JP2022518254A - 合剤中の二量体の定量化及び同定 - Google Patents
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Abstract
オンラインクロマトグラフィー及びエレクトロスプレーイオン化質量分析を使用して二量体種を同定するための方法及びシステムが提供される。免疫沈降及び液体クロマトグラフィー質量分析を使用して、ヘテロ二量体種を定量化するための方法及びシステムもまた提供される。【選択図】図１
Description
分野
本発明は、概して、オンラインクロマトグラフィー及びエレクトロスプレーイオン化質量分析を使用して二量体種を同定し、免疫沈降及び液体クロマトグラフィー質量分析を使用してヘテロ二量体種を定量化するための、方法及びシステムに関する。
本発明は、概して、オンラインクロマトグラフィー及びエレクトロスプレーイオン化質量分析を使用して二量体種を同定し、免疫沈降及び液体クロマトグラフィー質量分析を使用してヘテロ二量体種を定量化するための、方法及びシステムに関する。
背景
タンパク質バイオ医薬品は、がん、自己免疫疾患、感染症、及び心血管代謝障害の治療のために重要な医薬品として浮上しており、製薬業界で最も急速に成長している製品セグメントの１つである。
タンパク質バイオ医薬品は、がん、自己免疫疾患、感染症、及び心血管代謝障害の治療のために重要な医薬品として浮上しており、製薬業界で最も急速に成長している製品セグメントの１つである。
２つ以上の治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）及び／または活性タンパク質を１つの最終医薬品に合剤化する戦略は、有効性の向上、有害事象の全体的な減少、及び患者の利便性とコンプライアンスの向上など、いくつかの利点をもたらし、近年、人気を得ている。２つの異なるｍＡｂ及び／または活性タンパク質を単一の製剤に製剤化することは問題を含む場合があり、妥協点となり得る賦形剤及び条件の選択を伴う。製剤開発の課題に加えて、合剤化された薬物は分析特性評価にも重大な課題を提示する。例えば、通常の保管またはストレス条件下での、合剤化された薬物に存在する異なる二量体形態の区別及び定量化は困難な場合があり、サイズ排除クロマトグラフィーなどの従来の方法では達成できないことがよくある。
合剤化された調製物を含むタンパク質バイオ医薬品は、非常に高い純度基準を満たす必要がある。したがって、薬物の開発、製造、保管、及び取り扱いの様々な段階で、合剤化された薬物中の不純物をモニターすることが重要な場合がある。特性評価のためのアッセイの分析方法は、目的の生成物を検出及び定量化するのに十分な精度及び分解能を示す必要がある。直接分析では、アッセイに十分な量の生成物を分離する必要があるが、これは望ましくなく、特定の場合にのみ可能であった。
当技術分野では、合剤化された調製物を特性評価するための方法及び／またはシステムに対するニーズが長い間あった。
概要
タンパク質バイオ医薬品の開発、製造、及び販売の成長により、不純物が含まれる可能性と共にタンパク質バイオ医薬品を特性評価するための需要が高まっている。安定した合剤化された調製物の開発は、抗体混合物に存在する個々のタンパク質の安定性及び分解の測定を必要とするため、追加の課題をもたらす。製剤中のタンパク質の数が多いこと、ヘテロ二量体種、ホモ二量体種の形成、及びそのようなタンパク質間の類似性のために、そのような決定はしばしば困難である。
タンパク質バイオ医薬品の開発、製造、及び販売の成長により、不純物が含まれる可能性と共にタンパク質バイオ医薬品を特性評価するための需要が高まっている。安定した合剤化された調製物の開発は、抗体混合物に存在する個々のタンパク質の安定性及び分解の測定を必要とするため、追加の課題をもたらす。製剤中のタンパク質の数が多いこと、ヘテロ二量体種、ホモ二量体種の形成、及びそのようなタンパク質間の類似性のために、そのような決定はしばしば困難である。
本明細書に開示される例示的な実施形態は、二量体種を同定するための、及び／またはヘテロ二量体種を定量化するための方法及び／またはシステムを提供することによって、前述のニーズを満たす。
この開示は、少なくとも部分的に、二量体種を同定するための方法を提供する。１つの例示的な実施形態では、二量体種を同定するための方法は、二量体種を含む試料を、クロマトグラフィー樹脂を備えたクロマトグラフィーシステムと接触させることと、移動相を使用して該樹脂を洗浄して、二量体種を含む溶離液を提供することと、エレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して、該溶離液中で二量体種を同定することと、を含む。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を備えたクロマトグラフィーシステムを含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計を、クロマトグラフィー樹脂を備えたクロマトグラフィーシステムに連結することを含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計を、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに連結することを含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、ネイティブ条件下で動作するエレクトロスプレーイオン化質量分析計を含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計を含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、ネイティブ条件下で動作するナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計を含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計を、樹脂を備えたクロマトグラフィーシステムに連結するための、少なくとも３つの経路を有する少なくとも１つのスプリッターを含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、紫外線検出器を、樹脂を備えたクロマトグラフィーシステムに連結するための、少なくとも３つの経路を有する少なくとも１つのスプリッターを含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、紫外線検出器及びエレクトロスプレーイオン化質量分析計を、樹脂を備えたクロマトグラフィーシステムに連結するための、少なくとも３つの経路を有する少なくとも１つのスプリッターを含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計を、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を備えたクロマトグラフィーシステムに連結するための、少なくとも３つの経路を有する少なくとも１つのスプリッターを含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、紫外線検出器を、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を備えたクロマトグラフィーシステムに連結するための、少なくとも３つの経路を有する少なくとも１つのスプリッターを含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、紫外線検出器及びエレクトロスプレーイオン化質量分析計を、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を備えたクロマトグラフィーシステムに連結するための、少なくとも３つの経路を有する少なくとも１つのスプリッターを含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、移動相を使用して樹脂を洗浄して、二量体種を含む溶離液を提供することを含むことができ、溶離液は、約０．２ｍＬ／分～約０．４ｍＬ／分の流速で、少なくとも３つの経路を有する少なくとも１つのスプリッターを通して、紫外線検出器に導入することができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、揮発性塩を含む移動相を含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、酢酸アンモニウムを含む移動相を含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、約０．２ｍＬ／分～約０．４ｍＬ／分の流速にて移動相で樹脂を洗浄することを含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、約６．８のｐＨを有する移動相を含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、約１０μｇ～約１００μｇの量の二量体種を含む試料を含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、抗体を含む二量体種を含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、融合タンパク質を含む二量体種を含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、流速が約１０ｎＬ／分～約５０ｎＬ／分であるエレクトロスプレーイオン化質量分析計を含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、エレクトロスプレーのスプレー電圧が約０．８ｋＶ～約１．５ｋＶであるエレクトロスプレーイオン化質量分析計を含むことができる。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法であって、二量体種はホモ二量体種であり得る。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法であって、二量体種はヘテロ二量体種であり得る。
この実施形態の一態様では、二量体種を同定するための方法は、二量体種を含む試料を、クロマトグラフィー樹脂を備えたクロマトグラフィーシステムに接触させることを含み得、該試料はタンパク質単量体を含み得る。
本開示は、少なくとも部分的に、クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムを含むシステムを提供する。例示的な一実施形態では、本システムは、クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムであって、移動相、及びタンパク質を含む試料を受け取ることができるクロマトグラフィーカラムと、エレクトロスプレーイオン化質量分析計とを含む。
この実施形態の一態様では、本システムは、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムを含むことができる。
この実施形態の一態様では、本システムは、該クロマトグラフィーカラムに連結することができるエレクトロスプレーイオン化質量分析計を含むことができる。
この実施形態の一態様では、本システムは、ネイティブ条件下で実行することができるエレクトロスプレーイオン化質量分析計を含むことができる。
この実施形態の一態様では、本システムは、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計を含むことができる。
この実施形態の一態様では、本システムは、少なくとも３つの経路を有するスプリッターを使用して質量分析計に連結することができるクロマトグラフィーカラムを含むことができる。
この実施形態の一態様では、本システムは、少なくとも３つの経路を有するスプリッターを使用して紫外線検出器に連結することができるクロマトグラフィーカラムを含むことができる。
この実施形態の一態様では、本システムは、少なくとも３つの経路を有するスプリッターを使用して紫外線検出器及び質量分析計に連結することができるクロマトグラフィーカラムを含むことができる。
この実施形態の一態様では、本システムは、二量体種を同定することができる。
本開示は、少なくとも部分的に、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化するための方法を提供し、本方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、試料を該抗体と共にインキュベートすることと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、沈殿試料を第１の化合物で処理することと、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理した沈殿試料と処理したフロースルーの少なくとも一部を混合して混合物を形成することと、質量分析計と連結した液体クロマトグラフィーを使用して混合物を分析し、試料中のヘテロ二量体種を定量化することと、を含む。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することを含み得、第１のタンパク質はモノクローナル抗体であり得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することを含み得、固体表面は磁性ビーズを含む。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することを含み得、固体表面はストレプトアビジンを含む。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することとを含み得、沈殿試料は、固体表面の第１のタンパク質に特異的な抗体に結合したヘテロ二量体種を含む。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することとを含み得、沈殿試料は、固体表面の第１のタンパク質に特異的な抗体に結合したヘテロ二量体種を含む。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、沈殿試料を再懸濁することと、再懸濁した沈殿試料を加熱することと、を含み得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、を含み得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理することと、を含み得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、フロースルーを第１の化合物で処理することと、を含み得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、を含み得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、を含み得、第１の化合物は第２の化合物の同位体であり得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理した沈殿試料と処理したフロースルーの少なくとも一部を混合して混合物を形成することと、を含み得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理した沈殿試料と処理したフロースルーの少なくとも一部を混合して混合物を形成することと、混合物を消化することと、を含み得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理した沈殿試料と処理したフロースルーの少なくとも一部を混合して混合物を形成することと、混合物を消化することと、消化した混合物を脱グリコシル化することと、を含み得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理した沈殿試料と処理したフロースルーの少なくとも一部を混合して混合物を形成することと、混合物を消化することと、質量分析計に連結した液体クロマトグラフィーを使用して混合物を分析し、試料中のヘテロ二量体種を定量化することと、を含み得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理した沈殿試料と処理したフロースルーの少なくとも一部を混合して混合物を形成することと、混合物を消化することと、消化した混合物を脱グリコシル化することと、質量分析計に連結した液体クロマトグラフィーを使用して混合物を分析し、試料中のヘテロ二量体種を定量化することと、を含み得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、質量分析計に連結された液体クロマトグラフィーを使用して分析して、試料中のヘテロ二量体種を定量化することを含むことができ、質量分析計はタンデム質量分析計であることができる。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理された沈殿試料に還元剤を添加することと、を含み得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理されたフロースルーに還元剤を添加することと、を含み得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理された沈殿試料と処理されたフロースルーの約１０％を混合して混合物を形成することと、その混合物を質量分析計に連結した液体クロマトグラフィーを使用して分析し、試料中のヘテロ二量体種を定量化することと、を含み得る。
この実施形態の一態様では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理した沈殿試料と処理したフロースルーの約１０％を混合して混合物を形成することと、混合物を消化することと、質量分析計に連結した液体クロマトグラフィーを使用して混合物を分析し、試料中のヘテロ二量体種を定量化することと、を含み得る。
