JP2022528807A - 宿主細胞タンパク質の同定 - Google Patents
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Abstract
試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法が提供される。本方法は、目的のタンパク質から宿主細胞タンパク質を解離することと、解離した宿主細胞タンパク質を分子量カットオフフィルタを使用して濾過することと、好ましくは質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質を同定することとを含む。【選択図】図１
Description
分野
本発明は、一般に、宿主細胞タンパク質を同定するための方法に関する。
本発明は、一般に、宿主細胞タンパク質を同定するための方法に関する。
背景
タンパク質ベースのバイオ医薬品は、がん、自己免疫疾患、感染症、及び心血管代謝性疾患の治療に重要な医薬品として登場しており、医薬品業界で最も成長している製品分野の一つとなっている。タンパク質ベースのバイオ医薬品は、非常に高い純度基準を満たす必要がある。したがって、薬物の開発、製造、保管、及び取り扱いの様々な段階で、このようなバイオ医薬品の不純物を監視することが重要となり得る。
タンパク質ベースのバイオ医薬品は、がん、自己免疫疾患、感染症、及び心血管代謝性疾患の治療に重要な医薬品として登場しており、医薬品業界で最も成長している製品分野の一つとなっている。タンパク質ベースのバイオ医薬品は、非常に高い純度基準を満たす必要がある。したがって、薬物の開発、製造、保管、及び取り扱いの様々な段階で、このようなバイオ医薬品の不純物を監視することが重要となり得る。
例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）は、細胞ベースのシステムを使用して開発されたタンパク質ベースのバイオ医薬品に存在する可能性がある。医薬品中のＨＣＰの存在は監視する必要があり、特定の量を超えると許容できない場合がある。ＨＣＰの特性評価のためのアッセイの分析方法は、十分な精度及び分解能を示す必要がある。直接分析では、アッセイに十分な量の生成物を単離する必要があるが、これは望ましくなく、一部の場合にのみ可能であった。したがって、圧倒的に高濃度の活性薬物と混合した場合の試料中のＨＣＰを特性決定するためのワークフロー及び分析試験を決定することは困難な作業である。前述のことから、試料中のＨＣＰを特性決定するための改善された方法の必要性が存在することが理解されるであろう。
概要
バイオ医薬品を開発する際の重要な基準は、製品中の不純物を監視することである。このような不純物が発生した場合、それらの同定及び定量化はバイオプロセスの重要なステップを構成する。
バイオ医薬品を開発する際の重要な基準は、製品中の不純物を監視することである。このような不純物が発生した場合、それらの同定及び定量化はバイオプロセスの重要なステップを構成する。
本明細書に開示される例示的な実施形態は、宿主細胞タンパク質（複数可）を同定するための方法を提供することにより、前述の要求を満たす。
１つの例示的な実施形態では、目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、目的のタンパク質から宿主細胞タンパク質を解離することと、分子量カットオフフィルタを使用して解離した宿主細胞タンパク質を濾過することと、を含み得る。本実施形態の一態様では、タンパク質解離は、タンパク質解離剤を使用して実施することができる。本実施形態の特定の態様では、タンパク質解離剤は、デオキシコール酸ナトリウムを含むことができる。本実施形態の別の特定の態様では、タンパク質解離剤は、Ｎ－ラウロイルサルコシンを含むことができる。本実施形態の更に別の特定の態様では、タンパク質解離剤は、デオキシコール酸ナトリウム及びＮ－ラウロイルサルコシンを含むことができる。本実施形態の特定の態様では、タンパク質解離剤は、本質的に分解性であり得る。本実施形態の一態様では、分子量カットオフフィルタは、少なくとも約１００ＫＤａのカットオフを有することができる。本実施形態の一態様では、分子量カットオフフィルタは、少なくとも約５０ＫＤａのカットオフを有することができる。本実施形態の一態様では、本方法は、少なくとも約１ｐｐｍの濃度である宿主細胞タンパク質を検出するように構成することができる。本実施形態の一態様では、濾過ステップは、解離した宿主細胞タンパク質を少なくとも約５０倍濃縮する。本実施形態の一態様では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、任意選択で、濾過された宿主細胞タンパク質を加水分解剤に接触させることを含むことができる。本実施形態の別の態様では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、任意選択で、質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質を同定することを含むことができる。
１つの例示的な実施形態では、目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、目的のタンパク質から宿主細胞タンパク質を解離することと、解離した宿主細胞タンパク質を分子量カットオフフィルタを使用して濾過することと、濾過した宿主細胞タンパク質を加水分解剤に接触させることと、を含むことができる。本実施形態の一態様では、タンパク質解離は、タンパク質解離剤を使用して実施することができる。本実施形態の特定の態様では、タンパク質解離剤は、デオキシコール酸ナトリウムを含むことができる。本実施形態の別の特定の態様では、タンパク質解離剤は、Ｎ－ラウロイルサルコシンを含むことができる。本実施形態の更に別の特定の態様では、タンパク質解離剤は、デオキシコール酸ナトリウム及びＮ－ラウロイルサルコシンを含むことができる。本実施形態の特定の態様では、タンパク質解離剤は、本質的に分解性であり得る。本実施形態の一態様では、分子量カットオフフィルタは、少なくとも約１００ＫＤａのカットオフを有することができる。本実施形態の一態様では、分子量カットオフフィルタは、少なくとも約５０ＫＤａのカットオフを有することができる。本実施形態の一態様では、本方法は、本方法の検出限界の濃度にある宿主細胞タンパク質のみを検出するように構成することができ、少なくとも約１ｐｐｍであり得る。本実施形態の一態様では、濾過ステップは、解離した宿主細胞タンパク質を少なくとも約５０倍濃縮する。本実施形態の一態様では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、任意選択で、濾過された宿主細胞タンパク質を加水分解剤に接触させることを含むことができる。本実施形態の別の態様では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、任意選択で、質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質を同定することを含むことができる。本実施形態の一態様では、加水分解剤はトリプシンであり得る。本実施形態の一態様では、本方法は、濾過された宿主細胞タンパク質をタンパク質還元剤に接触させることを更に含むことができる。本実施形態の特定の態様では、タンパク質還元剤はＴＣＥＰであり得る。本実施形態の一態様では、本方法は、濾過された宿主細胞タンパク質をタンパク質アルキル化剤に接触させることを更に含むことができる。本実施形態の特定の態様では、タンパク質アルキル化剤はＣＡＡであり得る。本実施形態の更に別の態様では、本方法は、濾過された宿主細胞タンパク質を遠心分離することを更に含むことができる。
１つの例示的な実施形態では、目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、目的のタンパク質から宿主細胞タンパク質を解離することと、分子量カットオフフィルタを使用して解離した宿主細胞タンパク質を濾過することと、宿主細胞タンパク質を同定することと、を含み得る。本実施形態の一態様では、タンパク質解離は、タンパク質解離剤を使用して実施することができる。本実施形態の一態様では、タンパク質解離は、タンパク質解離剤を使用して実施することができる。本実施形態の特定の態様では、タンパク質解離剤は、デオキシコール酸ナトリウムを含むことができる。本実施形態の別の特定の態様では、タンパク質解離剤は、Ｎ－ラウロイルサルコシンを含むことができる。本実施形態の更に別の特定の態様では、タンパク質解離剤は、デオキシコール酸ナトリウム及びＮ－ラウロイルサルコシンを含むことができる。本実施形態の特定の態様では、タンパク質解離剤は、本質的に分解性であり得る。本実施形態の一態様では、分子量カットオフフィルタは、少なくとも約１００ＫＤａのカットオフを有することができる。本実施形態の一態様では、分子量カットオフフィルタは、少なくとも約５０ＫＤａのカットオフを有することができる。本実施形態の一態様では、宿主細胞タンパク質の同定は、質量分析計を使用して実施することができる。本実施形態の特定の態様では、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに結合することができる。本実施形態の別の特定の態様では、液体クロマトグラフィーシステムは、ナノ液体クロマトグラフィーシステムであり得る。本実施形態の別の特定の態様では、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。本実施形態の一態様では、本方法は、少なくとも約１ｐｐｍの濃度である宿主細胞タンパク質を検出するように構成することができる。本実施形態の一態様では、濾過ステップは、解離した宿主細胞タンパク質を少なくとも約５０倍濃縮する。本実施形態の一態様では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、任意選択で、濾過された宿主細胞タンパク質を加水分解剤に接触させることを含むことができる。
１つの例示的な実施形態では、目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、目的のタンパク質から宿主細胞タンパク質を解離することと、解離した宿主細胞タンパク質を分子量カットオフフィルタを使用して濾過することと、濾過した宿主細胞タンパク質を加水分解剤に接触させることと、宿主細胞タンパク質を同定することと、を含むことができる。本実施形態の一態様では、タンパク質解離は、タンパク質解離剤を使用して実施することができる。本実施形態の特定の態様では、タンパク質解離剤は、デオキシコール酸ナトリウムを含むことができる。本実施形態の別の特定の態様では、タンパク質解離剤は、Ｎ－ラウロイルサルコシンを含むことができる。本実施形態の更に別の特定の態様では、タンパク質解離剤は、デオキシコール酸ナトリウム及びＮ－ラウロイルサルコシンを含むことができる。本実施形態の特定の態様では、タンパク質解離剤は、本質的に分解性であり得る。本実施形態の一態様では、分子量カットオフフィルタは、少なくとも約１００ＫＤａのカットオフを有することができる。本実施形態の一態様では、分子量カットオフフィルタは、少なくとも約５０ＫＤａのカットオフを有することができる。本実施形態の一態様では、加水分解剤はトリプシンであり得る。本実施形態の一態様では、本方法は、少なくとも約１ｐｐｍの濃度である宿主細胞タンパク質を検出するように構成することができる。本実施形態の一態様では、濾過ステップは、解離した宿主細胞タンパク質を少なくとも約５０倍濃縮する。本実施形態の一態様では、宿主細胞タンパク質の同定は、質量分析計を使用して実施することができる。本実施形態の特定の態様では、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに結合することができる。本実施形態の別の特定の態様では、液体クロマトグラフィーシステムは、ナノ液体クロマトグラフィーシステムであり得る。本実施形態の別の特定の態様では、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。本実施形態の一態様では、本方法は、濾過された宿主細胞タンパク質をタンパク質還元剤に接触させることを更に含むことができる。本実施形態の特定の態様では、タンパク質還元剤はＴＣＥＰであり得る。本実施形態の別の態様では、本方法は、濾過された宿主細胞タンパク質をタンパク質アルキル化剤に接触させることを更に含むことができる。本実施形態の特定の態様では、タンパク質アルキル化剤はＣＡＡであり得る。本実施形態の更に別の態様では、本方法は、濾過された宿主細胞タンパク質を遠心分離することを更に含むことができる。
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を含む本特許または特許出願公開の複写は、要請かつ必要な料金の支払により特許庁より提供される。
詳細な説明
