CN117169519B - 用于检测样本中tt3和/或tt4的解离剂和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测样本中TT3和/或TT4的解离剂和试剂盒，所使用的解离剂能够很好地将血清中结合态的T3、T4从各自的结合蛋白中解离出来，使之成为游离态后，利用荧光免疫层析法检测血清中的TT3和TT4，从而提高荧光免疫层析平台检测TT3和TT4的灵敏度及准确性。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种用于检测样本中TT3和/或TT4的解离剂和试剂盒。
背景技术
三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）是甲状腺分泌的主要产物，也是构成下丘脑-垂体前叶-甲状腺调节系统完整性不可缺少的成分，对合成代谢有影响作用，是临床甲状腺功能项目检测中的重要组成部分。T3和T4可以辅助诊断甲状腺癌。在人体血液中99%以上的T3和T4与各自的结合蛋白结合，主要是与甲状腺结合球蛋白（TBG）和少量的白蛋白以及甲状腺素结合前白蛋白（TBPA）结合。结合状态的T3和T4很难被检测，解离剂的主要作用是将结合状态下的T3及T4从各自的结合蛋白中解离出来，成为游离态的分子，以方便相关试剂对其进行检测。解离的程度与实际检测的准确性密切相关。因此，在检测血清中的总T3（TT3）及总T4（TT4）时，必须将结合形式的T3或T4分子全部解离出来， 这样才能得到准确的血清中TT3或TT4的含量。
目前用于雅培、贝克曼等TT3/TT4化学发光试剂平台、艾康生物等TT3/TT4酶联免疫平台的解离剂主要成分为8-苯氨基-1-萘磺酸铵盐（ANS）。荧光免疫层析平台，作为可以定量检测被检物质的快速诊断技术，其荧光信号值决定了检测的准确性。ANS溶液自身有较强的荧光，对荧光免疫层析平台检测有一定背景干扰，导致灵敏度降低和结果不准确。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明提供的一种新的解离剂配方，能够很好地将血清中结合态的T3及T4从各自的结合蛋白中解离出来，然后通过测定游离态的T3或T4含量来获得样本临床实验数据，以提高TT3和TT4临床测量的灵敏度准确性。
本发明提供一种用于检测样本中TT3和/或TT4的解离剂，所述解离剂包括弹性蛋白酶和还原剂。
本发明还提供一种用于检测样本中TT3和/或TT4的试剂盒，所述试剂盒包括解离剂，所述解离剂包括弹性蛋白酶和还原剂。
弹性蛋白酶用于破坏甲状腺素结合蛋白和T3、T4的结合，从而将T3、T4从结合态中解离出来。在本发明的一些实施例中，弹性蛋白酶为来自猪胰腺的弹性蛋白酶。在本发明的一些实施例中，弹性蛋白酶的浓度为0.1～2g/L，还原剂的浓度为0.1～3g/L。
在本发明的一些实施例中，还原剂为二硫键还原剂，常用于蛋白中的二硫键还原，并且通过破坏T3和T4与各自的结合蛋白之间的结合，让T3和T4从结合状态中解离出来。进一步地，二硫键还原剂可选自二硫苏糖醇（DTT）、三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP-HCl）或其组合。
在本发明的一些实施例中，所述解离剂还包括表面活性剂。在本发明的一些实施例中，表面活性剂的浓度为0.5%～2%（v/v）。在本发明的一些实施例中，表面活性剂为非离子型表面活性剂。在本发明的一些实施例中，非离子型表面活性剂选自Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85、Triton X-100或其组合。
在本发明的一些实施例中，所述解离剂还包括缓冲液。在本发明的一些实施例中，缓冲液的pH为7.1～7.4。在本发明的一些实施例中，缓冲液选自PBS、Tris-HCl。
在本发明的一些实施例中，所述解离剂还包括N-杂环化合物。在本发明的一些实施例中，N-杂环化合物的浓度为0.1～2g/L。在本发明的一些实施例中，N-杂环化合物选自5-溴-2-甲基吡啶、3-溴-5-羟基吡啶或其组合。N-杂环化合物通过竞争结合血液等生物体液中各自的结合蛋白，使T3和T4解离出来，与此同时也可避免处于解离状态的T3、 T4再次结合各自的结合蛋白。