本開示は、少なくとも部分的に、ヘテロ二量体種を定量化するための方法を提供する。１つの例示的な実施形態では、ヘテロ二量体種を定量化するための方法は、ヘテロ二量体種を免疫沈降し、安定同位体標識法とそれに続く質量分析計に連結した液体クロマトグラフィーを使用することによってヘテロ二量体種を定量化することを含む。
この実施形態の一態様では、ヘテロ二量体種を定量化するための方法は、抗体を含むヘテロ二量体種を含むことができる。
この実施形態の一態様では、ヘテロ二量体種を定量化するための方法は、融合タンパク質を含むヘテロ二量体種を含むことができる。
この実施形態の一態様では、ヘテロ二量体種を定量化するための方法は、固体表面上で抗体を使用することによって、ヘテロ二量体種を免疫沈降させることを含むことができる。
この実施形態の一態様では、ヘテロ二量体種を定量化するための方法は、固体表面上で抗体を使用することによってヘテロ二量体種を免疫沈降させることを含み得、抗体はヘテロ二量体からのタンパク質に結合することができる。
この実施形態の一態様では、ヘテロ二量体種を定量化するための方法は、アルキル化化合物を用いた安定同位体標識法を使用することを含むことができる。
この実施形態の一態様では、ヘテロ二量体種を定量化するための方法は、アルキル化化合物を用いた安定同位体標識法を使用することを含むことができる。
この実施形態の一態様では、ヘテロ二量体種を定量化するための方法は、安定同位体標識法を使用することに加えて、消化を実行することを含むことができる。
詳細な説明
タンパク質バイオ医薬品中のタンパク質の同定及び定量化は、製品の製造及び開発において非常に重要な場合がある。タンパク質バイオ医薬品の不純物の分析は、安全で効果的な製品の開発に不可欠な場合がある。したがって、不純物を特性評価するためのロバストな方法及び／またはワークフローが有益である可能性がある。
タンパク質バイオ医薬品中のタンパク質の同定及び定量化は、製品の製造及び開発において非常に重要な場合がある。タンパク質バイオ医薬品の不純物の分析は、安全で効果的な製品の開発に不可欠な場合がある。したがって、不純物を特性評価するためのロバストな方法及び／またはワークフローが有益である可能性がある。
ほとんどのバイオ医薬品は、単一のタンパク質を含み得る。いくつかの場合では、組み合わせて投与された、単一の標的または複数の標的に向けられた複数のタンパク質は、それらの診断的または治療的効能及び有効性を改善することがある。このような合剤化された調製物の開発は、ますます一般的な剤形になりつつある（Ｓｖｅｎｄ Ｈａｖｅｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｈｙｓｉｃｏ－Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｔｈａｔ Ｅｎａｂｌｅ Ｃｏ－Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｓａｌ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｄｅｇｌｕｄｅｃ ｗｉｔｈ Ｆａｓｔ－Ａｃｔｉｎｇ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ａｓｐａｒｔ，３２ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２５０－２２５８（２０１５）；Ｓａｎｊａｙ Ｋａｌｒａ ＆ Ｙａｓｈｄｅｅｐ Ｇｕｐｔａ，Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｙ，６ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｔｈｅｒａｐｙ１０１－１１１（２０１５）；Ｒｙｚｏｄｅｇ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ－Ｆｉｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－Ｒａｘｏｎｅ，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｍａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／ｅｎ／ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ／ｈｕｍａｎ／ＥＰＡＲ／ｒｙｚｏｄｅｇ（最後にアクセスしたのは２０１９年１月１７日））。
しかしながら、合剤化された調製物の開発には、薬力学的相互作用の可能性、薬物動態学的相互作用の可能性、毒性学的相互作用の可能性、内因性のレベルまたは活性における変化の可能性、及び一方の薬剤の有効性を損なう可能性を検討する必要があるため、いくつかの課題がある（Ｃｌａｕｄｉａ Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｕｌｒｉｋｅ Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒ ＆ Ｓｉｌｋｅ Ｍｏｈｌ，Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，７０ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６６６－６７４（２０１７））。安定した合剤化された調製物の製造には、製造の様々な段階で２つ以上のタンパク質の安定性を確保するための追加の努力も必要になる場合がある。
合剤化された最終製品は、保管、輸送、及び投与中に、光、熱、及び酸素にさらされ得、凝集（高分子量種のホモ二量体（複数可）及び／またはヘテロ二量体（複数可））、電荷パターン、断片化、化学修飾（例えば、酸化、脱アミド化）などを引き起こす可能性がある。
合剤化された最終製品の高品質及び安全性を確保するには、分析方法の優れた性能及び感度が不可欠である。しかしながら、合剤化された調製物の開発及び評価のための分析手法は、単一のタンパク質を有効医薬成分として含む製剤に適用される手法よりも、著しく困難かつ複雑なものとなる可能性がある。単一のタンパク質を含む製剤に採用されている特定の標準的な方法では、合剤化された調製物中のタンパク質を常に区別できるとは限らないため、これは困難になる可能性がある。
方法の１つには、バイオテクノロジー業界における生体分子の凝集及び断片化を特性評価するためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の使用が含まれる（Ｈｏｎｇ Ｐａｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｚｅ－Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ，３５ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＬＩＱＵＩＤ ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ ＡＮＤ ＲＥＬＡＴＥＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ２９２３－２９５０（２０１２））。ＳＥＣによる分子の分離は、分子の、固定相上の制御された多孔質構造との示差的な相互作用に依存する。ＳＥＣは、溶液中のタンパク質の本来の構造を維持する緩衝液条件を使用するため、本来のコンフォメーションを乱すことなく生体分子の特性評価を可能とする。さらに、ＳＥＣと組み合わせることができる様々な検出モードのうち、質量分析（ＭＳ）により、複雑な試料の個々の成分を精密かつ正確に識別することができる。ＳＥＣとＭＳの組み合わせは、ＳＥＣピークの収集と、それに続く直接注入ＭＳを含め、以前に報告されている（Ｂａｓａｋ Ｋｕｋｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｔａｃｔ Ｈｕｍａｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ ｂｙ Ｓｉｚｅ－Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，２７ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１９７－２２０４（２０１０）；Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｄｅｂａｅｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｎａｔｉｖｅ ＭＳ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｎａｔｉｖｅ ＭＳ ａｎｄ ＩＭ－ＭＳ ｆｏｒ Ａｖｅｒａｇｅ ＤＡＲ ａｎｄ ＤＡＲ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，８６ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０６７４－１０６８３（２０１４））またはオンラインＳＥＣ－ＭＳ（Ｋｈａｊａ Ｍｕｎｅｅｒｕｄｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ Ｕｓｉｎｇ Ｓｉｚｅ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｗｉｔｈ Ｏｎｌｉｎｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｎａｔｉｖｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，８６ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０６９２－１０６９９（２０１４）；Ｃ．Ｆ．Ｍｃｄｏｎａｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｅｓ ｏｆ ｄｒｕｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ，１９ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ２９９－３０７（２００６））。しかしながら、ＳＥＣ分離から生成された高流速を直接イオン化するには、ネイティブＭＳ分析と互換性がないことが多い過酷なイオン化条件が必要であるため、非共有相互作用の分析には、これらのテクノロジーを連結させることの有用性は限られている。さらに、質量分析計の感度は、ＳＥＣ緩衝液において使用される高塩濃度の影響を受ける可能性がある。
タンパク質単量体及び任意の存在するホモ二量体（複数可）の存在下で、形成されるヘテロ二量体（複数可）の量を評価する必要があるため、同定に加えて、合剤化された製品において形成されるヘテロ二量体（複数可）の定量化もまた、課題を引き起こす可能性がある。
既存の方法の限界を考慮して、二量体種の同定及び定量化のための効果的かつ効率的な方法が開発された。
別段記載されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料が、実施または試験において使用され得るが、ここでは特定の方法及び材料が記載される。言及されるすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
用語「１つの（ａ）」は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、用語「約」及び「およそ」は、当業者によって理解されるであろう標準偏差を許容すると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、終点が含まれる。
いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、合剤化された調製物中の二量体種を同定するための方法を提供する。
本明細書で使用される場合、「合剤化された調製物」は、単一の剤形で２つ以上の活性医薬成分を含む。本剤は、異なる分子標的を標的化することによって、特定の病態を治療、予防、または改善するために使用することができ、単一の薬剤（複数可）を単独で使用した場合と比較して、相加的及び／または相乗的な効果により、患者の全体的な病状の改善を得ることができる（Ｃｌａｕｄｉａ Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｕｌｒｉｋｅ Ａｌｔｅｎｂｕｒｇｅｒ ＆ Ｓｉｌｋｅ Ｍｏｈｌ，Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ，７０ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ６６６－６７４（２０１７））。いくつかの利点には、単一の薬剤と比較した有効性の向上、有害事象の全体的な減少、患者の利便性とコンプライアンスの改善（患者の遵守の向上、患者の指導及び教育の簡素化）、医療費の削減（製造と購入）、供給プロセスの容易さ、及び既存の市販製品のライフサイクル管理における新製品の機会が含まれる。
いくつかの例示的な実施形態では、２つ以上の活性医薬成分は、タンパク質であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、合剤化された調製物は、少なくとも２つのタンパク質を含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、合剤化された調製物は、少なくとも３つのタンパク質を含み得る。
本明細書で使用される場合、「タンパク質」という用語は、共有結合したアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含む。タンパク質は、当技術分野で「ポリペプチド」として一般に知られている１つまたは複数のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造変異体、及びペプチド結合を介して連結されたそれらの非天然に存在する合成類似体、関連する天然に存在する構造変異体、及びそれらの非天然に存在する合成類似体から構成されるポリマーを指す。「合成ペプチドまたはポリペプチド」とは、天然に存在しないペプチドまたはポリペプチドを指す。合成ペプチドまたはポリペプチドは、例えば、自動化されたポリペプチドシンセサイザーを使用して合成することができる。様々な固相ペプチド合成法が知られている。タンパク質は、単一の機能する生体分子を形成するために、１つまたは複数のポリペプチドを含み得る。タンパク質には、生物療法タンパク質、研究または治療で使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質、及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体のいずれかが含まれ得る。別の例示的な態様では、タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含むことができる。タンパク質は、昆虫バキュロウイルスシステム、酵母システム（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、哺乳動物システム（例えば、ＣＨＯ細胞、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの組換え細胞ベースの産生システムを使用して産生され得る。生物療法タンパク質及びその生産について論じている総説については、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”（ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＧＥＮＥＴ．ＥＮＧ．ＲＥＶ．１４７－１７５（２０１２））を参照のこと。いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、修飾、付加物、及び他の共有結合された部分を含む。これらの修飾、付加物、及び部分には、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ニューラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、及び他の単糖）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧｔａｇ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識、及び他の染料などが含まれる。タンパク質は、組成と溶解度に基づいて分類できるため、したがって、球状タンパク質及び繊維状タンパク質などの単純なタンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質などのコンジュゲートタンパク質、及び一次誘導タンパク質及び二次誘導タンパク質などの誘導タンパク質を含むことができる。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、またはＦｃ融合タンパク質であることができる。一態様では、タンパク質は抗ＶＥＧＦタンパク質である。特定の態様では、ＶＥＧＦタンパク質はアフリベルセプトである。
