JP2022517338A - 抗体の断片化を特定及び定量する方法及びシステム - Google Patents
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Abstract
混合モードのサイズ排除固定相（１１０）を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプルをロードする工程、移動相を使用して前記混合モードのサイズ排除固定相を洗浄して、前記断片を含む溶離液を得る工程、質量分析計（１２０）を使用して前記断片の分子量を決定する工程、及び前記分子量を既知のタンパク質標準と相関させる工程、を含む、抗体断片を同定及び定量するための方法ならびにサンプル中の抗体断片化部位を特定するための方法を提供する。【選択図】図３
Description
関連出願への相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条の下、２０１９年１月１６日に出願された米国仮出願第６２／７９３，００４号に基づく恩典を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
本出願は、米国特許法第１１９条の下、２０１９年１月１６日に出願された米国仮出願第６２／７９３，００４号に基づく恩典を主張するものであり、これはその全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
発明の分野
本発明は、概して、抗体断片を同定及び定量し、抗体上の断片化部位を特定するための方法及びシステムに関する。
本発明は、概して、抗体断片を同定及び定量し、抗体上の断片化部位を特定するための方法及びシステムに関する。
背景
タンパク質ベースのバイオ医薬品は、がん、自己免疫疾患、感染症、及び心血管代謝障害の治療のための重要な薬品として台頭してきており、それらは製薬業界で最も急速に成長している製品区分のうちの１つである。
タンパク質ベースのバイオ医薬品は、がん、自己免疫疾患、感染症、及び心血管代謝障害の治療のための重要な薬品として台頭してきており、それらは製薬業界で最も急速に成長している製品区分のうちの１つである。
酵素的または非酵素的のいずれかによるタンパク質消化は、タンパク質の同定、特性評価、及び定量における重要なツールである。断片化部位は、タンパク質の複雑さ及び／または消化方法に依存する場合がある。断片化部位を検出するためには、切り出された断片の同定が必要とされる。
更に、タンパク質ベースのバイオ医薬品は、非常に高い純度基準を満たさなければならない。タンパク質は、ペプチド骨格が断片へと切断されやすく、これは、処理、取り扱い、または保管中に使用される酸性条件によって触媒される場合がある。これらの切り出された断片は、製品と比較して異なる作用機序及び潜在的な毒性または免疫原性を示す可能性がある。加えて、それらは製品よりも低い安定性を有する場合があり、これは凝集及び免疫原性の高いリスクになる。最近の進歩にもかかわらず、そのような切り出された断片の定量的評価のための純度試験方法を開発することは依然として課題である。したがって、薬品の開発及び製造の様々な段階中に、このような切り出された断片を検査及び特性評価することが重要である。
断片を検出する試験のための分析方法は、望まれる生成物を検出及び定量するのに十分な精度及び感度を示す必要がある。タンパク質と切り出された断片との間の構造的及び物理化学的特性が類似しているため、評価が困難な場合がある。直接分析では、試験するのに十分な多い量で切り出された断片を単離する必要がある場合があるが、これは望ましくない場合があり、選択された事例でのみ可能であった。
抗体断片を同定及び定量し、抗体上の断片化部位を特定するための方法及び／またはシステムが当該技術分野で長年必要とされている。
概要
タンパク質ベースのバイオ医薬品の開発、製造、及び販売の成長により、タンパク質の断片及びタンパク質の断片化部位の特性評価に対する需要が増加している。
タンパク質ベースのバイオ医薬品の開発、製造、及び販売の成長により、タンパク質の断片及びタンパク質の断片化部位の特性評価に対する需要が増加している。
本明細書に開示の例示的な実施形態は、抗体断片を同定及び定量し、抗体上の断片化部位を特定するための方法及びシステムを提供することによって、前述した要求を満たす。
本開示は、少なくとも一部において、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法を提供する。
例示的な一実施形態では、抗体の断片を定量するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程、移動相を使用して混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、断片を含む溶離液を得る工程、及び質量分析計を使用して溶離液中の断片の量を定量する工程、を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、疎水性相互作用機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、電荷－電荷相互作用機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、約１０μｇ～約１００μｇのサンプルを接触させる工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、移動相を使用して混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、断片を含む溶離液を得る工程を含み得る。この実施形態の特定の態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、質量分析計と適合性を有することができる移動相を使用して、混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含み得る。別の特定の態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、移動相を使用して混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含むことができ、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせから選択することができる。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、最大６００ｍＭの総塩濃度を含む移動相を使用して、混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、０．２ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量で移動相を使用して、混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、断片は抗体の分解生成物であってもよい。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、断片は不純物である。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、抗体はモノクローナル抗体である。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、抗体は治療用抗体である。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、抗体は二重特異性抗体である。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、抗体は多重特異性抗体である。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を定量するための方法は、質量分析計を使用して前記溶離液中の断片の量を定量する工程を含むことができ、質量分析計はタンデム質量分析計とすることができる。
本開示は、少なくとも一部において、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法を提供する。
例示的な一実施形態では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程、移動相を使用して混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、断片を含む溶離液を得る工程、質量分析計を使用して溶離液中の断片の分子量を決定する工程、及び断片の分子量データを、少なくとも１つの既知のタンパク質標準から得られたデータと相関させる工程、を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、疎水性相互作用機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに前記サンプルを接触させる工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、電荷－電荷相互作用機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに前記サンプルを接触させる工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、追加の相互作用機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、約１０μｇ～約１００μｇのサンプルを接触させる工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、移動相を使用して混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、断片を含む溶離液を得る工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、質量分析計と適合性を有することができる移動相を使用して、混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含み得る。特定の態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、移動相を使用して混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含むことができ、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせから選択することができる。別の特定の態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、最大６００ｍＭの総塩濃度を含む移動相を使用して、混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、０．２ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量で移動相を使用して、混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、断片は抗体の分解生成物である。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、抗体はモノクローナル抗体である。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、抗体は治療用抗体である。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、抗体は二重特異性抗体である。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、抗体は多重特異性抗体である。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程を含むことができ、断片は抗体の消化産物であってもよい。
この実施形態の一態様では、サンプル中の抗体の断片を同定するための方法は、質量分析計を使用して前記溶離液中の断片の量を定量する工程を含むことができ、質量分析計はタンデム質量分析計とすることができる。
本開示は、少なくとも一部において、抗体の断片化部位を特定するための方法を提供する。
