辨率，以检测和定量所需产品。直接分析可能需要分离足够大量的产物以进行测定，这是不合需要的，并且仅在选定的情况下才有可能。
本领域长期需要一种用于表征共同配制的制剂的方法和/或系统。
发明内容
蛋白质生物药物产品的研发、制造和销售的增长导致对蛋白质生物药物以及可能的杂质进行表征的需求不断增加。研发稳定的共同配制的制剂带来了另外的挑战，因为其需要确定抗体混合物中存在的单独蛋白质的稳定性和降解性。由于制剂中的大量蛋白质、异二聚体物质、同二聚体物质的形成以及这些蛋白质之间的相似性，这种确定通常是困难的。
本文公开的示例性实施方案通过提供用于鉴别二聚体物质和/或定量异二聚体物质的方法和/或系统来满足前述需求。
本公开至少部分地提供了一种用于鉴别二聚体物质的方法。在一个示例性实施方案中，用于鉴别二聚体物质的方法包括使包含二聚体物质的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述树脂以提供包含二聚体物质的洗脱液，以及使用电喷雾电离质谱仪鉴别所述洗脱液中的二聚体物质。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括将电喷雾电离质谱仪耦接至具有色谱树脂的色谱系统。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括将电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括在天然条件下操作的电喷雾电离质谱仪。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括纳米电喷雾电离质谱仪。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括在天然条件下操作的纳米电喷雾电离质谱仪。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括具有至少三个路径的至少一个分流器，以将电喷雾电离质谱仪耦接至具有树脂的色谱系统。
在这个实施方案的一个方面中，鉴别二聚体物质的方法可以包括具有至少三个路径的至少一个分流器，以将紫外光检测器耦接至具有树脂的色谱系统。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括具有至少三个路径的至少一个分流器，以将紫外光检测器和电喷雾电离质谱仪耦接至具有树脂的色谱系统。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括具有至少三个路径的至少一个分流器，以将电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括具有至少三个路径的至少一个分流器，以将紫外光检测器耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括具有至少三个路径的至少一个分流器，以将紫外光检测器和电喷雾电离质谱仪耦接至具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括使用流动相洗涤树脂以提供包括二聚体包括的洗脱液，其中可以通过具有至少三个路径的至少一个分流器以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速将洗脱液引入到紫外光检测器中。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括包含挥发性盐的流动相。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括包含乙酸铵的流动相。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括用流动相以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速洗涤树脂。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括pH为约6.8的流动相。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括包括量为约10μg至约100μg的二聚体物质的样品。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括包括抗体的二聚体物质。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括包括融合蛋白的二聚体物质。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括流速为约10nL/min至约50nL/min的电喷雾电离质谱仪。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括电喷雾电离质谱仪，其中电喷雾的喷雾电压为约0.8kV至约1.5kV。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法，其中所述二聚体物质可为同二聚体物质。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法，其中所述二聚体物质可为异二聚体物质。
在这个实施方案的一个方面中，用于鉴别二聚体物质的方法可以包括使包含二聚体物质的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触，其中所述样品可以包含蛋白质单体。
本公开至少部分地提供了一种包含具有色谱树脂的色谱柱的系统。在一个示例性实施方案中，系统包含具有色谱树脂的色谱柱，其中色谱柱能够接收流动相和包含蛋白质的样品，以及电喷雾电离质谱仪。
在这个实施方案的一个方面中，系统可以包含具有尺寸排阻色谱树脂的色谱柱。
在这个实施方案的一个方面中，系统可以包含能够耦接至所述色谱柱的电喷雾电离质谱仪。
在这个实施方案的一个方面中，系统可以包含能够在天然条件下运行的电喷雾电离质谱仪。
在这个实施方案的一个方面中，系统可以包含纳米电喷雾电离质谱仪。
在这个实施方案的一个方面中，系统可以包含能够使用具有至少三个路径的分流器耦接至质谱仪的色谱柱。
在这个实施方案的一个方面中，系统可以包含能够使用具有至少三个路径的分流器耦接至紫外光检测器的色谱柱。
在这个实施方案的一个方面中，系统可以包含能够使用具有至少三个路径的分流器耦接至紫外光检测器和质谱仪的色谱柱。
在这个实施方案的一个方面中，系统可能能够鉴别二聚体物质。
本公开至少部分地提供了一种用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法，所述方法包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上，将样品与所述抗体一起孵育，捕获沉淀样品，收集流过物，用第一化合物处理沉淀样品，用第二化合物处理流过物，将处理过的沉淀样品和至少一部分处理过的流过物混合以形成混合物，并且使用耦接至质谱仪的液相色谱分析混合物以定量样品中的异二聚体物质。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上，其中第一蛋白质可为单克隆的抗体。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上，其中固体表面包含磁珠。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上，其中固体表面包含链霉亲和素。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上并捕获沉淀样品，其中沉淀样品包括与固体表面上对第一蛋白质具有特异性的抗体结合的异二聚体物质。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上并捕获沉淀样品，其中沉淀样品包含与固体表面上对第一蛋白质具有特异性的抗体结合的异二聚体物质。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品、重新悬浮沉淀样品并加热重新悬浮的沉淀样品。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品并收集流过物。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理流过物。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，其中第一化合物可为第二化合物的同位素。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，并且将处理过的沉淀样品和至少一部分处理过的流过物混合以形成混合物。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，将处理过的沉淀样品和至少一部分处理过的流过物混合以形成混合物，并且消化混合物。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，将处理过的沉淀样品和至少一部分处理过的流过物混合以形成混合物，消化混合物，并且将消化的混合物去糖基化。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，将处理过的沉淀样品和至少一部分处理过的流过物混合以形成混合物，消化混合物，并且使用耦接至质谱仪的液相色谱分析混合物以定量样品中的异二聚体物质。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，将处理过的沉淀样品和至少一部分处理过的流过物混合以形成混合物，消化混合物，将消化的混合物去糖基化，并且使用耦接至质谱仪的液相色谱分析混合物以定量样品中的异二聚体物质。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括使用耦接至质谱仪的液相色谱进行分析以定量样品中的异二聚体物质，其中质谱仪可为串联质谱仪。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，并且向处理过的沉淀样品中添加还原剂。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，并且向处理过的流过物中添加还原剂。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，将处理过的沉淀样品和约10％的处理过的流过物混合以形成混合物，并且使用耦接至质谱仪的液相色谱分析混合物以定量样品中的异二聚体物质。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上、捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，将处理过的沉淀样品和约10％的处理过的流过物混合以形成混合物，消化混合物，并且使用耦接至质谱仪的液相色谱分析混合物以定量样品中的异二聚体物质。