最初の治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるムロモナブＣＤ３（ｍｕｒｏｍｏｎａ－ＣＤ３）は、急性拒絶反応のある臓器移植患者を治療するために１９９２年にＦＤＡによって承認され、８０を超える治療用ｍＡｂが臨床使用に承認されて大きな成功を収めている。これらの治療用タンパク質を細胞ベースで製造する際、最終的なタンパク質ベース医薬品が、臨床使用前に細胞からの不純物が許容可能な低レベルであるように高度に精製しなければならない。不純物、特に哺乳類の発現系に由来する宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など）は、監視する必要がある。最終原薬中のＨＣＰレベルの一般的なガイドラインは１００ｐｐｍ未満である（Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｃｈｏｎ＆Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｚａｒｂｉｓ－Ｐａｐａｓｔｏｉｔｓｉｓ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２８ Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４５８－４６３（２０１１））。しかしながら、ＨＣＰの総不純物が原薬中に低レベルで存在する場合であっても、注射後に毒性または生物学的に活性であり、免疫応答を引き起こす可能性のある特定のＨＣＰについては微量のＨＣＰが許容されない場合がある（Ｊ．Ｒ．Ｂｉｅｒｉｃｈ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ｄｗａｒｆｉｓｍ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ，７５ Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ１３－１８（１９８６）；Ｔ．Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，３０Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ５７８－５８９ （２００７）；Ｄａｎｉｅｌ Ｇ．Ｂｒａｃｅｗｅｌｌ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｆｒａｎｃｉｓ＆Ｃ．Ｍａｒｋ Ｓｍａｌｅｓ，Ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ａ ｒｉｓｋ－ｂａｓｅｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｒｏｌ，１１２Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１７２７－１７３７（２０１５）；Ｓａｌｏｕｍｅｈ Ｋａｄｋｈｏｄａｙａｎ Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｂ－Ｌｉｋｅ ２ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｉｍｐｕｒｉｔｙ ｉｎ Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ，１９Ｔｈｅ ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ２５４－２６３（２０１６））。また、ＨＣＰが、抗体を分解したり、または抗体結合能を変化させたりする能力に関係する場合も、容認できない可能性がある（Ｎｉｔｉｎ Ｄｉｘｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｓｕｌｆａｔａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，１０５Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１６５７１－６６６（２０１６）；Ｔｒｏｉｉ Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ ２０ ａｎｄ ８０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｇｒｏｕｐ ＸＶ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ Ｉｓｏｍｅｒ Ｘ１ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．，１０５Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１６３３－１６４２））。したがって、全てのＨＣＰコンポーネントを個別に監視できる方法があることが望ましい場合がある。
最初の治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるムロモナブＣＤ３（ｍｕｒｏｍｏｎａ－ＣＤ３）は、急性拒絶反応のある臓器移植患者を治療するために１９９２年にＦＤＡによって承認され、８０を超える治療用ｍＡｂが臨床使用に承認されて大きな成功を収めている。これらの治療用タンパク質を細胞ベースで製造する際、最終的なタンパク質ベース医薬品が、臨床使用前に細胞からの不純物が許容可能な低レベルであるように高度に精製しなければならない。不純物、特に哺乳類の発現系に由来する宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など）は、監視する必要がある。最終原薬中のＨＣＰレベルの一般的なガイドラインは１００ｐｐｍ未満である（Ｊｏｈｎ Ｈ．Ｃｈｏｎ＆Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｚａｒｂｉｓ－Ｐａｐａｓｔｏｉｔｓｉｓ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２８ Ｎｅｗ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４５８－４６３（２０１１））。しかしながら、ＨＣＰの総不純物が原薬中に低レベルで存在する場合であっても、注射後に毒性または生物学的に活性であり、免疫応答を引き起こす可能性のある特定のＨＣＰについては微量のＨＣＰが許容されない場合がある（Ｊ．Ｒ．Ｂｉｅｒｉｃｈ，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ Ｄｗａｒｆｉｓｍ ｗｉｔｈ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｇｒｏｗｔｈ Ｈｏｒｍｏｎｅ，７５ Ａｃｔａ Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ１３－１８（１９８６）；Ｔ．Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｓａｆｅｔｙ ｏｆ ａ ｎｅｗ ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ，３０Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ５７８－５８９ （２００７）；Ｄａｎｉｅｌ Ｇ．Ｂｒａｃｅｗｅｌｌ，Ｒｉｃｈａｒｄ Ｆｒａｎｃｉｓ＆Ｃ．Ｍａｒｋ Ｓｍａｌｅｓ，Ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ａ ｒｉｓｋ－ｂａｓｅｄ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｔｒｏｌ，１１２Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ１７２７－１７３７（２０１５）；Ｓａｌｏｕｍｅｈ Ｋａｄｋｈｏｄａｙａｎ Ｆｉｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｂ－Ｌｉｋｅ ２ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｉｍｐｕｒｉｔｙ ｉｎ Ｌｅｂｒｉｋｉｚｕｍａｂ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ，１９Ｔｈｅ ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ２５４－２６３（２０１６））。また、ＨＣＰが、抗体を分解したり、または抗体結合能を変化させたりする能力に関係する場合も、容認できない可能性がある（Ｎｉｔｉｎ Ｄｉｘｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｓｉｄｕａｌ Ｈｏｓｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｍｏｔｅｓ Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｓｕｌｆａｔａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ Ｆｒｅｅ Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ，１０５Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１６５７１－６６６（２０１６）；Ｔｒｏｉｉ Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅｓ ２０ ａｎｄ ８０ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｇｒｏｕｐ ＸＶ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ Ｉｓｏｍｅｒ Ｘ１ ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ．，１０５Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１６３３－１６４２））。したがって、全てのＨＣＰコンポーネントを個別に監視できる方法があることが望ましい場合がある。
従来、ポリクローナル抗ＨＣＰ抗体を用いた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、ＨＣＰの全体的な存在量を定量化するために使用されてきた（Ｄｅｎｉｓｅ Ｃ．Ｋｒａｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｓｔｕｄｉｅｓ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｔｏ ｍｏｎｉｔｏｒ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ，６Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ９４－１１０（２００６）；Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ｅｍ Ｈｏｇｗｏｏｄ，Ｄａｎｉｅｌ Ｇ Ｂｒａｃｅｗｅｌｌ＆Ｃ Ｍａｒｋ Ｓｍａｌｅｓ，Ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ，４Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ２８８－２９１（２０１３））。個々のＨＣＰコンポーネントの測定に対する需要をふまえると、ＥＬＩＳＡはＨＣＰのレベルを評価するための最終的な解決策ではない可能性がある。更に、一部の弱い、または非免疫原性ＨＣＰは、ＥＬＩＳＡ検出用の抗体を生成しない可能性があるため、これらのＨＣＰは検出できない。
１Ｄ／２Ｄ－ＰＡＧＥ及び質量分析ベースの分析技術など、ＨＣＰを監視するために多くの補完的分析手法が採用されている（Ｊｕｌｉｔａ Ｋ．Ｇｒｚｅｓｋｏｗｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｎｏｎ－ａｆｆｉｎｉｔｙ ｂａｓｅｄ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，１２１６Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ４９０２－４９１２（２００９）；Ｃａｔａｌｉｎ Ｄｏｎｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｏｓｔ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｏｎｌｉｎｅ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，４ｍＡｂｓ２４－４４（２０１２）；Ｍｉ Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（２Ｄ－ＤＩＧＥ）：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０５Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ３０６－３１６（２０１０））。液体クロマトグラフィー結合タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）は、ＨＣＰ不純物の同定及び定量の両方の手段を同時に提供することもでき、ＥＬＩＳＡアッセイを補完する主要なオルトゴナル法として関心が高まってきた。しかしながら、質量分析ベースの方法の主な課題は、質量分析計自体が、圧倒的に高濃度の抗体原薬と混合した際に低濃度のＨＣＰを検出する能力を欠くことであり得る。低ｐｐｍレベルのＨＣＰと多量の治療用抗体との間の広いダイナミックレンジ（６桁以上）という問題を克服するために、１つの戦略は、分離効率を高めるために、データ依存型取得またはデータ非依存型取得に加えて、２Ｄ－ＬＣ及びイオン移動度などの別次元の分離を加えることにより、質量分析の前に共溶出ペプチドを分解することである。ある研究では、Ｅｃｋｅｒらは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いて、１桁ｐｐｍレベルのＨＣＰの同定を報告し、ｎｕｌｌ株由来のＨＣＰの質量、保持時間、及びフラグメントイオンを含むライブラリを構築した。本方法は感度が高いが、本方法では、特定の生成物とのみ共発現するＨＣＰが失われる可能性がある（Ｄａｗｎ Ｍ Ｅｃｋｅｒ，Ｓｕｓａｎ Ｄａｎａ Ｊｏｎｅｓ＆Ｈｏｗａｒｄ Ｌ Ｌｅｖｉｎｅ，Ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍａｒｋｅｔ，７ｍＡｂｓ９－１４（２０１４））。別の研究では、イオン移動度を備えた２Ｄ－ＨＰＬＣを使用して１０～５０ｐｐｍのＨＣＰを特定できることが示された（Ｃａｔａｌｉｎ Ｄｏｎｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｏｓｔ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｏｎｌｉｎｅ ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，４ ｍＡｂｓ ２４－４４（２０１２））。しかしながら、２Ｄ－ＬＣのサイクル時間は非常に長く、本方法では低レベルのＨＣＰ（１０ｐｐｍ未満）分析には十分な感度がない。他の戦略は、アフィニティー精製、限定分解で試料中の抗体を除去したり、またはポリクローナル抗体を用いてＨＣＰを捕捉することによって、ＨＣＰを濃縮するための試料調製に焦点を当てている（Ｌｉｈｕａ Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｎｏｖｅｌ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｓｈｏｔｇｕｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＣＰｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，８９Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５４３６－５４４４（２０１７）；Ｊｅｎｎｙ Ｈｅｉｄｂｒｉｎｋ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＨＣＰｓ）ｉｎ ａ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｕｓｉｎｇ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａｎ ＨＣＰ－ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｓｔｒａｔｅｇｙ，２８Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ８５５－８６０（２０１４）；Ｊａｍｅｓ Ａ Ｍａｄｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｖｉａ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎｓ，ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ，ａｎｄ ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，７ｍＡｂｓ１１２８－１１３７（２０１５））。