例示的な一実施形態では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプルを接触させる工程、移動相を使用して混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、溶離液を得る工程、質量分析計を使用して前記溶離液中の抗体断片の分子量データを決定する工程、及び断片の分子量データを、少なくとも１つの既知のタンパク質標準から得られたデータと相関させる工程、を含み得る。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、疎水性相互作用機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプルを接触させる工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、電荷－電荷相互作用機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプルを接触させる工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプル約１０μｇ～約１００μｇを接触させる工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、電荷－電荷相互作用機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプルを接触させる工程、及び移動相を使用して混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、断片を含む溶離液を得る工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、質量分析計と適合性を有することができる移動相を使用して、混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含み得る。特定の態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、移動相を使用して混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含むことができ、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせから選択することができる。別の特定の態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、最大６００ｍＭの総塩濃度を含む移動相を使用して、混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、０．２ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量で移動相を使用して、混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄する工程を含み得る。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプルを接触させる工程を含むことができ、抗体はモノクローナル抗体であってもよい。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプルを接触させる工程を含むことができ、抗体は治療用抗体であってもよい。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプルを接触させる工程を含むことができ、抗体は二重特異性抗体であってもよい。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプルを接触させる工程を含むことができ、抗体は多重特異性抗体であってもよい。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプルを接触させる工程を含むことができ、サンプルは２種より多い断片を含む。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプルを接触させる工程を含むことができ、断片は抗体の分解により形成されたものである。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプルを接触させる工程を含むことができ、断片は抗体の消化産物である。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプルを接触させる工程を含むことができ、断片は抗体の分解により形成されたものである。
この実施形態の一態様では、抗体の断片化部位を特定するための方法は、質量分析計を使用して前記溶離液中の断片を同定する工程を含むことができ、質量分析計はタンデム質量分析計とすることができる。
本開示は、少なくとも一部において、混合モードのクロマトグラフィーシステムを提供する。
例示的な一実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムと質量分析計とを含み得る。
この実施形態の一態様では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、疎水性相互作用機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含み得る。
この実施形態の一態様では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、電荷－電荷相互作用機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含み得る。
この実施形態の一態様では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、約１０μｇ～約１００μｇのサンプルの溶離のために使用できる、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含み得る。
この実施形態の一態様では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、移動相を受け入れることができる混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含み得る。
この実施形態の一態様では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、断片を有するサンプルを更に受け入れることができる混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含み得る。
この実施形態の一態様では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、移動相で洗浄することができる混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含み得る。
この実施形態の一態様では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムに連結された質量分析計を含み得る。
この実施形態の一態様では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、タンデム質量分析計を含み得る。
この実施形態の一態様では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムを含むことができ、混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせから選択される移動相と適合性を有し得る。
この実施形態の一態様では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムを含むことができ、混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂は、最大６００ｍＭの総塩濃度を含む移動相を使用して洗浄することができる。
この実施形態の一態様では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムを含むことができ、クロマトグラフィーカラムは、０．２ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量で移動相を用いて洗浄することができる。
詳細な説明
酵素的または非酵素的のいずれかによる抗体の断片化は、抗体産物の処理中に不純物として抗体断片を形成する場合がある。タンパク質ベースの治療薬において存在する莫大な動的なタンパク質種は、抗体断片の量が低含量である場合があることから、抗体断片及び断片化部位を検出するための現行の質量分析に基づく方法の障害となる。
酵素的または非酵素的のいずれかによる抗体の断片化は、抗体産物の処理中に不純物として抗体断片を形成する場合がある。タンパク質ベースの治療薬において存在する莫大な動的なタンパク質種は、抗体断片の量が低含量である場合があることから、抗体断片及び断片化部位を検出するための現行の質量分析に基づく方法の障害となる。
あるいは、多種多様な抗体断片が治療薬として設計されてきた。抗体断片の最も重要な利点としては、サイズ、製造、組織浸透、及び多重特異性を生成するために連結する能力が挙げられる。場合によっては、分子の他の部分からの干渉なしに免疫グロブリンの一部分の活性を研究または利用することが有用である。免疫グロブリン分子を個別の特性を持つ断片へと選択的に切断することが可能である。抗体の断片化は、免疫グロブリンタンパク質構造の特定の部分を消化または切断する還元剤及びプロテアーゼを使用して行うことができる（Ｎｅｌｓｏｎ（２０１０） ｍＡｂｓ ２：７７－８３；１２－Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｅｄｉｔｏｒ（ｓ）：Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ，Ｌｉｌａ Ｍ．Ｓｔｒｏｈｌ，Ｉｎ Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，“Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１２，２６５－５９５）。そのような抗体断片を設計及び評価するために、特定の消化方法によって抗体断片及び抗体上の断片化部位を特定することが重要な場合がある。
抗体断片及び断片化部位を特定するためには、電気泳動及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）ベースの方法などの従来の分離に基づいた抗体純度試験は、必要な感度が不足している。ＲＰ－ＬＣ－ＭＳのためのサンプル調製プロセスには時間がかかり、また場合によっては高温、有機溶媒、または酸性のｐＨなどのクロマトグラフィー条件が酸化物アーティファクトを生じさせる可能性があるため、質量分析と組み合わされた逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）によるペプチドマッピングにもいくつかの制限がある。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）及びプロテインＡクロマトグラフィーも抗体酸化の分析に使用されているものの、より長いクロマトグラフィーの実行時間を要する場合があり、また様々な断片に対して限定的な能力しか有さない場合がある（Ｈａｖｅｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．ｍＡｂｓ，（２０１４）６：８５２－８５８；Ｂｏｙｄ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（２０１１）８７９：９５５－９６０；ａｎｄ Ｌｏｅｗ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（２０１２）１０１：４２４８－４２５７）。
加えて、抗体の消化時に形成される抗体断片を分離するために、いくつかのサイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー法を使用することができる。抗体断片は、質量分析計または紫外線吸収システムを使用して更に分析することができる。しかしながら、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーカラムからの移動相を質量分析計に直接注入することはできず、移動相の変更を含む追加の工程が必要とされる（図１を参照）。
既存の方法の限界を踏まえ、新規の混合モード－サイズ排除クロマトグラフィー－質量分析システムを使用する抗体断片及び抗体断片化部位を特定及び定量するための有効かつ効率的な方法が開発された。
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法及び材料を実施または試験において使用できるものの、以降では特定の方法及び材料について説明する。言及される全ての出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。
「１つの（ａ）」という用語は、「少なくとも１つの」を意味すると理解されるべきである。「約」及び「おおよそ」という用語は、当業者によって理解される標準的な変化形が可能なように理解されるべきである。範囲が示されている場合には端点が含まれる。