在本发明的一些实施例中，所述解离剂还包括防腐剂，防腐剂的浓度为0.1%～2%。在本发明的一些实施例中，防腐剂选自叠氮钠、硫柳汞、苯甲酸钠、Proclin-150、Proclin-200、Proclin-300、Proclin-5000或其组合。
在本发明的一些实施例中，所述试剂盒还包括甲状腺激素或其类似物与载体蛋白的偶联物和荧光标记物标记的甲状腺激素抗体，所述甲状腺激素选自T3、T4或其组合。在本发明的一些实施例中，甲状腺激素或其类似物与载体蛋白的偶联物包被在免疫层析试条的检测线上，荧光标记物标记的甲状腺激素抗体在检测时位于检测线的上游并且在加入样品后向检测线移动。
在本发明的一些实施例中，荧光标记物选自时间分辨荧光分子、时间分辨荧光微球、荧光化合物或有色荧光微球。在本发明的一些实施例中，荧光标记物为内部包裹着镧系元素或其螯合物的时间分辨荧光微球。此外，所述试剂盒还可包括测试卡和说明书等。
本发明还提供一种制备解离剂的方法，所述解离剂包括弹性蛋白酶、还原剂、表面活性剂、N-杂环化合物和缓冲液，在制备时，首先配制缓冲液并调整pH至7.1～7.4，接着加入弹性蛋白酶、还原剂、N-杂环化合物并搅拌混匀，待完全混匀溶解后再加入表面活性剂并搅拌混匀。
有益效果：（1）本发明提供一种新的解离剂配方，能够比较充分地将临床样本中结合形式的T3及T4从各自的结合蛋白中解离出来；（2）本发明发现现有技术中使用的含有ANS的解离剂在用于荧光层析平台中时会干扰荧光标记物在检测线上产生的荧光信号，背景荧光噪音较大，从而导致样本检测荧光信号值异常，对整体检测浓度产生较大偏差，采用本发明提供的一种新的解离剂配方不会干扰荧光标记物在检测线上产生的荧光信号，背景荧光噪音比较小，从而提高荧光免疫层析平台检测TT3和TT4的灵敏度及准确性，而且与雅培化学发光试剂检测值的临床相关性比较好。
附图说明
图1是本发明所使用的测试卡的分解示意图。
图2是本发明所使用的测试卡中的免疫分析条的示意图。
具体实施方式
如图1和图2所示，测试卡包括卡盖1、免疫分析试条2和卡座3。所使用的免疫分析试条2为免疫层析试条，包括依次搭接在一起的加样垫21、标记垫22、检测垫25和样本吸收垫26。检测垫25是由硝酸纤维素、玻璃纤维、聚醚砜或尼龙等材料制成，比如检测垫25为硝酸纤维素膜。检测垫25上面设有检测线23和对照线24。加样垫21由吸水性材料制成，可选用玻璃纤维或无纺布。标记垫22也由吸水性材料制成，可选用聚酯膜、玻璃纤维或无纺布。
免疫分析试条2还包括一个底部支撑层27，底部支撑层27由常见的聚氯乙烯等疏水性材料制成，确保样本不能从底部支撑层27中渗漏出去。检测垫25设置在底部支撑层27上。加样垫21设置在底部支撑层27上，加样垫21的一端与标记垫22部分重叠；标记垫22设置在底部支撑层27上，标记垫22的一端与加样垫21部分重叠，标记垫22的另一端与检测垫25部分重叠；样本吸收垫26设置在底部支撑层27上，由亲水性材料制成，可选自滤纸；样本吸收垫26的一端与检测垫25部分重叠。此外，在一些情形下，任何相邻两个垫之间的重叠区域长0.5～5毫米。
免疫分析试条2位于一个壳体内，壳体由卡盖1和卡座3经超声波焊接、卡扣或胶水粘结方法组合而成。在一些情形下，卡盖1和卡座3选用塑料材质。卡座3中间设有试纸槽32，用于放入免疫分析试条2。在一些情形下，卡盖1上设有多个向下延伸的卡扣（图上未显示），卡座3上设有多个向上延伸的卡槽31，卡盖1上设置的卡扣和卡座3上设置的卡槽31一一对应，从而使得在将卡盖1、免疫分析试条2和卡座3组装在一起时，卡盖1和卡座3可牢固地固定在一起，并将免疫分析试条2固定在试纸槽32中。在一些情形下，卡盖1上的多个卡扣对称地分布在卡盖1的两侧，卡座3上的多个卡槽31对称地分布在卡座3的两侧。
卡盖1上还设有样本加入口11和观察窗12。当通过往样本加入口11加入临床样本时，样本进入位于样本加入口11下方的加样垫21，在毛细管作用下，样本沿着免疫分析试条2的长度方向向样本吸收垫26迁移。观察窗12设置在检测垫25的检测线23和对照线24的上方。外部光源发出的激发光可通过透明或半透明的观察窗12照射到免疫分析试条2的检测线23和对照线24上。经激发光照射后，检测线23和对照线24上的荧光标记物发出的发射光也可通过观察窗12输出到检测器。
