CN106383116B - 一种检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒 - Google Patents

一种检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒。它包括试剂R1和试剂R2;所述试剂R1的组分及浓度如下:缓冲液I 10~100mmol/L;多聚阴离子化合物0.1~10mmol/L;二价阳离子0.1~100mmol/L;显色剂0.1~10mmol/L;表面活性剂I1~100g/L;表面活性剂II1~100g/L;防腐剂1g/L~50g/L;所述试剂R2的组分及浓度如下:缓冲液II10~100mmol/L;4‑氨基安替比林0.1~10mmol/L;表面活性剂Ⅲ1~100g/L;胆固醇酯酶0.1~10KU/L;胆固醇氧化酶0.1~10KU/L;过氧化物酶0.1~10KU/L;防腐剂1~50g/L。本发明在选择性抑制法的基础上进行改良,加入优选的复合表面活性剂对,在第一步反应中抑制并消除脂血干扰,因而脂血样本无需前处理,可以直接用于全自动生化分析仪检测,操作简便,提高了检测效率,降低了检测成本。

Description

一种检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒,属于高密度脂蛋白胆固醇测定领域。
背景技术
人体血浆中胆固醇的存在和运输形式为血浆脂蛋白,即非极性的脂类包括胆固醇和亲水性的载脂蛋白结合。血浆脂蛋白按照密度不同主要可分为四种:高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)。其中高密度脂蛋白是由多种富蛋白质颗粒组成的,是一组不均一的脂蛋白,是密度最大的脂蛋白(d=1.063~1.210kg/L)。其组分中蛋白质(Pro)、磷脂(PL)、胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)各约占50%、25%、20%和5%。HDL中蛋白质主要是载脂蛋白AI和AII;胆固醇占总胆固醇(TC)的25%~35%。
临床研究表明,高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)越低,发生冠状动脉粥样硬化的危险性就越大。HDL-C是冠心病辅助诊断的良好指标。HDL-C降低也多见于心、脑血管病,肝炎,肝硬化等患者。
国外临床常规实验室直接分离测定HDL-C的方法大致分为2代。第1代为化学沉淀法,常用的沉淀剂为聚阴离子,如磷钨酸、DS、肝素或非离子多聚体如聚乙二醇(PEG)与某些两价阳离子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+)合用。最早采用的是肝素-锰沉淀法(HM法)。后多采用DS50-Mg2+法,也有采用磷钨酸镁沉淀法(PTA-Mg2+法)和聚乙二醇沉淀法(PEG法)。具体原理是沉淀试剂可以选择性的聚集带正电荷的含有apoB的脂蛋白,HDL溶解在溶液中。用离心法分离出非HDL的凝集物,对上清液的胆固醇分析就可以测定HDL-C。化学沉淀法多受高TG影响,含apoB颗粒因不能完全沉淀而导致HDL-C假性增高。第2代为匀相测定法,均相法能够用于自动化分析仪不需要预处理,以化学和免疫学为基础,非HDL颗粒不需要沉淀,适当的振荡后,酶试剂会选择性解离血清样本中的胆固醇。标本用量少,不需沉淀处理,可用于自动生化分析仪测定,在准确度和精密度方面基本达到NCEP的分析目标,因此在短短的数年里迅速被临床实验室采用。
目前应用的自动分析法有聚乙二醇修饰酶法、免疫分离法(IS)、选择性抑制法、消除法。聚乙二醇修饰酶法:用聚乙二醇(PEG)修饰改性胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶,修饰酶对脂蛋白的结构具有选择性,其顺序依次为LDL<VLDL<CM<HDL;将a-环糊精进行硫酸化,Mg2+和葡聚糖(DS)共同作用能与非HDL形成沉淀,从而避免修饰酶对非HDL的作用,Mg2+和硫酸化环糊精能降低胆固醇的活性,特别是乳糜微粒和极低密度脂蛋白,因此不像沉淀法那样麻烦需要沉淀这些脂蛋白成分。故在Mg2+,DS,a-环糊精以及修饰酶作用下,可直接测定HDL-C。