CN109001462A

CN109001462A - 一种同型半胱氨酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN109001462A
Application number: CN201810723602.8A
Authority: CN
Inventors: 王贤理; 池万余; 王伊琳; 邓慰; 卢强
Original assignee: ZHEJIANG YILIKANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: ZHEJIANG YILIKANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2018-07-04
Filing date: 2018-07-04
Publication date: 2018-12-14

Abstract

本发明涉及体外诊断技术领域，尤其是一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2，试剂R1组分为丝氨酸0.5‑20mmol/L、HCY还原剂0.5‑10mmol/L、NADH 0.5‑1.8g/L、LDH 10‑200KU/L、缓冲液20‑100mmol/L；试剂R2组分为胱硫醚β‑合成酶0.5‑10KU/L、胱硫醚β‑分解酶10‑50KU/L、缓冲液20‑100mmol/L。本试剂盒用于体外定量检测人血清中同型半胱氨酸(Hcy)的含量，Hcy与心血管疾病密切相关，是心血管疾病发病的一个重要危险因子，用于心血管疾病危险因素的辅助诊断，并指导临床治疗。具有稳定性好、使用方便、制备简单的优点。

Description

一种同型半胱氨酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及半胱氨酸检测技术领域，尤其涉及一种同型半胱氨酸检测试剂盒。

背景技术

同型半胱氨酸(又称高半胱氨酸，homocysteine,Hcy)是蛋氨酸代谢过程中的中间产物。同型半胱氨酸在体内的分解代谢，受两方面因素影响最大。一是与先天遗传有关的某些生物酶的缺乏，另一个就是体内叶酸、维生素B6、维生素B12等营养元素的缺乏。这两种缺乏都会影响同型半胱氨酸转化为其他物质，导致高同型半胱氨酸血症。Hcy的测定，对心血管疾病、尿毒症、动脉粥样硬化、糖尿病、老年痴呆症等疾病的判定中，有重要的临床意义。

通常认为成人空腹血浆总Hcy水平正常值为4～12μmol/L，理想值为<10μmol/L，高于15μmol/L则被认为是高同型半胱氨酸败血症；老年人(≥60岁)空腹血浆总Hcy水平正常值为15～20μmol/L，高于20μmol/L被认为是高同型半胱氨酸败血症。

目前，实验室常用的Hcy测定方法有色谱法、酶联免疫法、荧光偏振免疫法及酶循环法。色谱法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，现在公认其为测定血浆Hcy浓度的首选方法，但因色谱法(HPLC及GC-MS)需要的设备复杂且昂贵，难以适应常规临床化学实验室应用；酶联免疫测定法自动化水平低，大部分需要手工操作，耗时较长，且容易造成误差；荧光偏振免疫检测 (FPIA) 方法灵敏度高，检测速度快，但价格昂贵，检测成本高，不适用常规生化检测；酶循环法是一种无需预处理样本，适用于全自动生化分析仪，具有快速、准确、灵敏的特点，因此受到临床广泛推广。但是普通的同型半胱氨酸检测试剂中由于存在多种酶，会使该试剂的稳定性受到影响，不利于试剂的长期保存，从而造成浪费的不良后果。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种同型半胱氨酸检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

设计一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2，试剂R1组分丝氨酸0.5-20mmol/L、HCY还原剂0.5-10mmol/L、NADH 0.5-1.8g/L、LDH 10-200KU/L、缓冲液20-100mmol/L；试剂R2组分为胱硫醚β-合成酶0.5-10KU/L、胱硫醚β-分解酶10-50KU/L、缓冲液20-100mmol/L。

其使用方法：首先把结合或聚合状态的Hcy,包括复杂的二硫键的聚合状态的Hcy以及蛋白结合的Hcy还原成游离型的Hcy，然后游离型的Hcy与丝氨酸在胱硫醚合成酶（CBS）的作用下形成胱硫醚，形成的胱硫醚在胱硫醚裂解酶（CBL）的作用下形成Hcy、丙酮酸和氨，丙酮酸与NADH（辅酶）在乳酸脱氢酶（LDH）的作用下反应，NADH转化为NAD+在340nm下每分钟转化的速率直接与Hcy的浓度正相关。

优选的，缓冲液为Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、PBS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或几种按任意比组成的混合物，缓冲液的PH值为7.1-7.5。

优选的，试剂R1和R2中还加入有电解质，电解质为氯化钠、氯化钾或氯化钙，电解质的质量百分比为0.2-2％。

优选的，试剂R1和R2中还加入有表面活性剂，表面活性剂选择Tween系列或聚氧乙烯苯基醚，表面活性剂的质量百分比为0.1-1.0％。

优选的，试剂R1和R2中还加入有防腐剂，防腐剂为为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素、硫柳汞中的一种或多种，防腐剂的浓度为0.1-0.5％(w/v)。

优选的，试剂R1和R2中还加入有稳定剂，稳定剂为BSA、蔗糖、山梨糖或海藻糖，稳定剂的浓度为2-5％(w/v)。

优选的，试剂R1和R2中还加入有促凝剂，促凝剂是聚乙二醇6000，促凝剂浓度为0.1-1％(w/v)。

优选的，HCY还原剂是三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP），二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇（β-ME）,浓度为0.5-10mmol/L。