在检测时，测试卡插入到分析仪的测试卡插入口中。在将临床样本添加到测试卡后，在分析仪外面反应时间一段后再插入到分析仪中进行检测，或者在将临床样本添加测试卡后立刻插入到分析仪中，然后在分析仪中反应一段时间后再进行检测。本发明所使用的分析仪可选用市面上销售的分析仪，比如干式荧光免疫分析仪FIC-Q100N（苏州和迈精密仪器有限公司）。
根据待测分析物（比如抗原、抗体或半抗原）的不同和免疫检测原理的不同，标记垫22和检测线上包被的物质会存在变化。这里以待测的分析物为TT3、检测原理为竞争法为例进行说明，标记垫22上包被着荧光标记物标记的T3抗体和荧光标记物的兔IgG抗体，检测线23上包被着T3抗原与载体蛋白BSA的偶联物，对照线24上包被着羊抗兔IgG抗体，这样当通过样本加入口11给加样垫21添加事先经过解离剂处理的临床样本后，临床样本携带着荧光标记物标记的T3抗体以及荧光标记物标记的兔IgG抗体沿着免疫分析试条2的长度方向流动。当临床样本到达标记垫22时，荧光标记物标记的T3抗体与临床样本中的T3（如果存在的话）特异性结合，所形成的荧光标记物-T3抗体-T3复合物继续流动，检测线23上包被的T3-BSA偶联物会和临床样本中的T3竞争荧光标记物标记的T3抗体，经来自分析仪中的光源发出的激发光照射检测线23后可产生检测物信号。当流到对照线24上时，荧光标记物标记的兔IgG抗体与对照线24上包被的羊抗兔IgG抗体特异性结合形成的复合物固定在对照线24上，经来自分析仪中的光源发出的激发光照射对照线24后可产生对照信号。
鉴于本发明中的对照线产生的荧光信号也可仅起到指示加入的临床样本是否流到样本吸收垫26的作用，不参与分析物浓度的计算，因此，荧光标记物标记的兔IgG抗体中的荧光标记物也可以用乳胶微球、胶体金、胶体碳、胶体硒等有色胶体颗粒来代替。
本发明中使用的荧光标记物可以是时间分辨荧光标记物。时间分辨荧光标记物具有发光延时的特性，这意味着当外部光源发出的激发光关闭后，它们仍然能在一定时间内持续发出荧光。时间分辨荧光标记物可以分子形式存在，称为时间分辨荧光分子，可选自诸如钐(Sm(III))、镝(Dy(III))、铕(Eu(III))) 和铽(Tb(III)之类的镧系元素及其螯合物。一种适当的镧系元素螯合物为N-(对异硫氰基苯)-二乙烯三胺四乙酸-Eu+3。时间分辨荧光标记物也可以另一种形式存在：时间分辨荧光微球，即将时间分辨荧光分子包裹在天然的或人工合成的微球或微珠的内部或表面上。每个时间分辨荧光微球可包裹成千上万个荧光分子，有效地提高了检测灵敏度。本发明中的荧光标记物可选用直径为100nm～400nm的将铕螯合物包埋在内部且表面携带羧基的时间分辨荧光微球（苏州为度生物技术有限公司，货号FT0200CA），它的激发波长360nm，发射波长615nm。
本发明中使用的荧光标记物也可以是荧光化合物，当经合适波长的激发光照射可产生没有发光延时特性的荧光信号，可选自量子点；荧光素及其衍生物，比如异硫氰酸荧光素（FITC）；荧光蛋白及其改进型变体，比如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白等。
本发明中使用的荧光标记物也可以是有色荧光微球，即将没有发光延时特性的荧光化合物包裹在表面上或内部的微球或微珠，经合适波长的激发光照射可产生没有发光延时特性的荧光信号。有色发光微球可选自绿色荧光微球、蓝色荧光微球、红色荧光微球、黄色荧光微球和彩色荧光微球（发出多种特定颜色的荧光）。
不论是在时间分辨荧光微球中，还是在有色荧光微球中，形成微球或微珠的聚合物可选自聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯乙烯丙烯酸-乙烯三聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙基丙烯酸甲酯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡啶、聚二乙烯基苯、聚丁烯对苯二甲酸酯、丙烯腈、氯乙烯-丙烯酸酯等，或它们的醛基、羧基、 氨基、羟基、酰肼衍生物，或者它们的混合物。此外，微球或微珠的表面通常携带羟基、羧基、氨基、醛基、磺基等基团，可通过常规的化学偶联试剂与抗体或抗原或半抗原-载体蛋白偶联物偶联结合在一起。在一些情形下，时间分辨荧光微球的颗粒大小为20nm～100μm；有色荧光微球的颗粒大小为100nm～100μm。