既存の方法では、試料中の低濃度のＨＣＰ（例えば、０．０１～１０ｐｐｍ）を検出する能力がなく、ＨＣＰと薬物間のダイナミックレンジが広い（５～８桁）ため、ＨＣＰ信号が分析でマスクされてしまうことが大きな課題の１つであり得る。
既存の方法の限界を考慮して、ＨＣＰを同定するための効果的かつ効率的な方法が開発された。
別段記載されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法及び材料は、実施または試験では使用され得るが、これより特定の方法及び材料が記載される。言及される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
用語「ａ」は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、用語「約」及び「およそ」は、当業者によって理解されるであろう標準的な変動を許容すると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、終点が含まれる。
いくつかの例示的な実施形態では、開示されるのは、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定するための方法である。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞タンパク質」という用語は、宿主細胞に由来するタンパク質を含み、目的の所望のタンパク質とは無関係であり得る。宿主細胞タンパク質は、製造プロセスから誘導できるプロセス関連の不純物である可能性があり、細胞基質由来、細胞培養由来、及びダウンストリーム由来の３つの主要なカテゴリーを含むことができる。細胞基質由来の不純物には、宿主生物及び核酸（宿主細胞のゲノム、ベクター、または全ＤＮＡ）に由来するタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。細胞培養由来の不純物には、誘導物質、抗生物質、血清、及び他の培地成分が含まれるが、これらに限定されない。ダウンストリーム由来の不純物としては、酵素、化学的・生化学的処理試薬（例えば、臭化シアノゲン、グアニジン、酸化剤、及び還元剤など）、無機塩類（例えば、重金属、ヒ素、非金属イオンなど）、溶媒、担体、リガンド（例えば、モノクローナル抗体など）、及び他の浸出物などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
細胞ベースシステムを使用してタンパク質を製造する際、製品自体を使用前に細胞ベースの不純物から許容レベルまで精製する必要がある。発現システムに由来し得る不純物、発現システムでは、採取のために収集された細胞培養液中に目的のタンパク質が分泌されるだけでなく、宿主細胞タンパク質（複数可）（ＨＣＰ）、核酸、脂質、及び製品の不純物とともに培地中に放出される可能性がある他の細胞物質もまた分泌される（上記のＢｒａｃｅｗｅｌｌ参照）。特に、ＨＣＰを監視する必要があり、最終製品では、リスクまたは製品劣化の観点から特定のＨＣＰには受け入れられない可能性があり、そうでなければ製品の免疫原性形態の発達につながるおそれがある。ダウンストリーム処理では、分離を使用して、ＨＣＰの多様なスペクトルから目的のタンパク質を分離することができる。
いくつかの例示的な実施形態では、試料マトリックスは、目的のタンパク質を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「目的のタンパク質」という用語は、共有結合したアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含む。タンパク質は、当技術分野で「ポリペプチド」として一般に知られている１つまたは複数のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、アミノ酸残基、関連する天然に存在する構造変異体、及びペプチド結合を介して連結されたそれらの合成の天然に存在しない類似体、関連する天然に存在する構造変異体、及びそれらの合成の天然に存在しない類似体から構成されるポリマーを指す。「合成ペプチドまたはポリペプチド」とは、天然に存在しないペプチドまたはポリペプチドを指す。合成ペプチドまたはポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。様々な固相ペプチド合成法が当業者に知られている。タンパク質は、単一の機能する生体分子を形成するために、１つまたは複数のポリペプチドを含み得る。タンパク質には、生物学的療法タンパク質、研究または治療で使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体のいずれかが含まれ得る。別の例示的な態様では、タンパク質は、抗体フラグメント、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含むことができる。タンパク質は、昆虫バキュロウイルスシステム、酵母システム（例えば、Ｐｉｃｈｉａ種）、哺乳動物システム（例えば、ＣＨＯ細胞、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの組換え細胞ベースの産生システムを使用して産生され得る。生物学的療法タンパク質及びその産生について論じているレビューについては、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”（ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＧＥＮＥＴ．ＥＮＧ．ＲＥＶ．１４７－１７５（２０１２））を参照のこと。いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、修飾、付加物、及び他の共有結合された部分を含む。これらの修飾、付加物、及び部分には、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ノイラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、及び他の単糖）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧｔａｇ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識、及び他の染料などが含まれる。タンパク質は、組成及び溶解度に基づいて分類でき、したがって、球状タンパク質及び繊維状タンパク質などの単純なタンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、及びリポタンパク質などのコンジュゲートタンパク質、ならびに一次誘導タンパク質及び二次誘導タンパク質などの誘導タンパク質を含むことができる。
いくつかの例示的な実施形態では、目的のタンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体フラグメント、モノクローナル抗体、宿主細胞タンパク質、またはそれらの組み合わせであり得る。
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、４つのポリペプチド鎖、すなわち、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖、ならびにその多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＬＣＶＲまたはＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ．ｓｕｂ．Ｌ１）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する超可変性の領域に更に細分され得るが、それらは、フレームワーク領域（ＦＲ）と称するより保存的な領域内に散在する。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される。異なる例示的な実施形態では、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体（またはその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得るか、または天然もしくは人工的に改変され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義することができる。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、完全な抗体分子の抗原結合フラグメントを含む。
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に得られる、合成の、または遺伝子操作されたポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、抗体の可変ドメイン及び任意選択で定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を伴うタンパク質分解または組換え遺伝子操作技術などの任意の適切な標準技術を用いて、完全な抗体分子から誘導され得る。そのようなＤＮＡは、既知であり、及び／または、例えば、商業的供給源、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、または合成することができる。ＤＮＡは、化学的に、または分子生物学技術を使用して、例えば、１つもしくは複数の可変及び／または定常ドメインを適切な構成に配置するため、またはコドンを導入するため、システイン残基を作成するため、アミノ酸を修飾、追加、もしくは欠失するなどのために配列決定及び操作することができる。
本明細書で使用する場合、「抗体フラグメント」は、例えば、抗体の抗原－結合または可変領域などのインタクトな抗体の一部を含む。抗体フラグメントの例には、これらに限定されないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、Ｆｄフラグメント、及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、ならびにトリアボディ、テトラボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子である。抗体フラグメントは、様々な手段によって産生され得る。例えば、抗体フラグメントは、インタクトな抗体の断片化によって酵素的または化学的に産生され得、及び／またはそれは、部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え産生され得る。あるいは、または更に、抗体フラグメントは、全体的または部分的に合成的に産生され得る。抗体フラグメントは、任意選択で、単鎖抗体フラグメントを含み得る。あるいは、または更に、抗体フラグメントは、例えば、ジスルフィド結合によって一緒に連結された複数の鎖を含み得る。抗体フラグメントは、任意選択で多分子複合体を含み得る。
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当技術分野で利用可能または既知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンから誘導することができる。本開示に有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマの使用、組み換え、及びファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせを含む、当技術分野で公知の多様な技術を用いて調製することができる。
特定の態様では、目的のタンパク質は、アフリベルセプト、組換えＭｉｎｉ－Ｔｒａｐ（その例は米国特許第７，２７９，１５９号に開示されている）、ｓｃＦｖ、及び他の抗ＶＥＧＦタンパク質からなる群から選択される。好ましい態様では、目的の組換えタンパク質はアフリベルセプトである。
いくつかの例示的な実施形態では、試料マトリックスは、任意選択で、生成物関連不純物を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「生成物関連不純物」（例えば、前駆体、特定の分解生成物）とは、製造及び／または保存中に生じ、活性、有効性、及び安全性に関して所望の産物のものと同等の特性を持たない分子変異体であり得る。このような変異体は、改変（複数可）の種類を同定するために、単離及び特性評価にかなりの労力を必要とする場合がある。生成物関連不純物には、短縮型、修飾型、及びアグリゲートが含まれる。短縮型は、ペプチド結合の切断を触媒する加水分解酵素または化学物質によって形成される。修飾型には、脱アミド化、異性化、ミスマッチのＳ－Ｓ結合、酸化、または改変されたコンジュゲート形態（例えば、グリコシル化、リン酸化）が含まれるが、これらに限定されない。修飾型は、任意の翻訳後修飾型を含んでもよい。アグリゲートには、目的物質の二量体及び高次多量体（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）が含まれる。（Ｑ６Ｂ Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｔｅｓｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ／Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＩＣＨ Ａｕｇｕｓｔ １９９９，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）。
いくつかの例示的な実施形態では、試料マトリックスは、タンパク質製剤であり得る。
