CN110702676A - 一种稳定性好的检测1,5-ag的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种稳定性很好的医学检测领域的检测1,5‑AG的试剂盒及方法。本发明所述试剂盒通过选择适宜的方法和稳定剂使试剂R1和试剂R2在高葡萄糖浓度的干扰下,在效期内保持稳定。本发明通过吡喃糖氧化酶法测定人体血清样本中的1,5‑AG含量。试验结果显示,本发明所述的1,5‑AG测定试剂盒相比其他市场上在售试剂盒抗葡萄糖干扰能力强,能够消除1‑30mM/L的内源性葡萄糖干扰,并且在37℃加速条件下,稳定存放7天,较市场上其他1,5‑AG测定试剂盒的加速稳定性好,并且该发明有准确度高,精密度高,线性范围广,稳定性好等特点,可广泛应用于糖尿病的诊断与治疗。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂生化试剂技术领域,具体涉及一种稳定性好的1,5-AG测定试剂盒及其检测方法。
背景技术
治疗糖尿病的主要目标是预防其慢性并发症的发生、延缓其慢性并发症的进展,降低致残率和病死率并改善患者的生存质量。研究发现血清I 5-AG能精确地检测出血糖的轻微变化,而果糖胺和HbA1c则不能。1,5-AG 反映糖尿病人血糖的近一周变化,糖化血红蛋白水平主要反映过去2-3个月血糖变化,果糖胺则反映过去10-14天血糖变化。虽然测定FPG能发现这种变化,但不如1,5-AG敏感。1,5- AG降低时半衰期较短,反映的是近10日的血糖控制情况,而上升时半衰期则较长(30~50天)。当1,5- AG星低值时,表示近期血糖控制不佳。控制改善时,1,5- AG值又以每日0.2~0.3mg/L依次递增。故认为1,5- AG测定能更准确的反映糖尿病患者短期的血糖控制状态,这在快速监测药物疗效和类固醇药物使血糖恶化的作用方面更具有优越性。1,5- AG还可作为早期预测糖尿病病情好转与恶化趋势的敏感指标。由于1,5 - AG的异常值比HbA1c、 FMN的幅度范围明显增大,参考值与病理值的上下限重叠现象甚少,故其实验误差小,准确度及灵敏度高,易于检出血糖平均水平的微小变化。且在血糖正常的边缘范围内也可明显降低。这一点在HbA1c和FMN难以完成,因此,血中1,5 - AG可作为血糖控制状态早期的警报。
1,5-脱水-D-山梨醇是一种具吡喃环结构的六碳单糖,是吡喃葡萄糖C-1位置上缺少一个羟基的还原型。高血糖时1,5-AG与葡萄糖一起从肾小球滤出,尿1,5-AG排出量也随之增加,使其血液中浓度明显下降。高血糖持续时间越长,1,5-AG水平就越低。1,5-AG代谢稳定,在糖尿病的诊断与治疗中很有价值。
1,5-AG检测方法有很多种,有利用液相层析系统、气相色谱质子层析技术以及离子交换柱层析系统等来测定1,5-AG和消除葡萄糖的干扰。这些方法的优点是灵敏度高,测定结果准确,但其操作繁琐,且均需要昂贵的专用仪器,不适合临床常规检测。目前测定1,5-AG主要采用全酶法测定,主要有氧化酶法和脱氢酶法两种方法。目前应用较多的是吡喃糖氧化酶法,且这两种方法都会受到血清中葡萄糖的干扰,严重影响测定结果,所以需要一系列的酶参与消除葡萄糖干扰。目前消除葡萄糖干扰有GOD法、HK和G6PD结合法以及HK和PK结合法三种。其中GOD法因颜色干扰无法消除葡萄糖,,所以不能使用。后两种方法目前均有使用。但因HK酶稳定性较差,导致了1,5-AG检测试剂盒的稳定性不好。且随着放置时间的延长使得其消除葡萄糖的能力减弱。
发明内容
鉴于此,本发明的目的在于解决1,5-AG稳定性的问题,以及对高浓度葡萄糖的消除反应,以便于运输并使应用更加广泛。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种1,5-脱水-D山梨醇的检测试剂盒,该试剂盒包含用于消除葡萄糖反应的试剂R1、主反应试剂R2和校准品;其中试剂R1主要是通过己糖激酶,在ATP存在下,将葡萄糖转化为葡萄糖六磷酸和ADP,ADP和磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的作用下生成ATP和丙酮酸,达到消除葡萄糖的目的。因天然HK酶在高温情况下不稳定,所以本发明应用了重组HK酶,并加入了稳定剂,使试剂更加稳定。所述试剂R2包含吡喃糖氧化酶和过氧化物酶,1,5-AG在吡喃糖氧化酶的作用下转化成1,5-脱水果糖和过氧化氢,过氧化氢与显色底物在过氧化物酶的作用下形成红色的醌亚胺化合物,从而引起546处吸光度的上升,此种变化与样本中的1,5-AG含量成比例。
本发明的检测原理如下:
a.葡萄糖的消除反应原理如下:
b.血清样本中1,5-AG检测原理如下:
其中试剂R1中包含缓冲溶液、己糖激酶、丙酮酸激酶、ATP、4-氨基安替吡啉、磷酸烯醇式丙酮酸,稳定剂、酶保护剂、酶促进剂、防腐剂;试剂R2包含缓冲液、吡喃糖氧化酶、过氧化物酶、显色剂、防腐剂、稳定剂。
本发明所述试剂R1组分浓度为:缓冲液 0.1-100mmol/L、己糖激酶 0.1-50KU/L、丙酮酸激酶 0.1-50KU/L、ATP 0.1-20mmol/L、4-氨基安替吡啉 0.1-30mmol/L、磷酸烯醇式丙酮酸0.1-50mmol/L,稳定剂 0.1-10g/L、酶保护剂 0. 1-10g/L、酶促进剂0.1-30mmol/L、防腐剂 0.1-10g/L;所述试剂R2组分浓度为:缓冲液 0.1-100mmol/L、吡喃糖氧化酶10-100KU/L、过氧化物酶1-100KU/L、显色剂0.1-50mmol/L、防腐剂0.1-10g/L、稳定剂0.1-10g/L。
本发明所述试剂R1组分优选的浓度为:缓冲液 50.05mmol/L、己糖激酶 25.05KU/L、丙酮酸激酶 25.05KU/L、ATP 10.05mmol/L、4-氨基安替吡啉 15.05mmol/L、磷酸烯醇式丙酮酸25.05mmol/L,稳定剂 5.05g/L、酶保护剂 5.05g/L、酶促进剂15.05mmol/L、防腐剂5.05g/L;所述试剂R2组分优选的浓度为:缓冲液 50.05mmol/L、吡喃糖氧化酶55KU/L、过氧化物酶50.5KU/L、显色剂25.05mmol/L、防腐剂5.05g/L、稳定剂5.05g/L。
优选的试剂R1中,所述的缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl,MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种;试剂R2中,所述的缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl,MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种。
优选的所述试剂R1和试剂R2中的缓冲液的PH值为6.0-9.0。
为了提高该发明试剂盒的稳定性,优选的试剂R1和R2中的稳定剂为Triton X系列,甘油,吐温系列。试剂R1中的酶保护剂为经过修饰以后的磷酸化合物,编号为WD-001。试剂R1中的酶促进剂为氯化镁,硫酸镁,氯化钾,硫酸钾。试剂R1和R2中的防腐剂为叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列,优选Proclin300。试剂R2中的显色剂为对羟基苯甲酸。
本发明还提供了一种上述1,5-AG测定试剂盒的检测方法,包括以下步骤:
(1)依次加入试剂R1,待测样本,混匀,37℃下温育4-10分钟,后加入试剂R2,混匀,37℃温育4-10分钟后,546nm波长下测定吸光度。
(2)根据定标的标准曲线计算待测样品中1,5-AG的浓度。
优选的,标准曲线采用1,5-AG校准品定标,1,5-AG校准品的浓度为0-500μmol/L。
本发明所述试剂盒通过选择适宜的方法和稳定剂使试剂盒能够消除高浓度的内源性葡萄糖,且试剂R1和试剂R2在效期内保持稳定。本发明利用吡喃糖氧化酶法测定人体血清样本中的1,5-AG含量。试验结果表明,本发明所述的1,5-AG测定试剂盒相比其他市场上在售试剂盒抗葡萄糖干扰能力强,能够消除1-30mM/L的内源性葡萄糖干扰,且稳定性较好,在37℃加速条件下,稳定存放7天,在冷藏状态下至少能稳定存放13个月,较市场上其他1,5-AG测定试剂盒的稳定性好,且测定结果准确度和精密度高,线性范围广。
附图说明
图1所示是在售1,5-AG检测试剂盒线性图。
图2所示是本发明1,5-AG检测试剂盒线性图。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种稳定性好的检测1,5-AG的试剂盒及方法。通过实施例进一步阐述本发明的技术手段、优点及功效,以下实施例旨在说明本发明,但并不限定本发明的范围,相关领域的技术人员在没有背离本发明的主旨和范围内,可对实施例进行更换和修改,但这些修改和更换均在本发明保护范围内。
实施例1
血清中1,5-AG检测试剂盒的制备过程:
试剂R1的组成成分及浓度:
MES(pH6.0) 50mmol/L
己糖激酶 15KU/L
丙酮酸激酶 10KU/L
ATP 5mmol/L
4-氨基安替吡啉 3mmol/L
磷酸烯醇式丙酮酸 3mmol/L
Triton X-100 5g/L
