CN107782679A - 一种抗干扰的d‑3羟丁酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
D‑3羟丁酸检测试剂盒,不能去除胆红素和VC引起的干扰,以及在稳定性方面不可长时间储存(保证检测结果不偏出正常值5%),因此本发明试剂盒基于以上问题,通过加入稳定剂聚乙二醇、葡聚糖和甘露醇和保护剂丙三醇,以及聚乙烯醇通过不同比例配合而成,使得D‑3羟丁酸的稳定性得到了空前的增强,丙三醇的加入保护了D‑3羟丁酸脱氢酶在较长时间内都保持较强脱氢活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗干扰的D-3羟丁酸检测试剂盒,主要涉及到体外临床检测领域,该产品是生物工程层次重要的高技术产品。
背景技术
随着社会进步,生活水平日益提高,生活中营养过剩,导致糖尿病发率日趋升高,在糖尿病中糖尿病酮症酸中毒是其中一项较为常见的疾病。造成该病的原因主要是血液中血酮体升高引起,酮体主要有三种成分组成,D-3羟丁酸,丙酮酸和乙酰乙酸,但是其中D-3羟丁酸占了总体70%,酮症诊断如果不及时诊断和治疗会给患者带来生命危险,因此D-3羟丁酸检测意义重大不可忽视。
D-3羟丁酸检测有色谱法、电泳法、化学放射法和酶法检测,化学放射法因其危害程度大,不能普及;电泳法操作时间长,操作复杂,不易大批量操作;色谱法特异性差,重复性低;酶法检测抗干扰能力弱,稳定性低。
鉴于以上因素,我们发明了一种抗干扰稳定的D-3羟丁酸检测试剂盒,该发明是在酶法的基础上进行了改进,解决了抗干扰问题和稳定性问题。
发明内容
针对酶法D-3羟丁酸检测试剂盒抗干扰能力弱和稳定性低问题,本发明试剂盒一种抗干扰的D-3羟丁酸检测试剂盒,解决了上述问题。
本发明是通过以下措施实现的:
采用酶法检测来测定血清中的D-3羟丁酸含量,D-3羟丁酸在D-3羟丁酸脱氢酶作用下,NAD提供能量,将D-3羟丁酸氧化成乙酰乙酸和NADH,还原性辅酶INADH在黄迪酶作用下将NBT催化成红色物质,引起505nm处吸光光度值的变化,通过计算吸光光度值变化来计算NADH含量,间接反映出D-3羟丁酸含量。
应用本发明试剂盒,参数设置如下:波长505nm,样本量:试剂R1:试剂R2=10μl:240μl:60μl,反应方向正方向,两点终点,以下实施案例检测均在BS-800全自动生化分析仪上进行检测。
本发明可以应用到迪瑞、迈瑞、日立、东芝等系列的全自动化分析仪中进行自动化检测。
应用本发明检测时,涉及参数如下:以BS-800为例,波长为505nm,样本量:试剂R1:试剂R2=10μl:240μl:60μl,反应方向正方向,两点终点,样本针吸取样本后于试剂R1中进行孵育,以保证反应环境外界条件的稳定,然后读取吸光光度值为ΔA1,进而加入试剂R2,D-3羟丁酸被氧化成乙酰乙酸,NAD被还原成NADH,后者与NBT在黄迪酶作用下生成红色物质,引起505nm波长处吸光光度值的变化,这与NAD的含量成线性关系反应5分钟记录ΔA2,通过计算NAD含量进而计算出D-3羟丁酸含量。
D-3羟丁酸含量=吸光光度值(ΔA2-ΔA1)*标准液浓度
相对于市场上目前流通的重氮法直接胆红素检测试剂盒,本发明试剂盒,重复性好,抗干扰能力强,试剂稳定性好,适用于全自动生化分析仪,临床使用价值较大。
附图说明
图1 实施例1抗干扰性能本发明试剂盒检测结果与对照试剂检测结果对比;
图2 实施例2稳定性能本发明试剂盒检测结果与对照试剂检测结果对比;
图3 实施例3本发明试剂盒与对照试剂盒线性检测结果对比;
图4 实施例4本发明试剂盒与对照试剂盒重复性检测结果对比。
具体实施方式
为了更好的理解本发明,下面结合具体实施例来进一步详细说明。
实施例1
本发明在具体实施例中,所述的试剂R1为:
HEPS缓冲液 0.4M
NAD 2.5mM
NBT 2mM
聚乙二醇 0.5%
葡聚糖 1.0g/L
甘露醇 5.5g/L
氯化钠 0.9%
三氯甲烷 0.1%
EDTA-2Na 0.1%
VC氧化酶 2500U/L。
试剂R2组成为:
柠檬酸-甘酸缓冲液 0.1M
D-3羟丁酸脱氢酶 3000U/L
氯化钠 0.9%
葡聚糖 1.0g/L
甘露醇 4.5g/L
丙三醇 10%。
实施例2
本发明在具体实施例中,所述的试剂R1为:
HEPS缓冲液 0.3M
NAD 1mM
NBT 2mM
聚乙二醇 0.5%
葡聚糖 1.0g/L
甘露醇 5.5g/L
氯化钠 0.9%
三氯甲烷 0.1%
EDTA-2Na 0.1%
VC氧化酶 2500U/L。
试剂R2组成为:
柠檬酸-甘酸缓冲液 0.1M
D-3羟丁酸脱氢酶 2000U/L
氯化钠 0.9%
葡聚糖 0.8g/L
甘露醇 4.5g/L
丙三醇 10%。
实施例3
本发明在具体实施例中,所述的试剂R1为:
HEPS缓冲液 0.2M
NAD 2mM
NBT 2mM
聚乙二醇 0.4%
葡聚糖 0.8g/L
甘露醇 5.5g/L
氯化钠 0.9%
三氯甲烷 0.01-0.1%