本明細書で使用される場合、「タンパク質製剤」という用語は、１つまたは複数の薬学的に許容されるビヒクルと一緒に製剤化される治療用タンパク質を指す。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、治療レジメンでの投与に適切な単位投与量で存在する。いくつかの例示的な実施形態では、製剤は、緩衝剤、増量剤、等張化剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、界面活性剤、可溶化剤、及び保存剤を含むがこれらに限定されない賦形剤を更に含み得る。他の追加の賦形剤も機能に基づいて選択することができ、製剤との適合性は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる Ｌｏｙｄ Ｖ．Ａｌｌｅｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ（１９版．１９９５）、Ｊｏｈｎ Ｅ Ｈｏｏｖｅｒ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７５）、及びＬｙｏｄ Ａｌｌｅｎ、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（１０版）に見出すことができる。
いくつかの例示的な実施形態では、目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、目的のタンパク質から宿主細胞タンパク質を解離させることを含み得る。目的のタンパク質からの宿主細胞タンパク質の解離は、タンパク質解離剤を使用して実施することができる。タンパク質解離剤の非限定的な例には、熱、高もしくは低ｐＨ、またはカオトロピック剤への曝露が含まれる。タンパク質解離剤として、いくつかのカオトロピック剤を使用することができる。カオトロピック溶質は、水素結合、ファンデルワールス力、及び疎水性効果などの非共有結合力によって媒介される分子内相互作用を妨害することにより、システムのエントロピーを増加させる。カオトロピック剤の非限定的な例には、ブタノール、エタノール、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、Ｎ－ラウロイルサルコシン、尿素、及びそれらの塩が含まれる。一態様では、目的のタンパク質から宿主細胞タンパク質を解離させることは、目的のタンパク質を変性させることを含み得る。別の態様では、目的のタンパク質から宿主細胞タンパク質を解離させることは、宿主細胞タンパク質を変性させることを含み得る。本明細書で使用される場合、「変性」という用語は、分子の三次元形状が、ペプチド結合を破壊することなくその天然状態から変化するプロセスを指す。
いくつかの例示的な実施形態では、目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、分子量カットオフフィルタを使用して解離した宿主細胞タンパク質を濾過することを含み得る。
本明細書で使用される場合、「分子量カットオフフィルタ」という用語は、少なくとも約９０％の溶質または既知の分子量（ＫＤａ）のタンパク質を保持する能力を有することができるフィルタまたは膜または濾過方法を含むことができる。いくつかの例示的な実施形態では、分子量カットオフフィルタは、少なくとも約３０ＫＤａのカットオフを有することができる。いくつかの他の例示的な実施形態では、分子量カットオフフィルタは、少なくとも約５０ＫＤａのカットオフを有することができる。いくつかの更なる例示的な実施形態では、分子量カットオフフィルタは、少なくとも約１００ＫＤａのカットオフを有することができる。分子量カットオフフィルタは、例えば、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃｅｎｔｒｉｓａｒｔ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｖｉｖａｓｐｉｎ、及びＳａｒｔｏｒｉｕｓなどのいくつかの商業サプライヤから入手できる。分子量カットオフフィルタは、必要とされる分子量カットオフ、動作条件、濾過試料の濃度、または濾過試料の組成に基づいて選択することができる。いくつかの例示的な実施形態では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、宿主細胞タンパク質を加水分解剤に接触させることを含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、目的のタンパク質から宿主細胞タンパク質を解離することと、解離した宿主細胞タンパク質を分子量カットオフフィルタを使用して濾過することと、濾過した宿主細胞タンパク質を加水分解剤に接触させることと、を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「加水分解剤」という用語は、タンパク質の分解を実行することができる多数の異なる薬剤の任意の１つまたは組み合わせを指す。酵素分解を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、トリプシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ、外膜プロテアーゼＴ（ＯｍｐＴ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、キモトリプシン、ペプシン、サーモライシン、パパイン、プロナーゼ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ由来のプロテアーゼが挙げられる。非酵素的分解を行うことができる加水分解剤の非限定的な例としては、高温、マイクロ波、超音波、高圧、赤外線、溶媒（非限定的な例としてはエタノール及びアセトニトリル）、固定化酵素分解（ＩＭＥＲ）、磁性粒子固定化酵素、及びオンチップ固定化酵素の使用が挙げられる。タンパク質分解に利用可能な技術について論じている最近のレビューについては、Ｓｗｉｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”（Ｌｉｎｄａ Ｓｗｉｔｚａｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｇｉｅｒａ＆Ｗｉｌｆｒｉｅｄ Ｍ．Ａ．Ｎｉｅｓｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，１２Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ１０６７－１０７７（２０１３））を参照のこと。加水分解剤の１つまたは組み合わせは、配列特異的な方法でタンパク質またはポリペプチドのペプチド結合を切断し、より短いペプチドの予測可能なコレクションを生成することができる。
タンパク質の分解を達成するために、加水分解剤対タンパク質の期間比率、ならびに分解に必要な時間を適切に選択することができる。酵素と基質の比率が不適切に高い場合、それに対応する高い分解率により、ペプチドを質量分析計で分析するのに十分な時間が与えられず、シーケンスカバレッジが損なわれる。一方、Ｅ／Ｓ比が低いと、分解が長くなり、データ取得時間が長くなる。酵素と基質の比率は、約１：０．５～約１：２００の範囲である可能性がある。本明細書で使用される場合、「分解」という用語は、タンパク質の１つまたは複数のペプチド結合の加水分解を指す。適切な加水分解剤を使用して試料中のタンパク質の分解を実行するには、例えば、酵素分解または非酵素分解など、いくつかのアプローチがある。
試料中のタンパク質を分解するために広く受け入れられている方法の１つは、プロテアーゼの使用を伴う。多くのプロテアーゼが利用可能であり、それらのそれぞれは、特異性、効率性、及び最適な分解条件の点で独自の特徴を持っている。プロテアーゼは、ペプチド内の非末端または末端アミノ酸で切断するプロテアーゼの能力に基づいて分類されるように、エンドペプチダーゼ及びエキソペプチダーゼの両方を指す。あるいは、プロテアーゼはまた、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、及びメタロプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、及びスレオニンプロテアーゼの６つの異なるクラスを指し、触媒作用のメカニズムによって分類される。「プロテアーゼ」及び「ペプチダーゼ」という用語は、ペプチド結合を加水分解する酵素を指すために互換的に使用される。
宿主細胞タンパク質を加水分解剤に接触させることとは別に、本方法は、任意選択で、宿主細胞タンパク質を還元する、宿主細胞タンパク質をアルキル化する、宿主細胞タンパク質を緩衝する、及び／または試料マトリックスを脱塩するためのステップを含むことができる。これらのステップは、必要に応じて任意の適切な方法で実行できる。
いくつかの例示的な実施形態では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、宿主細胞タンパク質をタンパク質還元剤に接触させることを含み得る。
本明細書で使用される場合、「タンパク質還元剤」という用語は、タンパク質中のジスルフィド架橋の還元に使用される薬剤を指す。タンパク質を還元するために使用されるタンパク質還元剤の非限定的な例としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、β－メルカプトエタノール、エルマン試薬、ヒドロキシルアミン塩酸塩、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの例示的な実施形態では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質の同定方法は、任意選択的に、宿主細胞タンパク質をタンパク質アルキル化剤に接触させることを含み得る。
本明細書で使用される場合、「タンパク質アルキル化剤」という用語は、タンパク質中の特定の遊離アミノ酸残基をアルキル化するために使用される薬剤を指す。タンパク質アルキル化剤の非限定的な例としては、ヨードアセトアミド（ＩＯＡ）、クロロアセトアミド（ＣＡＡ）、アクリルアミド（ＡＡ）、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）、メチルメタンチオスルホネート（ＭＭＴＳ）、及び４－ビニルピリジン、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの例示的な実施形態では、目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、目的のタンパク質から宿主細胞タンパク質を解離することと、分子量カットオフフィルタを使用して解離した宿主細胞タンパク質を濾過することと、ボトムアップまたはショットガンプロテオミクスアプローチを使用して宿主細胞タンパク質を同定することと、を含み得る。
従来のボトムアップアプローチ実験では、タンパク質を小さなポリペプチドに分解して特性決定することができる。次に、ペプチド混合物を質量分析にかけることができる。ペプチドの同定は、ポリペプチドの断片化に由来する質量スペクトルを、タンパク質のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分解から生成された理論上の質量スペクトルと比較することによって更に実行することができる。次に、タンパク質にペプチド配列を割り当てることにより、タンパク質推定が行われる。
一般的なペプチドマッピングワークフローは、タンパク質の変性、システイン残基の還元及びアルキル化、タンパク質分解、ならびにタンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）と組み合わせた液体クロマトグラフィーのステップで構成され得る。（Ｐａｖｅｌ Ｖ．Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｓｓ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｏｐ－ｄｏｗｎ ＨＰＬＣ／ＭＳ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｏｎ ａ ｈｙｂｒｉｄ ｌｉｎｅａｒ ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ｉｏｎ ｔｒａｐ－ｏｒｂｉｔｒａｐ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ，２０Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ１４１５－１４２４（２００９）；Ｊａｍｅｓ Ｈ．Ｂｏｕｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，６６Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２０８８－２０９５（１９９４）；Ｗｅｉ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ４ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，３１１Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１－９（２００２）；Ｄａｎｉｅｌ Ｊ．Ｋｒｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ ｉｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１３Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ１０４９－１０５４（１９９５）；Ｂ．Ｗ．Ｇｉｂｓｏｎ＆Ｋ．Ｂｉｅｍａｎｎ，Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｅｄｕｃｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅｉｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．，８１Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１９５６－１９６０（１９８４）；Ｄｉｒｋ Ｃｈｅｌｉｕｓ，Ｄｏｕｇｌａｓ Ｓ．Ｒｅｈｄｅｒ＆Ｐａｖｅｌ Ｖ．Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏ，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇａｍｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，７７Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ６００４－６０１１（２００５）；Ｎｅｉｌ Ｋｅｌｌｅｈｅｒ，Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ；７６ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ１９７Ａ－２０３Ａ（２００４）；Ｙｕａｎ Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｐ－Ｄｏｗｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ｉｎｔａｃｔ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ－Ｆｏｕｒｉｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ Ｉｏｎ Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ－Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，８５Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４２３９－４２４６（２０１３）；Ｙｕｒｙ Ｏ．Ｔｓｙｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｔａｃｔ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，８３Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ８９１９－８９２７（２０１１）；Ｌｕｃａ Ｆｏｒｎｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｔａｃｔ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＩｇＧ１ ｂｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＦＴＭＳ，１１Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ１７５８－１７６７（２０１２）；Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ Ａ．Ｓｒｅｂａｌｕｓ Ｂａｒｎｅｓ＆Ａｍａｒｅｔｈ Ｌｉｍ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，２６Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ３７０－３８８（２００７））。液体クロマトグラフィーと質量分析装置の急速な進歩により、このペプチドマッピング法は、現在、ほぼ完全なシーケンスカバレッジを日常的に生成することができ、したがってモノクローナル抗体の同一性を確認するための効果的なアプローチになっている。
いくつかの例示的な実施形態では、目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、目的のタンパク質から宿主細胞タンパク質を解離することと、分子量カットオフフィルタを使用して解離した宿主細胞タンパク質を濾過することと、質量分析計を使用して宿主細胞を同定することと、を含み得る。
本明細書で使用される場合、「質量分析計」という用語は、特定の分子種を同定し、それらの正確な質量を測定することができる装置を含む。この用語は、ポリペプチドまたはペプチドが検出及び／または特性決定のために溶出され得る任意の分子検出器を含むことを意味する。質量分析計は、イオン源、質量分析器、及び検出器の３つの主要部分を含むことができる。イオン源の役割は、気相イオンを生成することである。分析対象原子、分子、またはクラスターは、気相に移動し、同時に（エレクトロスプレーイオン化の場合のように）または別々のプロセスでイオン化できる。イオン源の選択は、アプリケーションに大きく依存する。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。
本明細書で使用される場合、「タンデム質量分析」という用語は、質量選択及び質量分離の複数の段階を使用することによって試料分子に関する構造情報が得られる技術を含む。前提条件は、試料分子を気相に移動してインタクトでイオン化できることと、最初の質量選択ステップの後に、予測可能かつ制御可能な方法で試料分子が崩壊するように誘導できることである。マルチステージＭＳ／ＭＳ、またはＭＳｎは、意味のある情報を取得できるか、またはフラグメントイオン信号が検出可能である限り、まずプリカーサーイオン（ＭＳ２）を選択して単離し、それをフラグメント化し、一次フラグメントイオン（ＭＳ３）を単離し、それをフラグメント化し、二次フラグメント（ＭＳ４）を単離するなどして実行できる。タンデムＭＳは、様々な分析器の組み合わせで正常に実行されている。特定のアプリケーションのために組み合わせる分析器は、感度、選択性、及び速度などの様々な要因だけでなく、サイズ、コスト、及び可用性によっても決定することができる。タンデムＭＳメソッドの２つの主要なカテゴリーは、タンデムインスペースとタンデムインタイムであるが、タンデムインタイム分析器がインスペースで、またはタンデムインスペース分析器と結合されているハイブリッドもある。タンデムインスペース質量分析計は、イオン源、プリカーサーイオン活性化デバイス、及び少なくとも２つの非トラップ型質量分析器で構成される。特定のｍ／ｚ分離関数は、機器の１つのセクションでイオンが選択され、中間領域で解離され、生成物イオンがｍ／ｚ分離とデータ取得のために別の分析器に送信されるように設計できる。タンデムインタイムでは、イオン源で生成された質量分析計イオンを、同じ物理デバイス内でトラップ、単離、フラグメント化、及びｍ／ｚ分離することができる。
質量分析計によって同定されたペプチドは、インタクトなタンパク質及びそれらの翻訳後修飾の代理として使用できる。それらは、実験的及び理論的なＭＳ／ＭＳデータを相関させることにより、タンパク質の特性評価に使用することができ、後者は、タンパク質配列データベース内の可能なペプチドから生成される。特性評価には、タンパク質フラグメントのアミノ酸のシークエンシング、タンパク質シークエンシングの決定、タンパク質ｄｅ ｎｏｖｏシークエンシングの決定、翻訳後修飾の特定、または翻訳後修飾の同定、または比較可能性分析、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「データベース」という用語は、データベース（複数可）内の全ての可能な配列に対して未解釈のＭＳ－ＭＳスペクトルを検索する可能性を提供するバイオインフォマティクスツールを指す。このようなツールの非限定的な例は、Ｍａｓｃｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）、またはＳｅｑｕｅｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）である。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計は、液体クロマトグラフィーシステムに結合することができる。
本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー」という用語は、液体または気体によって運ばれる化学的混合物が、静止した液相または固相の周りまたは上を流れるときに、化学物質の異なる分布の結果として成分に分離され得るプロセスを指す。クロマトグラフィーの非限定的な例には、従来の逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）、及び順相クロマトグラフィー（ＮＰ）が挙げられる。疎水性相互作用、親水性相互作用、及びイオン相互作用がそれぞれ主要な相互作用モードであるＲＰ、ＮＰ、及びＩＥＸクロマトグラフィーとは異なり、混合モードクロマトグラフィーでは、これらの相互作用モードを２つ以上組み合わせて使用できる。高速液体クロマトグラフィー（ＲＲＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＦＬＣ）、及びナノ液体クロマトグラフィー（ｎＬＣ）など、いくつかのタイプの液体クロマトグラフィーを質量分析計で使用できる。クロマトグラフィーの方法及び原理の更なる詳細については、Ｃｏｌｉｎ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｌｉｎ Ｆ．Ｐｏｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ（２０１７））を参照のこと。
いくつかの例示的な実施形態では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、トップダウンプロテオミクスアプローチを使用して宿主細胞タンパク質を同定することを含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定する方法は、ネイティブＭＳを使用して宿主細胞タンパク質を同定することを含み得る。
トップダウンプロテオミクスアプローチでは、インタクトなタンパク質を分析できる。トップダウンＭＳでは、全ての種類のＰＴＭ（例えば、リン酸化、タンパク質分解、アセチル化など）及び配列変異体（例えば、変異、多型、代替スプライシングアイソフォームなど）を、先験的な知識がなくても１つのスペクトル（「鳥瞰図」）で同時に検出することで、タンパク質全体の包括的な配列情報を提供することができる（Ｎｅｉｌ Ｌ．Ｋｅｌｌｅｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｏｐ Ｄｏｗｎ ｖｅｒｓｕｓ Ｂｏｔｔｏｍ Ｕｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｔａｎｄｅｍ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１２１Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ８０６－８１２（１９９９）；Ｂ．Ｔ．Ｃｈａｉｔ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ：Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ｂｏｔｔｏｍ－Ｕｐ ｏｒ Ｔｏｐ－Ｄｏｗｎ？，３１４Ｓｃｉｅｎｃｅ６５－６６（２００６）；Ｚａｃｈｅｒｙ Ｒ．Ｇｒｅｇｏｒｉｃｈ＆Ｙｉｎｇ Ｇｅ，Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ，１４Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ１１９５－１２１０（２０１４））。
いくつかの例示的な実施形態では、宿主細胞タンパク質は、約４．５～約９．０の範囲のｐＩを有することができる。一つの例示的な特定の実施形態では、ｐＩは、約４．５、約５．０、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、または約９．０であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質の種類は、少なくとも２つであり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質の濃度は、約０．０５ｐｐｍよりも低くすることができる。いくつかの特定の例示的な実施形態では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質の濃度は、約０．０５ｐｐｍ未満、約１ｐｐｍ未満、約２ｐｐｍ未満、約３ｐｐｍ未満、約４ｐｐｍ未満、約５ｐｐｍ未満、約１０ｐｐｍ未満、約２０ｐｐｍ未満、約３０ｐｐｍ未満、約４０ｐｐｍ未満、約５０ｐｐｍ未満、約６０ｐｐｍ未満、約７０ｐｐｍ未満、約８０ｐｐｍ未満、約９０ｐｐｍ未満、約１００ｐｐｍ未満、約１５０ｐｐｍ未満、約２００ｐｐｍ未満、約２５０ｐｐｍ未満、約３００ｐｐｍ未満、約３５０ｐｐｍ未満、約２００ｐｐｍ未満、約２５０ｐｐｍ未満、約３００ｐｐｍ未満、約３５０ｐｐｍ未満、約４００ｐｐｍ未満、約４５０ｐｐｍ未満、約５００ｐｐｍ未満、約５５０ｐｐｍ未満、約６００ｐｐｍ未満、約６５０ｐｐｍ未満、約７００ｐｐｍ未満、約７５０ｐｐｍ未満、約８００ｐｐｍ未満、約８５０ｐｐｍ未満、約９００ｐｐｍ未満、約９５０ｐｐｍ未満、または約１０００ｐｐｍ未満であり得る。
別の例示的な実施形態では、試料マトリックスは、培養細胞培養液（ＣＣＦ）、採取細胞培養液（ＨＣＣＦ）、プロセス性能適格性評価（ＰＰＱ）、ダウンストリーム処理中の任意のステップ、薬液（ＤＳ）、または最終的に製剤化された製品を構成する医薬品（ＤＰ）などのバイオプロセスの任意のステップから得ることができる。いくつかの他の特定の例示的な実施形態では、試料は、清澄化、クロマトグラフィー精製、ウイルス不活化、または濾過のダウンストリーム処理の任意のステップから選択することができる。いくつかの特定の例示的な実施形態では、医薬品は、診療所、輸送、保管、または取り扱いでは製造された医薬品から選択することができる。
いくつかの例示的な実施形態では、目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質（複数可）を同定するための方法は、適切な温度でＮ－ラウロイルサルコシンまたはデオキシコール酸ナトリウムまたはその両方を使用して、目的のタンパク質から宿主細胞タンパク質を解離することを含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、宿主細胞タンパク質は、宿主細胞タンパク質を酸性または塩基性のｐＨに曝露することによって解離させることができる。いくつかの例示的な実施形態では、宿主細胞タンパク質は、宿主細胞タンパク質を酸性のｐＨ、例えば、約０、または約０．５、または約１、または約１．５、または約２、または約２．５、または約３、または約３．５、または約４、または約４．５、または約５、または約５．５、または約６のｐＨで解離させることができる。１つの例示的な実施形態では 、宿主細胞タンパク質は、例えば、約８、または約８．５、または約９、または約９．５、または約１０、または約１０．５、または約１１、または約１１．５、または約１２、または約１２．５、または約１３、または約１３．５、または約１４のｐＨで、宿主細胞タンパク質を塩基性ｐＨに曝露することによって解離され得る。
いくつかの例示的な実施形態では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質（複数可）を同定するための方法は、宿主細胞タンパク質をアルキル化することを含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では 、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質（複数可）を同定するための方法は、任意選択で、宿主細胞タンパク質を有する溶液を脱塩するステップを含み得る。脱塩は、透析、限外濾過、脱塩クロマトグラフィーカラム、ゲル濾過カラム、遠心限外濾過、またはそれらの組み合わせを使用することによって実施することができる。