以下实施例进一步说明本发明。这些实施例不是用来限制本发明范围，而是提供对本发明的进一步理解。
实施例1：解离剂配方
解离剂配方：弹性蛋白酶0.1～2g/L；还原剂 0.1～3g/L；N-杂环化合物0.1～2g/L；表面活性剂0.5%～2%（v/v）；pH 7.1～7.4的缓冲液。
配方1：1L去离子水中，0.1g弹性蛋白酶、1.0g DTT、2.0g 5-溴-2-甲基吡啶、Tween-40 0.5%（v/v）、缓冲液10mM PBS（pH 7.1～7.4）。
配方2：1L去离子水中，1.0g弹性蛋白酶、3.0g DTT 、0.1g 5-溴-2-甲基吡啶、Tween-40 0.5%（v/v）、缓冲液10mM PBS（pH 7.1～7.4）。
配方3：1L去离子水中，2.0g弹性蛋白酶、0.1g DTT、1.0g 3-溴-5-羟基吡啶、Tween-40 2%（v/v）、缓冲液10mM PBS（pH 7.1～7.4）。
另外，配方中的DTT还可用TCEP-HCl替代；配方中的表面活性剂还可选自Tween-20、Tween-21、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85及Triton X-100；配方中的缓冲液还可选自50mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.1～7.4）。
为了保持解离剂配方在储存时的稳定性，可在解离剂配方中添加防腐剂，所述防腐剂可选自叠氮钠、硫柳汞、苯甲酸钠、Proclin-150、Proclin-200、Proclin-300和Proclin-5000，其浓度可选择为0.1%～2%（v/v）。
实施例2：解离剂制备方法
一种用于检测人血清中TT3和TT4的解离剂制备方法，包括以下步骤：
首先配制实施例1中的缓冲液并调整pH至7.1～7.4，接着加入实施例1中的弹性蛋白酶、还原剂、N-杂环化合物和防腐剂并搅拌混匀，待完全混匀溶解后再加入表面活性剂并搅拌混匀。
实施例3: TT3性能检测
收集经雅培公司生产的总三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）（国械注进20142405914）配合雅培公司免疫分析仪ARCHITECT i2000定值的临床血清样本，共30例（包含低中高值），其中样本编号为1～30。每个样本用移液枪取40μL样本到5个样本反应管中，反应管编号为A、B、C、D、E加上样本编号，即为A1-A30、B1-B30、C1-C30、D1-D30、E1-E30。
在A组反应管中各加入100μL的实施例1中的解离剂配方1；
在B组反应管中各加入100μL的实施例1中的解离剂配方2；
在C组反应管中各加入100μL的实施例1中的解离剂配方3；
在D组反应管中各加入100μL的对照解离剂配方，具体配方如下：
1L去离子水中，0.5g EDTA、 2.5g 5-溴-2-甲基吡啶、2.5g 3-溴-5-羟基吡啶、1mlProclin-300、5ml Tween-40、10g ANS、1g柠檬酸钠。
在E组反应管中各加入100μL的常规处理液，具体配方如下：
在1L去离子水中加1ml Proclin-300、5ml Tween-40、2.9g磷酸氢二钠、0.296g磷酸二氢钠。
将上述反应管溶液混匀后，室温静置10分钟，然后用艾康生物技术（杭州）有限公司生产的总三碘甲状腺原氨酸（T3）定量检测试剂盒（荧光免疫分析法）试剂（货号F131-20211）配合苏州和迈精密仪器有限公司生产的干式荧光免疫分析仪（FIC-Q100N）分别进行检测，检测得到的结果与雅培公司生产的总三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）（国械注进20142405914）配合雅培公司免疫分析仪ARCHITECT i2000的定值结果（下称雅培化学发光检测值）进行对比分析，结果如表1所示。
表1 TT3对比实验结果（单位：nmol/L）
从表1的对比结果进行分析，结论如下:
1、用常规处理液（E组）处理临床血清样本后，测值结果普遍偏低较多，这是因为是临床样本中的大部分TT3没有被解离出来，从而无法被配对的抗体结合。比如30号样本，雅培化学发光试剂检测值为9.84 nmol/L，A组的检测值为9.11 nmol/L，B组的检测值为9.45nmol/L，C组的检测值为9.26 nmol/L，而E组的检测值仅为1.35 nmol/L。
2、含解离剂ANS的处理液（D组）处理临床样本以后，临床样本的检测值会普遍大于常规处理液（E组）处理后的临床样本的检测值，但因为ANS本身在荧光层析平台会干扰荧光的信号值，背景荧光噪音较大，从而导致临床样本检测荧光信号值异常，对整体检测浓度产生较大偏差。就与雅培化学发光试剂检测值的临床相关性而言，A-C组的相关性分别为0.9873，0.9880，0.9825，而D组的相关性仅为0.7304。
3、A-C组的解离剂处理临床样本后的检测值与雅培化学发光试剂检测值相关性较好，都大于0.95。这是因为A-C组配制出来的解离剂对临床样本中的TT3解离比较充分，且解离剂本身不会影响荧光信号值的检测。
实施例4: TT4性能检测
收集经雅培公司生产的总甲状腺素测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）（国械注进20162404093）配合仪器型号（ARCHITECT i2000）定值的临床血清样本，共30例（包含低中高值），其中样本编号为1～30。每个样本用移液枪取40μL样本到5个样本反应管中，反应管编号为A、B、C、D、E，加上样本编号，即为A1-A30、B1-B30、C1-C30、D1-D30、E1-E30。
在A组反应管中各加入100μL的实施例1中的解离剂配方1；
在B组反应管中各加入100μL的实施例1中的解离剂配方2；
在C组反应管中各加入100μL的实施例1中的解离剂配方3；
在D组反应管中各加入100μL的对照解离剂配方，具体配方如下：
1L去离子水中，0.5g EDTA、 2.5g 5-溴-2-甲基吡啶、2.5g 3-溴-5-羟基吡啶、1mlProclin-300、5ml Tween-40、10g ANS、1g柠檬酸钠。
在E组反应管中各加入100μL的常规处理液，具体配方如下：
在1L去离子水中加1ml Proclin-300、5ml Tween-40、2.9g磷酸氢二钠、0.296g磷酸二氢钠。
将上述反应管溶液混匀后，室温静置10分钟，然后用艾康生物技术（杭州）有限公司（货号F131-202311）注册的总甲状腺素（T4）定量检测试剂盒（荧光免疫分析法）试剂配合苏州和迈精密仪器有限公司生产的干式荧光免疫分析仪（FIC-Q100N）分别进行检测，检测得到的结果与雅培公司生产的总甲状腺素测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）（国械注进20162404093）配合雅培公司免疫分析仪ARCHITECT i2000的定值结果（下称雅培化学发光检测值）进行对比分析，结果如表2所示。
表2 TT4对比实验结果（单位：nmol/L）
从表2的对比结果进行分析，结论如下:
1、用常规处理液（E组）处理临床血清样本后，测值结果普遍偏低较多，这是因为是临床样本中的大部分TT4没有被解离出来，从而无法被配对的抗体结合。如26号样本，雅培化学发光试剂检测值为196.82nmol/L，A组的检测值为215.00 nmol/L，B组的检测值为195.65nmol/L，C组的检测值为231.70 nmol/L,而E组的检测值仅为1.72nmol/L。
2、含解离剂ANS的处理液（D组）处理样本以后，临床样本的测值会普遍大于常规处理液（E组）处理后的临床样本的检测值，但因为ANS本身在荧光层析平台会干扰荧光的信号值，背景荧光噪音较大，从而导致样本检测荧光信号值异常，对整体检测浓度产生较大偏差。就与雅培化学发光试剂检测值的临床相关性而言，A-C组的相关性分别为0.9819、0.9797和0.9778，而D组的相关性仅为0.7796。
2、含解离剂ANS的处理液（D组）处理临床样本以后，临床样本的检测值会普遍大于常规处理液（E组）处理后的临床样本的检测值，但因为ANS本身在荧光层析平台会干扰荧光的信号值，背景荧光噪音较大，从而导致临床样本检测荧光信号值异常，对整体检测浓度产生较大偏差。就与雅培化学发光试剂检测值的临床相关性而言，A-C组的相关性分别为0.9873，0.9880，0.9825，而D组的相关性仅为0.7304。