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＬＣＶＲまたはＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化でき、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域が点在する。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。異なる例示的な実施形態では、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、または天然もしくは人工的に改変され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲのサイドバイサイド分析に基づいて定義することができる。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全な抗体分子の抗原結合断片を含む。本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、特異的に結合する任意の天然に存在する、酵素的に得られる、合成の、または遺伝子操作された、複合体を形成する抗原に特異的に結合するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体の可変ドメイン及び任意の定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を伴う、タンパク質消化または組換え遺伝子操作技術などの任意の適切な標準技術を用いて、完全な抗体分子から誘導され得る。そのようなＤＮＡは、既知であり、及び／または、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリー（例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、化学的に、または分子生物学技術を使用して、例えば、１つまたは複数の可変及び／または定常ドメインを適切な構成に配置するため、またはコドンを導入するため、システイン残基を作成するため、アミノ酸を改変、追加、または削除するためなどに、シークエンシング及び操作することができる。
本明細書で使用される、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合または可変領域などのインタクトな抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、ならびにトリアボディ、テトラボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子である。抗体断片は、様々な手段によって生成され得る。例えば、抗体断片は、インタクトな抗体の断片化によって酵素的または化学的に生成され得る、及び／または、それは部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え生成され得る。あるいは、またはさらに、抗体断片は、全体的または部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意選択で、単鎖抗体断片を含み得る。あるいは、またはさらに、抗体断片は、例えば、ジスルフィド結合によって一緒に連結された複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択で多分子複合体を含み得る。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野で利用可能または既知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンから誘導することができる。本開示に有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマの使用、組換え、及びファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせを含む、当技術分野で公知の多様な技術を用いて調製することができる。
本明細書で使用される「Ｆｃ融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質の一部またはすべてを含み、そのうちの１つは、自然な状態では融合しない免疫グロブリン分子のＦｃ部分である。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合された特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１；Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０；及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ１０．１９．１－１０．１９．１１，１９９２によって記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分に結合された受容体の１つ以上の細胞外ドメイン（複数可）を含み、これは、いくつかの実施形態では、ヒンジ領域を含み、その後に免疫グロブリンのＣＨ２及びＣＨ３ドメインが続く。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、１つ以上のリガンド（複数可）に結合する２つ以上の別個の受容体鎖を含む。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、例えばＩＬ－１トラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合されたＩＬ－１Ｒ１細胞外領域に融合されたＩＬ－１ ＲＡｃＰリガンド結合領域を含むリロナセプト、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９２７，００４号を参照のこと）、またはＶＥＧＦトラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含むアフリベルセプト；例えば、配列番号１；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，０８７，４１１号及び第７，２７９，１５９号を参照のこと）などのトラップである。
いくつかの例示的な実施形態では、合剤化された調製物は二量体種を含むことができる。一態様では、合剤化された調製物は、ホモ二量体種を含むことができる。いくつかの他の特定の例示的な実施形態では、合剤化された調製物は、ヘテロ二量体種を含むことができる。別の態様では、合剤化された調製物は、ホモ二量体種及びヘテロ二量体種を含むことができる。
いくつかの例示的な実施形態では、合剤化された調製物は、不純物として二量体種を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、タンパク質バイオ医薬品に存在する任意の望ましくないタンパク質を含むことができる。不純物には、プロセス及び製品関連の不純物が含まれる場合がある。不純物はさらに、既知の構造のもの、部分的に特徴付けられたもの、または同定されていないものであり得る。プロセス関連の不純物は、製造プロセスから派生する可能性があり、細胞基質由来、細胞培養由来、及びダウンストリーム由来の３つの主要なカテゴリーを含む可能性がある。細胞基質由来の不純物には、宿主生物及び核酸（宿主細胞のゲノム、ベクター、または全ＤＮＡ）に由来するタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。細胞培養物由来の不純物には、誘導物質、抗生物質、血清、及び他の培地成分が含まれるが、これらに限定されない。ダウンストリーム由来の不純物には、酵素、化学的及び生化学的処理試薬（例えば、臭化シアン、グアニジン、酸化剤及び還元剤）、無機塩（例えば、重金属、ヒ素、非金属イオン）、溶媒、担体、リガンド（例えば、モノクローナル抗体）、及び他の浸出物が含まれるが、これらに限定されない。製品関連の不純物（例えば、前駆体、特定の分解生成物）は、製造及び／または保管中に生じる分子バリアントであり得、活性、効力、及び安全性に関して所望の製品の特性に匹敵する特性を有さない。このようなバリアントは、修飾（複数可）のタイプを識別するために、分離と特性評価にかなりの労力を必要とする場合がある。製品関連の不純物には、短縮型、修飾型、及び凝集物が含まれ得る。短縮型は、ペプチド結合の切断を触媒する加水分解酵素または化学物質によって形成される。修飾型には、脱アミド化、異性化、ミスマッチのＳ－Ｓ結合、酸化、または改変されたコンジュゲート型（例えば、グリコシル化、リン酸化）が含まれるが、これらに限定されない。修飾型には、いずれかの翻訳後修飾型を含めることもできる。凝集物には、目的の製品の二量体及びより高い多量体（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓ）が含まれる。（Ｑ６Ｂ仕様：Ｔｅｓｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＩＣＨ Ａｕｇｕｓｔ １９９９，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。
本明細書で使用される場合、一般用語「翻訳後修飾」または「ＰＴＭ」は、ポリペプチドがそれらのリボソーム合成中（同時翻訳修飾）または後（翻訳後修飾）のいずれかで受ける共有結合修飾を指す。ＰＴＭは通常、特定の酵素または酵素経路によって導入される。多くは、タンパク質骨格内の特定の特徴的なタンパク質配列（シグネチャー配列）の部位で発生する。数百のＰＴＭが記録されており、これらの修飾は常にタンパク質の構造または機能のいくつかの側面に影響を与える（Ｗａｌｓｈ，Ｇ．“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（２０１４）ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，出版元 Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，ＩＳＢＮ：９７８０４７０６６９８５３）。様々な翻訳後修飾には、切断、Ｎ末端伸長、タンパク質分解、Ｎ末端のアシル化、ビオチン化（リジン残基のビオチンによるアシル化）、Ｃ末端のアミド化、グリコシル化、ヨウ素化、補欠分子族の共有結合、アセチル化（通常はタンパク質のＮ末端でのアセチル基の付加）、アルキル化（通常はリジンまたはアルギニン残基でのアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル）の付加）、メチル化、アデニル化、ＡＤＰ－リボシル化、ポリペプチド鎖内またはポリペプチド鎖間共有架橋、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性修飾（プロリン及びリジンのヒドロキシル化及びカルボキシ末端アミド化）、ビタミンＫ依存性修飾（ここで、ビタミンＫはグルタミン酸残基のカルボキシル化における補因子であり、γ－カルボキシグルタミン酸（ｇｌｕ残基）の形成をもたらす）、グルタミル化（グルタミン酸残基の共有結合）、グリシル化（共有結合グリシン残基）、グリコシル化（アスパラギン、ヒドロキシリジン、セリン、またはスレオニンのいずれかにグリコシル基を付加して、糖タンパク質を生成する）、イソプレニル化（ファルネソール及びゲラニルゲラニオールなどのイソプレノイド基の付加）、リポイル化（リポエート官能基の付加）、ホスホパンテテイニル化（脂肪酸、ポリケチド、非リボソームペプチド及びロイシン生合成の場合のように、補酵素Ａからの４’－ホスホパンテテイニル部分の付加）、リン酸化（通常はセリン、チロシン、スレオニン、またはヒスチジンへのリン酸基の付加）、及び硫酸化（通常はチロシン残基への硫酸基の付加）が含まれるが、これらに限定されない。アミノ酸の化学的性質を変化させる翻訳後修飾には、シトルリン化（脱イミノ化によるアルギニンからシトルリンへの変換）、及び脱アミド化（グルタミンからグルタミン酸またはアスパラギンからアスパラギン酸への変換）が含まれるが、これらに限定されない。構造変化を伴う翻訳後修飾には、ジスルフィド架橋の形成（２つのシステインアミノ酸の共有結合）及びタンパク質分解切断（ペプチド結合でのタンパク質の切断）が含まれるが、これらに限定されない。特定の翻訳後修飾には、ＩＳＧ化（ＩＳＧ１５タンパク質（インターフェロン刺激遺伝子）への共有結合）、ＳＵＭＯ化（ＳＵＭＯタンパク質（小さなユビキチン様修飾因子）への共有結合）、及びユビキチン化（タンパク質ユビキチンへの共有結合）などの他のタンパク質またはペプチドの追加が含まれる。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＲｅｓｏｕｒｃｅＳＩＢ Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｄｒｓ－Ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ－Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｆｒｕｉｔ ｆｌｙ）－Ｄｒｓ ｇｅｎｅ ＆ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ｐｔｍｌｉｓｔ（最後にアクセスしたのは２０１９年１月１５日）で、ＵｎｉＰｒｏｔによってキュレーションされたＰＴＭのより詳細な統制語彙を参照のこと。
いくつかの例示的な実施形態では、二量体種は、二量体種を含む試料をクロマトグラフィーシステムに接触させることによって同定することができる。
本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー」という用語は、液体または気体によって運ばれる化学混合物が、静止した液体または固体相の周りまたはその上を流れるときに化学物質の異なる分布の結果として成分に分離され得るプロセスを指す。クロマトグラフィーの非限定的な例には、従来の逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）、混合モードクロマトグラフィー、及び順相クロマトグラフィー（ＮＰ）が含まれる。
本明細書で使用される場合、「混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）」または「マルチモーダルクロマトグラフィー」という用語は、溶質が複数の相互作用モードまたはメカニズムを介して固定相と相互作用するクロマトグラフィー法を含む。ＭＭＣは、従来の逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）、及び順相クロマトグラフィー（ＮＰ）への代替または補完ツールとして使用できる。疎水性相互作用、親水性相互作用、及びイオン相互作用がそれぞれ主要な相互作用モードであるＲＰ、ＮＰ、及びＩＥＸクロマトグラフィーとは異なり、混合モードクロマトグラフィーでは、これらの相互作用モードを２つ以上組み合わせて使用できる。混合モードクロマトグラフィー媒体は、シングルモードクロマトグラフィーでは再現できない独自の選択性を提供できる。混合モードクロマトグラフィーは、親和性ベースの方法と比較して、潜在的なコスト削減と操作の柔軟性も提供できる。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィーであり得る。
本明細書で使用される場合、「ＳＥＣクロマトグラフィー樹脂」または「ＳＥＣクロマトグラフィー媒体」という用語は、交換可能に使用され、所望の生成物（例えば、二重特異性抗体生成物のホモ二量体汚染物質）から不純物を分離する、ＳＥＣで使用される任意の種類の固相を含むことができる。樹脂の体積、使用するカラムの長さと直径、及び動的容量と流速は、処理する流体の体積、プロセスにかけられる流体中のタンパク質の濃度など、いくつかのパラメーターに依存する可能性がある。
いくつかの例示的な実施形態では、二量体種を同定するための方法は、移動相を使用して、生物医薬品タンパク質を含む試料をクロマトグラフィーシステムに接触させて二量体種を含む溶離液を提供することと、エレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して、該溶離液中のタンパク質を同定することと、を含み得る。
本明細書で使用される場合、「質量分析計」という用語は、特定の分子種を同定し、それらの正確な質量を測定することができる装置を含む。この用語は、ポリペプチドまたはペプチドが検出及び／または特性決定のために溶出され得る任意の分子検出器を含むことを意味する。質量分析計には、イオン源、質量分析計、及び検出器の３つの主要部分を含めることができる。イオン源の役割は、気相イオンを生成することである。分析対象物の原子、分子、またはクラスターは、気相に移動し、同時にイオン化することができる（エレクトロスプレーイオン化の場合と同様）。イオン源の選択は、目的に大きく依存する。
いくつかの実施形態では、質量分析計は、エレクトロスプレー質量分析計であり得る。
本明細書で使用される場合、「エレクトロスプレーイオン化」または「ＥＳＩ」という用語は、溶液中のカチオンまたはアニオンのいずれかが、溶液を含むエレクトロスプレー針の先端と対極との間に電位差を印加することから生じる、高帯電液滴の流れの大気圧下での形成及び脱溶媒を介して、気相に移動するスプレーイオン化のプロセスを指す。溶液中の電解質イオンから気相イオンを生成するには、一般に３つの主要なステップがある。これらは、（ａ）ＥＳ注入端での帯電液滴の生成、（ｂ）気相イオンを生成することができる小さな高帯電液滴をもたらす溶媒蒸発及び繰り返しの液滴崩壊による帯電液滴の収縮、（ｃ）気相イオンが非常に小さく高電荷の液滴から生成されるメカニズムである。段階（ａ）～（ｃ）は、通常、装置の大気圧領域で発生する。
本明細書で使用される場合、「エレクトロスプレー注入セットアップ」という用語は、タンパク質の質量分析に使用される質量分析計と互換性のあるエレクトロスプレーイオン化システムを指す。エレクトロスプレーイオン化では、エレクトロスプレーニードルが、分光計の入口オリフィスの近くに配置されるオリフィスを有する。目的のタンパク質を含む試料は、シリンジニードルを通してポンプで送ることができる。シリンジニードルオリフィスと質量分析計につながるオリフィス間の電位は、溶液のスプレー（「エレクトロスプレー」）を形成する。エレクトロスプレーは大気圧で実行でき、溶液の高帯電液滴を提供する。エレクトロスプレー注入セットアップは、エレクトロスプレーエミッター、噴霧ガス、及び／またはＥＳＩ電源を含むことができる。セットアップは、オプションで自動化して、試料の吸引、試料の分注、試料の供給、及び／または試料をスプレーすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計であり得る。
