CN110777190A - 用于检测同型半胱氨酸的试剂盒及其应用 - Google Patents

用于检测同型半胱氨酸的试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测同型半胱氨酸的试剂盒及其应用。本发明提供了一种用于检测同型半胱氨酸的试剂盒，包括试剂甲和试剂乙；试剂甲：TCEP 2～10mmol/L、L‑丝氨酸1～5mmol/L、NADH 1～5mmol/L、底物稳定剂CCD 1～5g/L、叠氮钠1～2g/L、TritonX‑100 1～2g/L，余量为Trise‑HCl缓冲液；试剂乙：CBS 2～3g/L、CBL 0.1～0.5g/L、LDH 200～300KU/L、EDTA 0.5～2g/L、BSA 1～2g/L、5‑磷酸吡哆醛一水合物10～50mg/L、叠氮钠1～2g/L，余量为Trise‑HCl缓冲液。本发明提供的试剂盒具有稳定性强、灵敏度高、测量准确度和精密度高、线性范围大、成本较低的优点。

Description

用于检测同型半胱氨酸的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测同型半胱氨酸的试剂盒及其应用，更具体涉及一种基于循环酶法检测同型半胱氨酸的试剂盒及其应用。
背景技术
同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一种人体内的含硫氨基酸，为甲硫氨酸和半胱氨酸代谢过程中的中间产物，其本身并不参与蛋白质的合成。体内不能直接合成Hcy，只能从食物中的甲硫氨酸脱甲基后转变而来。近些年，大量的研究表明，高同型半胱氨酸(hyperhomocysteinemia，HHcy)是导致心脑血管疾病的又一个主要发病因素，升高的血浆同型半胱氨酸和患有高血压的人群中在导致心脑血管疾病上具有协同效果。高同型半胱氨酸血症与一些疾病如脑血管疾病、冠状动脉粥样硬化、糖尿病、阿尔茨海默病等的发病关系越来越多的受到关注。研究表明Hcy水平与心血管事件风险呈正相关，Hcy每升高5μmol/L脑卒中风险升高59％，缺血性心脏病风险升高32％，血中同型半胱氨酸浓度升高(Hcy≥12μmol/L)是冠心病、中风、外周血管粥样硬化及动静脉栓塞的危险因子，血中同型半胱氨酸升高使心血管疾病发病率及死亡率增加，Hcy每降低5μmol/L脑卒中风险降低24％，缺血性心脏病风险降低16％。调研数据显示，血液Hcy含量升高已成为加速动脉粥样硬化发生的一个独立危险因子,因此测定血中HCY浓度在临床上意义十分重要。
血浆中的同型半胱氨酸分两种形式存在：氧化型同型半胱氨酸和还原型同型半胱氨酸。还原型同型半胱氨酸中游离的巯基具有高度活性，其容易氧化，从而形成二硫化物的形式。氧化型同型半胱氨酸是同型半胱氨酸在血浆中的主要存在形式，以二硫化物形式或是与蛋白质共价结合的形式存在。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测同型半胱氨酸的试剂盒及其应用。
本发明提供了一种用于检测同型半胱氨酸的试剂盒(试剂盒Ⅰ)，包括试剂甲(液态试剂)和试剂乙(液态试剂)；
试剂甲的组成：三(2-羰基乙基)磷盐酸盐2～10mmol/L、L-丝氨酸1～5mmol/L、NADH 1～5mmol/L、底物稳定剂CCD 1～5g/L、叠氮钠1～2g/L、TritonX-100 1～2g/L，余量为Trise-HCl缓冲液；
试剂乙的组成：胱硫醚β-合成酶2～3g/L、胱硫醚β-裂解酶0.1～0.5g/L、D-乳酸脱氢酶200～300KU/L、EDTA 0.5～2g/L、BSA 1～2g/L、5-磷酸吡哆醛一水合物10～50mg/L、叠氮钠1～2g/L，余量为Trise-HCl缓冲液。