いくつかの例示的な実施形態では、本方法は、解離条件下で試料を分解することを更に含むことができる。いくつかの特定の例示的な実施形態では、試料は、加水分解剤を用いて分解することができ、該加水分解剤は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉ由来のプロテアーゼ、エラスターゼ、サブチリシン、プロテアーゼＸＩＩＩ、ペプシン、トリプシン、Ｔｒｙｐ－Ｎ、キモトリプシン、アスペルギロペプシンＩ、ＬｙｓＮプロテアーゼ（Ｌｙｓ－Ｎ）、ＬｙｓＣエンドプロテイナーゼ（Ｌｙｓ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ（Ａｓｐ－Ｎ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ（Ａｒｇ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ（Ｇｌｕ－Ｃ）、または外膜タンパク質Ｔ（ＯｍｐＴ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、サーモライシン、パパイン、プロナーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、またはそれらの生物学的に活性なフラグメントもしくはホモログ、またはそれらの組み合わせから選択することができる。いくつかの例示的な実施形態では、加水分解剤を含む溶液の濃度は、約０．１μｇ／μＬ～約１００μｇ／μＬであり得る。一実施形態では、溶液の濃度は、約０．１μｇ／μＬ、または約０．２μｇ／μＬ、または０．５μｇ／μＬ、または約１μｇ／μＬ、または約２μｇ／μＬ、または約３μｇ／μＬ、または約４μｇ／μＬ、または約５μｇ／μＬ、または約１０μｇ／μＬ、または約１５μｇ／μＬ、または約２０μｇ／μＬ、または約２５μｇ／μＬ、または約３０μｇ／μＬ、または約３５μｇ／μＬ、または約４０μｇ／μＬ、または約４５μｇ／μＬ、または約５０μｇ／μＬ、または約６０μｇ／μＬ、または約７０μｇ／μＬ、または約８０μｇ／μＬ、または約９０μｇ／μＬ、または約１００μｇ／μＬであり得る。試料中のタンパク質の濃度は、約０．１μｇ／μＬ～約１００μｇ／μＬの範囲であり得る。いくつかの例示的な実施形態では、加水分解剤対宿主細胞タンパク質の重量比は、約１：０．１～約１：５０の範囲であり得る。例えば、加水分解剤対宿主細胞タンパク質の比率（ｗ／ｗ）は、約１：０．５、または約１：１、または約１：２、または約１：３、または約１：４、または約１：５、または約１：１０、または約１：１５、または約１：２０、または約１：２５、または約１：３０、または約１：３５、または約１：４０、または約１：４５、または約１：５０であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、試料マトリックスに宿主細胞タンパク質（複数可）を同定するための方法は、分子量カットオフフィルタを使用して宿主細胞タンパク質を濾過することを含み得る。いくつかの特定の例示的な実施形態では、濾過された宿主細胞タンパク質は、解離して濾過され得る。いくつかの他の特定の例示的な実施形態では、濾過された宿主細胞タンパク質は、解離せずに濾過され得る。
いくつかの例示的な実施形態では、分子量カットオフフィルタの分子量フィルタは、約３０ＫＤａより大きくなり得る。いくつかの特定の例示的な実施形態では、分子量カットオフフィルタの分子量フィルタは、約３０ＫＤａ超、約３５ＫＤａ超、約４０ＫＤａ超、約４５ＫＤａ超、約５０ＫＤａ超、約５５ＫＤａ超、約６０ＫＤａ超、約６５ＫＤａ超、約７０ＫＤａ超、約７５ＫＤａ超、約８０ＫＤａ超、約８５ＫＤａ超、約９０ＫＤａ超、約９５ＫＤａ超、約１００ＫＤａ超、約１１０ＫＤａ超、約１２０ＫＤａ超、約１３０ＫＤａ超、約１４０ＫＤａ超、約１５０ＫＤａ超、約１６０ＫＤａ超、約１７０ＫＤａ超、約１８０ＫＤａ超、約１９０ＫＤａ超、約２００ＫＤａ超であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、分子量カットオフフィルタを用いて宿主細胞タンパク質を濾過すると、宿主細胞タンパク質が少なくとも約５倍濃縮される。いくつかの特定の例示的な実施形態では、宿主細胞タンパク質の濃縮は、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０５倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１１５倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１２５倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１３５倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１４５倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１５５倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１６５倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１７５倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１８５倍、少なくとも約１９０倍、少なくとも約１９５倍、または少なくとも約２００倍である。
いくつかの例示的な実施形態では、試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質（複数可）を同定する方法は、質量分析計を使用して宿主細胞タンパク質を同定することを含み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計のためのイオン源は、エレクトロスプレー注入セットアップであり得る。他のいくつかの例示的な実施形態では、質量分析器用の質量分析器は、飛行時間（ＴＯＦ）、磁気／電気セクター、四重極質量フィルタ（Ｑ）、四重極イオントラップ（ＱＩＴ）、オービトラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）、加速器質量分析（ＡＭＳ）、またはそれらの組み合わせから選択することができる。一つの例示的な実施形態では、エレクトロスプレー注入セットアップは、質量分析計とオンラインにすることができる。エレクトロスプレー注入セットアップは、エレクトロスプレーエミッター、噴霧ガス、及び／またはＥＳＩ電源を含み得る。エレクトロスプレーエミッターは、炭素被覆注入チップを持つことができる。ＥＳＩ電源は、質量分析計の試料オリフィスが０ｋＶのままの状態で、エレクトロスプレーエミッターの炭素被覆注入チップに正／負の電圧を印加することができ、エミッタ内の最終試料と質量分析計の接地オリフィスとの間に強い静電界を発生させ、エレクトロスプレーを発生させる。一つの例示的な実施形態では、正の電圧を、エレクトロスプレーエミッターの炭素被覆注入チップに印加することができる。エレクトロスプレーエミッターの炭素被覆注入チップに印加される正の電圧は、約０．５ｋＶ、約１ｋＶ、約１．４ｋＶ、約２ｋＶ、約３ｋＶ、または約４ｋＶから選択できる。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計は、液体クロマトグラフィーに結合することができる。いくつかの特定の例示的な実施形態では、質量分析計は、ナノ液体クロマトグラフィーに結合することができる。いくつかの例示的な実施形態では、液体クロマトグラフィーではタンパク質を溶出するために使用される移動相は、質量分析計と適合性があり得る移動相であり得る。いくつかの特定の例示的な実施形態では、移動相は、酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、またはギ酸アンモニウム、またはそれらの組み合わせであり得る。
別の例示的な実施形態では、質量分析計は、ナノスプレーを含むことができる。
いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計は、タンパク質を特性決定するためのタンデム質量分析計であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、本方法の検出限界は、少なくとも約０．５ｐｐｍであり得る。いくつかの特定の例示的な実施形態では、検出限界は、少なくとも約０．５ｐｐｍ未満、少なくとも約１ｐｐｍ未満、少なくとも約２ｐｐｍ未満、少なくとも約３ｐｐｍ未満、少なくとも約４ｐｐｍ未満、少なくとも約５ｐｐｍ未満、少なくとも約１０ｐｐｍ未満、少なくとも約２０ｐｐｍ未満、少なくとも約３０ｐｐｍ未満、少なくとも約４０ｐｐｍ未満、少なくとも約５０ｐｐｍ未満、少なくとも約６０ｐｐｍ未満、少なくとも約７０ｐｐｍ未満、少なくとも約８０ｐｐｍ未満、少なくとも約９０ｐｐｍ未満、少なくとも約１００ｐｐｍ未満、少なくとも約１５０ｐｐｍ未満、少なくとも約２００ｐｐｍ未満、少なくとも約２５０ｐｐｍ未満、少なくとも約３００ｐｐｍ未満、少なくとも約３５０ｐｐｍ未満、少なくとも約４００ｐｐｍ未満、少なくとも約４５０ｐｐｍ未満、少なくとも約５００ｐｐｍ未満、少なくとも約５５０ｐｐｍ未満、少なくとも約６００ｐｐｍ未満、少なくとも約６５０ｐｐｍ未満、少なくとも約７００ｐｐｍ未満、少なくとも約７５０ｐｐｍ未満、少なくとも約８００ｐｐｍ未満、少なくとも約８５０ｐｐｍ未満、少なくとも約９００ｐｐｍ未満、少なくとも約９５０ｐｐｍ未満、または少なくとも約１０００ｐｐｍ未満であり得る。
いくつかの例示的な実施形態では、分子量カットオフフィルタを使用して宿主細胞タンパク質を濾過するためのステップを含む方法は、分子量カットオフフィルタを使用して宿主細胞タンパク質を濾過するためのステップを含まない方法よりも少なくとも約５倍高い検出限界を有することができる。いくつかの特定の例示的な実施形態では、検出限界は、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０５倍、少なくとも約１１０倍、少なくとも約１１５倍、少なくとも約１２０倍、少なくとも約１２５倍、少なくとも約１３０倍、少なくとも約１３５倍、少なくとも約１４０倍、少なくとも約１４５倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約１５５倍、少なくとも約１６０倍、少なくとも約１６５倍、少なくとも約１７０倍、少なくとも約１７５倍、少なくとも約１８０倍、少なくとも約１８５倍、少なくとも約１９０倍、少なくとも約１９５倍、または少なくとも約２００倍高くなり得る。
本発明が前述の宿主細胞タンパク質（複数可）、加水分解剤（複数可）、タンパク質解離剤（複数可）、タンパク質アルキル化剤（複数可）、同定に使用される機器（複数可）、及び分子量カットオフフィルタ（複数可）、及び任意の宿主細胞タンパク質（複数可）のいずれにも限定されないこと、ならびに任意の宿主細胞タンパク質（複数可）、加水分解剤（複数可）、タンパク質解離剤（複数可）、タンパク質アルキル化剤（複数可）、同定に使用される機器（複数可）、及び分子量カットオフフィルタ（複数可）が任意の好適な手段によって選択され得ること、が理解される。
本明細書に記載されている方法ステップを数字及び／または文字で連続的に表記することは、本方法またはその任意の実施形態を特定の表示された順序に限定することを意味するものではない。
特許、特許出願、公開特許出願、登録番号、技術論文、及び学術論文を含む様々な刊行物を、本明細書全体では引用する。これらの引用文献は、本明細書において、参照により、その全体が、あらゆる目的で援用される。
本開示は、以下の実施例を参照することにより十分に理解され、これらは、本開示をより詳細に説明するために提供される。これらは説明を目的としており、開示の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
材料。全ての化学物質は高純度のものであり、商業的供給源から入手した。ＬＣ－ＭＳグレードのクロマトグラフィー溶媒は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。モノクローナル抗体（以下、ｍＡｂ１）及びＣＨＯタンパク質をスパイクしたものは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ、ＮＹ）によって製造された。デオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）、ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（ＳＬＳ）、及びクロロアセトアミド（ＣＡＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）から購入した。トリス－（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＮＩＳＴモノクローナル抗体標準ＲＭ８６７０は、米国国立標準技術研究所から入手した。
試料前処理とタンパク質分解。治療用抗体は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０に１２ｍＭのＳＤＣ及び１２ｍＭのＳＬＳを含む１００μｌの変性バッファーに溶解した。変性タンパク質をＡｍｉｃｏｎ ｕｌｔｒａ－０．５、５０ＫＤａフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ｓｉｇｍａ）にローディングし、１３，０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、コレクションチューブから抗体枯渇試料を得た。抗体枯渇試料を、１０ｍＭのＴＣＥＰ及び４０ｍＭのＣＡＡで、９５℃で５分間、還元し、アルキル化した。アルキル化タンパク質を１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０で５倍に希釈し、酵素とタンパク質の比率を１：２０（ｗ／ｗ）で３７℃で一晩分解した。分解されたペプチドは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で最終濃度が１％ＴＦＡになるように酸性化し、５００μｌの酢酸エチルを５００μｌの分解溶液に添加した。混合物を２分間振盪し、次に１３，２００ｒｐｍで２分間遠心分離して、水相及び有機相を得た。水相を収集し、ｓｐｅｅｄｖａｃによって乾燥させた。乾燥したペプチド混合物を０．１％ＴＦＡで再懸濁し、ＧＬ－Ｔｉｐ（商標）ＳＤＢ脱塩チップ（ＧＬ ｓｃｉｅｎｃｅ，日本）を使用して脱塩した。
