CN106434854A - 一种检测同型半胱氨酸的试剂盒 - Google Patents

一种检测同型半胱氨酸的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测同型半胱氨酸的试剂盒。它包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1的组分及浓度如下：浓度的组份：缓冲液10～200mmol/L；同型半胱氨酸还原剂1～10mmol/L；丝氨酸0.1～15mmol/L；辅酶0.2～5.8mg/L；乳酸脱氢酶5～100KU/L；还原性辅酶Ⅰ0.01～0.8g/L；酶稳定剂5～150g/L；表面活性剂1～100g/L；防腐剂0.1～5g/L；所述试剂R2的组分及浓度如下：缓冲液10～200mmol/L；辅酶0.2～5.8mg/L；胱硫醚β‑合成酶1～100KU/L；胱硫醚β‑裂解酶1～100KU/L；酶稳定剂5～150g/L；表面活性剂1～100g/L；防腐剂0.1～5g/L。本发明试剂盒能降低使用酶量，提高检测的稳定性，提高循环检测灵敏度，准确度高，适用范围广。本发明方法与HPLC法相关性良好，无需样本预处理，在全自动生化分析仪上检测自动化，速度快。

Description

一种检测同型半胱氨酸的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测同型半胱氨酸的试剂盒。
背景技术
同型半胱氨酸(homocysteine，HCY)是一种含硫的氨基酸，是蛋氨酸的代谢产物。近年的研究发现HCY可引起神经管畸形(neural tube defects,NTDs)及先天性心脏畸形(congenital heart defect,CHD)等出生缺陷类疾病，而且HCY与动脉粥样硬化的发病也密切相关。
早在40年前，McCully博士就首先发现并探讨了同型半胱氨酸与心血管疾病发生、发展的关系，伴有同型半胱氨酸尿症的患者，常在其十几至二十多岁的青少年时期即发生严重的心血管疾病。近期研究发现有10-20％的心血管疾病患者与胆固醇水平、吸烟及高血压等危险因素无关，而是由于同型半胱氨酸升高所致。遗传和饮食习惯是导致患者同型半胱氨酸升高的主要原因，因此为了预防心血管疾病的发生，除注意控制血脂水平以外，同型半胱氨酸水平也是非常重要的危险因素，应积极预防。
同型半胱氨酸的检测方法主要有以下几种：
放射免疫分析法(Raduiebzynuc Assays)：由Refesum等1985年建立，该方法灵敏度高，特异性强，但操作繁琐且有放射污染，同时同位素易衰变及对人体有危害，限制了使用。
气相色谱-质谱法(GC-MS)：由Stabler1987年首先报道了气相色谱-质谱法联用测定同型半胱氨酸，特异性强，灵敏度高重复好等优点。但因需要的设备昂贵，难以适合常规临床化学实验室使用，此法操作十分复杂，耗时长，仪器设备要求高，普及很困难。
高效液相色谱(HPLC)法应用最广泛，费用也比其他方法低。根据检测方法的不同又分为荧光法和电化学法。根据衍生方式的不同又分为柱前或柱后衍生法。
高效液相荧光检测法(HPLC-FD)采用柱前衍生的技术，然后用HPLC将衍生物分离，并用荧光检测。Fiskerstrand等首先于1993年采用全自动HPLC法对血浆和尿液的HCY和硫醇物进行测定，该方法较有代表性。近年来，国内郭健等对HPLC进行改进。该法检测原理为血浆中同型半胱氨酸、混合型-硫化物及蛋白质结合的同型半胱氨酸经巯基还原剂处理之后，再与巯基特异结合的荧光物质SBD-F充分反应形成带有共轭结构的化合物，其受紫外光激发后，能辐射出荧光，而且在一定条件下，荧光强度和样品的浓度成正比。另外，因所形成的不同化合物结构有差异，其极性也就有所不同，在色谱中的保留时间也就不一样，故此可利用荧光检测器检测出血浆中的HCY的浓度。但是需要专门的仪器，费用较高，对技术人员要求比较高。
高效液相电化学法(HPLC-ED)具有样本处理简单，无需衍生等特点，又有较高的灵敏性、专一性和稳定性，应用较广泛。该法中有两种电极均可使用(H2/H+-玻璃电极，Ag/AgCl-碳糊电极)。缺点主要是由于电化学检测器的检测池易受污染和电极使用后易受污染，极易老化。
酶联免疫吸附测定(ELISA)法是一种无需预处理的方法，基本原理为：1)二硫苏糖醇(DTT)还原，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(SAHase)催化HCY和腺苷反应生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)；2)加入SAHase抑制剂终止反应后，用腺苷酶(Adoase)降解残余腺苷除去干扰；3)由抗SAH单克隆抗体组成的竞争性酶联免疫检测系统定量测定SAH。Frantzen等用该法测定HCY线性等试剂性能良好，胆红素，溶血，血脂的干扰较小，并且该法与HPLC法有良好的相关性。但是操作比较繁琐，耗时比较长。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测同型半胱氨酸的试剂盒，本发明能降低使用酶量，提高反应的稳定性，提高循环检测灵敏度。
本发明提供的检测同型半胱氨酸的试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1的组成及浓度如下：
所述试剂R2的组成及浓度如下：
本发明中，所述缓冲液的浓度指的是所述缓冲液在所述试剂R1或试剂R2中的浓度。
本发明中，所述丝氨酸简称SER；所述乳酸脱氢酶简称LDH；所述还原性辅酶Ⅰ简称NADH。
本发明中，所述胱硫醚β-合成酶的1个酶活力单位指的是在37℃、pH8.0条件下，在1分钟内能转化1微摩尔的丝氨酸所需的酶量；
所述胱硫醚β-裂解酶的1个酶活力单位指的是在37℃、pH8.0条件下，在1分钟内能转化1微摩尔的L-胱硫醚所需的酶量；
所述乳酸脱氢酶的1个酶活力单位指的是在37℃温度、pH8.0条件下，在1分钟内能转化1微摩尔的丙酮酸所需的酶量。
上述的试剂盒中，所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸(简称Hepes)、Tris-HCl、三乙醇胺(简称TEA)和3-(N-吗啉基)丙磺酸(简称MOPS)中的至少一种；
所述试剂盒中，R1中各组分混合后的pH值为8.0～8.5，R2中各组分混合后的pH值为7.5～8.0；
R1和R2的体积比为1～12：1；具体可为10:1，R1和R2按照10:1比例混合后pH值为8.0～8.5。