具体来说，试剂甲的组成：三(2-羰基乙基)磷盐酸盐5mmol/L、L-丝氨酸3mmol/L、NADH 3mmol/L、底物稳定剂CCD 3g/L、叠氮钠1.5g/L、TritonX-100 1.5g/L，余量为Trise-HCl缓冲液。
具体来说，试剂乙的组成：胱硫醚β-合成酶2.5g/L、胱硫醚β-裂解酶0.2g/L、D-乳酸脱氢酶200KU/L、EDTA 1g/L、BSA 1.5g/L、5-磷酸吡哆醛一水合物30mg/L、叠氮钠1.5g/L，余量为Trise-HCl缓冲液。
试剂甲中，所述Trise-HCl缓冲液为pH8.0～9.0、20～50mmol/L的Trise-HCl缓冲液。试剂甲中，所述Trise-HCl缓冲液为pH8.5、20mmol/L的Trise-HCl缓冲液。
试剂乙中，所述Trise-HCl缓冲液为pH7.0～8.0,20～50mmol/L的Trise-HCl缓冲液。试剂乙中，所述Trise-HCl缓冲液为pH7.5,20mmol/L的Trise-HCl缓冲液。
本发明还保护试剂盒Ⅰ中所述的试剂甲和试剂盒Ⅰ中所述的试剂乙在制备用于检测同型半胱氨酸的试剂盒中的应用。
本发明还保护一种用于检测同型半胱氨酸的试剂盒(试剂盒Ⅱ)，包括试剂甲(固态试剂)和试剂乙(固态试剂)；
试剂甲由三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、L-丝氨酸、NADH、底物稳定剂CCD、叠氮钠和TritonX-100组成；试剂甲中各组分的配比依次为：三(2-羰基乙基)磷盐酸盐2～10mmol：L-丝氨酸1～5mmol：NADH 1～5mmol：底物稳定剂CCD 1～5g：叠氮钠1～2g：TritonX-100 1～2g；
试剂乙由胱硫醚β-合成酶、胱硫醚β-裂解酶、D-乳酸脱氢酶、EDTA、BSA、5-磷酸吡哆醛一水合物和叠氮钠组成；试剂乙中各组分的配比依次为：胱硫醚β-合成酶2～3g：胱硫醚β-裂解酶0.1～0.5g：D-乳酸脱氢酶200～300KU：EDTA 0.5～2g：BSA 1～2g：5-磷酸吡哆醛一水合物10～50mg：叠氮钠1～2g。
具体来说，试剂甲中各组分的配比依次为：三(2-羰基乙基)磷盐酸盐5mmol：L-丝氨酸3mmol：NADH 3mmol：底物稳定剂CCD 3g：叠氮钠1.5g：TritonX-100 1.5g；
具体来说，试剂乙中各组分的配比依次为：胱硫醚β-合成酶2.5g：胱硫醚β-裂解酶0.2g：D-乳酸脱氢酶200KU：EDTA 1g：BSA 1.5g：5-磷酸吡哆醛一水合物30mg：叠氮钠1.5g。
试剂甲中的各个组分可以独立包装，使用时再混合。
试剂甲中的各个组分也可以混合包装。
试剂乙中的各个组分可以独立包装，使用时再混合。
试剂乙中的各个组分也可以混合包装。
本发明还保护试剂盒Ⅱ中所述的试剂甲和试剂盒Ⅱ中所述的试剂乙在制备用于检测同型半胱氨酸的试剂盒中的应用。
本发明还保护一种用于检测同型半胱氨酸的试剂盒(试剂盒Ⅲ)，包括试剂甲(固态试剂)和试剂乙(固态试剂)；
试剂甲由三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、L-丝氨酸、NADH、底物稳定剂CCD、叠氮钠和TritonX-100组成；
试剂乙由胱硫醚β-合成酶、胱硫醚β-裂解酶、D-乳酸脱氢酶、EDTA、BSA、5-磷酸吡哆醛一水合物和叠氮钠组成。
试剂甲中的各个组分可以独立包装，使用时再混合。
试剂甲中的各个组分也可以混合包装。
试剂乙中的各个组分可以独立包装，使用时再混合。
试剂乙中的各个组分也可以混合包装。
本发明还保护试剂盒Ⅲ中所述的试剂甲和试剂盒Ⅲ中所述的试剂乙在制备用于检测同型半胱氨酸的试剂盒中的应用。
本发明还保护一种用于检测同型半胱氨酸的试剂盒(试剂盒Ⅳ)，包括试剂甲(液态试剂)和试剂乙(液态试剂)；