本公开至少部分地提供了一种用于定量异二聚体物质的方法。在一个示例性实施方案中，用于定量异二聚体物质的方法包括对异二聚体物质进行免疫沉淀并通过使用稳定的同位素标记方法随后使用耦接至质谱仪的液相色谱来定量异二聚体物质。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量异二聚体物质的方法可以包括包括抗体的异二聚体物质。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量异二聚体物质的方法可以包括包括融合蛋白的异二聚体物质。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量异二聚体物质的方法可以包括通过使用固体表面上的抗体对异二聚体物质进行免疫沉淀。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量异二聚体物质的方法可以包括通过使用固体表面上的抗体对异二聚体物质进行免疫沉淀，其中抗体可以与来自异二聚体的蛋白质结合。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量异二聚体物质的方法可以包括使用稳定的同位素标记方法与烷基化化合物。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量异二聚体物质的方法可以包括使用稳定的同位素标记方法与烷基化化合物。
在这个实施方案的一个方面中，用于定量异二聚体物质的方法除了使用稳定的同位素标记方法之外还可以包括进行消化。
附图说明
图1显示了能够鉴别二聚体物质的系统的示例性实施方案。
图2显示了用于定量共同配制的制剂样品中的异二聚体物质的方法的示例性实施方案。
图3显示了根据示例性实施方案的用于定量阴性样品中蛋白质与抗体的非特异性结合的方法。
图4显示了用于定量共同配制的制剂样品中的异二聚体物质的方法的示例性实施方案。
图5显示了可能存在于包含三种单克隆抗体的共同制剂中的六种二聚体。
图6显示了根据示例性实施方案的使用天然SEC-MS分析鉴别包含三种单克隆抗体的共同制剂中的异二聚体物质。
图7显示了根据示例性实施方案的使用天然SEC-MS分析定量包含三种单克隆抗体的共同制剂中的异二聚体物质。
图8显示了可能存在于包含单克隆抗体和融合蛋白的共同制剂中的三种二聚体。
图9显示了根据示例性实施方案区分的共同制剂的提取离子色谱图(XIC)。
图10显示了根据示例性实施方案区分的共同制剂的二聚体物质的质荷比测定。
图11显示了根据示例性实施方案的用于异二聚体定量的免疫沉淀和同位素标记策略的工作流程。
图12显示了针对根据示例性实施方案的冷白加压的共同制剂和阴性样品所获得的下拉物和流过物级分的质荷比。
图13显示了在不同条件下加压的样品中发现的融合蛋白1的四种肽中融合蛋白1异二聚体％的图表，其中根据示例性实施方案进行定量。
图14显示了在不同条件下加压的样品中融合蛋白1肽1(轻片段和重片段)的质荷比的图表，其中根据示例性实施方案进行包含融合蛋白1的异二聚体的定量。
图15显示了在不同条件下加压的样品中融合蛋白1肽2(轻片段和重片段)的质荷比的图表，其中根据示例性实施方案进行包含融合蛋白1的异二聚体的定量。
图16显示了在不同条件下加压的样品中融合蛋白1肽3(轻片段和重片段)的质荷比的图表，其中根据示例性实施方案进行包含融合蛋白1的异二聚体的定量。
图17显示了在不同条件下加压的样品中融合蛋白1肽4(轻片段和重片段)的质荷比的图表，其中根据示例性实施方案进行包含融合蛋白1的异二聚体的定量。
图18显示了将融合蛋白1异二聚体％转化为异二聚体％的计算，其中根据示例性实施方案进行包含融合蛋白1的异二聚体的定量。
图19表示测试样品中的融合蛋白1异二聚体％归一化为未稀释的测试样品中的融合蛋白异二聚体％的图表，其中根据示例性实施方案进行包含融合蛋白1的异二聚体的定量。
图20显示了用于定量融合蛋白1的三种肽的混合样品中融合蛋白1异二聚体％相比于冷白加压的样品％的图，其中根据示例性实施方案进行包含融合蛋白1的异二聚体的定量。
图21显示了来自储存在环境条件下的共同配制的制剂的样品中的融合蛋白1异二聚体％，其中根据示例性实施方案进行包含融合蛋白1的异二聚体的定量。
具体实施方式
在产品的生产和研发期间，蛋白质生物药物产品中蛋白质的鉴别和定量可能非常重要。对任何蛋白质生物药物产品中的杂质进行分析对于研发安全和有效的产品可能是必不可少的。因此，表征杂质的稳健方法和/或工作流程可能是有益的。
大多数生物药物产品可包含单一蛋白质。在一些情况下，针对单个靶标的多种蛋白质或联合施用的多个靶标可以改善其的诊断或治疗适应症和功效。此类共同配制的制剂的研发正成为越来越受欢迎的剂型(Svend Havelund等人,Investigation of thePhysico-Chemical Properties that Enable Co-Formulation of Basal InsulinDegludec with Fast-Acting Insulin Aspart,32 PHARMACEUTICAL RESEARCH 2250–2258(2015)；Sanjay Kalra&Yashdeep Gupta,Injectable Coformulations in Diabetology,6DIABETES THERAPY101–111(2015)；Ryzodeg,EUROPEAN MEDICINES AGENCY-FINDMEDICINE-RAXONE,https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/ryzodeg(2019年1月17日最后一次访问))。
然而，共同配制的制剂的研发具有一些挑战，因为其需要研究潜在的药效学相互作用、潜在的药代动力学相互作用、毒理学相互作用的可能性、内源性水平或活性变化的可能性，以及损害药物中的一种的功效(Claudia Mueller,Ulrike Altenburger&SilkeMohl,Challenges for the pharmaceutical technical development of proteincoformulations,70 JOURNAL OF PHARMACY AND PHARMACOLOGY 666–674(2017))。稳定的共同配制的制剂的制造也可能需要另外的努力来确保在制造的不同步骤中另外两种蛋白质的稳定性。
在储存、运输和施用期间，最终的共同配制的产品可能会暴露于光、热和氧气并引起聚集(高分子量物质同二聚体和/或异二聚体)、电荷模式、片段化、化学修饰(例如，氧化、脱酰胺)等。
良好的分析方法性能和灵敏度对于确保最终的共同配制的产品的高质量和安全性至关重要。然而，与用于包含单一蛋白质作为活性药物成分的制剂的方法相比，用于研发和评估共同配制的制剂的分析方法可能具有极大的挑战性和复杂性。这可能会变得具有挑战性，因为用于包含单一蛋白质的制剂的某些标准方法可能并不总是能够区分共同配制的制剂中的蛋白质。
其中一种方法包括使用尺寸排阻色谱法(SEC)来表征生物技术行业中的生物分子聚集和片段化(Hong Paule等人,Size-Exclusion Chromatography for the Analysis ofProtein Biotherapeutics and their Aggregates,35JOURNAL OF LIQUIDCHROMATOGRAPHY AND RELATED TECHNOLOGY 2923-2950(2012))。SEC对分子的分离依赖于分子与固定相上的受控多孔结构的不同相互作用。由于SEC使用保留溶液中的蛋白质的天然结构的缓冲条件，因此允许在不干扰其天然构象的情况下对生物分子进行表征。此外，在可能与SEC联合的各种检测模式中，质谱法(MS)允许精确和准确地鉴别复杂样品中的单独成分。先前已报道SEC和MS的组合，包括收集SEC峰，然后直接注入MS(
Kükrer等人,Mass Spectrometric Analysis of Intact Human Monoclonal Antibody AggregatesFractionated by Size-Exclusion Chromatography,27PHARMACEUTICAL RESEARCH 2197–2204(2010)；
Debaene等人,Innovative Native MS Methodologies forAntibody Drug Conjugate Characterization:High Resolution Native MS and IM-MSfor Average DAR and DAR Distribution Assessment,86ANALYTICAL CHEMISTRY 10674–10683(2014))或在线SEC-MS(Khaja Muneeruddin等人,Characterization of SmallProtein Aggregates and Oligomers Using Size Exclusion Chromatography withOnline Detection by Native Electrospray Ionization Mass Spectrometry,86ANALYTICAL CHEMISTRY 10692–10699(2014)；C.F.Mcdonagh等人,Engineeredantibody-drug conjugates with defined sites and stoichiometries of drugattachment,19 PROTEIN ENGINEERING DESIGN AND SELECTION 299–307(2006))。然而，为直接电离从SEC分离产生的高流量，需要苛刻的电离条件，所述条件通常与原生MS分析不兼容，从而限制了将这些技术联合用于非共价相互作用分析的效用。此外，质谱仪的灵敏度可能会受到SEC缓冲液中使用的高盐浓度的影响。