3、A-C组的解离剂处理临床样本后的检测值与雅培化学发光试剂检测值相关性较好，都大于0.95。这是因为A-C组配制出来的解离剂对临床样本中的TT4解离比较充分，且解离剂本身不会影响荧光信号值的检测。
实施例5：还原剂评估实验
配方4：1L去离子水中，0.1g弹性蛋白酶、1.0g TCEP-HCl 、2.0g 5-溴-2-甲基吡啶、Tween-40 0.5%（v/v）、缓冲液10mM PBS（pH 7.1～7.4）。
配方5：1L去离子水中，0.1g弹性蛋白酶、3.0g TCEP-HCl 、2.0g 5-溴-2-甲基吡啶、Tween-40 0.5%（v/v）、缓冲液10mM PBS（pH 7.1～7.4）。
收集雅培公司总三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）（国械注进20142405914）配合雅培公司免疫分析仪ARCHITECT i2000定值的新鲜临床血液样本各15例，要求浓度分布均匀。然后按照实施3中的TT3性能检测方法检测，不同之处在于只选择三个反应管，而且往A组反应管中添加100μL实施例1中的解离剂配方1，往B组反应管中添加100μL解离剂配方4，往B组反应管中添加100μL解离剂配方5。结果如表3所示。
表3 还原剂评估实验结果（单位：nmol/L）
由表3可知，在选择解离剂配方1、配方4和配方5后利用荧光免疫分析法计算的浓度值与雅培化学发光检测值的相关系数均大于0.95，这说明解离剂配方1、配方4和配方5能够充分地解离样品中的TT3，从而使得检测出的样品中TT3值较为准确。
收集经雅培公司生产的总甲状腺素测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）（国械注进20162404093）配合仪器型号（ARCHITECT i2000）定值的新鲜临床血液样本各15例，要求浓度分布均匀。然后按照实施4中的TT4性能检测方法检测，不同之处在于只选择三个反应管，而且往A组反应管中添加100μL实施例1中的解离剂配方1，往B组反应管中添加100μL解离剂配方4，往B组反应管中添加100μL解离剂配方5。结果如表4所示。
表4 还原剂评估实验结果（单位：nmol/L）
由表4可知，在选择解离剂配方1、配方4和配方5后利用荧光免疫分析法计算的浓度值与雅培化学发光检测值的相关系数均大于0.95，这说明解离剂配方1、配方4和配方5能够充分地解离样品中的TT4，从而使得检测出的样品中TT4值较为准确。
实施例6：表面活性剂评估实验
配方6：1L去离子水中，0.1g弹性蛋白酶、1.0g DTT、2.0g 5-溴-2-甲基吡啶、Tween-20 0.5%（v/v）、缓冲液10mM PBS（pH 7.1～7.4）。
配方7：1L去离子水中，0.1g弹性蛋白酶、1.0g DTT、2.0g 5-溴-2-甲基吡啶、Triton X-100 0.5%（v/v）、缓冲液10mM PBS（pH 7.1～7.4）。
收集雅培公司总三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）（国械注进20142405914）配合雅培公司免疫分析仪ARCHITECT i2000定值的新鲜临床血液样本各15例，要求浓度分布均匀。然后按照实施3种的TT3性能检测方法检测，不同之处在于只选择三个反应管，而且往A组反应管中添加100μL实施例1中的解离剂配方1，往B组反应管中添加100μL解离剂配方6，往B组反应管中添加100μL解离剂配方7。结果如表5所示。
表5表面活性剂评估实验结果（单位：nmol/L）
由表5可知，在选择解离剂配方1、配方6和配方7后利用荧光免疫分析法计算的浓度值与雅培化学发光检测值的相关系数均大于0.95，这说明解离剂配方1、配方6和配方7能够充分地解离样品中的TT3，从而使得检测出的样品中TT3值较为准确。