WD-001 5g/L
氯化镁 6mmol/L
Proclin300 5g/L;
试剂R1的组成成分及浓度:
HEPES(pH7.5) 50mmol/L
吡喃糖氧化酶 50KU/L
过氧化物酶 20KU/L
对羟基苯甲酸 10mmol/L
Proclin300 5g/L
Triton X-100 5g/L。
血清中1,5-AG检测试剂盒在全自动生化分析仪上的应用:
分析方法:两点终点法
反应方向:上升反应
校准方式:line
测定主波长:546nm
测定副波长:700nm
测定温度:37℃
加样量比例:样本:R1:R2=6:180:60(μL)
操作步骤:将6μL检测样本加入到180μL试剂R1中,37℃孵育3-5分钟后读取吸光度A1,后加入试剂R2 60μL,混匀,37℃温育5分钟后读取吸光度A2,计算ΔA=A2-A1。
定标:采用两点定标法,用东芝-40全自动生化分析仪进行检测,校准品浓度为:180.0μmol/L。
实施例2
1,5-AG测定试剂盒性能评估
一、分析灵敏度
以实施例1配制的本发明试剂盒B与市场在售1,5-AG测定试剂盒A利用各自的校准品同时定标,其结果见表1。
表1在售1,5-AG测定试剂盒与本发明试剂盒定标结果
由表1可以看出,本发明试剂盒B在1,5-AG含量为150μmol/L时,吸光度变化率是0.0572,在售试剂盒A在1,5-AG含量为150μmol/L时,吸光度变化率是0.0330,由此可见本发明试剂盒B的分析灵敏度明显高于在售试剂盒A的分析灵敏度。
二、准确度测定
以实施例1配制的本发明试剂盒B与市场在售1,5-AG测定试剂盒A通过回收实验测定准确度。
在临床血清样本中加入一定体积的标准溶液(标准溶液是由西格玛奥德里奇中国有限公司生产的1,5-脱水-D-山梨醇纯品,参照其说明书进行配制),通过测值计算其回收率。测定结果及回收率见表2。
表2在售1,5-AG测定试剂盒与本发明试剂盒准确度测定结果
单位:μmol/L
由表2可以看出,本发明试剂盒B较在售试剂盒A的回收率更接近100%,说明本发明试剂盒B的准确度较在售试剂盒A高。
三、加速稳定性检测
以实施例1配制的本发明试剂盒B与市场在售1,5-AG测定试剂盒A通过水浴37℃加速后,定标,并测定10例新鲜血清样本。测定结果见表3、表4。
表3 在售1,5-AG测定试剂盒与本发明试剂盒加速后定标结果
表4 在售1,5-AG测定试剂盒与本发明试剂盒加速后测定10例新鲜血清样本结果
单位:μmol/L
通过表4可以看出,本发明试剂盒B在37℃加速3天、5天、7天、10天后,测定10例新鲜血清样本平均值的偏差小于5%,性能稳定。在售试剂盒A在37℃加速3天、5天、7天后,测定10例新鲜血清样本平均值的偏差小于10%,加速10天后测定10例新鲜血清样本平均值较没加速前的偏差为18%。可以看出本发明试剂盒B在37℃加速稳定性较好。
四、抗血糖干扰实验
以实施例1配制的本发明试剂盒B以及以实施例1配制的本发明试剂盒C在37℃加速7天,与市场在售1,5-AG测定试剂盒A通过血糖干扰实验测定抗血糖的最高浓度。具体操作方法:先测定基础血清中的葡萄糖含量,后将基础血清样本分成五等分,向其中四分分别添加等体积不同浓度的葡萄糖溶液,形成含葡萄糖终浓度为50mmol/L、30mmol/L、15mmol/L、7.5mmol/L的血清样本,第五份基础血清样本中添加等体积的纯化水。利用上述ABC三种试剂分别对该五分样本进行测定,其结果见表5。
表5 在售1,5-AG测定试剂盒与本发明试剂盒抗血糖干扰实验结果
单位:μmol/L
由表5可以看出,本发明试剂盒B和37℃加速7天后的本发明试剂盒C测定血糖含量为30mmol/L的血清样本其回收率分别为4.24%和4.76%,血糖含量为50mmol/L的血清样本其回收率分别为12.10%和12.87%;市场在售1,5-AG测定试剂盒A在测定血糖含量为30mmol/L的血清样本其回收率为17.87%,50mmol/L的血清样本其回收率分别为163.32%。说明本发明试剂盒不论是冷藏放置还是加速以后消除30mmol/L的葡萄糖干扰结果较好。
五、线性检测
以实施例1配制的本发明试剂盒B与市场在售1,5-AG测定试剂盒A通过测定由1,5-AG纯品(纯品来源于西格玛奥德里奇中国有限公司生产的1,5-脱水-D-山梨醇纯品)配制成的一系类浓度梯度的标准溶液,进行线性测定。其线性结果见表6、表7、图1、图2。
表6 在售1,5-AG测定试剂盒线性结果
表7 本发明1,5-AG测定试剂盒线性结果
