CN102435749B - 用循环酶法测定β-羟丁酸的液体稳定试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用循环酶法测定β-羟丁酸的液体稳定试剂盒，由试剂1和2组成，试剂1：缓冲液50-500mmol/L，β-羟丁酸脱氢酶1-5KU/L，黄递酶1-5KU/L，表面活性剂0.1-100g/L，稳定剂1-100mmol/L，抗干扰剂I 0.1-100g/L，抗干扰剂II 0.1-100g/L，防腐剂0.1-100ml/L；试剂2：缓冲液50-500mmol/L，辅酶I 1-20mmol/L，硝基四氮唑蓝0.1-10mmol/L，稳定剂1-100mmol/L，防腐剂0.1-100ml/L。本发明具有稳定、线性范围大、测量准确度和精密度高、抗干扰能力强、成本较低的优点。

Description

用循环酶法测定β-羟丁酸的液体稳定试剂盒

技术领域

本发明属于医学检验测定技术领域，具体涉及一种用循环酶法测定β-羟丁酸的液体稳定试剂盒。

背景技术

酮体是脂肪代谢的产物，正常人体内的每个细胞均含有脂肪酸，当体内需要更多的能量，如超出摄入食物产生的葡萄糖能提供的能量时，就要求脂肪细胞释放脂肪酸进入血液，然后脂肪酸被运输到肝脏转化为酮体。该酮体包括丙酮、乙酰乙酸和β-羟丁酸，这三者处于动态平衡之中。其中β-羟丁酸含量最多，可占酮体总量的75％。酮体和血糖一样，是检测代谢控制的一项重要的标记物。I型糖尿病病人的最重要的特征之一就是易发展成为酮症酸中毒，酮症酸中毒是一种威胁生命的疾病，因此及时准确地检测酮体水平是十分关键的预知酮症酸中毒的重要手段。此外，酮体还是监测糖尿病控制和诊断酮症酸中毒以及监测治疗的重要标志物。

特别是糖尿病孕妇易发展成为高酮体水平，这可能极大的影响胎儿的生长发育。在糖尿病控制不良的孕妇中，母体酮血症与死胎率增高相关，并且会削弱婴儿的神经生理功能的发展。另外监测血酮体对控制酮源性饮食也十分必要。

目前，酮体试验普遍采用的是以硝普盐反应为基础的定性或半定量检测，并且只检测乙酰乙酸或丙酮；其中乙酰乙酸只占酮体23％且不稳定，丙酮占酮体2％。而且，该方法采用的是化学法，因此造成灵敏度低、特异性差，有较高的假阳性或假阴性结果。此外，在糖尿病酮症发生早期，β-羟丁酸有明显升高，而乙酰乙酸尚无明显反应；在酮症酸中毒恢复期，β-羟丁酸迅速下降时，乙酰乙酸在一定时间内仍然保持下降缓慢。因此，β-羟丁酸测定在糖尿病控制好坏的预告中比乙酰乙酸更敏感、可靠。同样，在糖尿病酮症及其他碳水化合物代谢障碍的诊断、监测与治疗中，也是一个很好的指标。

β-羟丁酸检测方法有高效液相色谱法、化学方法和酶法，其中酶法测定血清β-羟丁酸因具有准确、简便、快速、灵敏和特异的特点，受到临床的广泛重视。目前有2种方法，其一是酶动力学法，在辅酶I(NAD⁺)存在的条件下，β-羟丁酸在β-羟丁酸脱氢酶的作用下生成乙酰乙酸、还原型辅酶I(NADH)及氢离子，反应生成的还原型辅酶I(NADH)在340nm吸光度的变化可以间接反映病人血清中的β-羟丁酸的浓度。其反应过程如下：

另一方法为循环酶比色法，是在β-羟丁酸脱氢酶反应基础上偶联黄递酶，使色原(硝基四氮唑蓝，氧化型INT)生成红色色素(还原型INT)，在505nm处测定吸光度的变化，计算样品中β-羟丁酸的含量。其反应过程如下：

相比之下，循环酶比色法因偶联了一个酶，其灵敏度较动力学法提高了10倍，线性范围也大为提高，并且由于反应是循环往复的进行的，因此减少了原料的投入量，降低了成本。但由于循环酶比色法试剂中氧化型INT溶解度差且不稳定，目前国内试剂公司大部分采用三试剂法，即临用时将含有硝基四氮唑蓝的溶液混入试剂1中，并且此混合液在2～8℃仅能稳定30天，相比之下，操作步骤复杂且试剂稳定性远不及动力学法。同时由于测定易受乳酸、抗坏血酸治疗的影响，致使其在临床上的大规模推广应用受到限制。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种稳定、线性范围大、测量准确度和精密度高、抗干扰性强的用循环酶法测定β-羟丁酸的液体稳定试剂盒，用来判断人体酮症酸中毒程度。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：用循环酶法测定β-羟丁酸的液体稳定试剂盒，该试剂盒为由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中