本明細書で使用される「ナノエレクトロスプレー」または「ナノスプレー」という用語は、非常に低い溶媒流速、通常は試料溶液の毎分数百ナノリットル以下でのエレクトロスプレーイオン化を指し、多くの場合、外部溶媒送達を使用しない。ナノエレクトロスプレーを形成するエレクトロスプレー注入セットアップは、静的ナノエレクトロスプレーエミッターまたは動的ナノエレクトロスプレーエミッターを使用することができる。静的ナノエレクトロスプレーエミッターは、長期間にわたって少量の試料（分析物）溶液量の連続分析を実行する。動的ナノエレクトロスプレーエミッターは、キャピラリーカラムと溶媒デリバリーシステムを使用して、質量分析計による分析の前に混合物のクロマトグラフィー分離を実行する。
本明細書で使用される場合、「質量分析器」という用語は、種、すなわち、原子、分子、またはクラスターをそれらの質量に従って分離することができる装置を含む。高速タンパク質シークエンシングに使用できた質量分析計の非限定的な例は、飛行時間（ＴＯＦ）、磁気／電気セクター、四重極質量フィルター（Ｑ）、四重極イオントラップ（ＱＩＴ）、オービトラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、及び加速器質量分析（ＡＭＳ）の手法である。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析は、ネイティブ条件下で実施することができる。
本明細書で使用される場合、「ネイティブ条件」または「ネイティブＭＳ」または「ネイティブＥＳＩ－ＭＳ」という用語は、分析物中の非共有相互作用を保存する条件下で質量分析を実行することを含むことができる。ネイティブＭＳの詳細な総説については、以下の総説：Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ Ｂｏｅｒｉ Ｅｒｂａ ＆ Ｃａｒｌｏ Ｐｅｔｏｓａ，Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，２４ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ１１７６－１１９２（２０１５）を参照のこと。ネイティブＥＳＩと通常ＥＳＩの違いのいくつかを表１に示す（Ｈａｏ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｉｇｍｅｎｔ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，５８７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０１２－１０２０（２０１３））。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。
本明細書で使用される場合、「タンデム質量分析」という用語は、質量選択及び質量分離の複数の段階を使用することによって試料分子に関する構造情報が得られる技術を含む。前提条件は、試料分子を気相に移して無傷でイオン化できることと、最初の質量選択ステップの後に、何らかの予測可能かつ制御可能な方法で試料分子が崩壊するように誘導できることである。マルチステージＭＳ／ＭＳ、またはＭＳｎは、意味のある情報を取得できるか、または断片イオン信号が検出可能である限り、最初にプリカーサーイオン（ＭＳ２）を選択して分離し、断片化し、一次断片イオン（ＭＳ３）を分離し、断片化し、二次断片（ＭＳ４）を分離することなどで実行できる。タンデムＭＳは、様々なアナライザーの組み合わせでうまく実行されている。特定の目的のために組み合わせるアナライザーは、感度、選択性、及び速度だけでなく、サイズ、コスト、可用性などの様々な要因によっても決まる。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリーは、タンデムインスペースとタンデムインタイムであるが、タンデムインタイム分析計がインスペースまたはタンデムインスペース分析計と連結されているハイブリッドもある。タンデムインスペース質量分析計は、イオン源、プリカーサーイオン活性化デバイス、及び少なくとも２つの非トラッピング質量分析計で構成される。特定のｍ／ｚ分離機能を設計することで、装置のあるセクションでイオンを選択し、中間領域で解離させ、プロダクトイオンを別の分析装置に伝送してｍ／ｚ分離及びデータ収集を行うことがでる。タンデムインタイム質量分析計では、イオン源で生成されたイオンを、同じ物理デバイス内でトラップ、単離、断片化、及びｍ／ｚ分離することができる。
質量分析計によって同定されたペプチドは、インタクトなタンパク質及びそれらの翻訳後修飾の代理代表として使用できる。それらは、実験的及び理論的なＭＳ／ＭＳデータを相関させることにより、タンパク質の特性評価に使用でき、後者のデータは、タンパク質配列データベース内の可能なペプチドから生成される。特性評価には、タンパク質断片のアミノ酸の配列決定、タンパク質シークエンシングの決定、タンパク質デノボシークエンシングの決定、翻訳後修飾の特定、または翻訳後修飾の同定、または比較可能性分析、またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「データベース」という用語は、データベース（複数可）内のすべての可能な配列に対して未解釈のＭＳ－ＭＳスペクトルを検索する可能性を提供するバイオインフォマティックツールを指す。このようなツールの非限定的な例は、Ｍａｓｃｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）、またはＳｅｑｕｅｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）である。
いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、ヘテロ二量体種を定量化するための方法を提供する。
いくつかの実施形態では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含むヘテロ二量体種を定量化するための方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することを含み得る。第１のタンパク質に特異的な抗体は、文献にある既知の方法のいずれかを使用して調製することができる。
本明細書で使用される場合、「固体表面」という用語は、目的の抗体に結合する能力を有する任意の表面を含むことができる。第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料のいくつかの実施形態では、目的の抗体は、第１のタンパク質に特異的な抗体であり得る。固体表面の非限定的な例には、親和性樹脂、磁性ビーズ、及びアビジン、ストレプトアビジン、またはニュートラアビジンなどの固定化タンパク質を含むコーティングされたプレートが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体種を定量化するための方法は、ヘテロ二量体種を免疫沈降させることを含み得る。免疫沈降は、固体表面に固定化された抗体を使用することによって行うことができ、抗体は、合剤化された調製物中の多くの医薬品有効成分の１つに結合でき、医薬品有効成分はタンパク質であることができる。
いくつかの実施形態では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料は、固体表面上の第１のタンパク質に特異的な固定化抗体と共にインキュベートされ得る。インキュベーション時間は、数分から数時間の範囲である可能性がある。
いくつかの実施形態では、固体表面上で第１のタンパク質に特異的な固定化抗体と共にインキュベートされた第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料は、プルダウンすることができる。
いくつかの実施形態では、固体表面上で第１のタンパク質に特異的な固定化抗体と共にインキュベートされた第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料は、遠心分離することができる。いくつかの特定の実施形態では、遠心分離は、沈殿試料及びフロースルーまたは上澄みを生成することができる。
いくつかの実施形態では、沈殿試料及びフロースルーは、還元剤を使用することによって還元することができる。
本明細書で使用される場合、「還元する」という用語は、タンパク質中のジスルフィド架橋の還元を指す。タンパク質を還元するために使用される還元剤の非限定的な例は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β－メルカプトエタノール、エルマン試薬、ヒドロキシルアミン塩酸塩、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、またはそれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、沈殿試料及び／またはフロースルーは、１つまたは複数の化合物を使用して処理することができる。いくつかの特定の実施形態では、処理はアルキル化を含むことができる。いくつかの他の特定の例示的な実施形態では、処理は、タンパク質上のスルフヒドリル基のアルキル化を含み得る。
本明細書で使用される場合、「処理する」または「同位体標識する」という用語は、タンパク質を化学的標識することを指すことができる。タンパク質を化学標識する方法の非選択例には、４プレックス、６プレックス、及び８プレックスなどの試薬を使用した相対及び絶対定量（ｉＴＲＡＱ）用の等圧タグ、アミンの還元的脱メチル化、アミンのカルバミル化、タンパク質のＣ末端での１８Ｏ－標識、またはアミンもしくはスルフヒドリル基を標識するためのタンパク質のアミンまたはスルフヒドリル基が挙げられる。
いくつかの実施形態では、沈殿試料及び／またはフロースルーは、２つの別個の化合物を使用して処理することができ、２つの化合物は、同位体である。
いくつかの実施形態では、沈殿試料及びフロースルーの少なくとも一部は、それらを処理または同位体標識した後に混合することができる。
いくつかの実施形態では、処理されたまたは同位体標識された沈殿試料と、処理されたまたは同位体標識されたフロースルーの少なくとも一部との混合物を消化することができる。
本明細書で使用される場合、「消化」という用語は、タンパク質の１つまたは複数のペプチド結合の加水分解を指す。適切な加水分解剤を使用して試料中のタンパク質の消化を実行するには、いくつかのアプローチがあり、例えば、酵素消化または非酵素消化である。
本明細書で使用される場合、「加水分解剤」という用語は、タンパク質の消化を実行することができる多数の異なる薬剤の任意の１つまたは組み合わせを指す。酵素消化が可能な加水分解剤の非限定例としては、トリプシン、エンドプロテアーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテアーゼＡｓｐ－Ｎ、エンドプロテアーゼＧｌｕ－Ｃ、外膜プロテアーゼＴ（ＯｍｐＴ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、キモトリプシン、ペプシン、サーモライシン、パパイン、プロナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ由来のプロテアーゼが挙げられる。非酵素消化を行うことができる加水分解剤の非限定例には、高温、マイクロ波、超音波、高圧、赤外線、溶媒（非限定例はエタノール及びアセトニトリル）、固定化酵素消化（ＩＭＥＲ）、磁性粒子固定化酵素、及びオンチップ固定化酵素の使用が挙げられる。タンパク質消化に利用可能な技術について論じている最近の総説については、Ｓｗｉｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”（Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３，１２，１０６７－１０７７）を参照のこと。加水分解剤の１つまたは組み合わせは、配列特異的な方法でタンパク質またはポリペプチドのペプチド結合を切断し、より短いペプチドの予測可能なコレクションを生成することができる。
いくつかの実施形態では、処理または同位体標識された沈殿試料と処理または同位体標識されたフロースルーの少なくとも一部の混合物の消化時に、質量分析計に連結された液体クロマトグラフィーを使用して分析することができる。そのような例示的な実施形態の１つが、図２に表されている。図２は、第１のタンパク質であるｍＡｂ１と第２のタンパク質である融合タンパク質１とを合剤化された調製物に含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法の例示的な実施形態を示しており、該方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体（抗ｍＡｂ１抗体）を固体表面に固定化することと、試料を該抗体とインキュベートすることと、ｍＡｂ１と融合タンパク質１とのヘテロ二量体、ｍＡｂ１単量体、及びｍＡｂ１二量体をプルダウンして沈殿試料を捕捉することと、融合タンパク質１単量体及び融合タンパク質１二量体を含むフロースルーを回収することと、沈殿試料を第１の化合物である非標識ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で処理することと、フロースルーを第２の化合物である標識ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で処理することと、処理された沈殿試料と処理されたフロースルーの約１０％を混合して混合物を形成することと、該混合物を消化することと、質量分析計と連結した液体クロマトグラフィーを使用して混合物を分析し、試料中のヘテロ二量体種を定量化することと、を含む。例示的な実施形態を使用したヘテロ二量体種の定量中、試料を該抗体とインキュベートする際に第２のタンパク質が非特異的結合される。このような非特異的結合は、ヘテロ二量体の量の過大評価につながる可能性がある。したがって、陰性試料を調製することができ、非特異的に結合した第２のタンパク質の量を得ることができる。そのような可能性の１つの例が図３に示されている。
いくつかの例示的な実施形態では、陰性試料は、ヘテロ二量体種の存在なしに、第１のタンパク質及び第２のタンパク質の単量体及びホモ二量体を含み得る。
図３は、陰性試料を調製するための例示的な実施形態を示す。それは、第１のタンパク質（ｍＡｂ１）及び第２のタンパク質（融合タンパク質１）の単量体及びホモ二量体を含む試料を使用することを含む。抗体に非特異的に結合したこの量の第２のタンパク質は、第１のタンパク質に特異的な抗体（抗ｍＡｂ１抗体）を固体表面に固定化することと、試料を該抗体とインキュベートすることと、非特異的に結合した融合タンパク質１、ｍＡｂ１単量体及びｍＡｂ１二量体をプルダウンすることによって沈殿試料を捕捉することと、融合タンパク質１単量体及び二量体を含むフロースルーを収集することと、沈殿試料を第１の化合物である非標識ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で処理することと、フロースルーを第２の化合物である標識ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）で処理することと、処理済み沈殿試料と処理済みフロースルーの約１０％を混合して混合物を形成することと、質量分析計と連結した液体クロマトグラフィーを使用して混合物を分析し、試料中のヘテロ二量体種を定量化することと、を含む方法を使用することによって定量化することができる。
例示的な実施形態
本明細書に開示される実施形態は、二量体種の同定及び／または定量化のための方法及びシステムを提供する。
本明細書に開示される実施形態は、二量体種の同定及び／または定量化のための方法及びシステムを提供する。
いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、二量体種を同定するための方法を提供し、二量体種を含む試料を、クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムと接触させることと、二量体種を含む溶離液を提供するために、移動相を使用して該樹脂を洗浄することと、エレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して該溶離液中で二量体種を同定することと、を含む。
いくつかの例示的な実施形態では、二量体種は、ホモ二量体種であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、二量体種は、ヘテロ二量体種であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、従来の逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）、または順相クロマトグラフィー（ＮＰ）を含むことができる。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、親和性クロマトグラフィー樹脂、陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂、親和性樹脂、混合モードクロマトグラフィー樹脂、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、またはサイズ排除クロマトグラフィー樹脂から選択することができる。１つの特定の例示的な実施形態では、クロマトグラフィー樹脂は、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにオンラインで連結可能である。
いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、ネイティブ条件下で実行可能である。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、少なくとも３つの経路を有するスプリッターを使用して、エレクトロスプレーイオン化質量分析計に連結可能である。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、少なくとも３つの経路を有するスプリッターを使用して、紫外線検出器に連結可能である。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、少なくとも３つの経路を有するスプリッターを使用して、エレクトロスプレーイオン化質量分析計及び紫外線検出器に連結可能である。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、少なくとも３つの経路を有するスプリッターを使用して、エレクトロスプレーイオン化質量分析計及び紫外線検出器に連結可能であり、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計である。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、少なくとも３つの経路を有するスプリッターを使用して、エレクトロスプレーイオン化質量分析計及び紫外線検出器に連結可能であり、質量分析計は、ネイティブ条件下で動作するエレクトロスプレーイオン化質量分析計であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、少なくとも３つの経路を有するスプリッターを使用して、エレクトロスプレーイオン化質量分析計及び紫外線検出器に連結可能であり、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、ネイティブ条件下でナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、樹脂の洗浄からのタンパク質または抗原－抗体複合体または抗体－薬物複合体を含む溶離液は、約０．２ｍＬ／分～約０．４ｍＬ／分の流速で少なくとも３つの経路を有する少なくとも１つのスプリッターを介して紫外線検出器に導入することができる。
いくつかの例示的な実施形態では、洗浄のための移動相は、約０．２ｍＬ／分～約０．４ｍＬ／分の流速を有することができる。
いくつかの例示的な実施形態では、移動相は揮発性塩を含むことができる。いくつかの特定の実施形態では、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
いくつかの例示的な実施形態では、使用される移動相は、質量分析計と互換性があり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、試料は、約１０μｇ～約１００μｇの二量体種を含むことができる。
いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計における流速は、約１０ｎＬ／分～約５０ｎＬ／分であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計は、約０．８ｋＶ～約１．５ｋＶの噴霧電圧を有することができる。
いくつかの例示的な実施形態では、同定は、タンパク質シークエンシング、タンパク質デノボシークエンシング、翻訳後修飾の同定、または比較可能性分析、またはそれらの組み合わせを含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、試料はまた、タンパク質の単量体を含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、二量体は、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含むことができ、第１のタンパク質及び第２のタンパク質は、治療用抗体、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、抗体断片、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせであり得る。一態様では、抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、トリアボディ、テトラボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、二量体種は、合剤化された調製物中に存在する生成物関連不純物であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、二量体は、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含むことができ、第１のタンパク質及び第２のタンパク質は、約４．５～約９．０の範囲のｐＩを有することができる。一態様では、タンパク質は、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０のｐＩを有することができる。
本方法は、前述のタンパク質、不純物、及びカラムのいずれかに限定されず、同定または定量化のための方法は、任意の適切な手段によって実施され得ることが理解される。
いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラム１００であって、移動相、及びタンパク質を含む試料を受け取ることができるクロマトグラフィーカラムと、エレクトロスプレーイオン化質量分析計１１０と、を含むシステムを提供する（図１を参照のこと）。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１００は、疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂、陰イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂、親和性クロマトグラフィー樹脂、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂、混合モード樹脂、またはそれらの組み合わせから選択される樹脂を有することができる。
いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計１１０は、該クロマトグラフィーカラム１００に連結可能である。
いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計１１０は、ネイティブ条件下で実行可能である。
いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計１１０は、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、エレクトロスプレーイオン化質量分析計１１０は、ネイティブ条件下で実行するナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１００は、少なくとも３つの経路１２０を有するスプリッターを使用して、エレクトロスプレーイオン化質量分析計１００に連結可能である。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１００は、少なくとも３つの経路１２０を有するスプリッターを使用して、紫外線検出器１３０に連結可能である。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１００は、少なくとも３つの経路１２０を有するスプリッターを使用して、紫外線検出器１３０及びエレクトロスプレーイオン化質量分析計１１０に連結可能である。
いくつかの例示的な実施形態では、三方スプリッター１２０は、不均衡に分割して、クロマトグラフィーカラム１００から紫外線検出器１３０及びエレクトロスプレーイオン化質量分析計１１０への流れを可能にすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、システムは、二量体種を同定可能である。
本システムの例示的な実施形態を図１に示す。ＵＶ／ＭＳの二重検出を可能にするために、少なくとも３つの経路を持つスプリッターがカラムの後に使用される。低容量のフラクションはＭＳに直接、高容量のフラクションはＵＶ検出器に移送することができる。検出はほぼ同じ保持時間を共有する。ＵＶ検出器からのフラクションは、試料回収のために収集することができる。
システムは、前述のタンパク質、クロマトグラフィーカラム、質量分析計、抗体－薬物複合体、抗原－抗体複合体のいずれにも限定されないことが理解される。
本開示は、少なくとも部分的に、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化するための方法を提供し、本方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、試料を該抗体と共にインキュベートすることと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、沈殿試料を第１の化合物で処理することと、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理した沈殿試料と処理したフロースルーの少なくとも一部を混合して混合物を形成することと、質量分析計と連結した液体クロマトグラフィーを使用して混合物を分析し、試料中のヘテロ二量体種を定量化することと、を含む。
いくつかの例示的な実施形態では、第１のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、またはＦｃ融合タンパク質モノクローナル抗体であり得る。いくつかの例示的な実施形態では、第１のタンパク質は、モノクローナル抗体であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、第２のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、またはＦｃ融合タンパク質であり得る。いくつかの例示的な実施形態では、第１のタンパク質は、Ｆｃ融合タンパク質であり得る。
いくつかの実施形態では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料は、第１のタンパク質のホモ二量体種、第１のタンパク質のホモ二量体種、第１のタンパク質及び第２のタンパク質のヘテロ二量体種、またはそれらの組み合わせから選択される種をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料は、少なくとももう１つのタンパク質をさらに含むことができる。
いくつかの実施形態では、固体表面は、親和性樹脂、磁性ビーズ、及びコーティングされたプレートから選択することができる。親和性樹脂の非限定的な例には、プロテインＡアガロースビーズ、プロテインＧアガロースビーズ、プロテインＡセファロースビーズ、及びプロテインＧセファロースビーズが含まれる。
いくつかの実施形態では、磁性ビーズは、表面に共有結合された組換えストレプトアビジンの単層を有することができる。
いくつかの実施形態では、固体表面上の第１のタンパク質に特異的な抗体及び試料は、数分から数時間インキュベートすることができる。
いくつかの実施形態では、沈殿試料は、遠心分離によって得ることができる。いくつかの特定の実施形態では、フロースルーは、上清を収集することによって得ることができる。
いくつかの実施形態では、沈殿試料は、再懸濁した沈殿試料を加熱することによって再懸濁することができる。
いくつかの実施形態では、沈殿試料は、再懸濁した沈殿試料を加熱することによって再懸濁することができる。
いくつかの実施形態では、沈殿試料は溶出する可能性がある。
いくつかの実施形態では、沈殿試料及びフロースルーは、還元剤を使用することによって還元することができる。いくつかの特定の実施形態では、還元剤は、ジチオスレイトールであり得る。
いくつかの特定の実施形態では、処理はアルキル化を含むことができる。
いくつかの実施形態では、第１の化合物及び第２の化合物は、同位体であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、処理されたフロースルーの少なくとも一部は、処理されたフロースルーの約１０％を含むことができる。一態様では、処理されたフロースルーの少なくとも一部は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約１００％であることができる。
いくつかの実施形態では、第１の化合物及び第２の化合物は、それぞれ、標識ヨードアセトアミド及び非標識ヨードアセトアミドであることができる。いくつかの他の例示的な実施形態では、第１の化合物及び第２の化合物は、それぞれ、非標識ヨードアセトアミド及び標識ヨードアセトアミドであることができる。
いくつかの実施形態では、混合物は、質量分析計に連結された液体クロマトグラフィーを使用して、それを分析する前に消化することができる。一態様では、混合物は、トリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、外膜プロテアーゼＴ（ＯｍｐＴ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉのプロテアーゼから選択される加水分解剤を使用して消化することができる。
いくつかの実施形態では、混合物は、トリプシンを使用して消化することができる。
いくつかの実施形態では、混合物は、質量分析計に連結された液体クロマトグラフィーを使用して、それを分析する前に脱グリコシル化することができる。
１つの例示的な実施形態の例が図４に表されている。図４に示されているように、混合物を消化してから半分に分割することができる。半分は、質量分析計に連結された液体クロマトグラフィーを使用して分析することができ、残りの半分は、質量分析計に連結された液体クロマトグラフィーを使用して脱グリコシル化及び分析することができる。
いくつかの実施形態では、液体クロマトグラフィーは、逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）、混合モードクロマトグラフィー、及び順相クロマトグラフィー（ＮＰ）であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計は、エレクトロスプレー質量分析計であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計は、ナノエレクトロスプレー質量分析計であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理した沈殿試料と処理したフロースルーの少なくとも一部とを混合して混合物を形成することと、混合物を消化することと、消化した混合物を脱グリコシル化することと、を含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理した沈殿試料と処理したフロースルーの少なくとも一部とを混合して混合物を形成することと、混合物を消化することと、質量分析計に連結した液体クロマトグラフィーを使用して混合物を分析し、試料中のヘテロ二量体種を定量化することと、を含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理した沈殿試料と処理したフロースルーの少なくとも一部とを混合して混合物を形成することと、混合物を消化することと、消化した混合物を脱グリコシル化することと、質量分析計に連結した液体クロマトグラフィーを使用して混合物を分析し、試料中のヘテロ二量体種を定量化することと、を含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、質量分析計に連結された液体クロマトグラフィーを使用して分析して、試料中のヘテロ二量体種を定量化することを含むことができ、質量分析計はタンデム質量分析計であることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、沈殿試料に還元剤を添加することと、を含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、フロースルーに還元剤を添加することと、を含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理した沈殿試料と処理したフロースルーの約１０％とを混合して混合物を形成することと、質量分析計に連結した液体クロマトグラフィーを使用して混合物を分析し、試料中のヘテロ二量体種を定量化することと、を含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化する方法は、第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、沈殿試料を捕捉することと、フロースルーを収集することと、捕捉された沈殿試料を第１の化合物で処理し、フロースルーを第２の化合物で処理することと、処理した沈殿試料と処理したフロースルーの約１０％とを混合して混合物を形成することと、混合物を消化することと、質量分析計に連結した液体クロマトグラフィーを使用して混合物を分析し、試料中のヘテロ二量体種を定量化することと、を含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、試料中のヘテロ二量体種を定量化するための方法は、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含み得、試料は、ＩＣＨガイドラインに基づく強制分解を含む、クールホワイト光曝露、過酸化水素曝露、紫外線曝露、熱、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される条件に供することによってストレスを受けることができる。
いくつかの実施形態では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中の第２のタンパク質ヘテロ二量体％であって、第１のタンパク質は非標識化合物で処理され、第２のタンパク質は標識化合物で処理される、第２のタンパク質ヘテロ二量体％は、以下の式を使用して計算され得る：