バイオ医薬品は、高レベルの有効性、純度、及び低レベルの構造的不均一性を示すことが必要とされる。構造の不均一性は、多くの場合、薬品の生物活性及び有効性に影響を及ぼす。そのため、治療用タンパク質及び／または不純物の特性評価及び定量は、医薬品開発において重要である。タンパク質の構造的不均一性は、翻訳後修飾、ならびに製造及び保管条件中の固有の化学的修飾に起因する場合がある。バイオテクノロジー産業において製造されるタンパク質では、標的タンパク質を精製することと、最終製品の品質を正確に把握することの両方のために、相補的な分離技術が必要とされる。製品の複雑さは、単純な一次元分離戦略の使用を排除する。
本明細書において、「タンパク質」という用語には、共有結合しているアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーが含まれる。タンパク質は、当該技術分野で「ポリペプチド」として一般的に知られている１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造バリアント、及びペプチド結合を介して連結されたそれらの合成による天然に存在しない類似体、関連する天然に存在する構造バリアント、及びそれらの合成による天然に存在しない類似体から構成されるポリマーを指す。「合成ペプチドまたはポリペプチド」は、天然に存在しないペプチドまたはポリペプチドを指す。合成ペプチドまたはポリペプチドは、例えば自動化されたポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。様々な固相ペプチド合成方法が当業者に公知である。タンパク質は、単一の機能する生体分子を形成するために、１つまたは複数のポリペプチドを含み得る。タンパク質には、バイオ治療用タンパク質、研究または治療で使用される組み換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体のいずれも含まれ得る。別の例示的な態様では、タンパク質には、抗体断片、ナノボディ、組み換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどが含まれ得る。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えばピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の種）、哺乳動物系（例えばＣＨＯ細胞、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの組み換え細胞ベースの産生系を使用して産生され得る。バイオ治療用タンパク質及びその製造に関して説明している概説については、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．（２０１２）１４７－７５）を参照のこと。いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、修飾物、付加物、及び他の共有結合された部位を含む。これらの修飾物、付加物、及び部位には、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、及び他の単糖）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識及び他の染料などが含まれる。タンパク質は、組成及び溶解度に基づいて分類できることから、タンパク質には、球状タンパク質や繊維状タンパク質などの単純タンパク質；核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質などの複合タンパク質；ならびに一次誘導タンパク質及び二次誘導タンパク質などの誘導タンパク質が含まれ得る。
いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、またはこれらの組み合わせであってもよい。
本明細書で使用される「抗体」という用語には、４本のポリペプチド鎖、ジスルフィド結合によって相互接続された２本の重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とを含む免疫グロブリン分子、ならびにそれらの多量体（例えばＩｇＭ）が含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略される）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３の３つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまたはＶＬと略される）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分化することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存される領域が点在する。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとから構成されており、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。様々な例示的な実施形態において、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよく、あるいは天然にもしくは人工的に改変されていてもよい。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲのサイドバイサイド分析に基づいて定義することができる。本明細書で使用される「抗体」という用語には、完全な抗体分子の抗原結合断片も含まれる。本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」や抗体の「抗原結合断片」などの用語には、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の、天然に存在する、酵素的に得られる、合成の、または遺伝子操作された、ポリペプチドまたは糖タンパク質が含まれる。抗体の抗原結合断片は、例えば、タンパク質分解または組み換え遺伝子工学技術（抗体可変ドメイン及び任意選択的に定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む）などの任意の適切な標準的手法を使用して、完全な抗体分子から誘導することができる。そのようなＤＮＡは公知である、及び／または例えば販売元のＤＮＡライブラリー（例えばファージ抗体ライブラリーを含む）から容易に入手可能であり、あるいは合成することができる。ＤＮＡは、例えば１つ以上の可変及び／または定常ドメインを適切な構成に配置するため、またはコドンを導入するため、システイン残基を形成するため、アミノ酸を修飾、追加、もしくは削除するなどのために、化学的に、または分子生物学手法を使用することによって、配列決定及び操作することができる。
本明細書で使用される「抗体断片」には、インタクト抗体の一部、例えば、抗体の抗原結合領域または可変領域などが含まれる。抗体断片の例としては、限定するものではないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、ならびにトライアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって連結されている組み換え一本鎖ポリペプチド分子である。抗体断片は、様々な手段によって製造することができる。例えば、抗体断片は、インタクト抗体の断片化によって酵素的もしくは化学的に製造することができる、及び／またはこれは部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組み換えにより製造することができる。あるいは、またはこれに加えて、抗体断片は、完全にまたは部分的に合成により製造することができる。抗体断片は、任意選択的には一本鎖抗体断片を含んでいてもよい。あるいは、またはこれに加えて、抗体断片は、例えばジスルフィド結合によって一体に連結された複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択的には多分子複合体を含んでいてもよい。
本明細書で使用される「消化」という用語は、タンパク質のペプチド結合の加水分解を指す。適切な加水分解剤を使用してサンプル中のタンパク質の分解を行うためには、例えば酵素的消化または非酵素的消化などの複数の手法が存在する。
本明細書で使用される「加水分解剤」という用語は、タンパク質の消化を行うことができる多数の異なる剤のうちの任意の１つまたは組み合わせを指す。酵素的消化を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、トリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、外膜プロテアーゼＴ（ＯｍｐＴ）、化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、及びアスペルギルス・サイトイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ）由来のプロテアーゼが挙げられる。非酵素的消化を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、高温、マイクロ波、超音波、高圧、赤外線、溶媒（非限定的な例はエタノール及びアセトニトリルである）、固定化酵素的消化（ＩＭＥＲ）、磁性粒子固定化酵素、及びオンチップ固定化酵素の使用が挙げられる。タンパク質消化に利用可能な技術に関して説明されている最近の概説については、Ｓｗｉｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”（Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０１３，１２，１０６７－１０７７）を参照のこと。加水分解剤の１つまたは組み合わせは、配列特異的な形でタンパク質またはポリペプチドのペプチド結合を切断し、予測可能なより短いペプチドのコレクションを生成することができる。
サンプル中のタンパク質を消化するための広く受け入れられている方法の１つには、プロテアーゼの使用が含まれていた。多くのプロテアーゼが利用可能であり、これらのそれぞれは、特異性、効率、及び最適な消化条件の点で独自の特徴を有している。プロテアーゼは、ペプチド内の非末端または末端アミノ酸で切断するプロテアーゼの能力に基づいて分類される、エンドペプチダーゼとエキソペプチダーゼの両方を指す。あるいは、プロテアーゼは、触媒作用の機構で分類される、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、及びスレオニンプロテアーゼの６つの異なる分類も指す。「プロテアーゼ」及び「ペプチダーゼ」という用語は、ペプチド結合を加水分解する酵素を指すために互換的に使用される。
プロテアーゼは、特異的及び非特異的プロテアーゼに分類することもできる。本明細書で使用される「特異的プロテアーゼ」という用語は、ペプチドの特定のアミノ酸側鎖でペプチド基質を切断する能力を有するプロテアーゼを指す。
本明細書で使用される「非特異的プロテアーゼ」という用語は、ペプチドの特定のアミノ酸側鎖でペプチド基質を切断する能力が小さいプロテアーゼを指す。切断の優先度は、タンパク質配列中の切断されたアミノ酸の総数に対する切断部位としての特定のアミノ酸の数の比率に基づくことができる。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当該技術分野で利用可能なまたは公知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンから誘導することができる。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組み換え、及びファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野で公知の多種多様な技術を使用して作製することができる。
本明細書で使用される「クロマトグラフィー」という用語は、液体または気体によって運ばれる化学混合物を、液体固定相または固体固定相の周囲または上を流れる際の化学物質の異なる分布の結果として複数の成分に分離することができるプロセスを指す。
本明細書で使用される「混合モードのクロマトグラフィー（ＭＭＣ）」または「マルチモーダルクロマトグラフィー」という用語には、溶質が複数の相互作用モードまたはメカニズムを介して固定相と相互作用するクロマトグラフィー法が含まれる。ＭＭＣは、従来の逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）、及び順相クロマトグラフィー（ＮＰ）の代替的なまたは補完的なツールとして使用することができる。それぞれ疎水性相互作用、親水性相互作用、及びイオン相互作用が主要な相互作用モードであるＲＰ、ＮＰ、及びＩＥＸクロマトグラフィーとは異なり、混合モードのクロマトグラフィーでは、これらの相互作用モードを２つ以上組み合わせて使用することができる。混合モードのクロマトグラフィーの媒体は、シングルモードのクロマトグラフィーでは再現できない独自の選択性を提供することができる。混合モードのクロマトグラフィーは、親和性に基づく方法と比較して、潜在的なコスト削減、より長いカラム寿命、及び操作の柔軟性を提供することができる。