试剂1(R1)各组分及浓度为：

试剂2(R2)各组分及浓度为：

本发明上述试剂1中的缓冲液为Tris缓冲液、GOOD’S缓冲液、三乙醇胺缓冲液等中的一种，优选三乙醇胺缓冲液(盐酸三乙醇胺缓冲液)。

本发明上述试剂2中的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液等中的一种，优选醋酸-醋酸钠缓冲液。

本发明的表面活性剂为Tween 20、Tween 80、Brij 35、Triton X-100等非离子表面活性剂中的一种。

本发明的稳定剂是多元醇(如甘露醇、丙三醇等)、BSA(N，O-双三甲硅基乙酰胺)、β-环糊精、甘露醇等中的一种。

本发明的抗干扰剂I和抗干扰剂II均为选自草酸盐、草酸、EDTA(乙二胺四乙酸)、EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)、维生素C氧化酶、谷胱甘肽等中的一种。

本发明的防腐剂为NaN₃或proclin系列防腐剂(如Proclin300)等。

本发明试剂1和试剂2的配制方法为常规方法，即按照上述配方比例，分别将试剂1和试剂2所述的各组分分别加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。

本发明试剂盒测定样本中的β-羟丁酸的测试条件如下：温度：30-37℃；比色杯光径为1.0cm。检测主波长505nm，副波长700nm。

应用本发明β-羟丁酸测定试剂盒测定样本中总胆红素的方法如下：样品(校准管以校准品做样品)加R1混匀，30-37℃孵育3-5min后读取吸光度A0，立即加入R2混匀，30-37℃反应5min后，读取吸光度A1，ΔA＝A1-A0。其中样本用量6μl，试剂1用量225μl，试剂2用量75μl。

本发明试剂盒测定样本中β-羟丁酸含量按以下公式进行计算：

本发明的突出实质性特点及显著进步主要表现在：

1)采用循环酶法，保证了反应的专一性、测定的高特异性，线性范围大，且成本较低；

2)通过将碱性条件下较稳定的反应物和酸性条件下较稳定的反应物分别配制为试剂1和试剂2，并加入相应的保护剂对酶及底物进行保护，得到稳定的液体双试剂，解决了反应物硝基四氮唑蓝不稳定带来的试剂检测步骤复杂且不稳定的缺陷。本发明的液体试剂在2-8℃至少可稳定12个月，能够直接使用，无需复溶，方法简便，易操作，可快速得到检测结果，不需要特殊或额外的仪器，便于行业内推广应用；

3)通过添加抗干扰剂增强了试剂盒的抗干扰性，反应不受样本中的乳酸脱氢酶、乳酸、抗坏血酸等的影响。

附图说明

附图本发明实施例试剂盒试样在0-6.9mmol/L的范围内检测的线性分布图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案作进一步描述，但本发明并不限于这些实施例。

本发明循环酶法反应测定β-羟丁酸是在酶动力学法反应测定β-羟丁酸的基础上偶联了一步酶反应，反应过程当中，首先β-羟丁酸被β-羟丁酸脱氢酶及辅酶I特异性氧化，生成乙酰乙酸、还原型辅酶I及氢离子，生成的还原型辅酶I和INT(氧化型)在黄递酶的催化下反应又生成辅酶I和INT(还原型)，如此循环往复，监测生成的INT(还原型)，在505nm波长处测定吸光度的变化。其反应方程式如下：

实施例1

试剂1：Tris-HCl(pH 9.0) 50mmol/L

β-羟丁酸脱氢酶    1KU/L

黄递酶    1KU/L

Tween 20    10g/L

BSA    10mmol/L

EDTA-2Na    20g/L

谷胱甘肽    1g/L

Proclin 300    1ml/L

试剂2：柠檬酸-柠檬酸三钠(pH 4.5) 50mmol/L

辅酶I    2.5mmol/L

硝基四氮唑蓝    1mmol/L

甘露醇    10mmol/L

Proclin 300    2ml/L

试剂1和试剂2的配制方法为常规方法，即试剂1和试剂2所述组分分别加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。

实施例2

试剂1：三乙醇胺缓冲液(pH 7.0) 100mmol/L

β-羟丁酸脱氢酶    2.5KU/L

黄递酶    2.5KU/L

Triton X-100    1g/L

丙三醇    20mmol/L

EDTA-2Na    20g/L

维生素C氧化酶    40g/L

Proclin 300    5ml/L

试剂2：醋酸-醋酸钠(pH 4.0)  100mmol/L

辅酶I    10mmol/L

硝基四氮唑蓝    5mmol/L

β-环糊精    10mmol/L

Proclin 300    3ml/L

实施例2试剂盒的制备方法同实施例1。

实施例3

试剂1：GOOD’S(pH 8.5) 200mmol/L

β-羟丁酸脱氢酶    5KU/L

黄递酶    5KU/L

Tween 80    5g/L

甘油    10mmol/L

草酸    20g/L

维生素C氧化酶    100g/L

Proclin 300    1ml/L

试剂2：甘氨酸缓冲液(pH 3.5) 200mmol/L

辅酶I    20mmol/L

硝基四氮唑蓝    10mmol/L

甘露醇    10mmol/L

Proclin 300    1ml/L

实施例3试剂盒的制备方法同实施例1。

应用本发明实施例试剂盒测定样本中的β-羟丁酸的测试条件如下：温度：30-37℃；比色杯光径为1.0cm。检测主波长505nm，副波长700nm。

应用本发明实施例β-羟丁酸测定试剂盒测定样本中总胆红素的方法如下：样品(校准管以校准品做样品)加R1混匀，30-37℃孵育3-5min后读取吸光度A0，立即加入R2混匀，30-37℃反应5min后，读取吸光度A1，ΔA＝A1-A0。其中样本用量6μl，试剂1用量225μl，试剂2用量75μl。