EDTA-2Na 0.1%
VC氧化酶 2000U/L。
试剂R2组成为:
柠檬酸-甘酸缓冲液 0.1M
D-3羟丁酸脱氢酶 1500U/L
氯化钠 0.9%
葡聚糖 1.0g/L
甘露醇 5.5g/L
丙三醇 12%。
本发明试剂盒性能检测:
抗干扰实验
购买胆红素和VC分别配制,胆红素A液位200μM,VC B液位1000mg/L,然后按照1/2、1/4、1/8、1/16稀释成不同浓度,每个浓度分别取溶解九强D-3羟丁酸试剂质控品。购买市场上目前流通D-3羟丁酸检测试剂盒作为对照试剂,本发明试剂盒采用实施例1配方,然后在BS-800全自动化生化分析仪上进行检测,检测结果如图1所示:
通过图1 我们能够看出,本发明试剂盒能够去除500mg/L的VC引起的干扰,但是当VC含量超过1000mg/L时检测结果偏低15%左右,对照试剂易于受到VC的干扰,当血清样本中VC含量在250mg/L已经使得检测结果偏低15%左右。对于对胆红素的抗干扰能力,我们发现本发明试剂盒在胆红素含量200μM范围内不会对检测结果产生影响,但是对照试剂在胆红素含量50μM时已经高于靶值15%左右。
稳定性实验
本发明试剂盒采用实施例2配方,与市场上流通的D-3羟丁酸检测试剂盒进行比较,检测仪器BS-800全自动生化分析仪,操作方法前面已经叙述过,不再重述。九强质控品作为参考物质,检测结果如图2所示:
通过图2我们能明显的看出,本发明试剂盒和对照试剂盒在4℃条件下,历时120天后对检测结果几乎不发生影响;37℃条件下本发明试剂盒在第60天时开始发生衰减,但是在第60天和第120天之间衰减很低,同等条件下对照试剂在第5天已经开始衰减,历时120天后衰减了50%左右;45℃条件下本发明试剂盒和对照试剂盒都存在一定程度的衰减,我们推测,高温可能对酶的活性造成不可逆损伤,致使两种试剂盒在高温条件下都出现了不同程度的衰减,但是本发明试剂盒在历时30天之后才出现明显的衰减,对照试剂在第6天已经开始出现明显的衰减。因此本发明试剂盒在稳定性上远超过了对照试剂盒。
线性实验
购买D3-羟丁酸药品配制20g/L的溶液然后等比稀释成不同浓度的试剂,运用BS-800检测。对照试剂采用市场上目前流通的D-3羟丁酸检测试剂盒进行对边,本发明试剂盒采用实施例3配方。操作不方法此处不再重述。检测结果如图3所示:
通过图3我们可以发现本发明试剂盒在D-3羟丁酸含量为20g/L时偏低了不足3%,但是对照试剂检测值却比结果低了70%多,显然对照试剂在线性范围远优于对照试剂。
重复性实验
运用本发明试剂盒和市场上流通的某一D-3羟丁酸检测试剂盒对某一样本重复检测N=20次,计算变异系数CV。本发明试剂盒采用实施例3的配方进行配制,图4为两种试剂盒20次检测结果及其变异系数。
经过图4我们发现本发明试剂盒重复性实验中性能远高于对照试剂盒。
综合以上各个实验说明本发明试剂盒在对抗干扰物质,试剂稳定性能,重复性,以及线性范围方面都优于对照试剂盒。但是同时也完善了D-3羟丁酸在酶法方法学检测上的不足,使得该试剂有了较强抵抗干扰物质VC和胆红素的能力,同过不同稳定剂的加入使得本发明试剂盒在D-3羟丁酸检测试剂盒在储存中延长了储存时间同时保证了检测效果,同时为本发明试剂盒大量生产,增加市场占有率提供了强有力的技术支持和保证。
Claims (6)
1.本发明一种抗干扰的D-3羟丁酸检测试剂盒,其特征在于所述试剂盒是一种液体型双试剂体外诊断检测试剂盒。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于该试剂盒中含以下物质:试剂R1包括HEPS缓冲液(0.4M)、NAD (2.5m M )、NBT(2m M)、聚乙二醇(0.5%)、葡聚糖(1.0g/L)、甘露醇(5.5g/L)、氯化钠(0.9% )、三氯甲烷(0.1%)、EDTA-2Na(0.1%)VC氧化酶(2500U/L);试剂R2包括柠檬酸-甘酸缓冲液(0.1M)、D-3羟丁酸脱氢酶(3000U/L)、氯化钠(0.9%)、葡聚糖(1.0g/L)、甘露醇(4.5g/L)、丙三醇(10%)。
3.根据权利要求2所述的试剂盒其特征在于,试剂盒中所涉及的缓冲液为柠檬酸-甘氨酸缓冲液、PIES缓冲液HEPS缓冲液的一种。
4.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在所述的试剂盒含有抗干扰物质,VC氧化酶能去除VC引起的干扰,三氯甲烷能去除胆红素引起的干扰,EDTA-2Na能螯合金属杂质离子,保证检测结果的准确性。
5.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在所述的保护剂是丙三醇。
6.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于所述的试剂盒中使用的稳定剂为聚乙二醇、葡聚糖、甘露醇及聚乙烯醇按不同比例组成的。
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