除了鉴别之外，定量在共同配制的产品中形成的异二聚体也可能带来挑战，因为形成的异二聚体的量需要在蛋白质单体和任何存在的同二聚体的存在下进行评估。
考虑到现有方法的局限性，研发了用于鉴别和定量二聚体物质的有效和高效方法。
除非另外描述，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域中普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然在实践或测试中可使用类似或等同于本文所描述的那些方法和材料的任何方法和材料，但现在描述特定的方法和材料。提及的所有出版物特此以引用的方式并入。
术语“一个/种(a)”应理解为意指“至少一个/种”；并且术语“约”和“大约”应理解为允许如本领域普通技术人员将理解的标准变化；并且在提供范围时，则包括端点。
在一些示例性实施方案中，本公开提供了一种用于鉴别共同配制的制剂中的二聚体物质的方法。
如本文所用，“共同配制的制剂”包括在单一剂型中的两种或更多种活性药物成分。这种剂型可用于通过靶向不同的分子靶标来治疗、预防或改善某种疾病状况，并且由于与单独的药物相比的附加和/或协同作用，患者的整体医疗状况得到改善(ClaudiaMueller,Ulrike Altenburger&Silke Mohl,Challenges for the pharmaceuticaltechnical development of protein coformulations,70JOURNAL OF PHARMACY ANDPHARMACOLOGY 666–674(2017))。一些优势包括与单一药物相比提高功效、总体上减少不良事件、提高患者便利性和依从性(提高患者依从性、简化患者指导和教育)、降低医疗保健成本(制造和购买)、更容易的供应流程，以及现有上市产品的生命周期管理中的新产品机会。
在一些示例性实施方案中，两种或更多种活性药物成分可为蛋白质。
在一些示例性实施方案中，共同配制的制剂可以包含至少两种蛋白质。
在一些示例性实施方案中，共同配制的制剂可以包含至少三种蛋白质。
如本文所用，术语“蛋白质”包括具有共价连接的酰胺键的任何氨基酸聚合物。蛋白质包含一个或多个氨基酸聚合物链，在本领域中通常称为“多肽”。“多肽”是指由氨基酸残基组成的聚合物、相关的天然存在的结构变体以及其通过肽键连接的合成的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体及其合成的非天然存在的类似物。“合成的肽或多肽”是指非天然存在的肽或多肽。合成的肽或多肽可例如使用自动化多肽合成仪来合成。各种固相肽合成方法是已知的。蛋白质可含有一种或多种多肽以形成单一功能生物分子。蛋白质可包括生物治疗性蛋白质、用于研究或治疗的重组蛋白、trap蛋白和其他嵌合受体Fc融合蛋白、嵌合蛋白、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人类抗体和双特异性抗体中的任一种。在另一个示例性方面，蛋白质可包括抗体片段、纳米抗体、重组抗体嵌合体、细胞因子、趋化因子、肽激素等。蛋白质可使用基于重组细胞的生产系统来产生，例如昆虫杆状病毒系统、酵母系统(例如，毕赤酵母属(Pichia sp.))、哺乳动物系统(例如，CHO细胞和CHO衍生物，如CHO-K1细胞)。对于讨论生物治疗性蛋白质及其生产的综述，参见Ghaderi等人,"Production platforms for biotherapeutic glycoproteins。Occurrence,impact,andchallenges of non-human sialylation,"(BIOTECHNOL.GENET.ENG.REV.147-175(2012))。在一些示例性实施方案中，蛋白质包含修饰、加合物和其他共价连接的部分。这些修饰、加合物和部分包括例如亲和素、链霉亲和素、生物素、聚糖(例如，N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、神经氨酸、N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖、甘露糖和其他单糖)、PEG、聚组氨酸、FLAG标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)、几丁质结合蛋白(CBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)myc表位、荧光标记和其他染料等。蛋白质可根据组成和溶解度来分类，并且因此可包括简单的蛋白质，例如球状蛋白质和纤维状蛋白质；缀合蛋白，例如核蛋白、糖蛋白、粘蛋白、色蛋白、磷蛋白、金属蛋白和脂蛋白；以及衍生蛋白，例如初级衍生蛋白和次级衍生蛋白。
在一些示例性实施方案中，蛋白质可为抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体或Fc融合蛋白。一方面，蛋白质是抗VEGF蛋白。在一具体方面，VEGF-蛋白是阿柏西普(Aflibercept)。
如本文所用，术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)的免疫球蛋白分子以及其多聚体(例如IgM)。每条重链包含重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH和VL区可进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区，穿插有被称为框架区(FR)的较保守区。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在不同的示例性实施方案中，抗大-ET-1抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人类种系序列相同，或可为天然或人工修饰的。氨基酸共有序列可基于两个或更多个CDR的并行分析来定义。如本文所用，术语“抗体”还包括完整抗体分子的抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。可使用诸如蛋白水解消化或重组基因工程化技术的任何合适的标准技术例如从完整抗体分子衍生出抗体的抗原结合片段，所述重组基因工程化技术涉及编码抗体可变结构域和任选地恒定结构域的DNA的操纵和表达。此类DNA为已知的和/或为从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)轻易可获得的或可为合成的。可以化学方式或通过使用分子生物学技术对DNA进行测序和操纵，例如以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型，或引入密码子；形成半胱氨酸残基；修饰、添加或去除氨基酸等。
如本文所用，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如像抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fc片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd′片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域，以及三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。Fv片段为免疫球蛋白重链和轻链可变区的组合，并且ScFv蛋白为重组单链多肽分子，其中免疫球蛋白轻链可变区和重链可变区通过肽接头连接。抗体片段可通过各种方式产生。例如，抗体片段可通过使完整抗体片段化来酶促或化学产生，且/或其可由编码部分抗体序列的基因重组产生。可替代地或另外，抗体片段可全部或部分合成产生。抗体片段可任选地包括单链抗体片段。可替代地或另外，抗体片段可包含例如通过二硫键连接在一起的多条链。抗体片段可任选地包括多分子复合物。
如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可通过本领域可获得的或已知的任何方式衍生自单个克隆，包括任何真核、原核或噬菌体克隆。可用于本公开的单克隆抗体可使用本领域已知的多种技术来制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术或其组合。
如本文所用，术语“Fc融合蛋白”包括在其天然状态下未融合的两种或更多种蛋白质的部分或全部，所述蛋白质中的一种为免疫球蛋白分子的Fc部分。已例如由Ashkenazi等人,Proc.Natl.Acad.ScL USA 88:10535,1991；Byrn等人,Nature 344:677,1990；以及Hollenbaugh等人,“Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins”,in CurrentProtocols in Immunology,增刊4,第10.19.1-10.19.11页,1992描述包含某些融合于抗体源性多肽的各种部分(包括Fc结构域)的异源多肽的融合蛋白的制备。“受体Fc融合蛋白”包含受体的偶合至Fc部分的一个或多个细胞外结构域中的一个或多个，在一些实施方案中，其包含免疫球蛋白的铰链区、接着CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，Fc融合蛋白含有结合至单个配体或多于一个配体的两个或更多个不同受体链。举例来说，Fc融合蛋白为trap，例如像IL-1 trap(例如利纳西普(Rilonacept)，其含有融合至与hIgG1 Fc融合的IL-1R1细胞外区的IL-1 RAcP配体结合区，参见美国专利号6,927,004，其以引用的方式整体并入本文中)或VEGF Trap(例如阿柏西普，其含有融合至与hIgG1 Fc融合的VEGF受体Flk1 Ig结构域3的VEGF受体Flt1 Ig结构域2；例如SEQ ID NO:1；参见美国专利号7,087,411和7,279,159，其以引用的方式整体并入本文中)。
在一些示例性实施方案中，共同配制的制剂可包含二聚体物质。一方面，共同配制的制剂可包含同二聚体物质。在一些其他具体的示例性实施方案中，共同配制的制剂可以包含异二聚体物质。在另一方面，共同配制的制剂可以包含同二聚体物质和异二聚体物质。
在一些示例性实施方案中，共同配制的制剂可包含二聚体物质作为杂质。
