CN112630216A - 一种检测1,5-ag的试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测1,5‑AG的试剂盒和检测方法。本发明第一方面提供了一种检测1,5‑AG的试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，其中，所述第一试剂包括葡萄糖变构酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、胆红素氧化酶、4‑AAP、表面活性剂、pH缓冲液、防腐剂以及稳定剂，所述第二试剂包括吡喃糖氧化酶、TOOS、pH缓冲液、防腐剂和稳定剂。采用本发明提供的试剂盒，能够利用紫外、可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪检测出1,5‑AG的浓度，检测过程中不受葡萄糖，甘露糖，果糖等血清重糖类化合物的干扰，具有稳定性高、检测速度快、准确度高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及临床生化诊断领域，尤其涉及一种检测1,5-AG的试剂盒和检测方法。
背景技术
1,5-脱水山梨醇(1,5-anhydroglucitol,1,5-AG)，又叫做2-脱氧葡萄糖、1,5-脱水葡萄糖醇，分子式为C6H12O5(分子量164.2，CAS号为154-58-5)，是一种具有吡喃环结构的六碳单糖，其结构与吡喃葡萄糖结构十分相似，主要区别在于吡喃葡萄糖C-1 位置上的羟基被氢所取代，形成C1椅形氧环，其结构决定了其具备较好的化学稳定性。
1,5-AG的浓度检测具有重要的临床意义，例如：正常情况下，血清中1,5-AG代谢稳定，浓度稳定在12-40mg/L，但当人体患糖尿病时，血清中1,5-AG的浓度会显著降低，主要原因是当人体患糖尿病时，大量葡萄糖由尿中排出竞争性的抑制了1,5-AG 的重吸收，从而使得1,5-AG大量经尿排出，导致血清中1,5-AG浓度降低，因此，血清中1,5-AG的浓度水平用于糖尿病诊断和疗效检测的常规指标；在非糖尿病人群中 1,5-AG浓度可以作为餐后血糖的筛查指标，监测餐后高血糖相关的心血管危险的发生；在慢性肾功能衰竭的病人的血清或尿液中1,5-AG的浓度也会明显下降，这是由于 1,5-AG重吸收减少造成的，血清或尿液中1,5-AG的浓度可很好的反映肾小管重吸收功能。
1,5-AG浓度的检测方法有很多，目前可实现自动分析的方法主要包括 ADP-HK-NADPH法和GK-PROD法，其中，ADP-HK-NADPH法原理主要为：1,5-AG 在ADP依赖性己糖激酶(ADP-HK)的作用下生成AG-6磷酸(AG-6-P)，AG-6-P再和 NADP进行反应，生成NADPH，NADPH具有还原性，和显色剂作用生成显色物质，通过对显色物质进行比色，即可得知1,5-AG的浓度；GK-PROD法的原理主要为：使用吡喃糖氧化酶(PROD:EC1.1.3.10)、葡萄糖激酶(EC2.7.1.2)和三磷酸腺苷(ATP) 重生系统可检测1,5-AG的浓度变化，葡萄糖激酶和ATP重生系统可将葡萄糖转化为不与吡喃糖氧化酶反应的葡萄糖-6-磷酸，吡喃糖氧化酶氧化1,5-AG生成的过氧化氢可通过TRINDER反应进行检测，该方法可针对1,5-AG进行检测，可避免葡萄糖的干扰。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种检测1,5-AG的试剂盒和检测方法。
为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种检测1,5-AG的试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，其中，所述第一试剂包括葡萄糖变构酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、胆红素氧化酶、4-AAP、表面活性剂、pH缓冲液、防腐剂以及稳定剂，所述第二试剂包括吡喃糖氧化酶、TOOS、pH缓冲液、防腐剂和稳定剂；
所述pH缓冲液控制所述第一试剂和第二试剂的pH为5.00-9.00。
进一步地，所述第一试剂中各组分的含量为：葡萄糖变构酶1-100KU/L、葡萄糖氧化酶1-100KU/L、过氧化物酶1-100KU/L、抗坏血酸氧化酶1-10008KU/L、胆红素氧化酶1-100KU/L、表面活性剂0.05-200g/L、pH缓冲液5-500mmol/L、稳定剂 0.05-200g/L、防腐剂0.05-10g/L；所述第二试剂中各组分的含量为：吡喃糖氧化酶 1-100KU/L、TOOS0.05-200g/L、表面活性剂0.05-200g/L、pH缓冲液5-500mmol/L、稳定剂0.05-200g/L、防腐剂0.05-10g/L。
