CN103276052B - 一种尿素氮检测试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种尿素氮检测试剂，包含稀释液和反应试剂。其中稀释液包含：三羟甲基氨基甲烷、表面活性剂、防腐剂；反应试剂包含：缓冲液、脲酶、α‑酮戊二酸、NADH、谷氨酸脱氢酶、稳定剂和冻干保护剂。本发明提供的尿素氮检测试剂以干粉的形式置于离心式试剂盘中，适用于引入微流控芯片技术的POCT生化分析仪，与临床上常用的大型生化分析仪上的液体试剂的检测结果具有良好的相关性，且具有操作简便，试剂保存运输便捷，检测成本低等优势。

Description

一种尿素氮检测试剂

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种用于POCT分析仪的尿素氮检测试剂。

背景技术

尿素氮（BUN）是一项对临床有着重要意义的检测项目，这是由于BUN是肾功能的主要指标之一，在临床上应用广泛，需求量很大。

BUN是人体蛋白质代谢的主要终产物。氨基酸脱氨基产生NH₃和CO₂，两者在肝脏中合成尿素，每克蛋白质代谢产生尿素0.3g。尿素中氮含量为28/60，几乎达一半。通常肾脏为排泄尿素的主要器官，尿素从肾小球滤过后在各段小管均可重吸收，但肾小管内尿流速越快重吸收越少，也即达到了最大清除率。在肾功能损害早期，血BUN可在正常范围，当肾小球滤过率下降到正常的50%以下时，血BUN的浓度才迅速升高。。

目前BUN普遍采用各种大型全自动生化分析仪检测，但由于大型全自动生化分析仪设备价格高，且操作复杂，操作人员需有相关的专业知识和接受相应的培训，使用配套条件要求高，需配备稳压电源、纯水机等，并且占地面积大，维护费用高，需要专业人员定期保养，因此基层医疗机构或家庭个人都没有条件购买和使用。此外，大型医院患者多，检测手续繁琐、流程长、等待时间长，这也给患者带来了巨大的时间负担，更重要的是病人因不能得到及时诊断而贻误治疗，甚至会失去生命。

即时检验（point-of-care testing，POCT）是一项新兴的技术领域，主要特点是快速得出结果，操作简便，容易使用和小型化。随着诊断和辅助技术的进步，以及人们对疾病的认识及治疗水平提高的要求，POCT逐渐受到关注。事实上POCT在欧美市场已逐渐成为体外诊断试剂与仪器领域的重要研究项目，已有不少产品投入市场，但这类POCT仪器目前有一个重要缺陷，就是分析仪及试剂耗材特别昂贵，对于中国这样具有庞大基层医疗系统，且试剂使用量极大的国家来说，目前欧美开发的仪器及配套试剂耗材显然都面临挑战。

微流控芯片技术是21世纪世界最为重要的前沿技术之一，它把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测及细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成到一块几十平方厘米（甚至更小）的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，是用以取代常规生物或化学实验室的各种功能的一种技术。将微流控芯片技术引入到POCT设备，开创了POCT发展的新局面，可使以往实验室繁复之全血定量、血球血清分离、血清稀释及同步测定等步骤，在芯片在线自动化作业完成，达到多种标记同步检测目的。结合微流控芯片技术的POCT分析仪兼具高准确度、低需血量、操作简单、检测试剂用量少、成本低等优点，如保生国际生医有限公司的POCT仪，Abaxis公司的Piccolo，Axis-Shield公司的Afinion等，此类POCT分析仪均可实现少量样品即可分析、操作简便、无交叉污染、可自动化作业，非常适用于中国这样具有庞大基层医疗系统且试剂使用量极大的国家。

随着“十一五”计划针对三级及二级医院基础设备的购置与加强，目前中级以上医院已具备良好的软硬件设施，但是基层医疗机构特别是卫生院、卫生所等单位其全自动生化检验仪器设施普遍不足，也没有足够数目的检验专业人员，因此建立操作简易、价格低廉、实时报告的POCT分析系统对发挥广大基层医院在疾病预防及诊疗中的作用有重要的意义。

而如何制备出一种适合在引入微流控芯片技术的POCT分析仪上检测尿素氮的试剂，以实现操作简易、价格低廉、实时报告的优势成为尿素氮检测领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明针对现有技术的上市不足，提供一种操作简易、价格低廉、可实时报告的可在引入微流控芯片技术的POCT分析仪上测定尿素氮的尿素氮检测试剂。