上述的试剂盒中，所述同型半胱氨酸还原剂为巯基还原剂。
上述的试剂盒中，所述巯基还原剂为二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦和β-巯基乙醇中的至少一种。
上述的试剂盒中，所述辅酶为磷酸吡哆醛；
所述防腐剂为叠氮钠和/或液体生物防腐剂(简称为PC300)。
上述的试剂盒中，所述试剂盒还包括如下浓度的组份：
酶稳定剂 5～150g/L；
表面活性剂 1～100g/L。
上述的试剂盒中，所述表面活性剂为曲拉通450(又称Triton X-450)、曲拉通100(又称Triton X-100)、Tween20和Tween80，Brij35，SDS中的至少一种；
所述辅酶和所述表面活性剂的质量比为1:100～20000，优选比例为1:500～3000；
所述酶稳定剂为牛血清白蛋白、丙三醇、甘露醇、山梨醇和乙二醇中的至少一种。
本发明中，所述试剂盒具体可由下述R1和R2混合组成，其中各组分浓度为R1和R2分别配制浓度：
R1为MOPS 100mmol/L；叠氮钠0.5g/L；丝氨酸3mmol/L；三(2-羟乙基)膦5mmol/L；Triton X-10 1g/L；磷酸吡哆醛0.5mg/L；乳酸脱氢酶35KU/L；还原性辅酶Ⅰ0.6g/L；甘露醇50ml/L；
R2为MOPS 100mmol/L；甘露醇50ml/L；磷酸吡哆醛1.58mg/L；叠氮钠0.5g/L；Triton X-100 5g/L；胱硫醚β-合成酶10KU/L；胱硫醚β-裂解酶1KU/L。
本发明还提供了一种同型半胱氨酸含量的检测方法，包括如下步骤：将待测样品依次与所述的试剂盒组分中R1和R2混合，反应，检测，即得到所述待测样品中同型半胱氨酸含量。
本发明具体的检测方法的条件和步骤如下：
分析方法：速率法
反应方向：下降反应
校准方式：两点线性
测定波长：主波长：340nm，副波长：405nm
测定温度：37℃
样本：R1:R2＝16.5:250:25(μL)
具体操作步骤：加入样本16.5μL，试剂R1 250μL，37℃孵育5分钟，测定吸光度A1，然后加入试剂R2 25μL，反应2分钟后，开始测定吸光度，连续监测3分钟，得到ΔA/min。采用2点定标法，用日立7100全自动生化分析仪检测吸光度，根据已知浓度的校准品和样本吸光度ΔA/min进行比较得到样本检测结果。
本发明中，所述试剂盒检测同型半胱氨酸的反应原理如下：待测样品与所述缓冲液和所述同型半胱氨酸还原剂反应，得到游离的同型半胱氨酸；
游离的同型半胱氨酸与所述丝氨酸，在所述胱硫醚β合成酶催化下反应，得到L-胱硫醚；
然后L-胱硫醚与所述还原性辅酶Ⅰ和所述胱硫醚β裂解酶，所述L-胱硫醚在所述胱硫醚β裂解酶的分解下，得到同型半胱氨酸和丙酮酸的混合液；
所述同型半胱氨酸再次参加与所述丝氨酸的反应中；
所述丙酮酸与所述还原性辅酶Ⅰ在所述乳酸脱氢酶催化下发生显色反应，检测，即得到所述待测样品中同型半胱氨酸含量。
本发明中，所述辅酶和所述表面活性剂的加入，降低所述胱硫醚β合成酶和所述胱硫醚β裂解酶的使用量，能提高反应的稳定性，提高循环检测灵敏度。
上述的检测方法中，所述待测样品为血清、肝素抗凝血浆和EDTA抗凝血浆中的至少一种；
所述检测采用吸收光谱法测定，具体可采用紫外可见分光光度计或全自动生化分析仪检测。
本发明所述的试剂盒在检测血清或血浆同型半胱氨酸含量中的应用。
本发明具有以下优点：
本发明试剂盒能降低使用酶量，提高检测的稳定性，提高循环检测灵敏度，准确度高，适用范围广。本发明方法与HPLC法相关性良好，无需样本预处理，在全自动生化分析仪上检测自动化，速度快。
附图说明
图1为本发明在2015年度两次室间质评结果，其中图1a)为第一次室间质评结果，图1b)为第二次室间质评结果。
图2为本发明使用日立7100系统与AU400系统测试的结果比较。
图3为本发明使用日立7100系统与东芝40系统测试的结果比较。
图4为本发明使用AU400系统与东芝40系统测试的结果比较。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、
同型半胱氨酸的试剂盒，由下述R1和R2组成，混合后的pH值为8.0～8.5。
1、R1的各组分浓度及名称，如表1所示。
表1 R1各组分浓度及名称
2、R2的各组分浓度及名称，如表2所示。
表2 R2各组分浓度及名称
检测结果：
1、准确度
HCY试剂检测三个不同水平质控品，检测结果与靶值比较，结果偏移应≤5％。参加2015年度卫生部室间质评，结果应在偏移要求范围内。
1)室内质控结果，检测三个水平的质控品，检测结果偏差均小于5％，结果如表1所示。
表1 HCY室内质控结果(μmol/L)
2)室间质评结果，参加卫生部临床检验中心主办的心肌类室间质评，一年两次，每次5个样本，盲样检测，结果如图1所示，最大偏移为5.31％，绝对平均偏移为3.08％，两次回报结果成绩均为100％通过。
2、灵敏度检测方法，根据美国临床和实验室标准协会EP17-A文件，进行空白检出限LOB，检出限LOD，定量检出限LOQ的检测。
依据上述EP17-A，重复检测水空白60遍及10个低浓度血清样本，浓度分别为2.64、0.70、0.34、0.31、0.29、0.26、0.25、0.24、0.16、0.13μmol/L 20遍，得到HCY试剂的空白检测限是0.13μmol/L，检出限是0.20μmol/L，定量检出限是0.30μmol/L。
3、稳定性检测方法，4度冷藏实时放置检测，吸光度下降不能大于20％。开盖稳定性1个月，质控偏差不能大于10％。
1)HCY试剂盒放置4度冷藏18个月，与零时间相比，本发明试剂盒定标吸光度下降不超过15％，结果如表2所示。
表2冷藏18个月稳定性
2)开盖稳定性。将HCY试剂开盖后，放置到仪器试剂仓中，每天检测，连续检测1个月，本发明试剂盒检测的偏差不大于5％。
4、不同机型结果比较，选取市场上有代表性的3个厂家全自动生化分析仪：日立7100，AU400，东芝40，使用同一批号试剂、校准和质控，检测40份临床血清样本，进行相关比较，以评价同型半胱氨酸试剂在不同仪器使用的一致性。
使用同一批号试剂、校准和质控，检测40份临床血清样本，进行两两相关比较，日立7100系统与AU400系统比较相关系数r为0.9954，如图2所示。日立7100系统与东芝40系统比较相关系数r为0.9970，如图3所示。AU400系统与东芝40系统比较相关系数r为0.9990，如图4所示。三个系统间均具有良好的相关性。本发明试剂盒在不同仪器系统结果一致性良好，适用范围广。