「サイズ排除クロマトグラフィー」または「ＳＥＣ」または「ゲル濾過」という語句には、溶液中のそれらのサイズに応じて分子を分類することができる液体カラムクロマトグラフィー技術が含まれる。
本明細書で使用される「ＳＥＣクロマトグラフィー樹脂」または「ＳＥＣクロマトグラフィー媒体」という用語は、本明細書においては互換的に使用され、不純物を目的生成物から分離する（例えば、二重特異性抗体製品について、ホモ二量体である混入物質）ＳＥＣにおいて使用される任意の種類の固相を含むことができる。樹脂の体積、使用するカラムの長さ及び直径、ならびに動的容量及び流量は、処理される流体の体積や、処理を受ける流体中のタンパク質の濃度などの複数のパラメータに依存し得る。
本明細書で使用される「混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー」または「ＭＭ－ＳＥＣ」という用語には、それらのサイズに基づく分離以外の追加の相互作用によってタンパク質を分離する任意のクロマトグラフィー方法が含まれ得る。追加のまたは二次的な相互作用は、陰イオン交換、陽イオン交換、疎水性相互作用、親水性相互作用、電荷－電荷相互作用、水素結合、パイ－パイ結合、及び金属親和性のうちの１つ以上のメカニズムを利用することができる。混合モードのサイズ排除クロマトグラフィーの樹脂は、ＭＭ－ＳＥＣ分離に使用されるあらゆる種類の固相を指すことができる。非限定的な例は、Ｓｅｐａｘ Ｚｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ３００、またはＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏ ＳＥＣ－３である。
本明細書で使用される「疎水性機能」という用語は、二次相互作用としての、タンパク質とＳＥＣクロマトグラフィー樹脂との疎水性相互作用を指す。これらはピーク形状にも大きな影響を与え、プロセスの分離能力に顕著な影響を及ぼす。疎水性相互作用は移動相における高いイオン強度で最も大きい。樹脂が疎水性機能を含むように移動相を選択するために、疎水性相互作用を促進する（塩析効果）か、水の構造を破壊する（カオトロピック効果）かに応じて、様々なイオンをいわゆる疎溶媒性系列に並べることができ、これによって疎水性相互作用が弱められる（図２を参照）。陽イオンは塩析効果を増加させる観点からＢａ＋＋；Ｃａ＋＋；Ｍｇ＋＋；Ｌｉ＋；Ｃｓ＋；Ｎａ＋；Ｋ＋；Ｒｂ＋；ＮＨ４＋，としてランク付けすることができる一方で、陰イオンはカオトロピック効果を増加させる観点からＰＯ－；ＳＯ４
－；ＣＨ３ＣＯ２
－；Ｃｌ－；Ｂｒ－；ＮＯ３
－；ＣｌＯ４
－；Ｉ－；ＳＣＮ－としてランク付けすることができる。通常、Ｎａ、Ｋ、またはＮＨ４の硫酸塩は、ＨＩＣにおけるリガンド－タンパク質相互作用を効果的に促進する。次の関係によって与えられる、相互作用の強さに影響を与える塩を配合することができる：（ＮＨ４）２ＳＯ４＞Ｎａ２ＳＯ４＞ＮａＣｌ＞ＮＨ４Ｃｌ＞ＮａＢｒ＞ＮａＳＣＮ。
本明細書で使用される「質量分析計」という用語には、特定の分子種を識別し、それらの正確な質量を測定することができる装置が含まれる。この用語は、検出及び／または特性評価のためにポリペプチドまたはペプチドを中で溶離させることができる任意の分子検出器を含むことを意図している。質量分析計は、イオン源、質量分析器、及び検出器の３つの主要部分を含み得る。イオン源の役割は、気相イオンを形成することである。分析対象の原子、分子、またはクラスターは、気相に移され、同時にイオン化することができる（エレクトロスプレーイオン化と同様）。イオン源の選択は用途に大きく依存する。
明細書で使用される「質量分析器」という用語には、種、すなわち原子、分子、またはクラスターをそれらの質量に応じて分離できる装置が含まれる。高速タンパク質配列解析に使用可能な質量分析器の非限定的な例は、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁気／電気セクター型、四重極質量フィルター型（Ｑ）、四重極イオントラップ型（ＱＩＴ）、オービトラップ型、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型（ＦＴＩＣＲ）、及び加速器質量分析法（ＡＭＳ）である。
本明細書で使用される「タンデム質量分析」という用語には、質量選択及び質量分離の複数の段階を使用することによってサンプル分子に関する構造情報が得られる技術が含まれる。前提条件は、サンプル分子を気相に移して完全なままイオン化できること、及び最初の質量選択段階の後に予測可能かつ制御可能な形で壊れるように誘導できることである。マルチステージＭＳ／ＭＳ、またはＭＳｎは、有意義な情報を取得できるか、フラグメントイオンシグナルが検出可能である限り、最初に前駆体イオン（ＭＳ２）を選択及び分離してフラグメント化し、一次フラグメントイオン（ＭＳ３）を分離してこれをフラグメント化し、二次フラグメントイオン（ＭＳ４）を分離するなどして行うことができる。タンデムＭＳは、多種多様な分析器の組み合わせを用いて首尾よく行われてきた。特定の用途のために組み合わせられる分析器が何であるかは、感度、選択性、及び速度などの多くの様々な要因だけでなく、サイズ、コスト、及び有効性によっても決定される。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリは、空間的タンデムと時間的タンデムであるが、時間的タンデム分析器が空間的にまたは空間的タンデム分析器と連結されているハイブリッドも存在する。
本明細書に開示の複数の実施形態は、サンプル中のタンパク質の迅速な特性評価のための組成物、方法、及びシステムを提供する。
本明細書において、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、非限定的であることを意味し、それぞれ「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を意味すると理解される。
本開示は、混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程、移動相を使用して混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、断片を含む溶離液を得る工程、及び質量分析計を使用して溶離液中の断片を定量する工程、を含む、サンプル中の抗体断片を定量するための方法を提供する。
本開示は、混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムにサンプルを接触させる工程、移動相を使用して混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、断片を含む溶離液を得る工程、質量分析計を使用して溶離液中の断片の分子量を決定する工程、及び断片の分子量データを、少なくとも１つの既知のタンパク質標準から得られたデータと相関させて断片を同定する工程、を含む、サンプル中の抗体断片を同定するための方法を提供する。
本開示は、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体断片を含むサンプルを接触させる工程、移動相を使用して混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、溶離液を得る工程、質量分析計を使用して前記溶離液中の抗体断片の分子量データを決定する工程、及び断片の分子量データを、少なくとも１つの既知のタンパク質標準から得られたデータと相関させる工程、を含む、抗体の断片化部位を特定するための方法も提供する。
いくつかの特定の例示的な実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、追加の相互作用を有するサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含み得る。
いくつかの特定の例示的な実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、疎水性相互作用機能を備えたサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含み得る。
いくつかの特定の例示的な実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、電荷－電荷相互作用機能を備えたサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、断片は抗体の消化産物であってもよい。消化産物は、加水分解剤によって形成することができる。加水分解剤には、酵素的消化または非酵素的消化を使用して消化を行う剤が含まれ得る。加水分解剤は、酵素的消化を使用して消化を行うことができる剤であってもよく、これにはトリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、外膜プロテアーゼＴ（ＯｍｐＴ）、化膿性レンサ球菌の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、キモトリプシン、ペプシン、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、及びアスペルギルス・サイトイ由来のプロテアーゼが含まれ得る。加水分解剤は、非酵素的消化を使用して消化を行うことができる剤であってもよく、これには、高温、マイクロ波、超音波、高圧、赤外線、溶媒の使用が含まれ得る。消化産物は、生成物に関連する不純物である場合がある。
いくつかの例示的な実施形態では、断片としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、トライアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を挙げることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、抗体は、約４．５～約９．０の範囲のｐＩを有するタンパク質とすることができる。一態様では、抗体は、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０のｐＩを有するタンパク質であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、断片は、約４．５～約９．０の範囲のｐＩを有するタンパク質とすることができる。一態様では、断片は、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０のｐＩを有するタンパク質であってもよい。
例示的な一実施形態では、サンプル中の断片の数は少なくとも２種であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーシステムにロードされるサンプル中の総タンパク質の量は、約１０μｇ～約１００μｇの範囲とすることができる。例示的な一実施形態では、クロマトグラフィーシステムにロードされるサンプルの量は、約１０μｇ、約１２．５μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、約５５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約８５μｇ、約９０μｇ、約９５μｇ、または約１００μｇであってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、断片を溶離するために使用される移動相は、質量分析計と適合性を有することができる移動相とすることができる。一態様では、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせであってもよい。
例示的な一実施形態では、移動相の総濃度は、最大約６００ｍＭの範囲とすることができる。一態様では、移動相の総濃度は、約５ｍＭ、約６ｍＭ、７ｍＭ、約８ｍＭ、９ｍＭ、約１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、約１５ｍＭ、１７．５ｍＭ、約２０ｍＭ、２５ｍＭ、約３０ｍＭ、３５ｍＭ、約４０ｍＭ、４５ｍＭ、約５０ｍＭ、５５ｍＭ、約６０ｍＭ、６５ｍＭ、約７０ｍＭ、７５ｍＭ、約８０ｍＭ、７５ｍＭ、約９５ｍＭ、１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、４００ｍＭ、約４２０５ｍＭ、４５０ｍＭ、約４７５ｍＭ、５００ｍＭ、約５２５ｍＭ、５５０ｍＭ、約５７５ｍＭ、または約６００ｍＭであってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、移動相は、約０．１ｍｌ／分～約０．４ｍｌ／分の流量を有することができる。一態様では、移動相の流量は、約０．１ｍｌ／分、約０．１５ｍｌ／分、約０．２０ｍｌ／分、約０．２５ｍｌ／分、約０．３０ｍｌ／分、約０．３５ｍｌ／分、または約０．４ｍｌ／分であってもよい。