如本文所用，术语“杂质”可包括存在于蛋白质生物药物产品中的任何不期望的蛋白质。杂质可包括过程相关杂质和产品相关杂质。杂质可以进一步具有部分表征或未鉴别的已知结构。过程相关杂质可来源于制造过程，并且可包括三个主要类别：细胞底物来源、细胞培养物来源和下游来源。细胞底物来源的杂质包括但不限于源自宿主生物的蛋白质和核酸(宿主细胞基因组、载体或总DNA)。细胞培养物来源的杂质包括但不限于诱导剂、抗生素、血清和其他培养基成分。下游来源的杂质包括但不限于酶、化学试剂和生物化学处理试剂(例如，溴化氰、胍、氧化剂和还原剂)、无机盐(例如，重金属、砷、非金属离子)、溶剂、载体、配体(例如，单克隆抗体)和其他可浸出物。产品相关杂质(例如前体、某些降解产物)可为制造和/或储存期间产生的分子变体，其具有在活性、功效和安全性方面与所需产品相当的特性。此类变体在分离和表征方面可能需要大量的努力，以便鉴别一种或多种修饰的类型。产品相关杂质可包括截短形式、修饰形式和聚集体。截短形式由催化肽键裂解的水解酶或化学物质形成。修饰形式包括但不限于脱酰胺化形式、异构化形式、错配性S-S连接形式、氧化形式或改变的缀合形式(例如，糖基化、磷酸化)。修饰形式也可包括任何翻译后修饰形式。聚集体包括所需产物的二聚体和更高聚体。(Q6B Specifications:Test Proceduresand Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products,ICH 1999年8月,U.S.Dept.of Health and Humans Services)。
如本文所用，通用术语“翻译后修饰”或“PTM”是指多肽在其核糖体合成期间(共翻译修饰)或之后(翻译后修饰)经历的共价修饰。PTM通常通过特定的酶或酶途径引入。许多PTM发生在蛋白质主链内的特定特征性蛋白质序列(签名序列)位点。已记录了数百个PTM，并且这些修饰总是影响蛋白质的结构或功能的一些方面(Walsh,G.“Proteins”(2014)第二版本,由Wiley and Sons,Ltd.出版,ISBN:9780470669853)。各种翻译后修饰包括但不限于裂解、N末端延伸、蛋白质降解、N末端的酰化、生物素化(用生物素使赖氨酸残基酰化)、C末端的酰胺化、糖基化、碘化、辅基的共价连接、乙酰化(通常在蛋白质的N末端处添加乙酰基)、烷基化(通常在赖氨酸或精氨酸残基处添加烷基(例如，甲基、乙基、丙基))、甲基化、腺苷酸化、ADP-核糖基化、在多肽链内或多肽链之间的共价交联、磺化、异戊二烯化、维生素C依赖性修饰(脯氨酸和赖氨酸羟基化和羧基末端酰胺化)、维生素K依赖性修饰(其中维生素K为谷氨酸残基羧化过程中的辅助因子，从而导致形成γ-羧基谷氨酸(glu残基))、谷氨酰化(谷氨酸残基的共价键)、甘氨酰化(glycylation)(甘氨酸残基的共价键)、糖基化(将糖基加到天冬酰胺、羟赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸，从而产生糖蛋白)、异戊二烯基化(添加类异戊二烯基团，例如法尼醇(farnesol)和香叶基香叶醇(geranylgeraniol))、脂基化(连接脂酸酯官能团)、磷酸泛锡基化(添加来自辅酶A的4'-磷酸泛亚锡基部分，例如在脂肪酸、聚酮化合物、非核糖体肽和亮氨酸生物合成中)、磷酸化(通常向丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸添加磷酸基团)和硫酸化(通常向酪氨酸残基添加硫酸盐基团)。改变氨基酸化学性质的翻译后修饰包括但不限于瓜氨酸化(通过脱氨基将精氨酸转化为瓜氨酸)和脱酰胺基(将谷氨酰胺转化为谷氨酸或将天冬酰胺转化为天冬氨酸)。涉及结构变化的翻译后修饰包括但不限于形成二硫键(两个半胱氨酸氨基酸的共价连接)和蛋白水解裂解(蛋白质在肽键处的裂解)。某些翻译后修饰涉及添加其他蛋白质或肽，例如ISG化(与ISG15蛋白(干扰素刺激基因)共价连接)、SUMO化(与SUMO蛋白(小泛素相关性修饰物)共价连接)和泛素化(与蛋白质泛素共价连接)。对于由UniProt展示的PTM的更详细受控词表，参见EuropeanBioinformatics Institute Protein Information ResourceSIB Swiss Institute ofBioinformatics、EUROPEAN BIOINFORMATICS INSTITUTE DRS-DROSOMYCIN PRECURSOR-DROSOPHILA MELANOGASTER(FRUIT FLY)-DRS GENE&PROTEIN、http://www.uniprot.org/docs/ptmlist(2019年1月15日最后一次访问)。
在一些示例性实施方案中，可以通过将包含二聚体物质的样品与色谱系统接触来鉴别二聚体物质。
如本文所用，术语“色谱法”是指一种过程，其中由于化学实体在固定液相或固相周围或上方流动时的差异分布，可将由液体或气体携带的化学混合物分离成组分。色谱法的非限制性实例包括传统的反相(RP)、离子交换(IEX)、混合模式色谱法和正相色谱法(NP)。
如本文所用，术语“混合模式色谱法(MMC)”或“多模式色谱法”包括其中溶质通过超过一种相互作用模式或机制与固定相相互作用的色谱法。MMC可用作传统的反相(RP)、离子交换(IEX)和正相色谱法(NP)的替代或补充工具。与分别以疏水相互作用、亲水相互作用和离子相互作用为主要相互作用模式的RP、NP和IEX色谱不同，混合模式色谱可采用这些相互作用模式中两种或更多种的组合。混合模式色谱介质可提供无法通过单一模式色谱法重现的独特选择性。与基于亲和的方法相比，混合模式色谱还可以提供潜在的成本节约和操作灵活性。
在一些示例性实施方案中，色谱法可为尺寸排阻色谱法。
如本文所用，术语“SEC色谱树脂”或“SEC色谱介质”在本文中可互换使用，并且可包括在SEC中使用的从所需产物分离杂质(例如，双特异性抗体产物之同二聚体污染物)的任何种类的固相。树脂的体积、待使用的柱的长度和直径以及动态容量和流速可取决于几个参数，例如待处理的流体体积、待经受过程的流体中蛋白质的浓度。
在一些示例性实施方案中，用于鉴别二聚体物质的方法可包括使用流动相使包含蛋白质生物药物的样品与色谱系统接触以提供包含二聚体物质的洗脱液；使用电喷雾电离质谱仪鉴别所述洗脱液中的蛋白质。
如本文所用，术语“质谱仪”包括能够鉴别特定分子物质并测量其准确质量的装置。所述术语意在包括可在其中洗脱多肽或肽以进行检测和/或表征的任何分子检测器。质谱仪可包括三个主要部分：离子源、质量分析器和检测器。离子源的作用是产生气相离子。可将分析物的原子、分子或簇转移到气相中并同时进行电离(如电喷雾电离)。离子源的选择在很大程度上取决于应用。
在一些实施方案中，质谱仪可为电喷雾质谱仪。
如本文所用，术语“电喷雾电离”或“ESI”是指喷雾电离的过程，其中溶液中的阳离子或阴离子通过形成高电荷液滴流并在大气压下使其去溶剂来转移到气相中，所述液滴流通过在含有溶液的电喷雾针尖端与反电极之间施加电势差来产生。由溶液中的电解质离子生产气相离子通常需要三个主要步骤。这些步骤为：(a)在ES注入尖端产生带电荷液滴；(b)由于溶剂蒸发而使带电荷液滴收缩，并且液滴反复崩解，从而形成能够产生气相离子的高电荷小液滴；以及(c)由非常小的高电荷液滴产生气相离子的机制。阶段(a)-(c)通常发生在设备的大气压区域。
如本文所用，术语“电喷雾注入装置”是指与用于蛋白质质量分析的质谱仪兼容的电喷雾电离系统。在电喷雾电离中，电喷雾针的孔口靠近光谱仪的入口孔口。可以将包含感兴趣蛋白质的样品泵送穿过注射器针。注射器针孔口与通向质量分析器的孔口之间的电势形成溶液的喷雾(“电喷雾”)。电喷雾可以在大气压下进行，并提供溶液的高电荷液滴。电喷雾注入装置可以包括电喷雾发射器、雾化气体和/或ESI电源。可以任选地使所述装置自动化，以执行样品抽吸、样品分配、样品递送和/或用于喷涂样品。
在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪可为纳米电喷雾电离质谱仪。
如本文所用，术语“纳米电喷雾”或“纳米喷雾”是指在通常不使用外部溶剂递送的情况下在非常低的溶剂流速(通常每分钟数百纳升样品溶液或更低)下的电喷雾电离。形成纳米电喷雾的电喷雾注入装置可使用静态纳米电喷雾发射器或动态纳米电喷雾发射器。静态纳米电喷雾发射器在延长的时间段内对小样品(分析物)溶液体积进行连续分析。动态纳米电喷雾发射器使用毛细管柱和溶剂递送系统对混合物进行色谱分离，然后通过质谱仪进行分析。
如本文所用，术语“质量分析器”包括可根据质量分离物质(即，原子、分子或簇)的装置。可用于快速蛋白质测序的质量分析器的非限制实例为飞行时间(TOF)、扇形磁场/扇形电场、四极滤质器(Q)、四极离子阱(QIT)、轨道阱、傅立叶变换离子回旋共振(FTICR)以及加速器质谱法(AMS)。
在一些示例性实施方案中，质谱法可以在天然条件下进行。
如本文所用，术语“天然条件”或“天然MS”或“天然ESI-MS”可包括在保留分析物中的非共价相互作用的条件下进行质谱分析。对于关于天然MS的详细评论，参见以下综述：Elisabetta Boeri Erba&Carlo Petosa,The emerging role of native massspectrometry in characterizing the structure and dynamics of macromolecularcomplexes,24PROTEIN SCIENCE1176–1192(2015)。表1中示出了天然ESI与常规ESI之间的一些区别(Hao Zhang等人,Native mass spectrometry of photosynthetic pigment-protein complexes,587FEBS Letters 1012–1020(2013))。
表1。
在一些示例性实施方案中，质谱仪可为串联质谱仪。
如本文所用，术语“串联质谱法”包括通过使用质量选择和质量分离的多个阶段获得关于样品分子的结构信息的技术。先决条件是样品分子可被转移到气相中并被完整电离，并且可在第一质量选择步骤之后以某种可预测且可控制的方式诱导其分解。多阶段MS/MS或MSn可通过以下方法进行：首先选择并分离前体离子(MS2)、使其片段化、分离出初级片段离子(MS3)、使其片段化、分离出次级片段(MS4)，以此类推，只要人们可获得有意义的信息或片段离子信号是可检测的。串联MS已成功地与多种分析器组合一起使用。对于某个应用，要组合哪些分析器取决于许多不同的因素，例如灵敏度、选择性和速度，还取决于尺寸、成本和可用性。串联MS方法的两个主要类别为空间串联和时间串联，但也存在时间串联分析器在空间中耦接或与空间串联分析器耦接的混合方法。空间串联质谱仪包括离子源、前体离子活化装置和至少两个非捕获质量分析器。可以设计特定m/z分离功能，以便在仪器的一个区段中选择离子，在中间区域解离，并且然后将产物离子传输到另一个分析器中进行m/z分离和数据采集。在时间串联质谱仪中，离子源中产生的离子可以在同一个物理设备中被捕获、分离、片段化和m/z分离。