Claims (10)

1.一种检测同型半胱氨酸的试剂盒，它包括试剂R1和试剂R2；
所述试剂R1的组分及浓度如下：
浓度的组份：
所述试剂R2的组分及浓度如下：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸、Tris-HCl、三乙醇胺和3-(N-吗啉基)丙磺酸中的至少一种；
所述试剂盒中，R1中各组分混合后的pH值为8.0～8.5，R2中各组分混合后的pH值为7.5～8.0；
R1和R2的体积比为1～12：1。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述同型半胱氨酸还原剂为巯基还原剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述巯基还原剂为二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦和β-巯基乙醇中的至少一种。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述辅酶为磷酸吡哆醛；
所述防腐剂为叠氮钠和/或液体生物防腐剂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下浓度的组份：
酶稳定剂 5～150g/L；
表面活性剂 1～100g/L。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述表面活性剂为曲拉通450、曲拉通100、Tween20、Tween80、Brij35和SDS中的至少一种；
所述辅酶和所述表面活性剂的质量比为1:100～20000；
所述酶稳定剂为牛血清白蛋白、丙三醇、甘露醇、山梨醇和乙二醇中的至少一种。
8.一种同型半胱氨酸含量的检测方法，包括如下步骤：将待测样品与权利要求1-7中任一项所述的试剂盒组分混合，反应，检测，即得到所述待测样品中同型半胱氨酸含量。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述待测样品为血清、肝素抗凝血浆和EDTA抗凝血浆中的至少一种；
所述检测采用吸收光谱法。
10.权利要求1-7中任一项所述的试剂盒在检测血清同型半胱氨酸含量中的应用。
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