ＮＩＳＴ標準直接分解。１００μｇのＮＩＳＴ標準をｓｐｅｅｄｖａｃで乾燥させた後、８Ｍ尿素及び１０ｍＭ ＤＴＴを含む２０μｌの変性／還元バッファーで再構成した。タンパク質を変性し、３７℃で３０分間還元した後、６μｌの５０ｍｇ／ｍｌヨードアセトアミドと共に暗所で３０分間インキュベートした。アルキル化タンパク質を１００μｌの０．１ｕｇ／μｌのトリプシンで３７℃で一晩分解した。ペプチド混合物を５μｌの１０％ＴＦＡで酸性化した。試料を０．４ｕｇ／μｌに希釈し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析のために２μｌを注入した。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析。ペプチド混合物を１０μｌの０．１％ギ酸（ＦＡ）に溶解し、８μｌをｕｌｔｉｍａｔｅ ｎａｎｏ ＬＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に注入した。ペプチドは、２５ｃｍカラム（０．０７５ｍｍ）Ｃ１８カラム（２．０ｕｍ、１００Å）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分離した。移動相バッファーは、超純水中の０．１％ＦＡ（バッファーＡ）と、８０％ＡＣＮ中の０．１％ＦＡ（バッファーＢ）で構成され、３００ｎｌ／分の流速でバッファーＢの２％～２５％の１００分間の直線グラジエントで実施した。ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ｎａｎｏＬＣは、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦＸ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と接続した。質量分析計は、データ依存モードで動作させ、ＭＳのフルスキャン（ｍ／ｚ ３７５－１５００、分解能１２０，０００）ではＡＧＣ ３ｅ６、最大注入時間６０ｍｓで、ＭＳ／ＭＳイベント（ｍ／ｚ ２００－２０００、分解能３０，０００）ではＡＧＣ １ｅ５、最大注入時間６０ｍｓで、最も強い１０個のイオンを正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）２７％の高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）断片化を行った。
ＰＲＭ分析。試料を８μＬの０．１％ギ酸に溶解し、０．５～１ｕｇの試料をｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ｎａｎｏＬＣシステムに注入した。２５ｃｍカラム（０．０７５ｍｍ）Ｃ１８カラム（２．０ｕｍ、１００Å）を使用して、溶離液を質量分析計に導入した。移動相バッファーは、水中の０．１％ギ酸と、８０％ＡＣＮ（バッファーＢ）中の０．１％ギ酸（バッファーＡ）の溶出バッファーで構成されている。ＬＣ流速は３００ｎｌ／分であった。グラジエントは、２～２５％バッファーＢの１００分間の線形グラジエントとして設定した。試料は、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦＸ（Ｔｈｅｒｍｏ， Ｇｅｒｍａｎｙ）で取得した。各試料は、２ｍ／ｚの分離ウィンドウで並列反応モニタリング（ＰＲＭ）の下で分析した。全ての実験では、ｍ／ｚ ２００に対して１２０，０００の分解能でのフルマススペクトル（ＡＧＣターゲット１ｅ６、最大注入時間６０ｍｓ、ｍ／ｚ ３５０～２０００）の後に、３０，０００の分解能でタイムスケジュールされたＰＲＭスキャン（ＡＧＣターゲット１ｅ５、最大注入時間１００ミリ秒）を行った。高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）は、２７ｅＶの正規化衝突エネルギーで使用した。
治療用抗体は、ＨＣＰと比較して比較的大きな分子であり、分子量は約１５０ＫＤａを有し、ポリペプチド鎖の２つの部分から構成されている。例示的な実施形態による分離スキームが図１に示されている。デオキシコール酸ナトリウムとサルコシン酸ラウロイルカクテルバッファーは、膜タンパク質への溶解性が高いため、もともとは主に膜タンパク質の分解に使用されていた。（Ｔａｋｅｓｈｉ Ｍａｓｕｄａ，Ｍａｓａｒｕ Ｔｏｍｉｔａ＆Ｙａｓｕｓｈｉ Ｉｓｈｉｈａｍａ，Ｐｈａｓｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ－Ａｉｄｅｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ，７Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ７３１－７４０（２００８））。この変性バッファーは、強力な変性剤であるだけでなく、ＭＳ分析前に簡単に除去できるため、このメソッドで採用された。ただし、他の変性剤も使用できる。変性後に濾過を適用する場合、抗体の大部分は濾過膜を通過しないが、ＨＣＰのほとんどはサイズが小さいため膜を自由に通過する。したがって、変性抗体及びそれに関連するＨＣＰは、それらの分子サイズに基づいて分離された。
実施例１
選択した変性剤の濾過効率を、最も一般的に使用される変性条件である５％酢酸中の尿素で比較した。濾過の前後に、総タンパク質量をＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。１．５ｍｇの抗体試料を５％酢酸中の８Ｍ尿素で１００Ｋ ＭＷカットオフフィルタに通したところ、最終的なペプチド量は１５０μｇと測定され、総タンパク質の改善はほとんど見られなかった。尿素を変性剤として使用した場合、タンパク質を９０％除去するだけで、試料の複雑さは大幅に軽減されなかった。総ＨＣＰが１００ｐｐｍ未満であったことを考えると、相対抗体レベルは依然として総ＨＣＰより少なくとも３桁高かった。対照的に、変性剤であるＳＤＣ＋ＳＬＳカクテルは、濾過効率を大幅に向上させた。ＳＤＣ＋ＳＬＳを利用した濾過後、試料量は４μｇまで減少し、同定されたタンパク質の数は２６に増加した（表１）。全ての抗体を濾過によって除去できると仮定すると、残っているタンパク質はＨＣＰのみであり、その量は約０．１５μｇとなる。この結果は、この特定の抗体については、１００Ｋ ＭＷカットオフ膜から逃げるｍＡｂがまだ十分にあることを示唆しており、したがって、ｍＡｂのバイパスを更に最小限に抑えるために最適化が必要であった。
選択した変性剤の濾過効率を、最も一般的に使用される変性条件である５％酢酸中の尿素で比較した。濾過の前後に、総タンパク質量をＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。１．５ｍｇの抗体試料を５％酢酸中の８Ｍ尿素で１００Ｋ ＭＷカットオフフィルタに通したところ、最終的なペプチド量は１５０μｇと測定され、総タンパク質の改善はほとんど見られなかった。尿素を変性剤として使用した場合、タンパク質を９０％除去するだけで、試料の複雑さは大幅に軽減されなかった。総ＨＣＰが１００ｐｐｍ未満であったことを考えると、相対抗体レベルは依然として総ＨＣＰより少なくとも３桁高かった。対照的に、変性剤であるＳＤＣ＋ＳＬＳカクテルは、濾過効率を大幅に向上させた。ＳＤＣ＋ＳＬＳを利用した濾過後、試料量は４μｇまで減少し、同定されたタンパク質の数は２６に増加した（表１）。全ての抗体を濾過によって除去できると仮定すると、残っているタンパク質はＨＣＰのみであり、その量は約０．１５μｇとなる。この結果は、この特定の抗体については、１００Ｋ ＭＷカットオフ膜から逃げるｍＡｂがまだ十分にあることを示唆しており、したがって、ｍＡｂのバイパスを更に最小限に抑えるために最適化が必要であった。
実施例２
フィルタからのｍＡｂの漏れを制限するために、ＭＷカットオフサイズが５０Ｋのフィルタを評価した。更に、濾過分離に対する遠心分離速度（１３，０００、７，０００ｒｐｍ）の影響も評価した。合計４つの条件でのこれら２つの要因の影響の結果を表２に示す。速度が１３，０００ｒｐｍの場合は８分が適用され、７０００ｒｐｍの場合は１５分を使用したため、試料の最終的な溶液は同じ量に達した。試料の総量は、４つの条件全てで濾過後に１．５ｍｇから１６μｇ未満に大幅に減少し、このことは濾過による試料除去の約１００倍を示す。使用した抗体ｍＡｂ１の場合、１００Ｋフィルタと比較して、５０Ｋフィルタは１μｇ未満の最終ペプチド量でかなり多くの抗体をブロックした。５０Ｋフィルタを１３，０００ｒｐｍで８分間が最良の条件であり、高い信頼性で最高の総タンパク質の同定が得られた（表２）。
フィルタからのｍＡｂの漏れを制限するために、ＭＷカットオフサイズが５０Ｋのフィルタを評価した。更に、濾過分離に対する遠心分離速度（１３，０００、７，０００ｒｐｍ）の影響も評価した。合計４つの条件でのこれら２つの要因の影響の結果を表２に示す。速度が１３，０００ｒｐｍの場合は８分が適用され、７０００ｒｐｍの場合は１５分を使用したため、試料の最終的な溶液は同じ量に達した。試料の総量は、４つの条件全てで濾過後に１．５ｍｇから１６μｇ未満に大幅に減少し、このことは濾過による試料除去の約１００倍を示す。使用した抗体ｍＡｂ１の場合、１００Ｋフィルタと比較して、５０Ｋフィルタは１μｇ未満の最終ペプチド量でかなり多くの抗体をブロックした。５０Ｋフィルタを１３，０００ｒｐｍで８分間が最良の条件であり、高い信頼性で最高の総タンパク質の同定が得られた（表２）。
５０Ｋフィルタを使用して１３，０００ｒｐｍで８分間実施される濾過の場合、図２及び図３は、それぞれ濾過前後の試料のトータルイオンクロマトグラフィーを示している。濾過後の試料注入量が同量の場合、濾過された試料のマススペクトルは濾過前のものよりもはるかにクリーンであり（図２及び３）、試料が大幅に減少したことを示している。試料の減少は、個々の抗体ピークのＸＩＣプロファイルからも確認できる。例えば、濾過によって処理した試料と比較した場合、濾過なしでｍ／ｚが５４６．６０３＋のピークのＸＩＣは、典型的な右側「シャークピン」形状で頂点の保持力が大幅に低下しており、このことは試料の著しい過剰ローディングを示す（図４）。なお、全体の注入量はほぼ同じであるため、濾過法により試料中の抗体が大幅に減少し、抗体は比較的少なく、ＨＣＰは多い試料となっている。したがって、ＨＣＰの同定が大幅に改善された。
実施例３
濾過プロセスで発生する試料還元または逆ＨＣＰ濃縮の正確な量を評価するために、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）をターゲットＭＳアプローチで実行し、濾過法によってＨＣＰ濃縮係数を計算した。濾過前後の個々のＨＣＰペプチドと抗体ペプチド（ｍＡｂ１の場合）の相対量を比較することにより、ＨＣＰ濃縮係数を計算できる。図５は、１つのＨＣＰペプチド、ＬＡＹＩＮＰＤＬＡＥＥＫのＰＲＭシグナル変化を示す。シグナルの１００倍を超える増加が観察され、抗体をフィルタで除去することにより、相対存在量が１４ｐｐｍから１６２８ｐｐｍに増加した（図５）。フィルタで抗体の大部分を除去することにより、濾過された溶液の濃度範囲が大幅に減少し、ＨＣＰの相対濃度がはるかに高くなり、後続のＭＳ分析で確認できる。
濾過プロセスで発生する試料還元または逆ＨＣＰ濃縮の正確な量を評価するために、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）をターゲットＭＳアプローチで実行し、濾過法によってＨＣＰ濃縮係数を計算した。濾過前後の個々のＨＣＰペプチドと抗体ペプチド（ｍＡｂ１の場合）の相対量を比較することにより、ＨＣＰ濃縮係数を計算できる。図５は、１つのＨＣＰペプチド、ＬＡＹＩＮＰＤＬＡＥＥＫのＰＲＭシグナル変化を示す。シグナルの１００倍を超える増加が観察され、抗体をフィルタで除去することにより、相対存在量が１４ｐｐｍから１６２８ｐｐｍに増加した（図５）。フィルタで抗体の大部分を除去することにより、濾過された溶液の濃度範囲が大幅に減少し、ＨＣＰの相対濃度がはるかに高くなり、後続のＭＳ分析で確認できる。
実施例４
ＨＣＰ同定法の検出限界を評価するために、スパイクイン実験を実施した。０．１～２００ｐｐｍの範囲の様々な濃度の、１１個のＣＨＯタンパク質と１個のヒトタンパク質を含む１２個のタンパク質を、非常に低レベルのＨＣＰを持つ１つの精製モノクローナル抗体（ｍＡｂ１）にスパイクした。ＭＷカットオフフィルタのサイズ影響の評価が行われたため、１２個の選択されたタンパク質は、濃度だけでなく、分子量／サイズも、１４．６ＫＤａから８６．５ＫＤａの範囲で様々であった（表３）。結果は、ＭＷカットオフ濾過が適用されたときにサイズが重要であったことを示した。ＰＬＢＤ２及びヒトＰＣＳＫ９は、それぞれ６５．５ＫＤａと７４．３ＫＤａのサイズのタンパク質であり、５０ＫＤａのカットオフをはるかに上回っている。５０ＫＤａのカットオフ濾過後、両方のタンパク質は検出されなかった。ただし、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＭｕ６（８６．５ＫＤａ）などのより大きな分子の量が非常に多い場合、ＭＷカットオフ分子量よりも高いにもかかわらずタンパク質がフィルタを通過する可能性がある。これはまた、抗体が常にフィルタ遮断に耐えることができる理由を説明することができる。低レベルのスパイクインタンパク質では４つの固有のペプチドを含む０．５ｐｐｍの酸性セラミダーゼに対して、１ｐｐｍのトランスサイレチンでは１つの固有のペプチドのみが検出された。通常、ショットガンプロテオミクス分析では、小さいサイズのタンパク質は大きいタンパク質よりもはるかに少ないペプチドを生成するため、小さいサイズのタンパク質は検出される可能性が低くなる。このような高い信頼性の同定のもう１つの理由は、酸性セラミダーゼからのいくつかの特定のトリプシンペプチドの高いイオン化効率に寄与し得る。それにもかかわらず、ＨＣＰ同定法は、濾過法の検出限界が０．５～１ｐｐｍの範囲にあることを示している。
ＨＣＰ同定法の検出限界を評価するために、スパイクイン実験を実施した。０．１～２００ｐｐｍの範囲の様々な濃度の、１１個のＣＨＯタンパク質と１個のヒトタンパク質を含む１２個のタンパク質を、非常に低レベルのＨＣＰを持つ１つの精製モノクローナル抗体（ｍＡｂ１）にスパイクした。ＭＷカットオフフィルタのサイズ影響の評価が行われたため、１２個の選択されたタンパク質は、濃度だけでなく、分子量／サイズも、１４．６ＫＤａから８６．５ＫＤａの範囲で様々であった（表３）。結果は、ＭＷカットオフ濾過が適用されたときにサイズが重要であったことを示した。ＰＬＢＤ２及びヒトＰＣＳＫ９は、それぞれ６５．５ＫＤａと７４．３ＫＤａのサイズのタンパク質であり、５０ＫＤａのカットオフをはるかに上回っている。５０ＫＤａのカットオフ濾過後、両方のタンパク質は検出されなかった。ただし、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼＭｕ６（８６．５ＫＤａ）などのより大きな分子の量が非常に多い場合、ＭＷカットオフ分子量よりも高いにもかかわらずタンパク質がフィルタを通過する可能性がある。これはまた、抗体が常にフィルタ遮断に耐えることができる理由を説明することができる。低レベルのスパイクインタンパク質では４つの固有のペプチドを含む０．５ｐｐｍの酸性セラミダーゼに対して、１ｐｐｍのトランスサイレチンでは１つの固有のペプチドのみが検出された。通常、ショットガンプロテオミクス分析では、小さいサイズのタンパク質は大きいタンパク質よりもはるかに少ないペプチドを生成するため、小さいサイズのタンパク質は検出される可能性が低くなる。このような高い信頼性の同定のもう１つの理由は、酸性セラミダーゼからのいくつかの特定のトリプシンペプチドの高いイオン化効率に寄与し得る。それにもかかわらず、ＨＣＰ同定法は、濾過法の検出限界が０．５～１ｐｐｍの範囲にあることを示している。