由质谱仪鉴别的肽可用作代表完整蛋白质及其翻译后修饰的替代物。其可以用于通过将实验和理论MS/MS数据相关联来进行蛋白质表征，所述理论数据由蛋白质序列数据库中可能的肽产生。表征包括但不限于对蛋白质片段的氨基酸进行测序、确定蛋白质测序、确定蛋白质从头测序、定位翻译后修饰、或鉴别翻译后修饰、或相似性分析、或其组合。
如本文所用，术语“数据库”是指生物信息学工具，其提供针对数据库中的所有可能序列搜索未解释的MS-MS谱图的可能性。此类工具的非限制性实例为Mascot(http://www.matrixscience.com)、Spectrum Mill(http://www.chem.agilent.com)、PLGS(http://www.waters.com)、PEAKS(http://www.bioinformaticssolutions.com)、Proteinpilot(http://download.appliedbiosystems.com//proteinpilot)、Phenyx(http://www.phenyx-ms.com)、Sorcerer(http://www.sagenresearch.com)、OMSSA(http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/omssa/)、X！Tandem(http://www.thegpm.org/TANDEM/)、Protein Prospector(http://www.http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm)、Byonic(https://www.proteinmetrics.com/products/byonic)或Sequest(http://fields.scripps.edu/sequest)。
在一些示例性实施方案中，本公开提供了一种用于定量异二聚体物质的方法。
在一些实施方案中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的异二聚体物质的方法可以包括将第一蛋白质特异性抗体固定在固体表面上。可以使用文献中的任何已知方法制备对第一蛋白质具有特异性的抗体。
如本文所用，术语“固体表面”可包括具有与所关注的抗体结合的能力的任何表面。在包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品的一些实施方案中，所关注的抗体可为对第一蛋白质具有特异性的抗体。固体表面的非限制性实例可包括亲和树脂、磁珠和具有固定蛋白的包被板，例如亲和素、链霉亲和素或中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)。
在一些实施方案中，用于定量异二聚体物质的方法可以包括对异二聚体物质进行免疫沉淀。免疫沉淀可以通过使用固定在固体表面上的抗体进行，其中抗体可以与共同配制的制剂中的许多活性药物成分中的一种结合，并且其中活性药物成分可为蛋白质。
在一些实施方案中，包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品可以与固体表面上对第一蛋白质具有特异性的固定化抗体一起孵育。孵育时间可以从几分钟到几小时不等。
在一些实施方案中，可以下拉与固体表面上对第一蛋白质具有特异性的固定化抗体一起孵育的包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品。
在一些实施方案中，可以离心与固体表面上对第一蛋白质具有特异性的固定化抗体一起孵育的包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品。在一些具体的实施方案中，离心可产生沉淀样品和流过物或上清液。
在一些实施方案中，沉淀样品和流过物可以通过使用还原剂来减少。
如本文所用，术语“还原”是指蛋白质中二硫键的还原。用于还原蛋白质的还原剂的非限制性实例是二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、埃尔曼试剂(Ellman’s reagent)、羟胺盐酸盐、氰基硼氢化钠、三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP-HCl)或其组合。
在一些实施方案中，可以使用一种或多种化合物处理沉淀样品和/或流过物。在一些具体的实施方案中，处理可包括烷基化。在一些其他具体的示例性实施方案中，处理可以包括蛋白质上巯基的烷基化。
如本文所用，术语“处理”或“同位素标记”可以指化学标记蛋白质。化学标记蛋白质的方法的非选定实例包括使用试剂(例如4-plex、6-plex和8-plex)进行相对和绝对定量(iTRAQ)的等量异位标签；胺的还原去甲基化；胺的氨基甲酰化；在蛋白质的C-末端上进行18O-标记；或蛋白质的任何胺基或巯氢基标记胺基或巯氢基。
在一些实施方案中，可以使用两种不同的化合物处理沉淀的样品和/或流过物，其中所述两种化合物是同位素。
在一些实施方案中，沉淀样品和至少一部分流过物可以在处理或同位素标记其之后混合。
在一些实施方案中，可消化处理过的或同位素标记的沉淀样品和至少一部分处理过的或同位素标记的流过物的混合物。
如本文所用，术语“消化”是指蛋白质的一个或多个肽键的水解。存在使用适当的水解剂对样品中的蛋白质执行消化的几种方法，例如酶促消化或非酶促消化。
如本文所用，术语“水解剂”是指可进行蛋白质消化的大量不同剂中的任一种或组合。可进行酶消化的水解剂的非限制性实例包括胰蛋白酶、胞内蛋白酶Arg-C、胞内蛋白酶Asp-N、胞内蛋白酶Glu-C、外膜蛋白酶T(OmpT)、酿脓链球菌的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶和来自佐氏曲霉(AspergillusSaitoi)的蛋白酶。可以进行非酶消化的水解剂的非限制性实例包括使用高温、微波、超声、高压、红外线、溶剂(非限制性实例是乙醇和乙腈)、固定化酶消化(IMER)、磁性粒子固定化酶和片上固定化酶。对于讨论可用的蛋白质消化技术的最新综述，参见Switazar等人,“Protein Digestion:An Overview of the Available Techniques and RecentDevelopments”(J.Proteome Research 2013,12,1067-1077)。一种水解剂或水解剂的组合可以序列特异性方式裂解蛋白质或多肽中的肽键，从而生成较短肽的可预测集合。
在一些实施方案中，在消化处理过的或同位素标记的沉淀样品和至少一部分处理过的或同位素标记的流过物的混合物时，可以使用耦接至质谱仪的液相色谱进行分析。一个这样的示例性实施方案呈现在图2上。图2显示了用于定量在共同配制的制剂中包含第一蛋白质(mAb1)和第二蛋白质(融合蛋白1)的样品中的异二聚体物质的方法的示例性实施方案，所述方法包括将对第一蛋白质(抗-mAb1抗体)具有特异性的抗体固定在固体表面上，将样品与所述抗体一起孵育，通过下拉mAb1和融合蛋白1的异二聚体、mAb1单体和mAb1二聚体来捕获沉淀样品，收集包含融合蛋白1单体和融合蛋白1二聚体的流过物，用第一化合物(未标记的碘乙酰胺(IAA))处理沉淀样品，用第二化合物(标记的碘乙酰胺(IAA))处理流过物，将处理过的沉淀样品和约10％的处理过的流过物混合以形成混合物，消化所述混合物，并且使用耦接至质谱仪的液相色谱分析混合物以定量样品中的异二聚体物质。在使用示例性实施方案对异二聚体物质进行定量期间，在将样品与所述抗体一起孵育时第二蛋白质的非特异性结合。这种非特异性结合可能导致对异二聚体数量的高估。因此，可以制备阴性样品并且可以获得非特异性结合的第二蛋白质的量。图3中显示了具有一个这种可能性的实例。
在一些示例性实施方案中，阴性样品可以包含第一蛋白质和第二蛋白质的单体和同二聚体，而不存在异二聚体物质。
图3显示了用于制备阴性样品的示例性实施方案。其包括使用包含第一蛋白质(mAb1)和第二蛋白质(融合蛋白1)的单体和同二聚体的样品。这种非特异性结合抗体的第二蛋白质的量可以通过使用包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体(抗mAb1抗体)固定在固体表面上、将样品与所述抗体一起孵育，通过下拉非特异性结合的融合蛋白1、mAb1单体和mAb1二聚体来捕获沉淀样品，收集包含融合蛋白1单体和二聚体的流过物，用第一化合物(未标记的碘乙酰胺(IAA))处理沉淀样品，用第二化合物(标记的碘乙酰胺(IAA))处理流过物，将处理过的沉淀样品和约10％的处理过的流过物混合以形成混合物，并且使用耦接至质谱仪的液相色谱分析混合物以定量样品中的异二聚体物质。
示例性实施方案
本文公开的实施方案提供了用于鉴别和/或定量二聚体物质的方法和系统。
在一些示例性实施方案中，本公开提供了一种用于鉴别二聚体物质的方法，其包括使包含二聚体物质的样品与具有色谱树脂的色谱系统接触，使用流动相洗涤所述树脂以提供包含二聚体物质的洗脱液，并且使用电喷雾电离质谱仪鉴别所述洗脱液中的二聚体物质。
在一些示例性实施方案中，二聚体物质可为同二聚体物质。
在一些示例性实施方案中，二聚体物质可为异二聚体物质。
在一些示例性实施方案中，色谱系统可以包括传统的反相(RP)、离子交换(IEX)或正相色谱(NP)。
在一些示例性实施方案中，色谱树脂可以选自亲和色谱树脂、阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、亲和树脂、混合模式色谱树脂、疏水相互作用色谱树脂或尺寸排阻色谱树脂。在一个具体的示例性实施方案中，色谱树脂可为尺寸排阻色谱树脂。
在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪可为纳米电喷雾电离质谱仪。
在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪可以在线耦接至具有色谱树脂的色谱系统。
在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪可以在天然条件下运行。
在一些示例性实施方案中，色谱系统可以使用具有至少三个路径的分流器耦接至电喷雾电离质谱仪。
在一些示例性实施方案中，色谱系统可以使用具有至少三个路径的分流器耦接至紫外光检测器。