为了解决上市技术问题，本发明采用的技术方案为：一种尿素氮检测试剂，该试剂包括稀释液和反应试剂，

其中稀释液是由以下成分组成：

三羟甲基氨基缓冲液（Tris缓冲液）（pH6.5-7.5）：0.01-1.0mol/L；

表面活性剂：0.1-10.0%（质量百分比）；

防腐剂：0.1-10.0%（质量百分比）；

其中反应试剂是由以下成分组成：

缓冲液（pH7.0-8.0）：50-500mmol/L；

脲酶：10-500KU/L；

α-酮戊二酸（α-KG）：1-100mmol/L；

还原型辅酶Ⅰ（NADH）：1-100mmol/L；

谷氨酸脱氢酶（GLDH）：10-500KU/L；

稳定剂：0.1-10g/L；

冻干保护剂：0.1-10g/L。

本发明上述的稀释液各组份中，表面活性剂为Triton X-100（曲拉通X-100）、Brij-35、PEG（聚乙二醇）的一种或几种；防腐剂为尼泊金酯，如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯等中的一种。

反应试剂各组份中，缓冲液为柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液或磷酸-磷酸钠缓冲液；稳定剂为EDTA、谷胱甘肽、Prolin-300、牛血清白蛋白（BSA）、吐温80、吐温20、司班80或司班20中的一种；冻干保护剂为糖/多元醇类中的一种，如海藻糖、蔗糖、甘油、山梨醇等；或聚合物类中的一种，如牛血清白蛋白（BSA）、聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等；或表面活性剂类中的一种，如吐温80、曲拉通X-100等。

所述BUN测定试剂中稀释液为液体状态，反应试剂为干粉状态。

所述BUN测定试剂的稀释液的制备方法如下：将稀释液中所述试剂成分按照配方比例加入蒸馏水后混合搅匀。

所述BUN测定试剂的反应试剂的制备方法如下：将反应试剂中所述试剂成分加入蒸馏水后混合搅匀，将0.5-10μl反应试剂加入到反应检测槽，经冻干（行业常规技术）或2-8℃挥干24～72h。

所述BUN测定试剂的测试条件如下：温度：37℃；检测主波长340nm，副波长750nm。

本发明所述的微流控芯片技术是将基本操作单元集成到一块几十平方厘米（甚至更小）的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统的一种技术。其特点在于芯片一般分为上下两层，上层有用于加样的通孔，下层包括样品槽、稀释液槽、样品定量槽、稀释液定量槽、储液槽、多个预装有反应试剂的反应检测槽、一组用于系统校正的自检槽、一组溢流槽、多组控制流体流动的不同形状的微流道等。其检测方法一般包括以下步骤：（1）将样品溶液及稀释液经各自通孔注入到所述的样品槽及稀释液槽中；（2）启动电机旋转所述的芯片；（3）样品溶液在离心力作用下实现固液分离和定量，同时稀释液进入稀释液定量槽；（4）定量的样品与稀释液流入混合槽进行混合；（5）混合后的液体进入反应检测槽与反应试剂进行反应；（6）通过与芯片配套的检测设备在反应检测槽中进行原位检测。

所述BUN测定试剂的测定方法如下：将5-20μl样品加入到样品槽，将20-100μl稀释液加入到稀释液槽，启动电机，37℃反应1min后记录吸光度A1，继续反应5-9min后记录吸光度A2。

所述BUN测定试剂的反应原理为：样本先与稀释液进行混合孵育，以去除样本中的胆红素、维生素C及血脂等干扰物质，混合液进入反应检测槽后,样本中尿素在脲酶的作用下生成NH₃，后者与α-酮戊二酸、NADH在谷氨酸脱氢酶（GLDH）的催化下生成谷氨酸和NAD+。因此可通过检测NADH的降低速率，计算出尿素氮的含量。

本发明的优点和有益效果：

1.本发明采用独特的“粉末湿化”原理的生化试剂，试剂保存和使用简便性相似于干化学生化仪的试剂条，试剂与样品反应时的准确度则相似于大型的生化分析仪，因此可同时兼具高准确度、操作简单、低成本的三大诉求。

2.本发明适用于引入微流控芯片技术的POCT生化分析仪上使用的、用于BUN检测的试剂，并且其检测结果与传统的大型生化分析仪具有良好的相关性，在操作简便性和试剂保存上又可以和小型的干化学式生化分析仪相媲美，又能满足临床上大规模的批量样本检测；从而实现操作简易、价格低廉、实时报告的POCT分析系统的建立。