进一步地，所述表面活性剂为曲拉通类、吐温类、布里杰类中的一种或多种。
进一步地，所述pH缓冲液为MES、MOPS、MOPSO、PIPES、HEPES、TES、 ADA、Tris、Bis-Tris、磷酸、柠檬酸、醋酸、碳酸、硼酸中的一种或多种，所述pH 缓冲液的浓度为5-500mmol/L。
进一步地，所述防腐剂为叠氮钠、PC300、山梨酸钾、新霉素、庆大霉素中的一种或多种。
进一步地，所述稳定剂为聚乙二醇类、多羟基醇类、金属离子络合剂中的一种或多种。
本发明第二方面提供了一种使用上述任一所述试剂盒的检测方法，包括如下检测步骤：
配制样品空白、样品、标准空白以及标准品，分别加入第一试剂，在30-37℃下反应，反应结束后，加入第二试剂，待反应结束后，测定相应的吸光度，计算得到样品中1,5-AG的浓度。
进一步地，根据式1计算所述样品中1,5-AG的浓度：
其中，A样品表示样品的吸光度、A样品空白表示样品空白的吸光度、A标准品表示标准品的吸光度、A标准空白表示标准空白的吸光度。
进一步地，测定吸光度时，波长为340-800nm。
进一步地，所述样品空白、样品、标准空白以及标准品的体积为1.5-50μL，所述第一试剂的体积为20-300μL，所述第二试剂的体积为20-300μL。
本发明提供了一种检测1,5-AG的试剂盒，其包括第一试剂和第二试剂，其检测原理如下：第一试剂中的葡萄糖变构酶将α-葡萄糖转化成β-D葡萄糖，β-D葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下和氧气、水产生葡萄糖酸内酯和双氧水，双氧水被4-AAP和过氧化物酶转化成无色化合物，避免样品中内源性葡萄糖的干扰；随后加入第二试剂，吡喃糖氧化酶将1,5-AG氧化成1,5-脱水果糖和双氧水，随后双氧水、4-AAP、TOOS在过氧化物酶作用下产生红色醌亚胺，通过比色分析即可确定样本中1,5-AG的含量；此外，第一试剂中的抗坏血酸氧化酶用于消除样本中高抗坏血酸的影响，胆红素氧化酶用于消除样本中高胆红素的影响，表面活性剂用于消除样本中甘油三酯的影响。
本发明提供了一种检测1,5-AG的试剂盒和使用该试剂盒的检测方法，采用本发明提供的试剂盒，能够利用紫外、可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪检测出 1,5-AG的浓度，检测过程中不受葡萄糖，甘露糖，果糖等血清重糖类化合物的干扰，具有稳定性高、检测速度快、准确度高的优点。
以下将结合具体实施例对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，其中：
图1为本发明配方配制试剂(研发试剂)和现有技术试剂(对照试剂)测定1,5AG 的结果相关性图。
具体实施方式
以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1：
本实施例提供的试剂盒包括第一试剂和第二试剂，其中，
第一试剂(1L)包括：葡萄糖异构酶5KU、葡萄糖氧化酶10KU、抗坏血酸氧化酶10KU、胆红素氧化酶10KU、过氧化物酶5KU、4-AAP 5mmol、磷酸二氢钠 150mmol、曲拉通X100 20g、乙二胺四乙酸10mmol、叠氮钠5g；
第二试剂(1L)包括：吡喃糖氧化酶800KU、TOOS 5mmol、磷酸盐150mmol、曲拉通X100 20g、乙二胺四乙酸10mmol、叠氮钠5g。
(一)测试本发明实施例1提供的试剂盒的回收率，测试方法包括：
使用一个正常随机血清样本(记录为a)，和一个高浓度的1,5-AG浓度样本 (记录为b)，将样本a体积950μL和样本b体积50μL进行混合(记录为c)；首先测试a样本浓度3次，随后测试样本b浓度3次，最后测试样本c浓度3次；三个样本浓度测试结果见表1：
表1三个样本浓度测试结果
| a | b | c | |
| 1 | 75.62 | 218.56 | 82.56 |
| 2 | 75.73 | 218.15 | 82.71 |
| 3 | 75.45 | 218.34 | 82.18 |
| 均值 | 75.60 | 218.35 | 82.48 |
在血清样品中加入一定体积标准或校准品溶液(标准溶液体积与血清体积比应不大于1：20或其体积比不会产生基质变化，加入标准或校准品溶液后样品总浓度应在试剂盒测定线性范围内，标准品或校准品应有溯源性)或纯品，每个浓度重复测定3次，按式2计算回收率：
其中，R—回收率；