在一些示例性实施方案中，色谱系统可以使用具有至少三个路径的分流器耦接至电喷雾电离质谱仪和紫外光检测器。
在一些示例性实施方案中，色谱系统可以使用具有至少三个路径的分流器耦接至电喷雾电离质谱仪和紫外光检测器，其中电喷雾电离质谱仪是纳米电喷雾电离质谱仪。
在一些示例性实施方案中，色谱系统可以使用具有至少三个路径的分流器耦接至电喷雾电离质谱仪和紫外光检测器，其中质谱仪可为在天然条件下操作的电喷雾电离质谱仪。
在一些示例性实施方案中，色谱系统可以使用具有至少三个路径的分流器耦接至电喷雾电离质谱仪和紫外光检测器，其中电喷雾电离质谱仪可为在天然条件下操作的纳米电喷雾电离质谱仪。
在一些示例性实施方案中，可以将来自洗涤树脂的包含蛋白质或抗原-抗体复合物或抗体-药物缀合物的洗脱液以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速通过具有至少三个路径的至少一个分流器引入紫外光检测器中。
在一些示例性实施方案中，用于洗涤的流动相可以具有约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速。
在一些示例性实施方案中，流动相可包含挥发性盐。在一些具体的示例性实施方案中，流动相可为乙酸铵、碳酸氢铵或甲酸铵，或其组合。
在一些示例性实施方案中，所使用的流动相可以与质谱仪兼容。
在一些示例性实施方案中，样品可包含约10μg至约100μg的二聚体物质。
在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪中的流速可为约10nL/min至约50nL/min。
在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪可具有约0.8kV至约1.5kV的喷雾电压。
在一些示例性实施方案中，鉴别可包括蛋白质测序、蛋白质从头测序、鉴别翻译后修饰或相似性分析或其组合。
在一些示例性实施方案中，样品还可以包含蛋白质的单体。
在一些示例性实施方案中，二聚体可以包含第一蛋白质和第二蛋白质，其中第一蛋白质和第二蛋白质可为治疗性抗体、抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段、融合蛋白或其组合。在一个方面，抗体片段可包括Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd′片段、Fd片段和分离的互补决定区(CDR)区域、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体分子和由抗体片段形成的多特异性抗体。
在一些示例性实施方案中，二聚体物质可为共同配制的制剂中存在的产品相关杂质。
在一些示例性实施方案中，二聚体可包含第一蛋白质和第二蛋白质，其中第一蛋白质和第二蛋白质可具有约4.5至约9.0范围内的pI。在一个示例性实施方案中，蛋白质可具有以下pI：约4.5、约5.0、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0、约8.1、约8.2、约8.3、约8.4、约8.5、约8.6、约8.7、约8.8、约8.9或约9.0。
应当理解，所述方法不限于上述蛋白质、杂质、柱中的任一种，并且可通过任何合适的方式进行用于鉴别或定量的方法。
在一些示例性实施方案中，本公开提供了一种系统，其包括具有色谱树脂的色谱柱100，其中色谱柱能够接收流动相和包含蛋白质的样品，以及电喷雾电离质谱仪110(参见图1)。
在一些示例性实施方案中，色谱柱100可具有选自疏水相互作用色谱树脂、阴离子交换树脂、阴离子交换树脂、亲和色谱树脂、尺寸排阻色谱树脂、混合模式树脂或其组合的树脂。
在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪110可能能够耦接至所述色谱柱100。
在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪110可能能够在天然条件下运行。
在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪110可为纳米电喷雾电离质谱仪。
在一些示例性实施方案中，电喷雾电离质谱仪110可为在天然条件下运行的纳米电喷雾电离质谱仪。
在一些示例性实施方案中，色谱柱100可能能够使用具有少三个路径的分流器120耦接至电喷雾电离质谱仪100。
在一些示例性实施方案中，色谱柱100可能能够使用具有至少三个路径的分流器120耦接至紫外光检测器130。
在一些示例性实施方案中，色谱柱100可能能够使用具有至少三个路径的分流器120耦接至紫外光检测器130和电喷雾电离质谱仪110。
在一些示例性实施方案中，三路分流器120可能能够不成比例地分流以允许从色谱柱100流向紫外光检测器130和电喷雾电离质谱仪110。
在一些示例性实施方案中，系统可能能够鉴别二聚体物质。
在图1中展示系统的一示例性实施方案。具有至少三个路径的柱后分流器用于启动UV/MS双重检测。低体积级分可以引导至MS，而高体积级分可以转移至UV检测器。检测几乎共享相同的保留时间。可以收集来自UV检测器的级分以进行样品回收。
应当理解，所述系统不限于上述蛋白质、色谱柱、质谱仪、抗体-药物缀合物、抗原-抗体复合物中的任一种。
本公开至少部分地提供了一种用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法，所述方法包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上，将样品与所述抗体一起孵育，捕获沉淀样品，收集流过物，用第一化合物处理沉淀样品，用第二化合物处理流过物，将处理过的沉淀样品和至少一部分处理过的流过物混合以形成混合物，并且使用耦接至质谱仪的液相色谱分析混合物以定量样品中的异二聚体物质。
在一些示例性实施方案中，第一蛋白质可为抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体或Fc融合蛋白单克隆抗体。在一些示例性实施方案中，蛋白质可为单克隆抗体。
在一些示例性实施方案中，第二蛋白质可为抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体片段、单克隆抗体或Fc融合蛋白。在一些示例性实施方案中，第一蛋白质可为Fc融合蛋白。
在一些实施方案中，包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品还可包含选自以下的物质：第一蛋白质的同二聚体物质、第一蛋白质的同二聚体物质、第一蛋白质和第二蛋白质的异二聚体物质或其组合。
在一些实施方案中，包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品还可包含至少一种或多种蛋白质。
在一些实施方案中，固体表面可以选自亲和树脂、磁珠和包被板。亲和树脂的非限制性实例包括蛋白A琼脂糖珠、蛋白G琼脂糖珠、蛋白A琼脂糖(凝胶)珠和蛋白G琼脂糖(凝胶)珠。
在一些实施方案中，磁珠可具有共价耦接至表面的重组链霉亲和素单层。
在一些实施方案中，对固体表面上的第一蛋白质具有特异性的抗体和样品可以孵育几分钟到几小时。
在一些实施方案中，沉淀样品可以通过离心获得。在一些具体的实施方案中，可以通过收集上清液来获得流过物。
在一些实施方案中，可以通过加热重新悬浮的沉淀样品来重新悬浮沉淀样品。
在一些实施方案中，可以通过加热重新悬浮的沉淀样品来重新悬浮沉淀样品。
在一些实施方案中，沉淀样品可以进行洗脱。
在一些实施方案中，沉淀样品和流过物可以通过使用还原剂来减少。在一些具体的实施方案中，还原剂可为二硫苏糖醇。
在一些实施方案中，处理可包括烷基化。
在一些实施方案中，第一化合物和第二化合物可为同位素。
在一些示例性实施方案中，至少一部分处理过的流过物可以包括约10％的处理过的流过物。在一方面，至少一部分处理过的流过物可为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约或100％。
在一些实施方案中，第一化合物和第二化合物可以分别是标记的碘乙酰胺和未标记的碘乙酰胺。在一些其他示例性实施方案中，第一化合物和第二化合物可以分别是未标记的碘乙酰胺和标记的碘乙酰胺。
在一些实施方案中，混合物可以在使用耦接至质谱仪的液相色谱对其进行分析之前被消化。在一方面，可以使用选自以下的水解剂消化混合物：胰蛋白酶、胞内蛋白酶Arg-C、胞内蛋白酶Asp-N、胞内蛋白酶Glu-C、外膜蛋白酶T(OmpT)、酿脓链球菌的免疫球蛋白降解酶(IdeS)、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶和来自佐氏曲霉的蛋白酶。
在一些实施方案中，可以使用胰蛋白酶消化混合物。
在一些实施方案中，混合物可以在使用耦接至质谱仪的液相色谱对其进行分析之前被去糖基化。
一个示例性实施方案的实例呈现于图4中。如图4所示，混合物可以被消化，然后分成两半。一半可以使用耦接至质谱仪的液相色谱进行分析，并且另一半可以使用耦接至质谱仪的液相色谱进行去糖基化和分析。
在一些实施方案中，液相色谱法可为反相(RP)、离子交换(IEX)、混合模式色谱法和正相色谱法(NP)。
在一些示例性实施方案中，质谱仪可为串联质谱仪。
在一些示例性实施方案中，质谱仪可为电喷雾质谱仪。
在一些示例性实施方案中，质谱仪可为纳米电喷雾质谱仪。
在一些示例性实施方案中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上，捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，将处理过的沉淀样品和至少一部分处理过的流过物混合以形成混合物，消化混合物，并且将消化的混合物去糖基化。
在一些示例性实施方案中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上，捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，将处理过的沉淀样品和至少一部分处理过的流过物混合以形成混合物，消化混合物，并且使用耦接至质谱仪的液相色谱分析混合物以定量样品中的异二聚体物质。
在一些示例性实施方案中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上，捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，将处理过的沉淀样品和至少一部分处理过的流过物混合以形成混合物，消化混合物，将消化的混合物去糖基化，并且使用耦接至质谱仪的液相色谱分析混合物以定量样品中的异二聚体物质。