実施例４
このメソッドの再現性を評価するために、ＮＩＳＴ標準を使用した重複実験を実施した。合計で、タンパク質の９７％に相当する３２６個のタンパク質及び９４％のペプチドに相当する１１１８個のペプチドが、両方の実行でそれぞれ同定された（図６）。再現性の高い結果は、ＨＣＰ研究で重要なタンパク質同定の信頼性が高いことも示している。両方の実行で各ペプチドの相対量を定量化するために、ラベルフリー定量を実施した。本方法を表す０．９７を超えるピアソン相関は、ほとんど変動せずに再現性が高くなっている（図７）。
このメソッドの再現性を評価するために、ＮＩＳＴ標準を使用した重複実験を実施した。合計で、タンパク質の９７％に相当する３２６個のタンパク質及び９４％のペプチドに相当する１１１８個のペプチドが、両方の実行でそれぞれ同定された（図６）。再現性の高い結果は、ＨＣＰ研究で重要なタンパク質同定の信頼性が高いことも示している。両方の実行で各ペプチドの相対量を定量化するために、ラベルフリー定量を実施した。本方法を表す０．９７を超えるピアソン相関は、ほとんど変動せずに再現性が高くなっている（図７）。
実施例５
他の研究者が利用できない特定のバイオ医薬品のＨＣＰを特性決定するために、多くの強力な質量分析ベースのアプローチが公開されているため、様々な方法で結果を直接比較することはほとんど不可能である。最近、Ｄｏｎｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．（上記）及びＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（上記）の両方は、ＮＩＳＴ抗体標準ＲＭ ８６７０にメソッドを適用し、それぞれ１４と５９の高信頼性ＨＣＰを同定した。直接比較を容易にするために、ＮＩＳＴ ＲＭ ８６７０標準でＨＣＰを特性決定するＨＣＰ同定法を実施した。１６４のマウスタンパク質が高い信頼性で同定され（２つ以上のペプチド）、偽陽性率は０．０１以下であった。図８に示すように、Ｄｏｎｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．（上記）及びＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（上記）によってそれぞれ検出された１４ＨＣＰのうち１３、及び５９ＨＣＰのうち４５が同定された。これらのメソッドにより同定されていないタンパク質は、分子量が５０ＫＤａ超のものか、または曖昧な存在量の少ない標的である（表４）。要約すると、ＨＣＰ同定法によって同定されたＮＩＳＴ抗体標準の１１９個のマウスＨＣＰは、以前の２つの研究では報告されていない。その中で、１１９個のタンパク質のうち３８個には、５個を超える固有のペプチドが含まれ、３個以上のペプチドには９０個が含まれている。
他の研究者が利用できない特定のバイオ医薬品のＨＣＰを特性決定するために、多くの強力な質量分析ベースのアプローチが公開されているため、様々な方法で結果を直接比較することはほとんど不可能である。最近、Ｄｏｎｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．（上記）及びＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（上記）の両方は、ＮＩＳＴ抗体標準ＲＭ ８６７０にメソッドを適用し、それぞれ１４と５９の高信頼性ＨＣＰを同定した。直接比較を容易にするために、ＮＩＳＴ ＲＭ ８６７０標準でＨＣＰを特性決定するＨＣＰ同定法を実施した。１６４のマウスタンパク質が高い信頼性で同定され（２つ以上のペプチド）、偽陽性率は０．０１以下であった。図８に示すように、Ｄｏｎｅａｎｕ ｅｔ ａｌ．（上記）及びＨｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（上記）によってそれぞれ検出された１４ＨＣＰのうち１３、及び５９ＨＣＰのうち４５が同定された。これらのメソッドにより同定されていないタンパク質は、分子量が５０ＫＤａ超のものか、または曖昧な存在量の少ない標的である（表４）。要約すると、ＨＣＰ同定法によって同定されたＮＩＳＴ抗体標準の１１９個のマウスＨＣＰは、以前の２つの研究では報告されていない。その中で、１１９個のタンパク質のうち３８個には、５個を超える固有のペプチドが含まれ、３個以上のペプチドには９０個が含まれている。
実施例６
ＮＩＳＴでの既知及び新規のＨＣＰの検証は、並列反応モニタリングによって実行された。
ＮＩＳＴでの既知及び新規のＨＣＰの検証は、並列反応モニタリングによって実行された。
ＨＣＰ同定法によって見出されたターゲットを検証するために、２７個の同定されたＮＩＳＴ ＨＣＰがランダムに選択され、ＰＲＭ分析の対象となった。濾過処理の前後でこれらのＨＣＰのペプチドシグナルを比較することにより、これらのタンパク質の検証が提供され、このメソッドの効率が向上した。選択した全てのターゲットは、ＨＣＰ同定法により２～１２０倍濃縮されていることが分かった（表５及び６）。表５に、他の２つの研究により同定されたターゲットを列挙する。選択されたターゲットの７０％は、直接分解試料で１ｐｐｍを超えると測定され、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（上記）の結果と一致しており、ターゲットの８０％超えが１ｐｐｍ以上であることが判明した。表６に、ＨＣＰ同定法のみで検出された新規ターゲットを示す。結果は明らかに劇的に改善された効力を示した。測定されたタンパク質のほとんどは、濾過処理前は０．５ｐｐｍ未満であった。しかし、濾過後、タンパク質の相対濃度が増加したため、簡単に検出できた。これらの低存在量のタンパク質の有効性の改善は顕著であり、ほとんどが１００倍を超え、一部は１０００倍の改善が見られる。存在量の少ないターゲットがより多く同定された事実は、本方法の重要な要素であるダイナミックレンジの減少の重要性を示唆している。抗体とそれに関連するＨＣＰによって構成されるダイナミックレンジは、３桁減少し、約８桁から５桁に減少したため、ＨＣＰ信号が拡大される。
上記の例は、分子量カットオフ濾過の１つのステップと、それに続くショットガンプロテオミクスなどの基本的なプロテオミクスアプローチを適用することにより、目的のタンパク質を有する試料マトリックス内のＨＣＰを特定する簡単かつ強力な方法を示している。この手順は、試料マトリックス内の目的のタンパク質の大部分を除去するために正常に使用できるため、試料マトリックス内のダイナミックレンジが劇的に減少し、存在量の少ないＨＣＰの検出が大幅に向上する。
Claims (33)
- 目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定するための方法であって、
前記目的のタンパク質から前記宿主細胞タンパク質を解離させることと、
前記解離した宿主細胞タンパク質を、分子量カットオフフィルタを使用して濾過することと、
前記濾過された宿主細胞タンパク質を加水分解剤に接触させることと、
前記宿主細胞タンパク質を同定することと
を含む、方法。 - 前記タンパク質解離が、タンパク質解離剤を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
- 前記濾過された宿主細胞タンパク質をタンパク質還元剤に接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 前記濾過された宿主細胞タンパク質をタンパク質アルキル化剤に接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 前記濾過された宿主細胞タンパク質を遠心分離することを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 前記宿主細胞タンパク質を約１３０００ｒｐｍで約８分間遠心分離することを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質が抗体である、請求項１に記載の方法。
- 前記目的のタンパク質が治療用抗体である、請求項１に記載の方法。
- ステップ（ｃ）の前記宿主細胞タンパク質の同定が、質量分析計を使用して実施される、請求項１に記載の方法。
- 前記質量分析計が、液体クロマトグラフィーシステムに結合されている、請求項９に記載の方法。
- 前記液体クロマトグラフィーシステムが、ナノ液体クロマトグラフィーシステムである、請求項１０に記載の方法。
- 前記質量分析計がタンデム質量分析計である、請求項９に記載の方法。
- 前記タンパク質解離剤がデオキシコール酸ナトリウムを含む、請求項２に記載の方法。
- 前記タンパク質解離剤がＮ－ラウロイルサルコシンを含む、請求項２に記載の方法。
- 前記タンパク質加水分解剤がトリプシンである、請求項１に記載の方法。
- 前記タンパク質還元剤がＴＣＥＰである、請求項３に記載の方法。
- 前記タンパク質アルキル化剤がＣＡＡである、請求項４に記載の方法。
- 前記分子量カットオフフィルタが約１００ＫＤａのカットオフを有する、請求項１に記載の方法。
- 前記分子量カットオフフィルタが約５０ＫＤａのカットオフを有する、請求項１に記載の方法。
- 前記タンパク質解離剤が分解性である、請求項１に記載の方法。
- 前記宿主細胞タンパク質の検出限界が少なくとも約１ｐｐｍである、請求項１に記載の方法。
- 前記濾過ステップが、前記解離した宿主細胞タンパク質を少なくとも約５０倍濃縮する、請求項１に記載の方法。
- 宿主細胞タンパク質の検出限界が、分子量カットオフフィルタを使用して前記解離した宿主細胞タンパク質を濾過するためのステップを含まない別の方法の検出限界よりも少なくとも約５倍優れている、請求項１に記載の方法。
- 目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定するための方法であって、
前記目的のタンパク質から前記宿主細胞タンパク質を解離させることと、
前記解離した宿主細胞タンパク質を、分子量カットオフフィルタを使用して濾過することと、
前記宿主細胞タンパク質を同定することと
を含む、方法。 - 前記濾過ステップが、前記解離した宿主細胞タンパク質を少なくとも約５０倍濃縮する、請求項２５に記載の方法。
- 前記宿主細胞タンパク質の同定が、質量分析計を使用して実施される、請求項２５に記載の方法。
- 目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定するための方法であって、
前記目的のタンパク質から前記宿主細胞タンパク質を、タンパク質解離剤を使用して解離させることと、
前記解離した宿主細胞タンパク質を、分子量カットオフフィルタを使用して濾過することと、
前記宿主細胞タンパク質を同定することと
を含む、方法。 - 目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定するための方法であって、
前記目的のタンパク質から前記宿主細胞タンパク質を、タンパク質解離剤を使用して解離させることと、
前記解離した宿主細胞タンパク質を、分子量カットオフフィルタを使用して濾過することと、
前記宿主細胞タンパク質を質量分析計を使用して同定することと
を含む、方法。 - 目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定するための方法であって、
前記目的のタンパク質から前記宿主細胞タンパク質を、タンパク質解離剤を使用して解離させることと、
前記解離した宿主細胞タンパク質を分子量カットオフフィルタを使用して濾過することであって、前記濾過が、前記解離した宿主細胞タンパク質を少なくとも約５０倍濃縮する、前記濾過することと、
前記宿主細胞タンパク質を同定することと
を含む、方法。 - 目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定するための方法であって、
前記目的のタンパク質から前記宿主細胞タンパク質を、タンパク質解離剤を使用して解離させることと、
前記解離した宿主細胞タンパク質を分子量カットオフフィルタを使用して濾過することであって、前記濾過が、前記解離した宿主細胞タンパク質を少なくとも約５０倍濃縮する、前記濾過することと、
前記宿主細胞タンパク質を質量分析計を使用して同定することと
を含む、方法。 - 目的のタンパク質を有する試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定するための方法であって、
前記目的のタンパク質から前記宿主細胞タンパク質を、タンパク質解離剤を使用して解離させることと、
前記解離した宿主細胞タンパク質を分子量カットオフフィルタを使用して濾過することであって、前記濾過が、前記解離した宿主細胞タンパク質を少なくとも約５０倍濃縮する、前記濾過することと、
前記濾過された宿主細胞タンパク質を加水分解剤に接触させることと、
前記宿主細胞タンパク質を質量分析計を使用して同定することと
を含む、方法。 - 試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定するための方法であって、
前記宿主細胞タンパク質を有する前記試料マトリックスをタンパク質解離剤に接触させることと、
前記解離した宿主細胞タンパク質を、分子量カットオフフィルタを使用して濾過することと、
前記濾過された宿主細胞タンパク質を加水分解剤に接触させることと、
前記宿主細胞タンパク質を同定することと
を含む、方法。 - 試料マトリックス中の宿主細胞タンパク質を同定するための方法であって、
前記宿主細胞タンパク質及び目的のタンパク質を有する前記試料マトリックスをタンパク質解離剤に接触させることであって、前記タンパク質解離剤が、前記目的のタンパク質を変性させる、前記接触させることと、
前記宿主細胞タンパク質を、分子量カットオフフィルタを使用して濾過することと、
前記濾過された宿主細胞タンパク質を加水分解剤に接触させることと、
前記宿主細胞タンパク質を同定することと
を含む、方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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