由表6、表7、图1、图2可知,本发明1,5-AG检测试剂盒线性相关系数R2为1,[1.2,37.5]μmol/L范围内,绝对偏差小于±1.2μmol/L;在(37.5,300]μmol/L范围内,相对偏差小于±0.5%。在售1,5-AG检测试剂盒线性相关系数R2为0.9998,线性很好,[1.2,37.5] μmol/L范围内,绝对偏差小于±1.8μmol/L;在(37.5,300]μmol/L范围内,相对偏差小于±2.0%。本发明1,5-AG检测试剂盒的线性很好。
Claims (13)
1.一种1,5-脱水-D山梨醇的检测试剂盒,其特征在于该试剂盒包含用于消除葡萄糖反应的试剂R1、主反应试剂R2和校准品;其中试剂R1中包含缓冲溶液、己糖激酶、丙酮酸激酶、ATP、4-氨基安替吡啉、磷酸烯醇式丙酮酸,稳定剂、酶保护剂、酶促进剂、防腐剂;试剂R2包含缓冲液、吡喃糖氧化酶、过氧化物酶、显色剂、防腐剂、稳定剂。
2.根据权利要求1所述的1,5-AG测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R1组分浓度为:缓冲液 0.1-100 mmol/L、己糖激酶 0.1-50 KU/L、丙酮酸激酶 0.1-50 KU/L、ATP 0.1-20mmol/L、4-氨基安替吡啉 0.1-30 mmol/L、磷酸烯醇式丙酮酸0.1-50 mmol/L,稳定剂 0.1-10 g/L、酶保护剂 0. 1-10 g/L、酶促进剂0.1-30 mmol/L、防腐剂 0.1-10g/L;所述试剂R2组分浓度为:缓冲液 0.1-100 mmol/L、吡喃糖氧化酶10-100 KU/L、过氧化物酶1-100 KU/L、显色剂0.1-50 mmol/L、防腐剂0.1-10g/L、稳定剂0.1-10 g/L。
3.根据权利要求2所述的1,5-AG测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R1组分浓度为:缓冲液 50.05 mmol/L、己糖激酶 25.05 KU/L、丙酮酸激酶 25.05KU/L、ATP 10.05 mmol/L、4-氨基安替吡啉 15.05 mmol/L、磷酸烯醇式丙酮酸25.05mmol/L,稳定剂 5.05 g/L、酶保护剂 5.05 g/L、酶促进剂15.05mmol/L、防腐剂 5.05g/L;所述试剂R2组分浓度为:缓冲液50.05 mmol/L、吡喃糖氧化酶55KU/L、过氧化物酶50.5 KU/L、显色剂25.05 mmol/L、防腐剂5.05g/L、稳定剂5.05g/L。
4.根据权利要求1-3所述的1,5-AG测定试剂盒,其特征在于,试剂R1中,所述的缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl,MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种;试剂R2中,所述的缓冲液为磷酸缓冲液、Tris-HCl,MES缓冲液、HEPES缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的1,5-AG测定试剂盒,其特征在于,所述试剂R1和试剂R2中的缓冲液的PH值为6.0-9.0。
6.根据权利要求1-3所述的1,5-AG测定试剂盒,其特征在于,试剂R1和R2中的稳定剂为Triton X系列,甘油,吐温系列。
7.根据权利要求1-3所述的1,5-AG测定试剂盒,其特征在于,试剂R1中的酶保护剂为经过修饰以后的磷酸化合物,编号为WD-001。
8.根据权利要求1-3所述的1,5-AG测定试剂盒,其特征在于,试剂R1中的酶促进剂为氯化镁、硫酸镁、氯化钾、硫酸钾。
9.根据权利要求1-3所述的1,5-AG测定试剂盒,其特征在于,试剂R1和R2中的防腐剂为叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列。
10.根据权利要求1-3所述的1,5-AG测定试剂盒,其特征在于,试剂R2中的显色剂为对羟基苯甲酸。
11.根据权利要求1-10所述,1,5-AG测定试剂盒的检测方法包括如下步骤:
(1)依次加入试剂R1,待测样本,混匀,37℃下温育4-10分钟,后加入试剂R2,混匀,37℃温育4-10分钟后,546nm波长下测定吸光度;
(2)根据定标的标准曲线计算待测样品中1,5-AG的浓度。
12.根据权利要求11所述,其特征在于,所述的标准曲线采用1,5-AG校准品定标。
13.根据权利要求12所述,其特征在于,1,5-AG校准品的浓度为0-500μmol/L。
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