收集经雅培公司生产的总甲状腺素测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）（国械注进20162404093）配合仪器型号（ARCHITECT i2000）定值的新鲜临床血液样本各15例，要求浓度分布均匀。然后按照实施4中的TT4性能检测方法检测，不同之处在于只选择三个反应管，而且往A组反应管中添加100μL实施例1中的解离剂配方1，往B组反应管中添加100μL解离剂配方6，往B组反应管中添加100μL解离剂配方7。结果如表6所示。
表6 表面活性剂评估实验结果（单位：nmol/L）
由表6可知，在选择解离剂配方1、配方4和配方5后利用荧光免疫分析法计算的浓度值与雅培化学发光检测值的相关系数均大于0.95，这说明解离剂配方1、配方6和配方7能够充分地解离样品中的TT4，从而使得检测出的样品中TT4值较为准确。
实施例7：缓冲液评估实验
配方8：1L去离子水中，0.1g弹性蛋白酶、1.0g DTT、2.0g 5-溴-2-甲基吡啶、Tween-40 1.0%（v/v）、缓冲液50mM Tris-HCl（pH 7.1～7.4）。
收集雅培公司总三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）（国械注进20142405914）配合雅培公司免疫分析仪ARCHITECT i2000定值的新鲜临床血液样本各15例，要求浓度分布均匀。然后按照实施3中的TT3性能检测方法检测，不同之处在于只选择两个反应管，而且往A组反应管中添加100μL实施例1中的解离剂配方1，往B组反应管中添加100μL解离剂配方8。结果如表7所示。
表7缓冲液评估实验结果（单位：nmol/L）
由表7可知，在选择解离剂配方1和配方8后利用荧光免疫分析法计算的浓度值与雅培化学发光检测值的相关系数均大于0.95，这说明解离剂配方1和配方8能够充分地解离样品中的TT3，从而使得检测出的样品中TT3值较为准确。
收集经雅培公司生产的总甲状腺素测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）（国械注进20162404093）配合仪器型号（ARCHITECT i2000）定值的新鲜临床血液样本各15例，要求浓度分布均匀。然后按照实施4中的TT4性能检测方法检测，不同之处在于只选择三个反应管，而且往A组反应管中添加100μL实施例1中的解离剂配方1，往B组反应管中添加100μL解离剂配方8。结果如表8所示。
表8 缓冲液评估实验结果（单位：nmol/L）
由表8可知，在选择解离剂配方1和配方8后利用荧光免疫分析法计算的浓度值与雅培化学发光检测值的相关系数均大于0.95，这说明解离剂配方1和配方8能够充分地解离样品中的TT4，从而使得检测出的样品中TT4值较为准确。
实施例8：解离剂评估实验
配方9：1L去离子水中，0.1g弹性蛋白酶、Tween-40 0.5%（v/v）、缓冲液10mM PBS（pH 7.1～7.4）；
配方10：1L去离子水中，1.0g弹性蛋白酶、Tween-40 0.5%（v/v）、缓冲液10mM PBS（pH 7.1～7.4）；
配方11：1L去离子水中，0.1g弹性蛋白酶、0.1g DTT、Tween-40 0.5%（v/v）、缓冲液10mM PBS（pH 7.1～7.4）；
配方12：1L去离子水中，0.1g弹性蛋白酶、1.0g DTT、Tween-40 0.5%（v/v）、缓冲液10mM PBS（pH 7.1～7.4）；
配方13：1L去离子水中，1.0g弹性蛋白酶、0.1g DTT、Tween-40 0.5%（v/v）、缓冲液10mM PBS（pH 7.1～7.4）；
配方14：1L去离子水中，1.0g弹性蛋白酶、1.0g DTT、Tween-40 0.5%（v/v）、缓冲液10mM PBS（pH 7.1～7.4）。
收集雅培公司总三碘甲状腺原氨酸测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）（国械注进20142405914）配合雅培公司免疫分析仪ARCHITECT i2000定值的新鲜临床血液样本各5例，要求浓度分布均匀。然后按照实施3中的TT3性能检测方法检测，不同之处在于只选择6个反应管，而且往A、B、C、D、E、F组反应管中添加100μL解离剂配方9、10、11、12、13和14，往G组反应管中添加100μL实施例3中的对照解离剂配方。结果如表9所示。