式中、軽量領域は、非標識化合物で処理された第２のタンパク質について決定されるＭＳピークの曲線下面積であり、重量領域は、標識化合物で処理された第２のタンパク質について決定されるＭＳピークの曲線下面積である。本方法はまた、第１のタンパク質が標識化合物で処理され、第２のタンパク質が非標識化合物で処理されるように実施することができる。
いくつかの実施形態では、第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中の第２のタンパク質ヘテロ二量体％であって、第１のタンパク質は非標識化合物で処理され、第２のタンパク質は標識化合物で処理される、第２のタンパク質ヘテロ二量体％は、以下の式を使用して計算され得る：
式中、軽量領域は、非標識化合物で処理された第２のタンパク質について決定されるＭＳピークの曲線下面積であり、重量領域は、標識化合物で処理された第２のタンパク質について決定されるＭＳピークの曲線下面積である。本方法はまた、第１のタンパク質が標識化合物で処理され、第２のタンパク質が非標識化合物で処理されるように実施することができる。
本明細書で提供される方法ステップの数字及び／または文字による連続的な標識は、方法またはその任意の実施形態を特定の示された順序に限定することを意味するものではない。
特許、特許出願、公開特許出願、受託番号、技術記事、及び学術記事を含む様々な出版物が、明細書全体で引用されている。各参照文献は、参照により、その全体が、あらゆる目的で、本明細書に援用される。
本開示は、本開示をより詳細に説明するために提供される、以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。それらは例を説明することを意図しており、開示の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
材料及び試薬。水はＨｏｎｅｙｗｅｌｌ（Ｍｕｓｋｅｇｏｎ，ＭＩ）から購入した。酢酸アンモニウムはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５はＴｅｋｎｏｖａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入した。溶融シリカチューブ（内径（ＩＤ）１５０μｍ、外径（ＯＤ）３６０μｍ）、３方向コネクタ、及びスリーブは、ＩＤＥＸ（Ｏａｋ Ｈａｒｂｏｒ，ＷＡ）から購入した。ＰｉｃｏＴｉｐ ＥＭＩＴＴＥＲ ＳｉｌｉｃａＴｉｐ（ＦＳ３６０－２０－１０－Ｄ－２０－７ＣＴ）は、Ｎｅｗ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から購入した。ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣカラム、２００Å、１．７μｍ、４．６×３００ｍｍは、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した。ホットポケットカラムヒーターは、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。すべての試薬は、追加の精製なしで使用した。
オンラインＳＥＣ－ナノ－ＥＳＩ－ＭＳ分析。ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｉクラスシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）は、すべてのオンラインＳＥＣ－ナノＥＳＩ－ＭＳ分析のために、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｂｒｅｍｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に連結させた。ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣカラム（２００Å，１．７μｍ，４．６×３００ｍｍ）を３０℃に設定し、ｍＡｂ及びＡＤＣ分離に使用した。移動相はｐＨ６．８の１００ｍＭ酢酸アンモニウムであった。各分離は０．３ｍＬ／分の流速で３０分であり、注入量は４０μｇに設定した。ＳＥＣカラムの後に三方スプリッター（Ｔスプリッター）を接続した。溶融シリカチューブ（Ｌ：１４０ｃｍ、ＩＤ：１５０μｍ）及びＳｉｌｉｃａＴｉｐ（Ｌ：５ｃｍ、ＩＤ：１０μｍ）をＴスプリッターに接続した。高容量のフラクションは、溶融シリカチューブを介してＵＶ検出器に転送され、低容量のフラクションはＳｉｌｉｃａＴｉｐを介してＭＳに方向転換させた。以下のＭＳパラメーターは、オンラインＳＥＣ－ナノ－ＥＳＩ－ＭＳデータ取得に使用した。各取得は、試料注入直後から２５分であった。試料は、３ｋＶのスプレー電圧、２００℃のキャピラリー温度、及び７０ＳレンズのＲＦレベルでポジティブモードでイオン化した。インソースＣＩＤは７５ｅＶに設定した。フルＭＳスキャンは、ｍ／ｚ２０００～８０００の質量範囲で１５Ｋの分解能で取得した。フルＭＳスキャンには、最大注入時間１００ｍｓ、自動利得制御ターゲット値３ｅ６、及び１０マイクロスキャンを使用した。
データ分析。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｔａｃｔ Ｍａｓｓソフトウェアを、生データのデコンボリューションに使用した。抽出イオンクロマトグラム分析には、Ｔｈｅｒｍｏ Ｘｃａｌｉｂｕｒ Ｑｕａｌ Ｂｒｏｗｓｅｒを使用した。ＡＤＣのＤＡＲ計算にはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌを使用した。
実施例１
１．１ オンラインＳＥＣ－ナノ－ＥＳＩ－ＭＳ計装
ＳＥＣ及びＭＳテクノロジーは、タンパク質試料の特性評価に日常的に使用されている。ＳＥＣは、タンパク質構造の変化を最小限に抑える条件下でのタンパク質の分離及び特性評価を可能にする一方、ＭＳは、複雑な試料中の個々の成分の識別を可能にする。ＳＥＣ及びＭＳの個々の機能を単一のプラットフォームに組み合わせることが非常に望ましいが、ＳＥＣ分析に使用される高流速及び不揮発性塩はネイティブＭＳと互換性がないため、困難であることが証明されている。この制限を克服するために、Ｔスプリッターをカラムの後に使用してＳＥＣからの溶出液の流れを分割することにより、ＭＳへの溶媒及び塩の摂取量を減らした（図１を参照）。次に、ＴスプリッターをＳｉｌｉｃａＴｉｐを介してＭＳに接続し、並行して、溶融シリカチューブを介してＵＶ検出器に接続した。この配置により、ＳＥＣ溶出液のＵＶ／ＭＳ同時二重検出が可能になった。溶融シリカチューブの長さ及び直径を変えることにより、ＳｉｌｉｃａＴｉｐを介したＭＳへの流速を調整可能である（例えば、チューブが長い／狭いと抵抗が高くなり、ＳｉｌｉｃａＴｉｐ及びＭＳへの流れが増加する）。タンパク質試料は、０．３ｍＬ／分の流速を使用して４．６ｍｍ ＳＥＣカラムで分離した。Ｔスプリッター及びＵＶ検出器を接続する長さ１４０ｃｍ及び内径１５０μｍの溶融シリカチューブにより、ＳｉｌｉｃａＴｉｐへの望ましい流速の約１μＬ／分となった。溶融シリカチューブの長さ及び直径も、ＵＶ及びＭＳによる分子のほぼ同期した検出を可能にした。
１．１ オンラインＳＥＣ－ナノ－ＥＳＩ－ＭＳ計装
ＳＥＣ及びＭＳテクノロジーは、タンパク質試料の特性評価に日常的に使用されている。ＳＥＣは、タンパク質構造の変化を最小限に抑える条件下でのタンパク質の分離及び特性評価を可能にする一方、ＭＳは、複雑な試料中の個々の成分の識別を可能にする。ＳＥＣ及びＭＳの個々の機能を単一のプラットフォームに組み合わせることが非常に望ましいが、ＳＥＣ分析に使用される高流速及び不揮発性塩はネイティブＭＳと互換性がないため、困難であることが証明されている。この制限を克服するために、Ｔスプリッターをカラムの後に使用してＳＥＣからの溶出液の流れを分割することにより、ＭＳへの溶媒及び塩の摂取量を減らした（図１を参照）。次に、ＴスプリッターをＳｉｌｉｃａＴｉｐを介してＭＳに接続し、並行して、溶融シリカチューブを介してＵＶ検出器に接続した。この配置により、ＳＥＣ溶出液のＵＶ／ＭＳ同時二重検出が可能になった。溶融シリカチューブの長さ及び直径を変えることにより、ＳｉｌｉｃａＴｉｐを介したＭＳへの流速を調整可能である（例えば、チューブが長い／狭いと抵抗が高くなり、ＳｉｌｉｃａＴｉｐ及びＭＳへの流れが増加する）。タンパク質試料は、０．３ｍＬ／分の流速を使用して４．６ｍｍ ＳＥＣカラムで分離した。Ｔスプリッター及びＵＶ検出器を接続する長さ１４０ｃｍ及び内径１５０μｍの溶融シリカチューブにより、ＳｉｌｉｃａＴｉｐへの望ましい流速の約１μＬ／分となった。溶融シリカチューブの長さ及び直径も、ＵＶ及びＭＳによる分子のほぼ同期した検出を可能にした。
１．２ 合剤化された調製物
実験には、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、及びｍＡｂ３を含む製剤を使用した。６つの二量体種が製剤中に存在する可能性がある（図５を参照）。試料は、光安定性試験（ＵＶ １ｘＩＣＨ及びＣＷ １ｘＩＣＨ）などのＩＣＨガイドラインで提供されている条件を含む様々な条件下でストレスをかけた。
実験には、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、及びｍＡｂ３を含む製剤を使用した。６つの二量体種が製剤中に存在する可能性がある（図５を参照）。試料は、光安定性試験（ＵＶ １ｘＩＣＨ及びＣＷ １ｘＩＣＨ）などのＩＣＨガイドラインで提供されている条件を含む様々な条件下でストレスをかけた。
１．３ 結果
５つの二量体（ｍＡｂ１－ｍＡｂ１、ｍＡｂ１－ｍＡｂ２、ｍＡｂ２－ｍＡｂ２、ｍＡｂ２－ｍＡｂ３、及びｍＡｂ３－ｍＡｂ３）は、１．１に示すシステムを使用して、図６及び７に示す抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）及び分子量測定の両方を使用して区別に成功した。同定されなかった唯一のヘテロ二量体はｍＡｂ１－ｍＡｂ３であり、その理由は、その分子量がホモ二量体ｍＡｂ２－ｍＡｂ２（１５Ｄａだけ異なる）に非常に近いためであった（図７を参照）。
５つの二量体（ｍＡｂ１－ｍＡｂ１、ｍＡｂ１－ｍＡｂ２、ｍＡｂ２－ｍＡｂ２、ｍＡｂ２－ｍＡｂ３、及びｍＡｂ３－ｍＡｂ３）は、１．１に示すシステムを使用して、図６及び７に示す抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）及び分子量測定の両方を使用して区別に成功した。同定されなかった唯一のヘテロ二量体はｍＡｂ１－ｍＡｂ３であり、その理由は、その分子量がホモ二量体ｍＡｂ２－ｍＡｂ２（１５Ｄａだけ異なる）に非常に近いためであった（図７を参照）。
実施例２
２．１ オンラインＳＥＣ－ナノ－ＥＳＩ－ＭＳ計装
１．１に示されている計装が使用された。
２．１ オンラインＳＥＣ－ナノ－ＥＳＩ－ＭＳ計装
１．１に示されている計装が使用された。
２．２ 合剤化された調製物
ｍＡｂ１及び融合タンパク質を含む製剤を実験に使用した。３つの二量体種が製剤中に存在する可能性がある（図８を参照）。融合タンパク質にＮ－グリカンが存在すると、インタクトな質量分析が大幅に複雑になる。
ｍＡｂ１及び融合タンパク質を含む製剤を実験に使用した。３つの二量体種が製剤中に存在する可能性がある（図８を参照）。融合タンパク質にＮ－グリカンが存在すると、インタクトな質量分析が大幅に複雑になる。
ｍＡｂ１及び融合タンパク質を１２０：４０の比率で含む合剤、ｍＡｂ１及び融合タンパク質を６０：４０の比率で含む合剤、ｍＡｂ１の製剤（１２０ｍｇ／ｍＬ）、ｍＡｂ１の製剤（６０ｍｇ／ｍＬ）、及び融合タンパク質の製剤（４０ｍｇ／ｍＬ）を、４つのストレス条件：（ａ）クールホワイト光（ＣＷ）、（ｂ）１８時間の過酸化水素、（ｃ）紫外線光（ＵＶ）、及び（ｄ）３７℃で２８時間の加熱にさらした。ストレス条件には、ＩＣＨガイドラインによって提供される条件が含まれる。
３７℃で２８時間加熱し、過酸化水素で１８時間処理した製剤及び合剤は、高分子量種（二量体または他の凝集体）の軽度の増加をもたらした。一方、クールホワイト光及び紫外線光で処理された製剤及び合剤は、高レベルの高分子量種を含んでいた。
２．３ 二量体種の同定
クールホワイト光にさらされた１２０：４０の比率のｍＡｂ１及び融合タンパク質を含む合剤を、１．１に示すシステムを使用して分析した。図９は、ＳＥＣ－ナノ－ＥＳＩ－ＭＳを使用して分析された合剤の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す。この方法は、単量体種及び二量体種の区別をもたらす。
クールホワイト光にさらされた１２０：４０の比率のｍＡｂ１及び融合タンパク質を含む合剤を、１．１に示すシステムを使用して分析した。図９は、ＳＥＣ－ナノ－ＥＳＩ－ＭＳを使用して分析された合剤の抽出イオンクロマトグラム（ＸＩＣ）を示す。この方法は、単量体種及び二量体種の区別をもたらす。
電荷低減技術の適用は、図１０に例示されるように、分子量が非常に不均一であるタンパク質成分の質量測定を大幅に改善した。
紫外線（ＵＶ）及びＭＳ二重検出を備えたオンラインＳＥＣ－ナノ－エレクトロスプレーイオン化（ｎａｎｏ－ＥＳＩ）－ＭＳプラットフォームが開発された。このプラットフォームの有用性は、合剤化された調製物中のホモ二量体及びヘテロ二量体種を同定することによって検証された。
三方スプリッターを使用して、ＳＥＣ溶出液をＭＳ及びＵＶ検出器に不均衡に分割し、低容量のフラクションをＭＳに向け、高容量のフラクションをＵＶ検出器に向けた。現在のプラットフォームでは、ＵＶ及びネイティブＭＳによる補完的な二重検出が可能であり、フラクション収集の可能性があり、二量体種の特性評価に適用できる。カラムケミストリーの変更またはＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＵＨＭＲ機器の使用など、このオンラインＳＥＣ－ナノ－ＥＳＩ－ＭＳプラットフォームをさらに変更すると、チャージバリアントまたは非常に大きなタンパク質複合体の分析などの他の目的に適合させることができる。本明細書に記載の方法は、高塩分離技術（すなわち、ＨＩＣ、ＷＣＸ）を質量分析ベースの検出と組み合わせる可能性を解き放った。結論として、オンラインＳＥＣ－ナノ－ＥＳＩ－ＭＳプラットフォームは、様々な目的のタンパク質バイオ医薬品の分析に広く適用できる。
実施例３
３．１ 試料調製
ｍＡｂ１及び融合タンパク質１を含む合剤を使用した。実験に使用した様々な試料（５０μＬ）を表１に示す。陰性対照（試料３）は、ストレスのかかった融合タンパク質１（試料１）とストレスのかかったｍＡｂ１（試料１）を分析の直前に混合して調製し、ＩＣＨガイドラインに基づいて提供される紫外線光を使用して試料にストレスをかけた。もう一方の陰性対照（試料７）は、ストレスのかかった融合タンパク質１（試料６）及びストレスのかかったｍＡｂ１（試料５）を分析の直前に混合することによって調製し、試料は、ＩＣＨガイドラインに基づいて提供されるクールホワイト光を使用してストレスをかけた。
３．１ 試料調製
ｍＡｂ１及び融合タンパク質１を含む合剤を使用した。実験に使用した様々な試料（５０μＬ）を表１に示す。陰性対照（試料３）は、ストレスのかかった融合タンパク質１（試料１）とストレスのかかったｍＡｂ１（試料１）を分析の直前に混合して調製し、ＩＣＨガイドラインに基づいて提供される紫外線光を使用して試料にストレスをかけた。もう一方の陰性対照（試料７）は、ストレスのかかった融合タンパク質１（試料６）及びストレスのかかったｍＡｂ１（試料５）を分析の直前に混合することによって調製し、試料は、ＩＣＨガイドラインに基づいて提供されるクールホワイト光を使用してストレスをかけた。
３．２ 免疫沈降
免疫沈降は、図１１に示されるように実施された。６本の遠心分離チューブに、０．５ｍｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＴ１（磁性ビーズ）と１００μｇの抗ｍＡｂ１抗体を加えた。試料１、２、４、５、６、及び８を個々のチューブに加え、適切なシェーカーで穏やかに混合することにより、室温で３０分間インキュベートした。すべてのビーズが確実に収集されるように、チューブを磁気スタンドに３分間置いた。上澄みを除去し、０．４ｍＬの１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液を加えた。チューブをＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ上で８００ｒｐｍで５分間インキュベートした。このステップを２回繰り返した（合計３回）。すべての上清（１．２ｍＬの上清）を１．５ｍＬチューブに収集した（ＦＴ１－フロースルーとしてマーク）。磁性ビーズは、８００ｒｐｍでＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使用して０．４ｍＬの１０％アセトニトリルで洗浄した。すべてのビーズが確実に収集されるように、ビーズを磁気スタンドに３分間置いた。洗浄の合間に上澄みを除去した。このステップを３回繰り返した（合計４回）。すべての上清を回収した（１．２ｍＬの上清）。１．５ｍＬチューブで、ＦＴ２としてマークする；０．２ｍＬの溶出緩衝液（５０％ＡＣＮ、０．１％ギ酸）を添加し、１０００ｒｐｍのＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ上で室温で５分間インキュベートした。すべての上清をチューブに集め、ＰＤプルダウンとしてマークした。