本发明试剂盒测定样本中β-羟丁酸含量按以下公式进行计算：

得到本发明β-羟丁酸测定试剂盒测定样本中β-羟丁酸的浓度。

下面结合表格和附图对本发明实施例3所得试剂盒的性能进行说明。

1、试剂盒稳定性

(1)37℃加速稳定性实验

该实施例配制试剂盒稳定性好，配制液体试剂进行37℃加速稳定性实验，37℃加速稳定性试验7天可模拟现实4-8℃保存1年。结果如表1所示：

表1本发明液体试剂进行37℃加速稳定性实验

(2)4-8℃稳定性实验

如表2所示：

表2本发明实施例3的试剂在4-8℃保存1年的实验结果

(3)开盖稳定性实验

试剂定标后开盖放置试剂仓中，定期检测固定质控品。检测试剂在使用过程中的稳定性性能。结果具体如表3所示：

表3本发明试剂使用过程中的稳定性性能

时间(天)	质控品I 0.28(0.24-0.33)	质控品II 1.20(1.02-1.38)
			1	0.279	1.202
3	0.283	1.200
			5	0.274	1.190
7	0.284	1.205
			9	0.274	1.183
11	0.262	1.130
			13	0.282	1.271
15	0.279	1.213

以上数据明显显示，本发明的试剂盒在4℃开盖稳定性能指标表现卓越

(4)运输条件下的稳定性实验

如表4：

表4实施例3试剂盒在运输条件下的稳定性

2、线性范围

采用本领域技术人员已知的方法，对实施例3制备的试剂盒的线性范围检测。将高值标本进行等比稀释10个浓度的样品，在检测仪器上采用试剂盒连续测定3次，计算其均值。计算理论值和检测均值之间的线性偏差。要求回归方程的回归系数R²＞0.99。

实施例3试剂盒，4-8℃保存试剂线性范围数据(如表5和附图)

表5 4-8℃保存试剂线性范围数据

根据以上数据，本发明试剂盒在0-6.9mmol/L的范围内检测呈线性分布。

3、准确值、精密度

对靶值为0.28(0.24-0.33)mmol/L的质控液I和靶值为1.20(1.02-1.38)mmol/L的质控液II在相同条件下，采用试剂盒对同一质控液的β-羟丁酸浓度连续检测20次，将检测结果的平均值与靶值范围进行比较，以检测所述的试剂盒的准确性，同时比较每个测定的变异系数，以检测所述的试剂盒实施例的精密度，结果如表6所示：

表6：

表6的结果表明：试剂盒20次检测结果的平均值在靶值范围内，不准确度相对偏差CV(％)不超过±5％。说明本发明的试剂盒的准确度符合诊断试剂盒的技术指标。

4、试剂盒的抗干扰实验

(1)胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油三酯的干扰

分别按照本领域的常规技术配制含有胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油三酯不同浓度的待测样品，测定实施例3的试剂盒对各种干扰物的抗干扰能力(每个样品一式三份，取其平均值)。检测结果(平均值)如表7所示：

表7

(2)乳酸、乳酸脱氢酶的干扰

分别按照本领域的常规技术配制含有不同浓度的乳酸、乳酸脱氢酶待测样品，测定实施例3的试剂盒对各种干扰物的抗干扰能力(每个样品一式三份，取其平均值)。检测结果(平均值)如表8所示：

表8：

Claims (3)

1.一种用循环酶法测定β-羟丁酸的液体稳定试剂盒，其特征在于：该试剂盒为由试剂1和试剂2组成的液体型双试剂，其中试剂1的各组分及其浓度范围为：

试剂2的各组分及其浓度范围为：

所述述试剂1中的缓冲液为Tris缓冲液、GOOD’S缓冲液、三乙醇胺缓冲液中的一种；所述试剂2中的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液中的一种；所述的表面活性剂为Tween20、Tween80、Brij35、TritonX-100中的一种；所述的稳定剂是多元醇、BSA、β-环糊精、甘露醇中的一种；所述的抗干扰剂I和抗干扰剂II均为选自草酸盐、草酸、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、维生素C氧化酶、谷胱甘肽中的一种；所述的防腐剂为NaN₃或proclin系列防腐剂。

2.根据权利要求1所述用循环酶法测定β-羟丁酸的液体稳定试剂盒，其特征在于：所述述试剂1中的缓冲液为三乙醇胺缓冲液。

3.根据权利要求1所述用循环酶法测定β-羟丁酸的液体稳定试剂盒，其特征在于：所述试剂2中的缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。

Images