表9 解离剂评估实验结果（单位：nmol/L）
由表9可知，总体而言，相比于对照解离剂配方，解离剂配方11～14均可使得检测的TT3值在准确性方面显著提高。
收集经雅培公司生产的总甲状腺素测定试剂盒（化学发光微粒子免疫检测法）（国械注进20162404093）配合仪器型号（ARCHITECT i2000）定值的新鲜临床血液样本各5例，要求浓度分布均匀。然后按照实施3中的TT4性能检测方法检测，不同之处在于只选择6个反应管，而且往A、B、C、D、E、F组反应管中添加100μL解离剂配方9、10、11、12、13和14，往G组反应管中添加100μL实施例3中的对照解离剂配方。结果如表10所示。
表10 解离剂评估实验结果（单位：nmol/L）
由表10可知，总体而言，相比于对照解离剂配方，解离剂配方11～14均可使得检测的TT4值在准确性方面显著提高。
Claims (19)
1.一种用于检测样本中TT3和/或TT4的解离剂，其特征在于，所述解离剂包括二硫键还原剂、非离子型表面活性剂、pH为7.1~7.4的缓冲液以及用于破坏甲状腺素结合蛋白与T3、T4的结合从而将T3、T4从结合态中解离出来的弹性蛋白酶。
2.如权利要求1所述的解离剂，其特征在于，弹性蛋白酶的浓度为0.1～2g/L，还原剂的浓度为0.1～3g/L。
3.如权利要求1所述的解离剂，其特征在于，二硫键还原剂选自二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
4.如权利要求1所述的解离剂，其特征在于，非离子型表面活性剂的浓度为0.5%～2%（v/v）。
5. 如权利要求4所述的解离剂，其特征在于，非离子型表面活性剂选自Tween-20、Tween-21、Tween-40、Tween-60、Tween-61、Tween-80、Tween-81、Tween-85、Triton X-100或其组合。
6.如权利要求1所述的解离剂，其特征在于，缓冲液选自PBS、Tris-HCl。
7.如权利要求1所述的解离剂，其特征在于，所述解离剂还包括N-杂环化合物。
8.如权利要求7所述的解离剂，其特征在于，N-杂环化合物的浓度为0.1～2g/L。
9.如权利要求7所述的解离剂，其特征在于，N-杂环化合物选自5-溴-2-甲基吡啶、3-溴-5-羟基吡啶或其组合。
10.如权利要求1所述的解离剂，其特征在于，所述解离剂还包括防腐剂，防腐剂的浓度为0.1%～2%。
11.如权利要求1所述的解离剂，其特征在于，弹性蛋白酶为来自猪胰腺的弹性蛋白酶。
12.一种用于检测样本中TT3和/或TT4的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～11中任意一项所述的解离剂。
13.如权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括甲状腺激素与载体蛋白的偶联物和荧光标记物标记的甲状腺激素抗体，所述甲状腺激素选自T3、T4或其组合。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，甲状腺激素与载体蛋白的偶联物包被在免疫层析试条的检测线上，荧光标记物标记的甲状腺激素抗体在检测时位于检测线的上游并且在加入样品后向检测线移动。
15.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，荧光标记物为时间分辨荧光分子。
16.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，荧光标记物为时间分辨荧光微球。
17.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，荧光标记物为荧光化合物。
18.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，荧光标记物为有色荧光微球。
19.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，荧光标记物为内部包裹着铕螯合物的时间分辨荧光微球。
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