试剂甲的组成：三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、L-丝氨酸、NADH、底物稳定剂CCD、叠氮钠、TritonX-100，余量为Trise-HCl缓冲液；
试剂乙的组成：胱硫醚β-合成酶、胱硫醚β-裂解酶、D-乳酸脱氢酶、EDTA、BSA、5-磷酸吡哆醛一水合物、叠氮钠，余量为Trise-HCl缓冲液。
试剂甲中，所述Trise-HCl缓冲液为pH8.0～9.0、20～50mmol/L的Trise-HCl缓冲液。试剂甲中，所述Trise-HCl缓冲液为pH8.5、20mmol/L的Trise-HCl缓冲液。
试剂乙中，所述Trise-HCl缓冲液为pH7.0～8.0,20～50mmol/L的Trise-HCl缓冲液。试剂乙中，所述Trise-HCl缓冲液为pH7.5,20mmol/L的Trise-HCl缓冲液。
本发明还保护试剂盒Ⅳ中所述的试剂甲和试剂盒Ⅳ中所述的试剂乙在制备用于检测同型半胱氨酸的试剂盒中的应用。
本发明还保护5-磷酸吡哆醛或5-磷酸吡哆醛水合物的应用，为如下(a)或(b)：
(a)作为基于循环酶法检测同型半胱氨酸的检测试剂中的稳定剂；
(b)增加基于循环酶法检测同型半胱氨酸的检测试剂的稳定性。
所述5-磷酸吡哆醛水合物具体为5-磷酸吡哆醛一水合物。
磷酸吡哆醛能够抑制酶的絮凝和沉淀，提高试剂稳定性。
基于循环酶法检测同型半胱氨酸的检测试剂可为以上任一所述试剂乙中除5-磷酸吡哆醛水合物以外的试剂。
本发明还保护以上任一所述试剂盒在检测同型半胱氨酸中的应用。
以上任一所述检测同型半胱氨酸为检测同型半胱氨酸的含量。
以上所述检测同型半胱氨酸为检测同型半胱氨酸在液体样本中的浓度。
所述液体样本可为血液样本，例如血清样本。
本发明提供的试剂盒的检测原理：氧化型HCY被转化成游离HCY；在胱硫醚β-合成酶(CBS)催化下，丝氨酸和游离HCY反应生成L-胱硫醚；在胱硫醚β-裂解酶(CBL)催化下，L-胱硫醚生成同型半胱氨酸、丙酮酸和NH3。
本发明提供的试剂盒的显色原理：丙酮酸可以借助乳酸脱氢酶(LDH)和NADH被检测到，具体为：在乳酸脱氢酶(LDH)催化下，NADH和丙酮酸反应生成乳酸和NAD+；NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，还原型辅酶Ⅰ)转化成NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化态)，导致在340nm监测NADH的吸光度下降。
本发明提供的试剂盒的使用方法：取16.5μl待测溶液和250μl试剂甲，混匀后37℃孵育5min；然后加入25μl试剂乙，混匀，37℃延迟90sec，然后连续监测120sec，计算吸光度变化率(ΔA/min)；将吸光度变化率代入标准曲线方程，计算得到待测溶液中的同型半胱氨酸浓度。
本发明提供的试剂盒不仅可以在可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行同型半胱氨酸浓度测定，而且解决了试剂由于胱硫醚β-裂解酶、胱硫醚β-合成酶易发生絮凝产生沉淀带来的试剂热稳定性差及长期稳定性差的问题，具有稳定性强、灵敏度高、测量准确度和精密度高、线性范围大、成本较低的优点，具有广泛推广应用的价值。
附图说明
图1为实施例1的步骤五中的标准曲线。
图2为实施例3的步骤三中的线性范围图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)，CAS号为51805-45-9；生产厂商为苏州亚科科技股份有限公司；货号为S0178；产品的网址链接：http://www.yacoo.com.cn/product/103896。底物稳定剂CCD：生产厂商为西宝生物(上海)科技股份有限公司；货号为ACE0072A；产品的网址链接：http://www.seebio.cn/Products/dwwdjccd.html。叠氮钠，CAS号为26628-22-8。5-磷酸吡哆醛：CAS号为41468-25-1。同型半胱氨酸标准品：厂家为sigma，CAS号为6027-13-0，货号为69453。