例示的な一実施形態では、質量分析計はタンデム質量分析計であってもよい。
別の例示的な実施形態では、質量分析計は、ナノスプレーを含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、抗体はモノクローナル抗体であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、抗体は治療用抗体であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、抗体は免疫グロブリンタンパク質であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、抗体は二重特異性抗体であってもよい。
例示的な一実施形態では、二重特異性抗体は抗ＣＤ２０／ＣＤ３モノクローナル抗体であってもよい。
例示的な一実施形態では、抗体はマウス線維芽細胞株ＭＧ８７を使用して産生されたものである。
いくつかの例示的な実施形態では、断片は抗体の消化により形成される抗体断片であってもよい。
例示的な一実施形態では、断片は翻訳後修飾されたタンパク質であってもよい。
更に別の例示的な実施形態では、断片はバイオ医薬品で見られる不純物であってもよい。
別の例示的な実施形態では、断片は、バイオ医薬品の製造中に見られる不純物であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、移動相を使用して混合モードのクロマトグラフィー樹脂を洗浄することは、約３０分未満を必要とする。一態様では、移動相を使用して混合モードのクロマトグラフィー樹脂を洗浄するのに要する時間は、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、約２０分、約２１分、約２２分、約２３分、約２４分、約２５分、約２６分、約２６分、約２７分、約２８分、約２９分、または約３０分であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーシステムは、洗浄せずに少なくとも約３回のサンプル分析に使用することができる。一態様では、クロマトグラフィーシステムは、洗浄せずに少なくとも約３回のサンプル分析、少なくとも約４回のサンプル分析、少なくとも約５回のサンプル分析、少なくとも約６回のサンプル分析、少なくとも約７回のサンプル分析、または少なくとも約８回のサンプル分析に使用することができる。
方法は、前述したタンパク質、断片、不純物、及びカラムのいずれにも限定されず、同定または定量するための方法は任意の適切な手段によって行い得ることが理解される。
本開示は、移動相を用いて洗浄して溶離液を得ることが可能なクロマトグラフィーカラム１１０と、クロマトグラフィーカラム１１０に連結された質量分析計１２０とを含む、混合モードのクロマトグラフィーシステムも提供する（図３を参照）。
例示的な一実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０は、サンプルローディングデバイス１００を使用して、抗体断片を含むサンプルと接触可能にすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０にロードすることができるサンプルの量は、約１０μｇ～約１００μｇの範囲とすることができる。一態様では、クロマトグラフィーカラム１１０にロードできるサンプルの量は、約１０μｇ、約１２．５μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約３５μｇ、約４０μｇ、約４５μｇ、約５０μｇ、約５５μｇ、約６０μｇ、約６５μｇ、約７０μｇ、約７５μｇ、約８０μｇ、約８５μｇ、約９０μｇ、約９５μｇ、または約１００μｇであってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０は移動相で洗浄可能にすることができる。一態様では、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせであってもよい。
例示的な一実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０と共に使用することができる移動相の総濃度は、最大約６００ｍＭの範囲とすることができる。一態様では、クロマトグラフィーカラム１１０と共に使用することができる移動相の総濃度は、約５ｍＭ、約６ｍＭ、７ｍＭ、約８ｍＭ、９ｍＭ、約１０ｍＭ、１２．５ｍＭ、約１５ｍＭ、１７．５ｍＭ、約２０ｍＭ、２５ｍＭ、約３０ｍＭ、３５ｍＭ、約４０ｍＭ、４５ｍＭ、約５０ｍＭ、５５ｍＭ、約６０ｍＭ、６５ｍＭ、約７０ｍＭ、７５ｍＭ、約８０ｍＭ、７５ｍＭ、約９５ｍＭ、１００ｍＭ、約１００ｍＭ、１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、４００ｍＭ、約４２５ｍＭ、４５０ｍＭ、約４７５ｍＭ、５００ｍＭ、約５２５ｍＭ、５５０ｍＭ、約５７５ｍＭ、または約６００ｍＭであってもよい。
別の例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０と共に使用することができる移動相は、０．１ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量を有することができる。一態様では、クロマトグラフィーカラム１１０と共に使用することができる移動相の流量は、約０．１ｍｌ／分、約０．１５ｍｌ／分、約０．２０ｍｌ／分、約０．２５ｍｌ／分、約０．３０ｍｌ／分、約０．３５ｍｌ／分、または約０．４ｍｌ／分であってもよい。
例示的な一実施形態では、抗体断片を含むサンプルと接触することができるクロマトグラフィーカラム１１０と共に使用される移動相を使用して、断片を溶離することができる。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０は質量分析計１２０と連結可能にすることができる。
例示的な一実施形態では、質量分析計１２０はナノスプレーを含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計１２０はタンデム質量分析計とすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、断片の同定１４０及び／または定量１３０を可能にすることができる（図３に図示の通り）。断片としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、トライアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を挙げることができる。
例示的な一実施形態では、２種以上の断片の同定１４０及び／または定量１３０のために、混合モードのクロマトグラフィーシステムを使用することができる。
いくつかの例示的な実施形態では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、モノクローナル抗体の断片の同定１４０及び／または定量１３０を可能にすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、治療用抗体の断片の同定１４０及び／または定量１３０を可能にすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、免疫グロブリンタンパク質の断片の同定１４０及び／または定量１３０を可能にすることができる。
例示的な一実施形態では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、ＩｇＧ１タンパク質の断片の同定１４０及び／または定量１３０を可能にすることができる。
例示的な一実施形態では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、ＩｇＧ４タンパク質の断片の同定１４０及び／または定量１３０を可能にすることができる。
例示的な一実施形態では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、二重特異性抗体の断片の同定１４０及び／または定量１３０を可能にすることができる。
例示的な一実施形態では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、抗ＣＤ２０／ＣＤ３モノクローナル抗体の断片の同定１４０及び／または定量１３０を可能にすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、抗体の消化により形成された抗体断片の断片の同定１４０及び／または定量１３０を可能にすることができる。
更に別の例示的な実施形態では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、バイオ医薬品で見られる不純物であってもよい断片の同定１４０及び／または定量１３０を可能にすることができる。
別の例示的な実施形態では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、バイオ医薬品の製造中に見られる不純物であってもよい断片の同定１４０及び／または定量１３０を可能にすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、約４．５～約９．０の範囲のｐＩを有するタンパク質であってもよい断片の同定１４０及び／または定量１３０を可能にすることができる。
いくつかの例示的な実施形態では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、製品に関連する不純物であってもよい断片の同定１４０及び／または定量１３０を可能にすることができる。
例示的な一実施形態では、サンプル中の断片の数は少なくとも２種であってもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０は、洗浄せずに少なくとも約３回のサンプル分析に使用することができる。
例示的な一実施形態では、クロマトグラフィーカラム１１０は、洗浄せずに少なくとも約３回のサンプル分析、少なくとも約４回のサンプル分析、少なくとも約５回のサンプル分析、少なくとも約６回のサンプル分析、少なくとも約７回のサンプル分析、または少なくとも約８回のサンプル分析に使用することができる。
システムは、前述したタンパク質、不純物、移動相、またはクロマトグラフィーカラムのいずれにも限定されないことが理解される。
本明細書で示される方法の工程の数字及び／または文字による連続したラベル付けは、方法またはその任意の実施形態を特定の示された順序に限定することを意図するものではない。
特許、特許出願、公開された特許出願、アクセッション番号、技術論文、及び学術論文を含む様々な刊行物が、明細書全体にわたって引用されている。これらの引用された参考文献のそれぞれは、その全体が、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、本開示をより詳細に説明するために示されている以降の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。これらは説明を目的としており、開示の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
実施例１．質量分析に連結された混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー（ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ）
分離は、ＵＶ検出器及びエレクトロスプレー質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＥＭＲ，ＵＳＡ）に連結されたＡｃｑｕｉｔｙシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）により行った。質量分析計は正の分解能モードで操作し、データはｍ／ｚ［２０００～１５，０００］から記録した。キャリブレーションは、メーカーの手順に従って取得範囲で行った。
分離は、ＵＶ検出器及びエレクトロスプレー質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＥＭＲ，ＵＳＡ）に連結されたＡｃｑｕｉｔｙシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）により行った。質量分析計は正の分解能モードで操作し、データはｍ／ｚ［２０００～１５，０００］から記録した。キャリブレーションは、メーカーの手順に従って取得範囲で行った。