免疫分离法:第一步反应中含有apoB抗体,它与血清中的LDL、VLDL和CM亲和力强,共同作用形成抗原-抗体复合物;第二步反应时加入酶试剂,抗原-抗体复合物不发生酶联反应,HDL则被解离释放出胆固醇参与酶联反应,在显色剂的存在下发生显色反应,根据显色程度即可测定HDL-C含量。选择性抑制法:用一种表面活性剂和聚阴离子与富含apoB的脂蛋白形成聚合物,另一种特定的表面活性剂选择性地溶解HDL,解离出HDL-C在酶试剂中反应,直接测定HDL-C。解离的特异性是这种方法准确测定的一个关键,即含apoB的脂蛋白是否能在第一步反应中与多阴离子完全结合并被抑制剂“包裹",而在第二步反应中不被打开。消除法:该方法主要是利用表面活性剂对HDL,LDL,VLDL和CM的选择性不同,在表面活性剂1的作用下,非HDL与表面活性剂l形成可溶性复合物,脂蛋白表面的游离胆固醇在胆固醇氧化酶(CHOD)的作用下发生反应氧化生成H202,过氧化物酶(POD)对H202作用从而将其清除。加入表面活性剂2选择性地解离HDL,在酶联试剂胆固醇酯酶(CHER)和胆固醇氧化酶作用下反应生成H202,过氧化物酶作用于H202在显色剂的存在下显色,根据吸光度大小测定HDL-C。
与国外相比,国内的第l代为电泳法。第2代为化学沉淀法,1995年中华医学会检验分会曾在国内推荐PTA-Mg2+法作为HDL-C测定常规方法。第3代为匀相测定法。其中选择性抑制法在临床上应用广泛,此方法具有正确度好,精密度高,线性范围广等优点,但是在抗脂血干扰方面存在缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒,所述试剂盒能够克服选择性抑制法现有技术存在的不抗脂血干扰缺陷。
本发明所提供的检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒,它包括试剂R1和试剂R2;
所述试剂R1的组分及浓度如下:
所述试剂R2的组分及浓度如下:
所述的试剂盒中,所述缓冲液I的浓度均指的是其在所述试剂R1中的浓度,所述缓冲液II的浓度均指的是其在所述试剂R2中的浓度;
所述缓冲液I和所述缓冲液II均可为2-吗啉乙磺酸(MES)、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)(Pipes)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)和N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(Hepes)中至少一种;
所述缓冲液I和所述缓冲液II的pH均为6.0~7.0。
所述的试剂盒中,所述多聚阴离子化合物可为环糊精硫酸盐、肝素硫酸盐、磷钨酸钠和硫酸葡聚糖中至少一种。
所述的试剂盒中,所述二价阳离子可为Mg2+、Ca2+和Mn2+中至少一种。
所述的试剂盒中,所述显色剂可为苯酚、3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠(DHBS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺(TOOS)和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOPS)中至少一种;
所述防腐剂可为叠氮钠、庆大霉素和Proclin300中至少一种。
所述的试剂盒中,所述表面活性剂I、所述表面活性剂II和所述表面活性剂Ⅲ均选自Triton X-100、Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、Emulgen A60(二苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚)、PEG-2000、PEG-6000、PEG-8000和胆酸盐中至少一种;
所述表面活性剂I和所述表面活性剂II的HLB值之和大于13。
HLB值指的是亲水亲油平衡值。
所述的试剂盒中,所述胆固醇酯酶的1个酶活力单位指的是:在37℃、30℃,pH8.0条件下,每分钟水解1μmol胆固醇酯的酶活定义为1U;
所述胆固醇氧化酶的1个酶活力单位指的是:在37℃、pH7.0条件下,每分钟生成1μmol过氧化氢的酶活定义为1U;
所述过氧化物酶的1个酶活力单位指的是:在37℃、20℃,pH6.0条件下,pH8.0条件下,20s内生成1mg红紫棓精定义为1U。
本发明试剂盒的组成具体如下:
包括试剂R1和试剂R2,
试剂R1的组成和浓度如下:
MOPS的浓度指的是其在试剂R1中的浓度;