胱硫醚β-合成酶(CBS)(EC 4.2.1.22)；生产厂商为北京达成生物科技有限公司；货号E011。胱硫醚β-裂解酶(CBL)(EC 4.4.1.8)：生产厂商为北京达成生物科技有限公司；货号E012。还原型辅酶I(NADH)：生产厂商为Protein Technologies,Inc.；货号：N07771。D-乳酸脱氢酶(LDH)：生产厂商为北京达成生物科技有限公司；货号E004-1。
吸光度检测参数：温度为37℃；比色杯光径为1.0cm；主波长为340nm，副波长为404(400～700)nm。
实施例1、试剂以及试剂盒的制备
一、本发明试剂盒的制备
试剂甲的组成：TCEP 5mmol/L、L-丝氨酸3mmol/L、NADH 3mmol/L、底物稳定剂CCD3g/L、叠氮钠1.5g/L、TritonX-100 1.5g/L，余量为Trise-HCl缓冲液(pH8.5、20mmol/L)。
试剂乙的组成：CBS 2.5g/L、CBL 0.2g/L、LDH 200KU/L、EDTA 1g/L、BSA 1.5g/L、5-磷酸吡哆醛一水合物30mg/L、叠氮钠1.5g/L，余量为Trise-HCl缓冲液(pH7.5,20mmol/L)。
本发明提供的试剂盒由试剂甲和试剂乙组成。
二、D1试剂盒的制备
试剂D1的组成：CBS 2.5g/L、CBL 0.2g/L、LDH 200KU/L、EDTA 1g/L、BSA 1.5g/L、叠氮钠1.5g/L，余量为Trise-HCl缓冲液(pH7.5,20mmol/L)。
D1试剂盒由试剂甲和试剂D1组成。
三、D2试剂盒的制备
试剂D2的组成：CBS 2.5g/L、CBL 0.2g/L、LDH 200KU/L、可溶性淀粉10g/L、谷胱甘肽1.5g/L、叠氮钠1.5g/L，余量为Trise-HCl缓冲液(pH7.5,20mmol/L)。
D2试剂盒由试剂甲和试剂D2组成。
四、D3试剂盒的制备
试剂D3的组成：CBS 2.5g/L、CBL 0.2g/L、LDH 200KU/L、EDTA·2Na 0.05g/L、甘氨酸0.75g/L、叠氮钠1.5g/L，余量为Trise-HCl缓冲液(pH7.5,20mmol/L)。
D3试剂盒由试剂甲和试剂D3组成。
五、应用试剂盒检测样本中的同型半胱氨酸的方法
操作步骤：
(1)制作标准曲线，获得标准曲线方程。
分析方法为速率法；校准方法为两点线性法。
取16.5μl标准品溶液和250μl试剂甲，混匀后37℃孵育5min；然后加入25μl试剂乙，混匀，37℃延迟90sec，然后连续监测120sec，计算吸光度变化率(ΔA/min)。以吸光度变化率为自变量(x)，以同型半胱氨酸浓度为因变量(y)，制作标准曲线，获得标准曲线方程。
标准品溶液为Cal0溶液或Cal1溶液。Cal0溶液：PB缓冲液(PH7.5，20mmol/L)。Cal1溶液：28μmol同型半胱氨酸标准品溶于1L的PB缓冲液(PH7.5，20mmol/L)。
进行两次重复试验，吸光度变化率结果见表1。
表1
Cal0溶液 Cal1溶液
第一次重复试验 -0.01 -0.062
第二次重复试验 -0.0101 -0.0622
平均值(Abs-Avg) -0.0101 -0.0621
y＝K×x+B；B＝Cal0Abs-Avg；
Figure BDA0002265332370000061
Cal1溶液中的同型半胱氨酸浓度为28μM。
因此，标准曲线方程为：y＝-0.0019x-0.0101；x为吸光度变化率，y为同型半胱氨酸浓度(单位为μM)。标准曲线见图1。