在一些示例性实施方案中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括使用耦接至质谱仪的液相色谱进行分析以定量样品中的异二聚体物质，其中质谱仪可为串联质谱仪。
在一些示例性实施方案中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上，捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，并且向沉淀样品中添加还原剂。
在一些示例性实施方案中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上，捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，并且向流过物中添加还原剂。
在一些示例性实施方案中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上，捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，将处理过的沉淀样品和约10％的处理过的流过物混合以形成混合物，并且使用耦接至质谱仪的液相色谱分析混合物以定量样品中的异二聚体物质。
在一些示例性实施方案中，用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法可以包括将对第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上，捕获沉淀样品并收集流过物，并且用第一化合物处理捕获的沉淀样品并用第二化合物处理流过物，将处理过的沉淀样品和约10％的处理过的流过物混合以形成混合物，消化混合物，并且使用耦接至质谱仪的液相色谱分析混合物以定量样品中的异二聚体物质。
在一些示例性实施方案中，用于定量样品中的异二聚体物质的方法可以包括第一蛋白质和第二蛋白质，其中通过使样品经受选自由以下组成的组中的条件来对样品进行加压：冷白光暴露、过氧化氢暴露、紫外光暴露、热或其组合，包括在ICH指南下的强制降解。
在一些实施方案中，可以使用以下公式计算包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的第二蛋白质异二聚体％，其中第一蛋白质用未标记的化合物处理并且第二蛋白质用标记的化合物处理：
其中面积轻是用未标记的化合物处理的第二蛋白质测定的MS峰曲线下面积，面积重是用标记的化合物处理的第二蛋白质测定的MS峰曲线下面积。还可以实施所述方法，使得第一蛋白质用标记的化合物处理，并且第二蛋白质用未标记的化合物处理。
在一些实施方案中，可以使用以下公式计算包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的第二蛋白质异二聚体％，其中第一蛋白质用未标记的化合物处理并且第二蛋白质用标记的化合物处理：
其中面积轻是用未标记的化合物处理的第二蛋白质测定的MS峰曲线下面积，面积重是用标记的化合物处理的第二蛋白质测定的MS峰曲线下面积。还可以实施所述方法，使得第一蛋白质用标记的化合物处理，并且第二蛋白质用未标记的化合物处理。
用数字和/或字母连续标记如本文提供的方法步骤并不意味着将方法或其任何实施方案局限于特定的指示顺序。
不同的出版物(包括专利、专利申请、公布的专利申请、登录号、技术文献和学术文章)在整个说明书中引用。这些引用的参考文献各自整体并出于所有目的以引用的方式并入本文。
通过参考以下实施例，将更充分地理解本公开，提供所述实施例以更详细地描述本公开。其旨在说明实施例且不应解释为限制本公开的范围。
实施例
材料和试剂。水购自Honeywell(Muskegon,MI)。乙酸铵购自Sigma-Aldrich(StLouis,MO)。1M Tris-HCl，pH 7.5购自Teknova(Hollister,CA)。熔融石英管(内径(ID)150μm，外径(OD)360μm)、3路连接器和套管购自IDEX(Oak Harbor,WA)。PicoTip EMITTERSilicaTip(FS360-20-10-D-20-7CT)购自New Objective(Woburn,MA)。ACQUITY UPLCProtein BEH SEC柱，
1.7μm，4.6×300mm购自Waters(Milford,MA)。热袋柱加热器购自Thermo-Fisher(Waltham,MA)。所有试剂均无需另外纯化即可使用。
在线SEC-纳米-ESI-MS分析。ACQUITY UPLC I类系统(Waters,Milford,MA)耦接至Q Exactive HF混合四极-轨道阱质谱仪(Thermo Scientific,Bremen,Germany)以进行所有在线SEC-纳米-ESI-MS分析。将ACQUITY UPLC蛋白质BEH SEC柱(
1.7μm，4.6×300mm)设定在30℃并用于mAb和ADC分离。流动相是pH 6.8的100mM乙酸铵。每次分离30分钟，流速为0.3mL/min，并且将注射量设定为40μg。三路分流器(T型分流器)连接在SEC柱之后。熔融石英管(L：140cm，ID：150μm)和SilicaTip(L：5cm，ID：10μm)连接至T型分流器。高体积级分通过熔融石英管传输至UV检测器，而低体积级分通过SilicaTip转移至MS。以下MS参数用于在线SEC-纳米-ESI-MS数据采集。每次采集都是在样品注射后25分钟立即开始。样品以3kV喷雾电压、200℃毛细管温度和70S-lens RF水平的正模式电离。将源内CID设定为75eV。在15K分辨率下获得全MS扫描，质量范围在m/z 2000-8000之间。最大注射时间为100ms，自动增益控制目标值为3e6，并且10次微扫描用于全MS扫描。
数据分析。Protein Metrics Intact Mass软件用于原始数据解卷积。ThermoXcalibur Qual Browser用于提取离子色谱图分析。Microsoft Excel用于ADC的DAR计算。
实施例1.
1.1在线SEC-纳米-ESI-MS仪器
SEC和MS技术常规地用于表征蛋白质样品。SEC允许在最小化蛋白质结构变化的条件下分离并表征蛋白质，而MS准许鉴别复杂样品中的单独组分。将SEC和MS的单独功能组合到单一平台中是高度合乎需要的，但已被证明具有挑战性，因为用于SEC分析的高流速和非挥发性盐与天然MS不兼容。为了克服这个限制，通过使用柱后T型分流器分流来自SEC的洗脱液流来减少进入MS的溶剂和盐摄入(参见图1)。然后将T型分流器通过SilicaTip连接至MS，并且通过熔融石英管并行连接至UV检测器。这种布置使得能够对SEC洗脱液进行同步、双重UV/MS检测。通过改变熔融石英管的长度和直径，可以调节通过SilicaTip进入MS的流速(例如，更长/更窄的管可能产生更高的阻力，从而导致流向SilicaTip和MS的流量增加)。用4.6mm SEC柱使用0.3mL/min流速分离蛋白质样品。长度为140cm且内径为150μm的连接T型分流器和UV检测器的熔融石英管使至SilicaTip的理想流速达到约1μL/min。熔融石英管的长度和直径也使得UV和MS能够几乎同步地检测分子。
1.2共同配制的制剂
包含mAb1、mAb2和mAb3的制剂用于实验。制剂中可能存在六种二聚体物质(参见图5)。样品在各种条件下加压，包括ICH指南中提供的条件，例如光稳定性测试(UV 1xICH和CW1xICH)。
1.3结果
使用1.1所示的系统，使用如图6和图7中所示的提取离子色谱图(XIC)和分子量测量成功区分了五种二聚体(mAb1-mAb1、mAb1-mAb2、mAb2-mAb2、mAb2-mAb3和mAb3-mAb3)。唯一未鉴别的异二聚体是mAb1-mAb3，因为其分子量非常接近同二聚体mAb2-mAb2(相差15Da)(参见图7)。
实施例2.
2.1在线SEC-纳米-ESI-MS仪器
使用如1.1中所示的仪器。
2.2共同配制的制剂
包含mAb1和融合蛋白的制剂用于实验。三种二聚体物质可能存在于制剂中(参见图8)。融合蛋白中N-聚糖的存在使完整质量分析明显复杂化。
使包含比率为120:40的mAb1和融合蛋白的共同制剂、包含比率为60:40的mAb1和融合蛋白的共同制剂、mAb1的制剂(120mg/mL)、mAb1的制剂(60mg/mL)和融合蛋白的制剂(40mg/mL)经受四种压力条件：(a)冷白光(CW)，(b)过氧化氢，持续18小时，(c)紫外光(UV)，和(d)在37℃下加热28小时。压力条件，包括由ICH指南提供的条件。
经受在37℃下加热28小时并用过氧化氢处理18小时的制剂和共同制剂导致高分子量物质(二聚体或其他聚集体)的轻度增加。相反，用冷白光和紫外光处理的制剂和共同制剂包含高水平的高分子量物质。
2.3二聚体物质的鉴别
使用1.1中所示的系统分析经受冷白光的包含比率为120:40的mAb1和融合蛋白的共同制剂。图9显示了使用SEC-纳米-ESI-MS分析的共同制剂的提取离子色谱图(XIC)。所述方法使得区分单体物质和二聚体物质。
电荷减少技术的应用极大地改善了分子量高度不均一的蛋白质成分的质量测量，如图10所示例。
开发了具有双重紫外(UV)和MS检测的在线SEC-纳米-电喷雾电离(纳米-ESI)-MS平台。该平台的效用通过在共同配制的制剂中鉴别同二聚体和异二聚体物质而得到验证。
三路分流器用于将SEC洗脱液不成比例地分流至MS和UV检测器，其中低体积级分被引导至MS，而高体积级分被引导至UV检测器。目前的平台使得能够通过UV和天然MS进行互补的双重检测，具有级分收集的可能性，并且可应用于二聚体物质的表征。对该在线SEC-纳米-ESI-MS平台的进一步修改(例如改变柱化学特性或使用Q Exactive UHMR仪器)将使其适用于其他应用，例如分析电荷变体或非常大的蛋白质复合物。本文所描述的方法开启了将高盐分离技术(即HIC、WCX)与基于质谱法的检测组合的可能性。总之，在线SEC-纳米-ESI-MS平台可广泛应用于各种应用的蛋白质生物药物分析。
实施例3.
3.1样品制备
使用包含mAb1和融合蛋白1的共同制剂。用于实验的不同样品(50μL)示于表1中。阴性对照(样品3)通过在分析前混合加压的融合蛋白1(样品1)和加压的mAb1(样品1)来制备，其中使用如根据ICH指南提供的紫外光对样品进行加压。另一个阴性对照(样品7)通过在分析前混合加压的融合蛋白1(样品6)和加压的mAb1(样品5)来制备，其中使用如根据ICH指南提供的冷白光对样品进行加压。
表1.