本发明提出的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，测定条件为：

主波长	340nm	副波长	405nm
				反应温度	37℃	反应类型	速率法
反应方向	下降	校准类型	Linear

测定步骤为：

结果计算：Hcy（μmol/L）= C_S× （μmol/L）

本发明提出的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，有益效果在于：本试剂盒用于体外定量检测人血清中同型半胱氨酸 (Hcy)的含量，Hcy 与心血管疾病密切相关，是心血管疾病发病的一个重要危险因子，用于心血管疾病危险因素的辅助诊断，并指导临床治疗。具有稳定性好、使用方便、制备简单的优点。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1：

Tris-HCl缓冲液 80 mmol/L

丝氨酸 0.5mmol/L

TCEP 1mmol/L

NADH 0.5g/L

LDH 50KU/L

proclin300 1g/L

BSA 20g/L

PEG6000 10 g/L

NaCl 2g/L

Tween20 1 g/L

其余为纯化水 PH=7.2

试剂R2：

Tris-HCl缓冲液 60 mmol/L

胱硫醚β-合成酶 1KU/L

胱硫醚β-分解酶 10KU/L

BSA 25g/L

proclin300 1g/L

PEG6000 5g/L

NaCl 2g/L

Tween20 2g/L

其余为纯化水 PH=7.5

实施例2

一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1：

HEPES缓冲液 100 mmol/L

丝氨酸 1mmol/L

DTT 2mmol/L

NADH 0.8g/L

LDH 80KU/L

NaN3 1g/L

海藻糖 30g/L

PEG6000 20 g/L

NaCl 2g/L

Tween20 1 g/L

其余为纯化水 PH=7.2

试剂R2：

HEPES缓冲液 100 mmol/L

胱硫醚β-合成酶 5KU/L

胱硫醚β-分解酶 25KU/L

BSA 20g/L

蔗糖 10 g/L

NaN3 1g/L

PEG6000 10g/L

NaCl 2g/L

Tween20 2g/L

其余为纯化水 PH=7.2

实施例3

一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1：

MOPS缓冲液 50 mmol/L

丝氨酸 10mmol/L

TCEP 5mmol/L

NADH 1g/L

LDH 100KU/L

NaN3 2g/L

海藻糖 30g/L

PEG6000 30 g/L

KCl 5g/L

聚氧乙烯苯基醚 5g/L

其余为纯化水 PH=7.5

试剂R2：

MOPS缓冲液 100 mmol/L

胱硫醚β-合成酶 10KU/L

胱硫醚β-分解酶 50KU/L

BSA 25g/L

山梨糖 10g/L

NaN3 2g/L

PEG6000 20g/L

KCl 2g/L

聚氧乙烯苯基醚 2g/L

其余为纯化水 PH=7.5

实施例4

一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1：

PBS缓冲液 100mmol/L

丝氨酸 10mmol/L

TCEP 2mmol/L

β-ME 1 mmol/L

NADH 1g/L

LDH 60KU/L

NaN3 2g/L

山梨糖 20g/L

PEG6000 15 g/L

KCl 3g/L

聚氧乙烯苯基醚 3g/L

其余为纯化水 PH=7.2

试剂R2：

PBS缓冲液 50mmol/L

胱硫醚β-合成酶 2KU/L

胱硫醚β-分解酶 20KU/L

BSA 25g/L

NaN3 2g/L

PEG6000 20g/L

KCl 2g/L

聚氧乙烯苯基醚 2g/L

其余为纯化水 PH=7.4

同型半胱氨酸检测试剂盒性能分析：

表1精密度实验

表2 准确度试验

表3 线性范围分析实验

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2，其特征在于：试剂R1组分丝氨酸0.5-20mmol/L、HCY还原剂0.5-10mmol/L、NADH 0.5-1.8g/L、LDH 10-200KU/L、缓冲液20-100mmol/L；试剂R2组分为胱硫醚β-合成酶0.5-10KU/L、胱硫醚β-分解酶10-50KU/L、缓冲液20-100mmol/L。

2.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，其使用方法：首先把结合或聚合状态的Hcy,包括复杂的二硫键的聚合状态的Hcy以及蛋白结合的Hcy还原成游离型的Hcy，然后游离型的Hcy与丝氨酸在胱硫醚合成酶（CBS）的作用下形成胱硫醚，形成的胱硫醚在胱硫醚裂解酶（CBL）的作用下形成Hcy、丙酮酸和氨，丙酮酸与NADH（辅酶）在乳酸脱氢酶（LDH）的作用下反应，NADH转化为NAD+在340nm下每分钟转化的速率直接与Hcy的浓度正相关。

3.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：缓冲液为Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、PBS缓冲液、MOPS缓冲液中的一种或几种按任意比组成的混合物，缓冲液的PH值为7.1-7.5。

4.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和R2中还加入有电解质，电解质为氯化钠、氯化钾或氯化钙，电解质的质量百分比为0.2-2％。

5.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和R2中还加入有表面活性剂，表面活性剂选择Tween系列或聚氧乙烯苯基醚，表面活性剂的质量百分比为0.1-1.0％。

6.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和R2中还加入有防腐剂，防腐剂为为叠氮钠、proclin300、MIT、硫酸庆大霉素、硫柳汞中的一种或多种，防腐剂的浓度为0.1-0.5％(w/v)。

7.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和R2中还加入有稳定剂，稳定剂为BSA、蔗糖、山梨糖或海藻糖，稳定剂的浓度为2-5％(w/v)。

8.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于：试剂R1和R2中还加入有促凝剂，促凝剂是聚乙二醇6000，促凝剂浓度为0.1-1％(w/v)。

9.根据权利要求1所述的一种同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，HCY还原剂可以是三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇（β-ME）。