(2)取16.5μl待测溶液和250μl试剂甲，混匀后37℃孵育5min；然后加入25μl试剂乙，混匀，37℃延迟90sec，然后连续监测120sec，计算吸光度变化率(ΔA/min)。将吸光度变化率代入标准曲线方程，计算得到待测溶液中的同型半胱氨酸浓度。
实施例2、试剂盒的稳定性
低值样本：将医院提供的10例临床血清混合，得到临床混合血清，即为低值样本。采用实施例1的步骤一制备的试剂盒并按实施例1的步骤五进行检测，低值样本中的同型半胱氨酸浓度为7.5μmol/L。
高值样本：在低值样本中加入同型半胱氨酸标准品，得到高值样本。采用实施例1的步骤一制备的试剂盒并按实施例1的步骤五进行检测，高值样本中的同型半胱氨酸浓度为29.0μmol/L。
空白样本：水。
待测溶液为低值样本、高值样本或空白样本。
一、37℃加速稳定性实验
取新制备的试剂甲、试剂乙、试剂D1、试剂D2和试剂D3，37℃保存(新制备的作为0天，保存1天、保存3天、保存5天或保存7天)。37℃保存7天可模拟2～8℃保存1年。
取16.5μl待测溶液和250μl试剂甲，混匀后37℃孵育5min；然后加入25μl试剂(试剂乙或试剂D1或试剂D2或试剂D3)，混匀，37℃延迟90sec，然后连续监测120sec，计算吸光度变化(ΔA)。
试剂甲和试剂乙进行检测的结果见表1。试剂甲和试剂D1进行检测的结果见表2。试剂甲和试剂D2进行检测的结果见表3。试剂甲和试剂D3进行检测的结果见表4。本发明提供的试剂盒稳定性最好。
表1
Figure BDA0002265332370000071
表2
Figure BDA0002265332370000072
表3
Figure BDA0002265332370000073
表4
Figure BDA0002265332370000074
Figure BDA0002265332370000081
二、2～8℃稳定性实验
取新制备的试剂甲、试剂乙、试剂D1、试剂D2和试剂D3，6℃保存(新制备的作为0个月，保存2个月、保存4个月、保存6个月、保存8个月、保存10个月、保存12个月或保存14个月)。
取16.5μl待测溶液和250μl试剂甲，混匀后37℃孵育5min；然后加入25μl试剂(试剂乙或试剂D1或试剂D2或试剂D3)，混匀，37℃延迟90sec，然后连续监测120sec，计算吸光度变化(ΔA)。
试剂甲和试剂乙进行检测的结果见表5。试剂甲和试剂D1进行检测的结果见表6。试剂甲和试剂D2进行检测的结果见表7。试剂甲和试剂D3进行检测的结果见表8。本发明提供的试剂盒稳定性最好。
表5
Figure BDA0002265332370000082
表6
Figure BDA0002265332370000083
Figure BDA0002265332370000091
表7
表8
Figure BDA0002265332370000093
三、开盖稳定性实验
质控液：12μmol同型半胱氨酸标准品溶于1L PB缓冲液(PH7.5，20mmol/L)。
取新制备的试剂甲和试剂乙，6℃开盖保存(保存1天、保存3天、保存5天、保存7天、保存9天、保存11天、保存13天、保存15天、保存17天、保存19天、保存21天、保存23天、保存25天、保存27天或保存29天)。
取16.5μl质控液和250μl试剂甲，混匀后37℃孵育5min；然后加入25μl试剂乙，混匀，37℃延迟90sec，然后连续监测120sec，计算吸光度变化率(ΔA/min)。将吸光度变化率代入标准曲线方程，计算得到同型半胱氨酸浓度。
质控液中的同型半胱氨酸浓度计算值见表9。结果表明，本发明的试剂盒在6℃开盖稳定性能指标表现卓越。
表9
保存时间 第一次重复试验 第二次重复试验 平均值 偏差
1天 11.7μM 11.6μM 11.65 -2.92
3天 12.1μM 12.0μM 12.05 0.42