附图说明

图1实施例1试剂检测BUN线性结果图。

图2实施例1试剂在全自动生化分析仪日立7180上测定BUN结果值数据和POCT分析仪上测定数据比较图。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明作出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1

稀释液各成份：

Tris：0.5mol/L，PH7.0

PEG6000：5.0%（质量比）

对羟基苯甲酸甲酯：5.0%（质量比）

反应试剂各成份：

甘氨酸缓冲液（pH7.0）：200mmol/L

脲酶：200KU/L

α-KG：50mmol/L

NADH：50mmol/L

GLDH：200KU/L

EDTA：5.0g/L

PEG：5.0g/L。

实施例2

稀释液各成份：

Tris：1.0mol/L，PH7.5

TritonX-100：0.01%（质量比）

对羟基苯甲酸丁酯：0.01%（质量比）

反应试剂各成份：

磷酸-磷酸钠缓冲液（pH7.5）：500mmol/L

脲酶：500KU/L

α-KG：100mmol/L

NADH：100mmol/L

GLDH：500KU/L

谷胱甘肽：10g/L

吐温80：10g/L。

实施例3

稀释液各成份：

Tris：0.01mol/L，PH6.5

Brij-35：0.1%（质量比）

对羟基苯甲酸异丁酯：0.1%（质量比）

反应试剂各成份：

柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液（pH8.0）：50mmol/L

脲酶：10KU/L

α-KG：1.0mmol/L

NADH：1.0mmol/L

GLDH：10KU/L

Prolin-300：0.1g/L

甘油：0.1g/L。

下面结合表格对本发明实施例1所得试剂的性能进行说明。

1、精密度

表1、精密度评估结果

2、线性

以标准血清样品外添加不同浓度的分析物进行检测，结果见图1。

3、方法学比对试验

与全自动生化分析仪上测定的BUN结果值进行比较，结果如图2，其中X轴代表全自动生化分析仪日立7180上测定数据，Y轴代表引入微流芯片技术的POCT分析仪（台湾保生国际，Amishield，TMO-100）上测定数据，结果见图2。

4、检测灵敏度

检测灵敏度的评估方法用10-20个空白样本讯号强度的标准差，及3-15个最低非零样本讯号强度的标准差，用统计软件EP Evaluator release6计算所得。实验结果显示本发明试剂有很好的灵敏度，能完全符合美国临床实验室改进修正法规。

表2试剂检测灵敏度

从上述检测结果可知，本发明试剂具有良好的灵敏度、准确度、精密度及线性，能完全满足临床检验要求。

Claims (1)

1.一种尿素氮检测试剂，其特征在于：该试剂包括稀释液和反应试剂，

其中稀释液是由以下成分组成：

三羟甲基氨基缓冲液pH 6.5-7.5：0.01-1.0mol/L；

表面活性剂：0.1-10.0%（质量百分比）；

防腐剂：0.1-10.0%（质量百分比）；

其中反应试剂是由以下成分组成：

缓冲液pH 7.0-8.0：50-500 mmol/L；

脲酶： 10-500 KU/L；

α-酮戊二酸：1-100 mmol/L；

还原型辅酶Ⅰ： 1-100 mmol/L；

谷氨酸脱氢酶：10-500 KU/L；

稳定剂： 0.1-10 g/L；

冻干保护剂：0.1-10 g/L；

所述稀释液中的表面活性剂为曲拉通X-100、Brij-35或聚乙二醇中的一种或几种;

所述稀释液中的防腐剂为对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸异丙酯、对羟基苯甲酸异丁酯中的一种；

所述反应试剂中的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液或磷酸-磷酸钠缓冲液；

所述反应试剂中的稳定剂为EDTA、谷胱甘肽、Prolin-300、牛血清白蛋白、吐温80、吐温20、司班80或司班20中的一种；

所述反应试剂中的冻干保护剂为糖/多元醇类中一种具体物质、聚合物类中一种具体物质或表面活性剂类中的一种具体物质；

所述的糖/多元醇为海藻糖、蔗糖、甘油、山梨醇；

所述的聚合物为牛血清白蛋白、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮；

所述的表面活性剂为吐温80、曲拉通X-100；

所述的尿素氮检测试剂中稀释液为液体状态，反应试剂为干粉状态。