実施例２．Ｚｅｎｉｘ－ＳＥＣカラムでＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用する、二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体２の消化された混合物中の断片の検出
２．１ 二重特異性抗体のサンプル調製
抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ結合を減少させるように改変されたＩｇＧ４アイソタイプに基づくヒンジ部が安定化されたＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性完全長抗体（Ａｂ）である。これは、Ｔ細胞（ＣＤ３を介して）及びＣＤ２０発現細胞に結合するように設計された。二重特異性抗体は、Ｓｍｉｔｈらによって説明された方法に従って製造した（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１５）５：１７９４３）。
２．１ 二重特異性抗体のサンプル調製
抗ＣＤ２０ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体は、Ｆｃ結合を減少させるように改変されたＩｇＧ４アイソタイプに基づくヒンジ部が安定化されたＣＤ２０ｘＣＤ３二重特異性完全長抗体（Ａｂ）である。これは、Ｔ細胞（ＣＤ３を介して）及びＣＤ２０発現細胞に結合するように設計された。二重特異性抗体は、Ｓｍｉｔｈらによって説明された方法に従って製造した（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．（２０１５）５：１７９４３）。
２．２ 二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体２の断片の生成
１ｍｇの二重特異性抗体を、１００単位のＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）を用いて、０．１ＭのｐＨ７．５のＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファーの中で、３７℃で６０分間消化した。
１ｍｇの二重特異性抗体を、１００単位のＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）を用いて、０．１ＭのｐＨ７．５のＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファーの中で、３７℃で６０分間消化した。
２．３ ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した分析は、実施例１で記載した通りに、システム上でＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ ＭＫカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用してアイソクラティックに行った。溶離は２８０ｎｍのＵＶによってモニターした。
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した分析は、実施例１で記載した通りに、システム上でＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ ＭＫカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用してアイソクラティックに行った。溶離は２８０ｎｍのＵＶによってモニターした。
移動相の総濃度を変化させた８セットの実験を実施した：１０ｍＭバッファー、２０ｍＭバッファー、３０ｍＭバッファー、４０ｍＭバッファー、５０ｍＭバッファー、６０ｍＭバッファー、７０ｍＭバッファー、及び７５ｍＭバッファー。溶離は０．３ｍＬ／分の流量で行った。クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｉ－ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステムで、室温のカラム温度で行った。平衡化は、１４：１のモル比の酢酸アンモニウム（バッファーＡ）と重炭酸アンモニウム（バッファーＢ）とで構成される移動相を使用して行った。
分析ランでは、注入負荷は、１０μｇの総タンパク質から構成されていた。溶離は、酢酸アンモニウム（バッファーＡ）と重炭酸アンモニウム（バッファーＢ）とからなるアイソクラティックグラジエントを使用して行った。質量分析データは、Ｉｎｔａｃｔ Ｍａｓｓソフトウェアを使用して分析した。
低い濃度の移動相を使用した場合、断片間の分離の増加が観察された（例えば１０ｍＭのバッファー濃度では、二重特異性ＡｂのＦ（ａｂ）２断片、ホモ二量体１のＦ（ａｂ）２断片、及びＦｃ断片の間の有意な分離が観察された（図４を参照））。塩濃度が低いと、ＭＭ－ＳＥＣカラムにおける電荷－電荷相互作用が強化され、これによって二重特異性Ａｂの断片間の分離が向上する（図４及び５を参照）。
実施例３．Ｚｅｎｉｘ－ＳＥＣカラムでＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用する、二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体２の消化された混合物中の断片の検出
３．１ 二重特異性抗体のサンプル調製、ならびに二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体の断片の生成は、２．１及び２．２で示した通りに行った。
３．１ 二重特異性抗体のサンプル調製、ならびに二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体の断片の生成は、２．１及び２．２で示した通りに行った。
３．２ ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した分析は、実施例１で記載した通りに、システム上でＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ ＭＫカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用してアイソクラティックに行った。溶離は２８０ｎｍのＵＶによってモニターした。
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した分析は、実施例１で記載した通りに、システム上でＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ ＭＫカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用してアイソクラティックに行った。溶離は２８０ｎｍのＵＶによってモニターした。
移動相の総濃度を変化させた６セットの実験を実施した：５０ｍＭバッファー、６０ｍＭバッファー、７０ｍＭバッファー、７５ｍＭバッファー、１００ｍＭバッファー、及び３００ｍＭバッファー。溶離は０．２ｍＬ／分の流量で行った。クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｉ－ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステムで、室温のカラム温度で行った。平衡化は移動相を使用して行った。
分析ランでは、注入負荷は、１０μｇの総タンパク質から構成されていた。溶離は、酢酸アンモニウム（バッファーＡ）と重炭酸アンモニウム（バッファーＢ）とからなるアイソクラティックグラジエントを使用して行った。質量分析データは、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭｅｔｒｉｃｓのＩｎｔａｃｔ Ｍａｓｓソフトウェアを使用して分析した。
低い塩濃度はＭＭ－ＳＥＣカラムにおける電荷－電荷相互作用を高め、高い塩濃度はＭＭ－ＳＥＣカラムにおける疎水性相互作用を高める。５０ｍＭのバッファー濃度ではシステムは二重特異性抗体のＦ（ａｂ）２断片とＦｃ断片との間の優れた分離を示した一方で、３００ｍＭでは、システムは二重特異性抗体のＦ（ａｂ）２断片とホモ二量体１のＦ（ａｂ）２断片との間の優れた分離を示した（図６及び７を参照）。二重特異性抗体とホモ二量体１のＦ（ａｂ）２の断片の保持時間の差、及び二重特異性抗体とホモ二量体２のＦ（ａｂ）２の断片の保持時間の差は、３００ｍＭの高いバッファー濃度でより優れた分離が達成されたことを更に示している（図８）。
実施例４．Ｚｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００、３μｍ、３００Å、７．８×３００ｍｍを使用する抗体分子（Ａｂ１）の断片の検出
４．１ Ａｂ１の断片の生成
０．５ｍｇのＡｂ１を、［５０単位］のＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）を用いて、０．１ＭのｐＨ７．５のＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファーの中で、３７℃で６０分間消化して断片を形成した。
４．１ Ａｂ１の断片の生成
０．５ｍｇのＡｂ１を、［５０単位］のＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ（登録商標）を用いて、０．１ＭのｐＨ７．５のＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファーの中で、３７℃で６０分間消化して断片を形成した。
４．２ ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した分析は、実施例１で記載した通りに、システム上でＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ ＭＫカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用してアイソクラティックに行った。溶離は２８０ｎｍのＵＶによってモニターした。
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した分析は、実施例１で記載した通りに、システム上でＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ ＭＫカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用してアイソクラティックに行った。溶離は２８０ｎｍのＵＶによってモニターした。
移動相の総濃度を変化させた５セットの実験を実施した：３０ｍＭバッファー、４０ｍＭバッファー、６６ｍＭバッファー、１００ｍＭバッファー、及び２００ｍＭバッファー。溶離は０．２ｍＬ／分の流量で行った。クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｉ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステムで、室温のカラム温度で行った。平衡化は移動相を使用して行った。
分析ランでは、注入負荷は、１０μｇの総タンパク質から構成されていた。溶離は、酢酸アンモニウム（バッファーＡ）と重炭酸アンモニウム（バッファーＢ）とからなるアイソクラティックグラジエントを使用して行った。質量分析データは、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭｅｔｒｉｃｓのＩｎｔａｃｔ Ｍａｓｓソフトウェアを使用して分析した。
異なる濃度の移動相を用いた分析からは、低い塩濃度が、ＭＭ－ＳＥＣカラムにおける電荷－電荷相互作用を高め、断片のより優れた分離を与えることが明らかになった（図９及び１０を参照）。Ａｂ１のＦｃ断片とＡｂ１のＦ（ａｂ）２断片の保持時間を比較すると、３０ｍＭの移動相濃度が最も優れた分離を与える。更に、ＨＣホモ二量体－Ｆ（ａｂ）２とＨＣ＊ＣＤＲ３クリッピング生成物の保持時間の相違は、３０ｍＭの低いバッファー濃度でより優れた分離が達成されたことを更に示している（図１１）。
実施例１～３で示した断片は、異なるバッファー濃度でより優れた分離を示す。この効果は、使用されるサイズ排除クロマトグラフィー樹脂と、タンパク質の電荷、形状、または疎水性などとの、様々なタイプの相互作用に起因する可能性がある。所定の塩濃度におけるタンパク質の電荷はｐＩ値に依存する（表１及び２）。ＭＭ－ＳＥＣ媒体との電荷相互作用における大きな相違は、ｐＩ値の大きな差により得られる。同じクラスのＩｇＧ分子では疎水性の相違はＦａｂ領域に起因する。低い塩濃度では保持時間は電荷－電荷相互作用が優勢であり、高い塩濃度では保持は疎水性相互作用が優勢である。したがって、酸性または疎水性の分子は、ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳシステムで塩濃度の高い移動相を使用して分離することができ、塩基性分子は、ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳシステムで塩濃度の低い移動相を使用して分離することができる（図１２及び図１３を参照）。