V-加入标准液体积；
V0-人血清样品的体积；
c-人血清样品加入标准液后的测定浓度；
c0-人血清样品的测定浓度；
ca-标准液的浓度。
根据式2计算得到回收率R为97.6％(一般行标回收率为90％-110％)。
(二)将实施例1提供的试剂盒与现有技术中北京九强提供的试剂盒进行比对：使用本发明配方配制试剂(研发试剂)和现有技术试剂(对照试剂)测定1,5 脱水山梨醇的结果相关性，相关性结果见图1，摘取50例血清样本数据见表2：
表2血清样本的测试数据
根据图1可知，相关性为0.999。
(三)将实施例1和北京九强提供的试剂在相同条件下进行37℃加速破坏试验， 10天加速稳定性数据见表3：
表3，研发试剂盒对照试剂的加速稳定性测试结果
| 天数 | 0 | 1 | 3 | 5 | 7 | 8 | 10 |
| 研发 | 100 | 99.6 | 101.2 | 98.7 | 98.2 | 97.5 | 96.8 |
| 对照 | 100 | 98.9 | 97.8 | 92.3 | 89.3 | 87.4 | 80.5 |
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种检测1,5-AG的试剂盒，其特征在于，包括第一试剂和第二试剂：
其中，所述第一试剂包括葡萄糖变构酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶、胆红素氧化酶、4-AAP、表面活性剂、pH缓冲液、防腐剂以及稳定剂；
所述第二试剂包括吡喃糖氧化酶、TOOS、pH缓冲液、防腐剂和稳定剂；
所述pH缓冲液控制所述第一试剂和第二试剂的pH为5.00-9.00。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一试剂中各组分的含量为：葡萄糖变构酶1-100KU/L、葡萄糖氧化酶1-100KU/L、过氧化物酶1-100KU/L、抗坏血酸氧化酶1-10008KU/L、胆红素氧化酶1-100KU/L、表面活性剂0.05-200g/L、pH缓冲液5-500mmol/L、稳定剂0.05-200g/L、防腐剂0.05-10g/L；所述第二试剂中各组分的含量为：吡喃糖氧化酶1-100KU/L、TOOS0.05-200g/L、表面活性剂0.05-200g/L、pH缓冲液5-500mmol/L、稳定剂0.05-200g/L、防腐剂0.05-10g/L。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为曲拉通类、吐温类、布里杰类中的一种或多种。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述pH缓冲液为MES、MOPS、MOPSO、PIPES、HEPES、TES、ADA、Tris、Bis-Tris、磷酸、柠檬酸、醋酸、碳酸、硼酸中的一种或多种，所述pH缓冲液的浓度为5-500mmol/L。
5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠、PC300、山梨酸钾、新霉素、庆大霉素中的一种或多种。
6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为聚乙二醇类、多羟基醇类、金属离子络合剂中的一种或多种。
7.一种使用权利要求1-6任一项所述试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下检测步骤：
配制样品空白、样品、标准空白以及标准品，分别加入第一试剂，在30-37℃下反应，反应结束后，加入第二试剂，待反应结束后，测定相应的吸光度，计算得到样品中1,5-AG的浓度。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，根据式1计算所述样品中1,5-AG的浓度：
其中，A样品表示样品的吸光度、A样品空白表示样品空白的吸光度、A标准品表示标准品的吸光度、A标准空白表示标准空白的吸光度。
9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，测定吸光度时，波长为340-800nm。
10.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述样品空白、样品、标准空白以及标准品的体积为1.5-50μL，所述第一试剂的体积为20-300μL，所述第二试剂的体积为20-300μL。
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