免疫沈降は、図１１に示されるように実施された。６本の遠心分離チューブに、０．５ｍｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＴ１（磁性ビーズ）と１００μｇの抗ｍＡｂ１抗体を加えた。試料１、２、４、５、６、及び８を個々のチューブに加え、適切なシェーカーで穏やかに混合することにより、室温で３０分間インキュベートした。すべてのビーズが確実に収集されるように、チューブを磁気スタンドに３分間置いた。上澄みを除去し、０．４ｍＬの１００ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液を加えた。チューブをＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ上で８００ｒｐｍで５分間インキュベートした。このステップを２回繰り返した（合計３回）。すべての上清（１．２ｍＬの上清）を１．５ｍＬチューブに収集した（ＦＴ１－フロースルーとしてマーク）。磁性ビーズは、８００ｒｐｍでＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを使用して０．４ｍＬの１０％アセトニトリルで洗浄した。すべてのビーズが確実に収集されるように、ビーズを磁気スタンドに３分間置いた。洗浄の合間に上澄みを除去した。このステップを３回繰り返した（合計４回）。すべての上清を回収した（１．２ｍＬの上清）。１．５ｍＬチューブで、ＦＴ２としてマークする；０．２ｍＬの溶出緩衝液（５０％ＡＣＮ、０．１％ギ酸）を添加し、１０００ｒｐｍのＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ上で室温で５分間インキュベートした。すべての上清をチューブに集め、ＰＤプルダウンとしてマークした。
３．３ 分析
試料の分析には、次の手順が含まれる：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の８Ｍ尿素２０ｕＬを各試料チューブに添加する。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中の１μＬの１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を各試料に加え、ボルテックスしてよく混合し、５０℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中の２００ｍＭ軽標識ヨードアセトアミド（ｌｉｇｈｔ－ＩＡＡ）１．１ｕＬをプルダウンに添加し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中の２００ｍＭ重標識ヨードアセトアミド（ｈｅａｖｙ－ＩＡＡ）１．１ｕＬをフロースルーに添加する。プルダウン及びフロースルーの両方を室温で暗所で３０分間インキュベートする。次に、プルダウン全体とフロースルーの約１０％を混合し、４μｇのトリプシンを加えて消化し、３７℃で一晩インキュベートした。消化された混合物は、ＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム及びＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計）を使用して分析した。
試料の分析には、次の手順が含まれる：１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の８Ｍ尿素２０ｕＬを各試料チューブに添加する。Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中の１μＬの１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を各試料に加え、ボルテックスしてよく混合し、５０℃で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中の２００ｍＭ軽標識ヨードアセトアミド（ｌｉｇｈｔ－ＩＡＡ）１．１ｕＬをプルダウンに添加し、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水中の２００ｍＭ重標識ヨードアセトアミド（ｈｅａｖｙ－ＩＡＡ）１．１ｕＬをフロースルーに添加する。プルダウン及びフロースルーの両方を室温で暗所で３０分間インキュベートする。次に、プルダウン全体とフロースルーの約１０％を混合し、４μｇのトリプシンを加えて消化し、３７℃で一晩インキュベートした。消化された混合物は、ＬＣ－ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム及びＴｈｅｒｍｏ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ質量分析計）を使用して分析した。
図１２は、試料７及び８について得られたプルダウン及びフロースルーの質量対電荷比を示す。プルダウンフラクションはヘテロ二量体で融合タンパク質１を含み、フロースルーフラクションは単量体及びホモ二量体で存在する融合タンパク質１を含む。図１３は、融合タンパク質１ヘテロ二量体の計算されたパーセンテージを示している。計算は、図４に示す式を使用して実行された。融合タンパク質１を定量化するために使用されるペプチドのいくつかについて、試料３、４、７、及び８の質量電荷比チャートを図１４～１７に示す。図中のペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４は、それぞれペプチド２５ＥＬＶＩＰＣＲ３１、ペプチド７３ＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫ８９、ペプチド、ペプチド１７８ＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫ１９４を表す。
融合タンパク質１ヘテロ二量体％は、図１８に示される方法に従うことにより、ヘテロ二量体％に変換された。図１８に表されるヘテロ二量体％の計算に基づいて、試料４及び試料８のヘテロ二量体％は、それぞれ６．４％及び８．５％であることが見出された。陰性対照試料（試料３及び７）からの低レベルの「ヘテロ二量体シグナル」は、混合後のｍＡｂ１と融合タンパク質１間の相互作用、及びｍＡｂ１と親和性樹脂の間の非特異的相互作用に起因する可能性がある。ヘテロ二量体％は、全体のＨＭＷ％と一致していた。
実施例４
免疫沈降による融合タンパク質ヘテロ二量体の定量限界と直線性を評価するために、順次希釈されたクールホワイトストレス合剤を含む試料を使用した。
免疫沈降による融合タンパク質ヘテロ二量体の定量限界と直線性を評価するために、順次希釈されたクールホワイトストレス合剤を含む試料を使用した。
表２にリストされているように試験試料を準備した。ｍＡｂ１及び融合タンパク質１を含む合剤を使用し、クールホワイト光を使用してストレスをかけた。陰性対照混合試料は、ストレス融合タンパク質１（試料６）とストレスのかかったｍＡｂ１（試料５）を分析の直前に混合することによって調製した。実験に使用した様々な試験試料を、表２に示すように準備した。
３．２及び３．３に示すように免疫沈降及び分析を行った。希釈なしの試験試料中の融合タンパク質ヘテロ二量体％に正規化された試験試料中の融合タンパク質ヘテロ二量体％のチャートを図１９に示す。さらに、融合タンパク質１を定量化するために使用される３つのペプチドについて、混合試料中の融合タンパク質ヘテロ二量体％対クールホワイトストレス試料％のプロットが図２０に示され、希釈１の試料は、クールホワイトのストレスのかかった元のままの合剤試料を表す。定量法は、少なくともヘテロ二量体の０．８％（試験された最低値）という低い良好な直線性を維持した。
実施例５
周囲条件でのヘテロ二量体の定量化を評価するために、ストレスのかかった合剤化された試料、すなわち、ｍＡｂ１及び融合タンパク質１を含む合剤化された調製物からの試料を２５℃で１２ヶ月、５℃で４６ヶ月間保存した。３．２及び３．３に示すように免疫沈降及び分析を行った。試料において計算された定量は、表３及び図２１に示されており、異なる融合タンパク質１ペプチドが定量化のために使用された。
周囲条件でのヘテロ二量体の定量化を評価するために、ストレスのかかった合剤化された試料、すなわち、ｍＡｂ１及び融合タンパク質１を含む合剤化された調製物からの試料を２５℃で１２ヶ月、５℃で４６ヶ月間保存した。３．２及び３．３に示すように免疫沈降及び分析を行った。試料において計算された定量は、表３及び図２１に示されており、異なる融合タンパク質１ペプチドが定量化のために使用された。
このように、合剤化された調製物から得られた試料中のヘテロ二量体レベルの定量化のために新しい免疫沈降法が開発された。この方法は、合剤化された調製物からのＵＶ／ＣＷストレス及び周囲条件ストレス試料の両方におけるヘテロ二量体のレベルを定量化するためにうまく適用された。
図１２は、試料７及び８について得られたプルダウン及びフロースルーの質量対電荷比を示す。プルダウンフラクションはヘテロ二量体で融合タンパク質１を含み、フロースルーフラクションは単量体及びホモ二量体で存在する融合タンパク質１を含む。図１３は、融合タンパク質１ヘテロ二量体の計算されたパーセンテージを示している。計算は、図４に示す式を使用して実行された。融合タンパク質１を定量化するために使用されるペプチドのいくつかについて、試料３、４、７、及び８の質量電荷比チャートを図１４～１７に示す。図中のペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４は、それぞれペプチド２５ＥＬＶＩＰＣＲ３１、ペプチド７３ＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫ８９、ペプチド１２０ＬＶＬＮＣＴＡＲ１２７、ペプチド１７８ＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫ１９４を表す。
この実施形態の一態様では、ヘテロ二量体種を定量化するための方法は、安定同位体標識法を使用することに加えて、消化を実行することを含むことができる。
[本発明1001]
少なくとも1つの二量体種を同定するための方法であって、
前記二量体種を含む試料を、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに接触させることと、
前記二量体種を含む溶離液を提供するために、前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を移動相を使用して洗浄することと、
前記溶離液中の前記二量体種を、ネイティブ条件下でエレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して同定することと
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計が、前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有する前記クロマトグラフィーシステムにオンラインで連結されている、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計が、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計と、前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有する前記クロマトグラフィーシステムとの流体連結を可能にするために、少なくとも3つの経路を有する少なくとも1つのスプリッターが使用される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
少なくとも3つの経路を有する少なくとも1つのスプリッターが、紫外線検出器と、前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有する前記クロマトグラフィーシステムとの間の流体連結を可能にするために使用される、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂の洗浄からの前記溶離液が、約0．2ｍＬ／分～約0．4ｍＬ／分の流速で、前記少なくとも1つのスプリッターを通して前記紫外線検出器に導入される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄するために使用される前記移動相が、酢酸アンモニウムを含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄するために使用される前記移動相が、揮発性塩を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄するために使用される前記移動相が、約0．2ｍＬ／分～約0．4ｍＬ／分の流速を有する、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記クロマトグラフィーシステムに接触する前記二量体種を含む前記試料の量が、約10μｇ～約100μｇである、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂の洗浄から提供される前記溶離液が、前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計に導入され、前記エレクトロスプレーイオン化からのエレクトロスプレーの流速が約10ｎＬ／分～約50ｎＬ／分である、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂の洗浄から提供される前記溶離液が、前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計に導入され、エレクトロスプレーのスプレー電圧が約0．8ｋＶ～約1．5ｋＶである、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記試料が少なくとも2つの二量体種を含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記試料がホモ二量体種を含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記試料がヘテロ二量体種を含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記試料が、合剤化された調製物から得られる、本発明1001の方法。
[本発明1017]
サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムであって、移動相とタンパク質を含む試料とを受け入れることができる、前記クロマトグラフィーカラム、及び
前記クロマトグラフィーカラムにオンラインで連結することができ、ネイティブ条件下で実行することができる、エレクトロスプレーイオン化質量分析計
を含む、システム。
[本発明1018]
前記クロマトグラフィーカラムが、スプリッターを使用して前記質量分析計に連結することができる、本発明1017のシステム。
[本発明1019]
前記クロマトグラフィーカラムが、少なくとも3つの経路を有するスプリッターを使用して紫外線検出器にさらに連結可能である、本発明1017のシステム。
[本発明1020]
前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計が、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計である、本発明1017のシステム。
[本発明1021]
第1のタンパク質及び第2のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化するための方法であって、
前記第1のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、
前記試料を前記抗体とインキュベートすることと、
沈殿試料を捕捉することと、
フロースルーを収集することと、
前記沈殿試料を第1の化合物で処理することと、
前記フロースルーを第2の化合物で処理することと、
前記処理された沈殿試料と前記処理されたフロースルーの少なくとも一部とを混合して混合物を形成することと、
前記試料中の前記ヘテロ二量体種を定量化するために、質量分析計に連結した液体クロマトグラフィーを使用して前記混合物を分析することと
を含む、前記方法。
[本発明1022]
前記質量分析計がタンデム質量分析計である、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記沈殿試料に還元剤を添加することをさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1024]
前記フロースルーに還元剤を添加することをさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1025]
前記混合物を分析する前に前記混合物を消化することをさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1026]
前記混合物を分析する前に前記混合物を脱グリコシル化することをさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1027]
前記処理された沈殿試料と前記処理されたフロースルーの約10％とを混合して前記混合物を形成する、本発明1021の方法。
[本発明1028]
前記第1の化合物が前記第2の化合物の同位体である、本発明1021の方法。
[本発明1029]
前記第1の化合物がヨードアセトアミドである、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記第1のタンパク質が抗体である、本発明1021の方法。
[本発明1031]
前記第1のタンパク質がモノクローナル抗体である、本発明1021の方法。
[本発明1032]
前記第1のタンパク質がポリクローナル抗体である、本発明1021の方法。
[本発明1033]
前記第2のタンパク質が融合タンパク質である、本発明1021の方法。
[本発明1034]
前記試料が、クールホワイト光曝露、過酸化水素曝露、紫外線曝露、熱、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される条件に前記試料をさらすことによってストレスをかけられる、本発明1021の方法。
[本発明1035]
前記試料が、合剤化された調製物から得られる、本発明1021の方法。
[本発明1036]
ヘテロ二量体種を定量化するための方法であって、
前記ヘテロ二量体種を免疫沈降することと、