3.2免疫沉淀
如图11所示进行免疫沉淀。在六个离心管中，添加0.5ml Dynabeads MyOneStreptavidin T1(磁珠)和100μg抗mAb1抗体。将样品1、2、4、5、6和8添加到单独的管中，并且通过在合适的振荡器上轻轻混合在室温下孵育30分钟。将管置放于磁力架上3分钟以确保收集到所有珠粒。去除上清液并且添加0.4mL 100mM乙酸铵缓冲液。将管在Thermomixer上以800rpm孵育5分钟。将该步骤重复两次(共3次)。将所有上清液(即1.2mL上清液)收集在1.5mL管中(并标记为FT1流过物)。使用Thermomixer以800rpm用0.4mL 10％乙腈洗涤磁珠。将珠粒置放于磁力架上3分钟以确保收集到所有珠粒。在洗涤之间去除上清液。将该步骤重复三次(共4次)。收集所有上清液(1.2mL上清液)。在1.5mL管中，标记为FT2；添加0.2mL洗脱缓冲液(50％ACN、0.1％甲酸)并在室温下在Thermomixer上以1000rpm孵育5分钟。将所有上清液收集到管中并标记为PD下拉物。
3.3分析
样品分析涉及以下步骤：将20uL含8M尿素的100mM Tris-HCl(pH 7.5)添加到每个样品管中。向每个样品中添加1μL含100mM二硫苏糖醇(DTT)的Milli-Q水，涡旋以良好混合并在50℃下孵育30分钟。孵育后，向下拉物中添加1.1uL含200mM轻标记的碘乙酰胺(轻-IAA)的Milli-Q水，并且向流过物中添加1.1uL含200mM重标记的碘乙酰胺(重-IAA)的Milli-Q水。在室温下在黑暗中孵育下拉物和流过物两者30分钟。然后，将整个下拉物和大约10％的流过物混合并通过添加4μg胰蛋白酶消化并在37℃下孵育过夜。使用LC-MS(Waters ACQUITY UPLC系统和Thermo Q Exactive质谱仪)分析消化的混合物。
图12显示了针对样品7和8获得的下拉物和流过物的质荷比。下拉物级分含有异二聚体中的融合蛋白1且流过物级分含有存在于单体和同二聚体中的融合蛋白1。图13显示了融合蛋白1异二聚体的计算百分比。使用图4所示的公式进行计算。对于用于定量融合蛋白1的一些肽，样品3、4、7和8中的质荷比图表显示于图14-17中。图中的肽1、肽2、肽3和肽4分别代表肽25ELVIPCR31、肽73EIGLLTCEATVNGHLYK89、肽120LVLNCTAR127和肽178SDQGLYTCAASSGLMTK194。
按照如图18所示的方法将融合蛋白1异二聚体％转化为异二聚体％。基于图18中所示的异二聚体％的计算，发现样品4和样品8中的异二聚体％分别为6.4％和8.5％。来自阴性对照样品(样品3和7)的低水平的“异二聚体信号”可归因于混合后mAb1与融合蛋白1之间的相互作用以及mAb1与亲和树脂之间的非特异性相互作用。异二聚体％与整体HMW％一致。
实施例4.
为了通过免疫沉淀评价融合蛋白异二聚体的定量限值和线性，使用了具有依次稀释的冷白加压的共同配制的制剂的样品。
如表2中所列制备测试样品。使用包含mAb1和融合蛋白1的共同配制的制剂，并且使用冷白光进行加压。通过在分析前混合加压的融合蛋白1(样品6)和加压的mAb1(样品5)来制备阴性对照混合样品。如表2中所示制备用于实验的不同测试样品。
表2.
如3.2和3.3中所示进行免疫沉淀和分析。将测试样品中的融合蛋白异二聚体％归一化至未稀释的测试样品中的融合蛋白异二聚体％的图表显示于图19中。此外，对于用于定量融合蛋白1的三种肽，混合样品中融合蛋白异二聚体％相比于冷白加压的样品％的图显示于图20中，其中稀释度为1的样品代表纯净的冷白色加压的共同配制的样品。所述定量方法保持良好的线性，至少低至0.8％的异二聚体(测试的最低值)。
实施例5.
为了评价环境条件加压的共同配制的样品中异二聚体的量，将来自包含mAb1和融合蛋白1的共同配制的制剂的样品在25℃下储存12个月并在5℃下储存46个月。如3.2和3.3中所示进行免疫沉淀和分析。样品中计算的量显示于表3和图21中，其中不同的融合蛋白1肽用于定量。
表3.
因此，研发了一种新的免疫沉淀方法，用于定量从共同配制的制剂中获得的样品中的异二聚体水平。其已成功应用于对来自共同配制的制剂的UV/CW加压和环境条件加压的样品中的异二聚体水平进行定量。
Claims (36)
1.一种鉴别至少一种二聚体物质的方法，所述方法包括：
使包含所述二聚体物质的样品与具有尺寸排阻色谱树脂的色谱系统接触；
使用流动相洗涤所述尺寸排阻色谱树脂以提供包含所述二聚体物质的洗脱液；和
在天然条件下使用电喷雾电离质谱仪鉴别所述洗脱液中的所述二聚体物质。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述电喷雾电离质谱仪在线耦接至具有所述尺寸排阻色谱树脂的所述色谱系统。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述电喷雾电离质谱仪为纳米电喷雾电离质谱仪。
4.如权利要求1所述的方法，其中使用具有至少三个路径的至少一个分流器以允许与所述电喷雾电离质谱仪和具有所述尺寸排阻色谱树脂的所述色谱系统流体连通。
5.如权利要求1所述的方法，其中使用具有至少三个路径的至少一个分流器以允许紫外光检测器与具有所述尺寸排阻色谱树脂的所述色谱系统之间的流体连通。
6.如权利要求5所述的方法，其中通过所述至少一个分流器以约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速将来自洗涤所述尺寸排阻色谱树脂的所述洗脱液引入到所述紫外光检测器中。
7.如权利要求1所述的方法，其中用于洗涤所述尺寸排阻色谱树脂的所述流动相包含乙酸铵。
8.如权利要求1所述的方法，其中用于洗涤所述尺寸排阻色谱树脂的所述流动相包含挥发性盐。
9.如权利要求1所述的方法，其中用于洗涤所述尺寸排阻色谱树脂的所述流动相具有约0.2mL/min至约0.4mL/min的流速。
10.如权利要求1所述的方法，其中与所述色谱系统接触的包含所述二聚体物质的所述样品的量为约10μg至约100μg。
11.如权利要求1所述的方法，其中将由洗涤所述尺寸排阻色谱树脂提供的所述洗脱液引入到所述电喷雾电离质谱仪中，其中来自所述电喷雾电离的电喷雾的流速为约10nL/min至约50nL/min。
12.如权利要求1所述的方法，其中将由洗涤所述尺寸排阻色谱树脂提供的所述洗脱液引入到所述电喷雾电离质谱仪中，其中电喷雾的喷雾电压为约0.8kV至约1.5kV。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含至少两种二聚体物质。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含同二聚体物质。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包含异二聚体物质。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述样品获自共同配制的制剂。
17.一种系统，其包括：
具有尺寸排阻色谱树脂的色谱柱，其中所述色谱柱能够接收流动相和包含蛋白质的样品，和
电喷雾电离质谱仪，其中所述电喷雾电离质谱仪能够在线耦接至所述色谱柱，并且其中所述电喷雾电离质谱仪能够在天然条件下运行。
18.如权利要求17所述的系统，其中所述色谱柱能够使用分流器耦接至所述质谱仪。
19.如权利要求17所述的系统，其中所述色谱柱还能够使用具有至少三个路径的分流器耦接至紫外光检测器。
20.如权利要求17所述的系统，其中所述电喷雾电离质谱仪为纳米电喷雾电离质谱仪。
21.一种用于定量包含第一蛋白质和第二蛋白质的样品中的异二聚体物质的方法，所述方法包括：
将对所述第一蛋白质具有特异性的抗体固定在固体表面上；
将所述样品与所述抗体一起孵育；
捕获沉淀样品；
收集流过物；
用第一化合物处理所述沉淀样品；
用第二化合物处理所述流过物；
将所处理的沉淀样品和至少一部分的所处理的流过物混合以形成混合物；和
使用耦接至质谱仪的液相色谱分析所述混合物以定量所述样品中的所述异二聚体物质。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述质谱仪为串联质谱仪。
23.如权利要求21所述的方法，其还包括向所述沉淀样品中添加还原剂。
24.如权利要求21所述的方法，其还包括向所述流过物添加还原剂。
25.如权利要求21所述的方法，其还包括在分析所述混合物之前消化所述混合物。
26.如权利要求21所述的方法，其还包括在分析所述混合物之前将所述混合物去糖基化。
27.如权利要求21所述的方法，其中将所处理的沉淀样品和约10％的所处理的流过物混合以形成所述混合物。
28.如权利要求21所述的方法，其中所述第一化合物是所述第二化合物的同位素。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述第一化合物是碘乙酰胺。
30.如权利要求21所述的方法，其中所述第一蛋白质是抗体。
31.如权利要求21所述的方法，其中所述第一蛋白质是单克隆抗体。
32.如权利要求21所述的方法，其中所述第一蛋白质是多克隆抗体。
33.如权利要求21所述的方法，其中所述第二蛋白质是融合蛋白。
34.如权利要求21所述的方法，其中通过使所述样品经受选自由以下组成的组中的条件来对所述样品进行加压：冷白光暴露、过氧化氢暴露、紫外光暴露、热或其组合。
35.如权利要求21所述的方法，其中所述样品获自共同配制的制剂。
36.一种用于定量异二聚体物质的方法，所述方法包括：
对所述异二聚体物质进行免疫沉淀；和
通过使用稳定同位素标记方法，然后使用耦接至质谱仪的液相色谱来定量所述异二聚体物质。
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