実施例５．Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ ＳＥＣカラムでＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用する、二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体２の消化された混合物中の断片の検出
５．１ 二重特異性抗体のサンプル調製、ならびに二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体の断片の生成は、２．１及び２．２で示した通りに行った。
５．１ 二重特異性抗体のサンプル調製、ならびに二重特異性抗体、ホモ二量体１、及びホモ二量体の断片の生成は、２．１及び２．２で示した通りに行った。
５．２ ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した分析は、実施例１で記載した通りに、システム上でＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ ＳＥＣカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用してアイソクラティックに行った。溶離は２８０ｎｍのＵＶによってモニターした。
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した分析は、実施例１で記載した通りに、システム上でＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ ＳＥＣカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用してアイソクラティックに行った。溶離は２８０ｎｍのＵＶによってモニターした。
移動相の総濃度を変化させた８セットの実験を実施した：２０ｍＭバッファー、２７．６ｍＭバッファー、３０ｍＭバッファー、４０ｍＭバッファー、５０ｍＭバッファー、１００ｍＭバッファー、１５０ｍＭバッファー、及び３００ｍＭバッファー。溶離は０．２ｍＬ／分の流量で行った。クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｉ－ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステムで、室温のカラム温度で行った。平衡化は移動相を使用して行った。
分析ランでは、注入負荷は、１０μｇの総タンパク質から構成されていた。溶離は、酢酸アンモニウム（バッファーＡ）と重炭酸アンモニウム（バッファーＢ）とからなるアイソクラティックグラジエントを使用して行った。質量分析データは、Ｉｎｔａｃｔ Ｍａｓｓソフトウェアを使用して分析した。
Ｚｅｎｉｘ ＳＥＣカラムで実施されるプロセスと同様に、二重特異性Ａｂ、ホモ二量体１、及びホモ二量体２の消化混合物のＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析は、より低い濃度のバッファー、すなわち２０ｍＭバッファーでより大きな分離を示した（図１４及び１５を参照）。
実施例６．ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用する、Ａｂ１における新規なＨＣ＊ＣＤＲ３クリッピング部位の特定
６．１ Ａｂ１の断片の生成
Ａｂ１の断片は、４．１に記載の方法を使用して生成した。
６．１ Ａｂ１の断片の生成
Ａｂ１の断片は、４．１に記載の方法を使用して生成した。
６．２ ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した分析は、実施例１で記載した通りに、システム上でＺｅｎｉｘ ＳＥＣカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用してアイソクラティックに行った。溶離は２８０ｎｍのＵＶによってモニターした。
ＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳを使用した分析は、実施例１で記載した通りに、システム上でＺｅｎｉｘ ＳＥＣカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用してアイソクラティックに行った。溶離は２８０ｎｍのＵＶによってモニターした。
分析は、４０ｍＭのバッファー総濃度を有する移動相を使用して行い、溶離は、０．２ｍＬ／分の流量で行った。クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｉ－ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステムで、室温のカラム温度で行った。平衡化は移動相を使用して行った。
分析ランでは、注入負荷は、１０μｇの総タンパク質から構成されていた。溶離は、酢酸アンモニウム（バッファーＡ）と重炭酸アンモニウム（バッファーＢ）とからなるアイソクラティックグラジエントを使用して行った。質量分析データは、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭｅｔｒｉｃｓのＩｎｔａｃｔ Ｍａｓｓソフトウェアを使用して分析した。サンプルのトータルイオンクロマトグラムは、１６分と１７分の保持時間の２つのピークを示した。ピークのうちの１つの質量分析は、質量電荷比が５１６２．６２及び６６６３．５９のフラグメントを有していた（図１６を参照）。１６分のこのピークは２つのｍ／ｚピーク分布を示した。１つは５１６２．６２の電荷状態のものであり、Ｋ１０５とＦ１０６との間のアミド結合の加水分解に対応するが、断片は非共有結合相互作用によって依然として一体に保持されており、他方のｍ／ｚピーク分布（電荷状態の１つはｍ／ｚ６６６３．５９である）は、加水分解生成物による解離した断片に対応する。他のピークは、質量電荷比が５１６１．４３のフラグメントを示した（図１６及び１７）。質量は、Ａｂ１シーケンスに基づく計算と比較され、１つのクリッピング部位（アミド結合加水分解）を有する二重特異性Ａｂ－Ｆ（ａｂ）２（ＭＷ＝９８，０６９．８）、ＨＣ＊が欠損している二重特異性Ａｂ－Ｆ（ａｂ）２（Ｅ１－Ｋ１０５）（ＭＷ＝８６，６１２．７）、及びインタクトな二重特異性ＡｂＦ（ａｂ）２（ＭＷ＝９８，０４８．１）であることが同定された。これらのフラグメントにより、二重特異性抗体ＡｂのＨＣにおける断片化の部位（リジン１０５とフェニルアラニン１０６との間）が特定された。
６．３ ネイティブＳＣＸ－ＭＳによるＨＣ＊ＣＤＲ３クリッピング部位の確認
強陽イオンクロマトグラフィーを使用する分析を、ＹＭＣ ＢｉｏＰｒｏ ＳＰ－Ｆカラム（４．６×１００ｎｍ）を使用して行った。溶離は２８０ｎｍのＵＶでモニターした。分離は、ＵＶ検出器及びエレクトロスプレー質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＥＭＲ，ＵＳＡ）に連結されたＡｃｑｕｉｔｙシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）により行った。質量分析計は正の分解能モードで操作し、データはｍ／ｚ ２０００～１５，０００から記録した。キャリブレーションは、メーカーの手順に従って取得範囲で行った。
強陽イオンクロマトグラフィーを使用する分析を、ＹＭＣ ＢｉｏＰｒｏ ＳＰ－Ｆカラム（４．６×１００ｎｍ）を使用して行った。溶離は２８０ｎｍのＵＶでモニターした。分離は、ＵＶ検出器及びエレクトロスプレー質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＥＭＲ，ＵＳＡ）に連結されたＡｃｑｕｉｔｙシステム（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）により行った。質量分析計は正の分解能モードで操作し、データはｍ／ｚ ２０００～１５，０００から記録した。キャリブレーションは、メーカーの手順に従って取得範囲で行った。
分析は、４ｍＬ／分の流量でグラジエント溶離を使用して行った：１８分で１００％のＡから１００％のＢ；溶媒Ａは２０ｍＭの酢酸アンモニウム、ｐＨ５．６であり、溶媒Ｂは１４０ｍＭの酢酸アンモニウム＋１０ｍＭの重炭酸アンモニウムであった。平衡化は移動相を使用して行った。
分析ランでは、注入負荷は、５０μｇの総タンパク質から構成されていた。溶離は上述した通りに行った。質量分析データは、Ｐｒｏｔｅｉｎ ＭｅｔｒｉｃｓのＩｎｔａｃｔ Ｍａｓｓソフトウェアを使用して分析した。サンプルのクロマトグラムは、１２分と１３分の保持時間の２つのピークを示した。ピークの１つの質量分析は、質量電荷比が５１６２．６６及び６６６３．５１のフラグメントを有していた。他方のピークは５１６１．５１の質量電荷比のフラグメントを示し（図１８及び１９）、これはＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳシステムを使用して得られた断片：１つのクリッピング部位（アミド結合加水分解）を有する二重特異性Ａｂ－Ｆ（ａｂ）２（ＭＷ＝９８，０６９．８）、ＨＣ＊が欠損している二重特異性Ａｂ－Ｆ（ａｂ）２（Ｅ１－Ｋ１０５）（ＭＷ＝８６，６１２．７）、及びインタクトな二重特異性ＡｂＦ（ａｂ）２（ＭＷ＝９８，０４８．１）を裏付けた。
６．４ ＨＣ＊ＣＤＲ３クリッピング断片の定量
１００μｇのＨＣ＊ＣＤＲ３クリッピング断片を、２μｇのＡｓｐＮ酵素を用いて、０．１ＭのｐＨ７．５のＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファーの中で、３７℃で１８時間消化し、その断片を形成した。ＰｅｐＭａｐカラムを使用した断片のクロマトグラムにより、Ａｂ１のＨＣ＊ＣＤＲ３クリッピング断片が定量された（図２０）。
１００μｇのＨＣ＊ＣＤＲ３クリッピング断片を、２μｇのＡｓｐＮ酵素を用いて、０．１ＭのｐＨ７．５のＴｒｉｓ－ＨＣｌバッファーの中で、３７℃で１８時間消化し、その断片を形成した。ＰｅｐＭａｐカラムを使用した断片のクロマトグラムにより、Ａｂ１のＨＣ＊ＣＤＲ３クリッピング断片が定量された（図２０）。
６．５ 生体内でＨＣ＊ＣＤＲ３クリッピング断片を形成するための、血漿プロテアーゼに対するＡｂ１の感受性
形成された消化断片のＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析は、実施例１で記載した通りに、システム上でＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ ＭＫカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用してアイソクラティックに行った。溶離は２８０ｎｍのＵＶによってモニターした。トリプシン酵素を使用して、血漿プロテアーゼに対する生体内でのＡｂ１の感受性を予測し、ＨＣ＊ＣＤＲ３クリッピング断片を形成した（実施例６．２で同定）。４．１に記載の通りに消化されたＡｂ１抗体の断片に、３７℃で２００：１の比率でトリプシンを添加した。
形成された消化断片のＭＭ－ＳＥＣ－ＭＳ分析は、実施例１で記載した通りに、システム上でＺｅｎｉｘ ＳＥＣ－３００ ＭＫカラム（４．６×３００ｎｍ、３μｍ）を使用してアイソクラティックに行った。溶離は２８０ｎｍのＵＶによってモニターした。トリプシン酵素を使用して、血漿プロテアーゼに対する生体内でのＡｂ１の感受性を予測し、ＨＣ＊ＣＤＲ３クリッピング断片を形成した（実施例６．２で同定）。４．１に記載の通りに消化されたＡｂ１抗体の断片に、３７℃で２００：１の比率でトリプシンを添加した。
１０μｇの総タンパク質からなる注入負荷をカラムにロードした。分析は、３０ｍＭの総濃度の移動相（酢酸アンモニウム（バッファーＡ）及び重炭酸アンモニウム）を使用して行い、溶離は０．２ｍＬ／分の流量で行った。クロマトグラフィーは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｉ－Ｃｌａｓｓ ＵＰＬＣシステムで、室温のカラム温度で行った。
トリプシン酵素の添加のゼロ時間の時点で、断片化は、ＨＣ＊ＣＤＲ３クリッピング断片の存在を示した（図２１、上のパネル）。トリプシン酵素の添加後３５分の時点での同様の分析において、断片化は、ＨＣ＊ＣＤＲ３クリッピング断片の存在の有意な増加を示した（図２１、下のパネル）。これは、抗体Ａｂ１がトリプシンによって部位Ｋ１０５－Ｆ１０６で切断されることを示しており、生体内の抗体Ａｂ１が生体内でそのような切断を受けやすいことを示唆している。
この実施形態の一態様では、混合モードのクロマトグラフィーシステムは、追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーカラムを含むことができ、クロマトグラフィーカラムは、０．２ｍｌ／分～０．４ｍｌ／分の流量で移動相を用いて洗浄することができる。