5天 11.7μM 11.8μM 11.75 -2.08
7天 11.8μM 11.7μM 11.75 -2.08
9天 11.5μM 11.6μM 11.55 -3.75
11天 11.9μM 11.8μM 11.85 -1.25
13天 11.8μM 11.8μM 11.8 -1.67
15天 12.2μM 12.1μM 12.15 1.25
17天 11.6μM 11.7μM 11.65 -2.92
19天 11.8μM 12.0μM 11.9 -0.83
21天 11.7μM 11.6μM 11.65 -2.92
23天 11.5μM 11.5μM 11.5 -4.17
25天 11.8μM 11.7μM 11.75 -2.08
27天 11.8μM 11.9μM 11.85 -1.25
29天 11.9μM 11.8μM 11.85 -1.25
实施例3、试剂盒的性能
一、准确度、精密度
质控液：12μmol同型半胱氨酸标准品溶于1L PB缓冲液(PH7.5，20mmol/L)。
取16.5μl质控液和250μl试剂甲，混匀后37℃孵育5min；然后加入25μl试剂乙，混匀，37℃延迟90sec，然后连续监测120sec，计算吸光度变化率(ΔA/min)。将吸光度变化率代入标准曲线方程，计算得到同型半胱氨酸浓度。
连续检测20次。质控液中的同型半胱氨酸浓度计算值见表10。将检测结果的平均值与靶值范围进行比较，以检测本发明试剂盒的准确性，同时比较每个测定的变异系数，以检测本发明试剂盒的精密度。不准确度相对偏差CV(％)不超过±5％。结果表明，本发明的试剂盒的准确度符合诊断试剂盒的技术指标。
表10
Figure BDA0002265332370000101
二、检测限
空白样本：5g/100mL牛血清白蛋白水溶液。
取16.5μl空白样本和250μl试剂甲，混匀后37℃孵育5min；然后加入25μl试剂乙，混匀，37℃延迟90sec，然后连续监测120sec，计算吸光度变化率(ΔA/min)。将吸光度变化率代入标准曲线方程，计算得到同型半胱氨酸浓度。
连续检测20次。空白样本中的同型半胱氨酸浓度计算值见表11。计算20次结果的均值与标准差SD，以空白均值加两倍标准差报告方法的检测限。
表11
Figure BDA0002265332370000121
三、线性范围
空白样本：5g/100mL牛血清白蛋白水溶液。
高值样本：将医院提供的10例临床血清混合，加入同型半胱氨酸标准品，得到高值样本。
用空白样本和高值样本制备待测样本(见表12)。
表12
待测样本号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
空白样本(mL) 1.00 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00
高值样本(mL) 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
取16.5μl待测样本和250μl试剂甲，混匀后37℃孵育5min；然后加入25μl试剂乙，混匀，37℃延迟90sec，然后连续监测120sec，计算吸光度变化率(ΔA/min)。将吸光度变化率代入标准曲线方程，计算得到同型半胱氨酸浓度。
结果见表13和图2。结果表明，使用本发明的试剂盒，采用本发明的测定方法线性可以达到60μmol/L。
表13
样本号 第一次重复试验 第二次重复试验 平均值 调零 理论值
1 -0.9 -1 -0.95 0.00 -0.10
2 5 4.7 4.85 5.80 5.81
3 10.7 10.6 10.65 11.60 11.72
4 16.5 16.6 16.55 17.50 17.63
5 23 22.5 22.75 23.70 23.54
6 28.5 28.4 28.45 29.40 29.45