安定同位体標識法とそれに続く質量分析計に連結された液体クロマトグラフィーを使用することによってヘテロ二量体種を定量化することと
を含む、前記方法。
[本発明1001]
少なくとも1つの二量体種を同定するための方法であって、
前記二量体種を含む試料を、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに接触させることと、
前記二量体種を含む溶離液を提供するために、前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を移動相を使用して洗浄することと、
前記溶離液中の前記二量体種を、ネイティブ条件下でエレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して同定することと
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計が、前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有する前記クロマトグラフィーシステムにオンラインで連結されている、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計が、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計と、前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有する前記クロマトグラフィーシステムとの流体連結を可能にするために、少なくとも3つの経路を有する少なくとも1つのスプリッターが使用される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
少なくとも3つの経路を有する少なくとも1つのスプリッターが、紫外線検出器と、前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有する前記クロマトグラフィーシステムとの間の流体連結を可能にするために使用される、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂の洗浄からの前記溶離液が、約0．2ｍＬ／分～約0．4ｍＬ／分の流速で、前記少なくとも1つのスプリッターを通して前記紫外線検出器に導入される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄するために使用される前記移動相が、酢酸アンモニウムを含む、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄するために使用される前記移動相が、揮発性塩を含む、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄するために使用される前記移動相が、約0．2ｍＬ／分～約0．4ｍＬ／分の流速を有する、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記クロマトグラフィーシステムに接触する前記二量体種を含む前記試料の量が、約10μｇ～約100μｇである、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂の洗浄から提供される前記溶離液が、前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計に導入され、前記エレクトロスプレーイオン化からのエレクトロスプレーの流速が約10ｎＬ／分～約50ｎＬ／分である、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂の洗浄から提供される前記溶離液が、前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計に導入され、エレクトロスプレーのスプレー電圧が約0．8ｋＶ～約1．5ｋＶである、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記試料が少なくとも2つの二量体種を含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記試料がホモ二量体種を含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記試料がヘテロ二量体種を含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記試料が、合剤化された調製物から得られる、本発明1001の方法。
[本発明1017]
サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムであって、移動相とタンパク質を含む試料とを受け入れることができる、前記クロマトグラフィーカラム、及び
前記クロマトグラフィーカラムにオンラインで連結することができ、ネイティブ条件下で実行することができる、エレクトロスプレーイオン化質量分析計
を含む、システム。
[本発明1018]
前記クロマトグラフィーカラムが、スプリッターを使用して前記質量分析計に連結することができる、本発明1017のシステム。
[本発明1019]
前記クロマトグラフィーカラムが、少なくとも3つの経路を有するスプリッターを使用して紫外線検出器にさらに連結可能である、本発明1017のシステム。
[本発明1020]
前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計が、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計である、本発明1017のシステム。
[本発明1021]
第1のタンパク質及び第2のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化するための方法であって、
前記第1のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、
前記試料を前記抗体とインキュベートすることと、
沈殿試料を捕捉することと、
フロースルーを収集することと、
前記沈殿試料を第1の化合物で処理することと、
前記フロースルーを第2の化合物で処理することと、
前記処理された沈殿試料と前記処理されたフロースルーの少なくとも一部とを混合して混合物を形成することと、
前記試料中の前記ヘテロ二量体種を定量化するために、質量分析計に連結した液体クロマトグラフィーを使用して前記混合物を分析することと
を含む、前記方法。
[本発明1022]
前記質量分析計がタンデム質量分析計である、本発明1021の方法。
[本発明1023]
前記沈殿試料に還元剤を添加することをさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1024]
前記フロースルーに還元剤を添加することをさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1025]
前記混合物を分析する前に前記混合物を消化することをさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1026]
前記混合物を分析する前に前記混合物を脱グリコシル化することをさらに含む、本発明1021の方法。
[本発明1027]
前記処理された沈殿試料と前記処理されたフロースルーの約10％とを混合して前記混合物を形成する、本発明1021の方法。
[本発明1028]
前記第1の化合物が前記第2の化合物の同位体である、本発明1021の方法。
[本発明1029]
前記第1の化合物がヨードアセトアミドである、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記第1のタンパク質が抗体である、本発明1021の方法。
[本発明1031]
前記第1のタンパク質がモノクローナル抗体である、本発明1021の方法。
[本発明1032]
前記第1のタンパク質がポリクローナル抗体である、本発明1021の方法。
[本発明1033]
前記第2のタンパク質が融合タンパク質である、本発明1021の方法。
[本発明1034]
前記試料が、クールホワイト光曝露、過酸化水素曝露、紫外線曝露、熱、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される条件に前記試料をさらすことによってストレスをかけられる、本発明1021の方法。
[本発明1035]
前記試料が、合剤化された調製物から得られる、本発明1021の方法。
[本発明1036]
ヘテロ二量体種を定量化するための方法であって、
前記ヘテロ二量体種を免疫沈降することと、
安定同位体標識法とそれに続く質量分析計に連結された液体クロマトグラフィーを使用することによってヘテロ二量体種を定量化することと
を含む、前記方法。
図１２は、試料７及び８について得られたプルダウン及びフロースルーの質量対電荷比を示す。プルダウンフラクションはヘテロ二量体で融合タンパク質１を含み、フロースルーフラクションは単量体及びホモ二量体で存在する融合タンパク質１を含む。図１３は、融合タンパク質１ヘテロ二量体の計算されたパーセンテージを示している。計算は、図４に示す式を使用して実行された。融合タンパク質１を定量化するために使用されるペプチドのいくつかについて、試料３、４、７、及び８の質量電荷比チャートを図１４～１７に示す。図中のペプチド１、ペプチド２、ペプチド３、ペプチド４は、それぞれペプチド２５ＥＬＶＩＰＣＲ３１
（配列番号１）、ペプチド７３ＥＩＧＬＬＴＣＥＡＴＶＮＧＨＬＹＫ８９
（配列番号２）、ペプチド１２０ＬＶＬＮＣＴＡＲ１２７
（配列番号３）、ペプチド１７８ＳＤＱＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧＬＭＴＫ１９４
（配列番号４）を表す。
Claims (36)
- 少なくとも１つの二量体種を同定するための方法であって、
前記二量体種を含む試料を、サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに接触させることと、
前記二量体種を含む溶離液を提供するために、前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を移動相を使用して洗浄することと、
前記溶離液中の前記二量体種を、ネイティブ条件下でエレクトロスプレーイオン化質量分析計を使用して同定することと
を含む、前記方法。 - 前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計が、前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有する前記クロマトグラフィーシステムにオンラインで連結されている、請求項１に記載の方法。
- 前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計が、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計である、請求項１に記載の方法。
- 前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計と、前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有する前記クロマトグラフィーシステムとの流体連結を可能にするために、少なくとも３つの経路を有する少なくとも１つのスプリッターが使用される、請求項１に記載の方法。
- 少なくとも３つの経路を有する少なくとも１つのスプリッターが、紫外線検出器と、前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有する前記クロマトグラフィーシステムとの間の流体連結を可能にするために使用される、請求項１に記載の方法。
- 前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂の洗浄からの前記溶離液が、約０．２ｍＬ／分～約０．４ｍＬ／分の流速で、前記少なくとも１つのスプリッターを通して前記紫外線検出器に導入される、請求項５に記載の方法。
- 前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄するために使用される前記移動相が、酢酸アンモニウムを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄するために使用される前記移動相が、揮発性塩を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄するために使用される前記移動相が、約０．２ｍＬ／分～約０．４ｍＬ／分の流速を有する、請求項１に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーシステムに接触する前記二量体種を含む前記試料の量が、約１０μｇ～約１００μｇである、請求項１に記載の方法。
- 前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂の洗浄から提供される前記溶離液が、前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計に導入され、前記エレクトロスプレーイオン化からのエレクトロスプレーの流速が約１０ｎＬ／分～約５０ｎＬ／分である、請求項１に記載の方法。
- 前記サイズ排除クロマトグラフィー樹脂の洗浄から提供される前記溶離液が、前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計に導入され、エレクトロスプレーのスプレー電圧が約０．８ｋＶ～約１．５ｋＶである、請求項１に記載の方法。
- 前記試料が少なくとも２つの二量体種を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記試料がホモ二量体種を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記試料がヘテロ二量体種を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記試料が、合剤化された調製物から得られる、請求項１に記載の方法。
- サイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムであって、移動相とタンパク質を含む試料とを受け入れることができる、前記クロマトグラフィーカラム、及び
前記クロマトグラフィーカラムにオンラインで連結することができ、ネイティブ条件下で実行することができる、エレクトロスプレーイオン化質量分析計
を含む、システム。 - 前記クロマトグラフィーカラムが、スプリッターを使用して前記質量分析計に連結することができる、請求項１７に記載のシステム。
- 前記クロマトグラフィーカラムが、少なくとも３つの経路を有するスプリッターを使用して紫外線検出器にさらに連結可能である、請求項１７に記載のシステム。
- 前記エレクトロスプレーイオン化質量分析計が、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計である、請求項１７に記載のシステム。
- 第１のタンパク質及び第２のタンパク質を含む試料中のヘテロ二量体種を定量化するための方法であって、
前記第１のタンパク質に特異的な抗体を固体表面に固定化することと、
前記試料を前記抗体とインキュベートすることと、
沈殿試料を捕捉することと、
フロースルーを収集することと、
前記沈殿試料を第１の化合物で処理することと、
前記フロースルーを第２の化合物で処理することと、
前記処理された沈殿試料と前記処理されたフロースルーの少なくとも一部とを混合して混合物を形成することと、
前記試料中の前記ヘテロ二量体種を定量化するために、質量分析計に連結した液体クロマトグラフィーを使用して前記混合物を分析することと
を含む、前記方法。 - 前記質量分析計がタンデム質量分析計である、請求項２１に記載の方法。
- 前記沈殿試料に還元剤を添加することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
- 前記フロースルーに還元剤を添加することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
- 前記混合物を分析する前に前記混合物を消化することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
- 前記混合物を分析する前に前記混合物を脱グリコシル化することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
- 前記処理された沈殿試料と前記処理されたフロースルーの約１０％とを混合して前記混合物を形成する、請求項２１に記載の方法。
- 前記第１の化合物が前記第２の化合物の同位体である、請求項２１に記載の方法。
- 前記第１の化合物がヨードアセトアミドである、請求項２８に記載の方法。
- 前記第１のタンパク質が抗体である、請求項２１に記載の方法。
- 前記第１のタンパク質がモノクローナル抗体である、請求項２１に記載の方法。
- 前記第１のタンパク質がポリクローナル抗体である、請求項２１に記載の方法。
- 前記第２のタンパク質が融合タンパク質である、請求項２１に記載の方法。
- 前記試料が、クールホワイト光曝露、過酸化水素曝露、紫外線曝露、熱、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される条件に前記試料をさらすことによってストレスをかけられる、請求項２１に記載の方法。
- 前記試料が、合剤化された調製物から得られる、請求項２１に記載の方法。
- ヘテロ二量体種を定量化するための方法であって、
前記ヘテロ二量体種を免疫沈降することと、
安定同位体標識法とそれに続く質量分析計に連結された液体クロマトグラフィーを使用することによってヘテロ二量体種を定量化することと
を含む、前記方法。
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