[本発明1001]
抗体の断片化部位を特定するための方法であって、
追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体の少なくとも1つの断片を含むサンプルを接触させる工程；
移動相を使用して前記混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記抗体の少なくとも1つの断片を有する溶離液を得る工程；
質量分析計を使用して、前記溶離液中の前記抗体の少なくとも1つの断片の分子量データを決定する工程；及び
前記抗体の少なくとも1つの断片の前記分子量データを、少なくとも1つの既知のタンパク質標準から得られたデータと相関させる工程
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記移動相が、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせを有する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記移動相が、約600ｍＭ未満の酢酸アンモニウムと重炭酸アンモニウムの総濃度を有する、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記移動相が約0．2ｍｌ／分～約0．4ｍｌ／分の流量を有する、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂にロードされる前記サンプルの量が約10μｇ～約100μｇである、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記抗体がモノクローナル抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記抗体が二重特異性抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記抗体が治療用抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記質量分析計が前記クロマトグラフィーシステムに連結されている、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記抗体の前記断片化部位が前記抗体のヒンジ領域にある、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記抗体の前記断片化部位が免疫グロブリンの定常ドメイン内にある、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記抗体の前記断片化部位が前記抗体の可変ドメイン内にある、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記追加の機能が電荷－電荷相互作用機能である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記追加の機能が疎水性相互作用機能である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記少なくとも1つの断片がＦ（ａｂ）2断片である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記少なくとも1つの断片がＦｃ断片である、本発明1001の方法。
[本発明1017]
抗体の断片を同定するための方法であって、
疎水性機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体の断片を含むサンプルを接触させる工程；
移動相を使用して前記混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記抗体の前記断片を有する溶離液を得る工程；
質量分析計を使用して、前記溶離液中の前記抗体の前記断片の分子量データを決定する工程；及び
前記抗体の前記断片の前記分子量データを、少なくとも1つの既知のタンパク質標準から得られたデータと相関させて、前記断片を同定する工程
を含む、前記方法。
[本発明1018]
抗体の断片を定量するための方法であって、
疎水性機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体の断片を含むサンプルを接触させる工程；
移動相を使用して前記混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記抗体の前記断片を有する溶離液を得る工程；及び
前記抗体の前記断片の量を定量する工程
を含む、前記方法。
[本発明1001]
抗体の断片化部位を特定するための方法であって、
追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体の少なくとも1つの断片を含むサンプルを接触させる工程；
移動相を使用して前記混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記抗体の少なくとも1つの断片を有する溶離液を得る工程；
質量分析計を使用して、前記溶離液中の前記抗体の少なくとも1つの断片の分子量データを決定する工程；及び
前記抗体の少なくとも1つの断片の前記分子量データを、少なくとも1つの既知のタンパク質標準から得られたデータと相関させる工程
を含む、前記方法。
[本発明1002]
前記移動相が、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせを有する、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記移動相が、約600ｍＭ未満の酢酸アンモニウムと重炭酸アンモニウムの総濃度を有する、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記移動相が約0．2ｍｌ／分～約0．4ｍｌ／分の流量を有する、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂にロードされる前記サンプルの量が約10μｇ～約100μｇである、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記抗体がモノクローナル抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記抗体が二重特異性抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記抗体が治療用抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記質量分析計が前記クロマトグラフィーシステムに連結されている、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記抗体の前記断片化部位が前記抗体のヒンジ領域にある、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記抗体の前記断片化部位が免疫グロブリンの定常ドメイン内にある、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記抗体の前記断片化部位が前記抗体の可変ドメイン内にある、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記追加の機能が電荷－電荷相互作用機能である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記追加の機能が疎水性相互作用機能である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記少なくとも1つの断片がＦ（ａｂ）2断片である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記少なくとも1つの断片がＦｃ断片である、本発明1001の方法。
[本発明1017]
抗体の断片を同定するための方法であって、
疎水性機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体の断片を含むサンプルを接触させる工程；
移動相を使用して前記混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記抗体の前記断片を有する溶離液を得る工程；
質量分析計を使用して、前記溶離液中の前記抗体の前記断片の分子量データを決定する工程；及び
前記抗体の前記断片の前記分子量データを、少なくとも1つの既知のタンパク質標準から得られたデータと相関させて、前記断片を同定する工程
を含む、前記方法。
[本発明1018]
抗体の断片を定量するための方法であって、
疎水性機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体の断片を含むサンプルを接触させる工程；
移動相を使用して前記混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記抗体の前記断片を有する溶離液を得る工程；及び
前記抗体の前記断片の量を定量する工程
を含む、前記方法。
Claims (18)
- 抗体の断片化部位を特定するための方法であって、
追加の機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体の少なくとも１つの断片を含むサンプルを接触させる工程；
移動相を使用して前記混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記抗体の少なくとも１つの断片を有する溶離液を得る工程；
質量分析計を使用して、前記溶離液中の前記抗体の少なくとも１つの断片の分子量データを決定する工程；及び
前記抗体の少なくとも１つの断片の前記分子量データを、少なくとも１つの既知のタンパク質標準から得られたデータと相関させる工程
を含む、前記方法。 - 前記移動相が、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはこれらの組み合わせを有する、請求項１に記載の方法。
- 前記移動相が、約６００ｍＭ未満の酢酸アンモニウムと重炭酸アンモニウムの総濃度を有する、請求項１に記載の方法。
- 前記移動相が約０．２ｍｌ／分～約０．４ｍｌ／分の流量を有する、請求項１に記載の方法。
- 前記混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂にロードされる前記サンプルの量が約１０μｇ～約１００μｇである、請求項１に記載の方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
- 前記抗体が二重特異性抗体である、請求項１に記載の方法。
- 前記抗体が治療用抗体である、請求項１に記載の方法。
- 前記質量分析計が前記クロマトグラフィーシステムに連結されている、請求項１に記載の方法。
- 前記抗体の前記断片化部位が前記抗体のヒンジ領域にある、請求項１に記載の方法。
- 前記抗体の前記断片化部位が免疫グロブリンの定常ドメイン内にある、請求項１に記載の方法。
- 前記抗体の前記断片化部位が前記抗体の可変ドメイン内にある、請求項１に記載の方法。
- 前記追加の機能が電荷－電荷相互作用機能である、請求項１に記載の方法。
- 前記追加の機能が疎水性相互作用機能である、請求項１に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの断片がＦ（ａｂ）２断片である、請求項１に記載の方法。
- 前記少なくとも１つの断片がＦｃ断片である、請求項１に記載の方法。
- 抗体の断片を同定するための方法であって、
疎水性機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体の断片を含むサンプルを接触させる工程；
移動相を使用して前記混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記抗体の前記断片を有する溶離液を得る工程；
質量分析計を使用して、前記溶離液中の前記抗体の前記断片の分子量データを決定する工程；及び
前記抗体の前記断片の前記分子量データを、少なくとも１つの既知のタンパク質標準から得られたデータと相関させて、前記断片を同定する工程
を含む、前記方法。 - 抗体の断片を定量するための方法であって、
疎水性機能を備えた混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を有するクロマトグラフィーシステムに、抗体の断片を含むサンプルを接触させる工程；
移動相を使用して前記混合モードのサイズ排除クロマトグラフィー樹脂を洗浄して、前記抗体の前記断片を有する溶離液を得る工程；及び
前記抗体の前記断片の量を定量する工程
を含む、前記方法。
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