7 34.9 34.6 34.75 35.70 35.36
8 41.3 40.9 41.10 42.05 41.27
9 47.5 46.9 47.20 48.15 47.18
10 53.7 53.5 53.60 54.55 53.09
11 60.5 60.2 60.35 61.30 59.00

Claims (10)

1.一种用于检测同型半胱氨酸的试剂盒，包括试剂甲和试剂乙；
试剂甲的组成：三(2-羰基乙基)磷盐酸盐2～10mmol/L、L-丝氨酸1～5mmol/L、NADH 1～5mmol/L、底物稳定剂CCD 1～5g/L、叠氮钠1～2g/L、TritonX-100 1～2g/L，余量为Trise-HCl缓冲液；
试剂乙的组成：胱硫醚β-合成酶2～3g/L、胱硫醚β-裂解酶0.1～0.5g/L、D-乳酸脱氢酶200～300KU/L、EDTA 0.5～2g/L、BSA 1～2g/L、5-磷酸吡哆醛一水合物10～50mg/L、叠氮钠1～2g/L，余量为Trise-HCl缓冲液。
2.权利要求1中所述的试剂甲和权利要求1中所述的试剂乙在制备用于检测同型半胱氨酸的试剂盒中的应用。
3.一种用于检测同型半胱氨酸的试剂盒，包括试剂甲和试剂乙；
试剂甲由三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、L-丝氨酸、NADH、底物稳定剂CCD、叠氮钠和TritonX-100组成；试剂甲中各组分的配比依次为：三(2-羰基乙基)磷盐酸盐2～10mmol：L-丝氨酸1～5mmol：NADH 1～5mmol：底物稳定剂CCD 1～5g：叠氮钠1～2g：TritonX-100 1～2g；
试剂乙由胱硫醚β-合成酶、胱硫醚β-裂解酶、D-乳酸脱氢酶、EDTA、BSA、5-磷酸吡哆醛一水合物和叠氮钠组成；试剂乙中各组分的配比依次为：胱硫醚β-合成酶2～3g：胱硫醚β-裂解酶0.1～0.5g：D-乳酸脱氢酶200～300KU：EDTA 0.5～2g：BSA 1～2g：5-磷酸吡哆醛一水合物10～50mg：叠氮钠1～2g。
4.权利要求3中所述的试剂甲和权利要求3中所述的试剂乙在制备用于检测同型半胱氨酸的试剂盒中的应用。
5.一种用于检测同型半胱氨酸的试剂盒，包括试剂甲和试剂乙；
试剂甲由三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、L-丝氨酸、NADH、底物稳定剂CCD、叠氮钠和TritonX-100组成；
试剂乙由胱硫醚β-合成酶、胱硫醚β-裂解酶、D-乳酸脱氢酶、EDTA、BSA、5-磷酸吡哆醛一水合物和叠氮钠组成。
6.权利要求5中所述的试剂甲和权利要求5中所述的试剂乙在制备用于检测同型半胱氨酸的试剂盒中的应用。
7.一种用于检测同型半胱氨酸的试剂盒，包括试剂甲和试剂乙；
试剂甲的组成：三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、L-丝氨酸、NADH、底物稳定剂CCD、叠氮钠、TritonX-100，余量为Trise-HCl缓冲液；
试剂乙的组成：胱硫醚β-合成酶、胱硫醚β-裂解酶、D-乳酸脱氢酶、EDTA、BSA、5-磷酸吡哆醛一水合物、叠氮钠，余量为Trise-HCl缓冲液。
8.权利要求7中所述的试剂甲和权利要求7中所述的试剂乙在制备用于检测同型半胱氨酸的试剂盒中的应用。
9.5-磷酸吡哆醛或5-磷酸吡哆醛水合物的应用，为如下(a)或(b)：
(a)作为基于循环酶法检测同型半胱氨酸的检测试剂中的稳定剂；
(b)增加基于循环酶法检测同型半胱氨酸的检测试剂的稳定性。
10.权利要求1至8中任一所述试剂盒在检测同型半胱氨酸中的应用。
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