试剂R2的组成和浓度如下:
MOPS的浓度指的是其在试剂R2中的浓度。
本发明还提供了一种高密度脂蛋白胆固醇含量的检测方法,包括如下步骤:将待测样品与所述的试剂盒组分混合,反应,检测,即得到所述待测样品中高密度脂蛋白胆固醇的含量;
所述待测样品可为血清和血浆中的至少一种;
所述检测采用吸收光谱法。
利用本发明试剂盒进行检测的方法基于如下原理:第一反应中,多聚阴离子吸附到LDL、VLDL、CM上形成稳定的复合物,在脂蛋白颗粒表面形成遮蔽圈,同时在HDL表面也吸附有少量多聚阴离子,但由于亲和性较弱,其结合是可逆的。第二反应中,加入可溶性表面活性剂,一方面抑制非HDL解离,同时对HDL颗粒中亲水基团具有亲和力可将游离HDL颗粒弥散、溶解,游离的胆固醇通过胆固醇氧化酶的作用生成过氧化氢。过氧化氢与过氧化物酶和氨基安替比林生成青紫色苯醌色素。通过测定吸光度来实现无须沉淀分离直接测定HDL-C的目的。研究发现该方法检测HDL-C特异性稍差,不抗脂血干扰。脂血样本中CM浓度大,其浊度会导致起始吸光度显著增高,并且在第一步反应中非HDL无法完全包裹遮蔽,从而引起第二步反应时酶试剂与其中CM、LDL、VLDL中胆固醇发生反应,使结果假性增高。为解决脂血干扰问题,本发明在试剂R1中加入一对复合的表面活性剂I和表面活性剂II,两者协同作用,可以减小脂血样本浊度,显著降低脂血样本吸光度,抑制并消除样本脂血干扰。试剂R1中不含或者只包含其中一种表面活性剂均无法达到抗脂血干扰的效果。
目前临床上高密度脂蛋白胆固醇的测定已经常规化,选择性抑制法具有准确性好,精密度高,线性范围广等优点,在临床应用广泛。但是此方法存在抗脂血干扰差的问题,临床使用时,脂血样本需要进行沉淀、离心等前处理,操作复杂,不便于临床检测。本发明在选择性抑制法的基础上进行改良,加入优选的复合表面活性剂对,在第一步反应中抑制并消除脂血干扰,因而脂血样本无需前处理,可以直接用于全自动生化分析仪检测,操作简便,提高了检测效率,降低了检测成本。同时本发明的试剂加入R2之前不会有反应,加入R2后反应曲线能够达到终点,准确性、精密度、抗干扰、线性、稳定性等方面均满足临床高密度脂蛋白胆固醇的检测要求,实用性强,适用于广泛推广和使用。
附图说明
图1为包含复合表面活性剂对试剂的反应曲线。
图2为不含复合表面活性剂对试剂的反应曲线。
图3为本发明方法与沉淀法的HDL测定结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本发明提供的试剂盒包括试剂R1和试剂R2。
试剂R1的组成和浓度如下:
MOPS的浓度指的是其在试剂R1中的浓度;
试剂R2的组成和浓度如下:
MOPS的浓度指的是其在试剂R2中的浓度。
按照下述方法采用本发明试剂盒进行检测:
仪器:奥林巴斯AU400全自动生化分析仪;
试剂使用方法:使用全自动生化分析仪,主波长为600nm,副波长为700nm,比色杯中加入样本2μL,试剂R1 180μL,37℃孵育5分钟,测定吸光度A1,然后加入试剂R2 60μL,反应5分钟后,测定吸光度A2,根据公式HDL=样本吸光度(A2-A1)×标准液浓度/标准液吸光度(A2-A1)计算HDL含量。检测结果如下:
1、试剂R1中包含与不包含复合表面活性剂对,其脂血样本的反应曲线比较
配制2组试剂,第一组试剂即为本发明试剂盒,第二组试剂在试剂R1中不添加表面活性剂I和表面活性剂II,其他各组分同第一组试剂。
取新鲜脂血样本,于奥林巴斯AU400全自动生化分析仪上检测,反应吸光度如图1和图2所示。
在图1和图2中的0~1点之间加入试剂R1和样本,孵育5分钟后,第10点读数A1,10~11点之间加入试剂R2开始反应,反应完全到达终点于第27点读数A2,根据A2-A1计算检测结果。从图1和图2可以看出,不包含复合表面活性剂对的试剂,检测脂血样本时,起始吸光度显著升高,比图1高出4倍有余,甚至高于加入试剂R2后起始段的反应吸光度,故无法得到正确的读数A1。并且受脂血干扰,加入试剂R2后反应曲线在读点时间内无法达到终点,吸光度仍持续上升,故无法得到正确的读数A2。最终造成检测结果不准确。与之相比较,含复合表面活性剂对的试剂,加入R2之前不会有反应,加入R2后反应曲线能够达到终点,不受脂血干扰,检测结果准确。
2、试剂R1中包含与不包含复合表面活性剂对,抗干扰结果比较
配制2组试剂,第一组试剂即为本发明试剂盒,第二组试剂在试剂R1中不添加表面活性剂I和表面活性剂II,其他各组分同第一组试剂。
配制不同梯度的Intralipid(脂肪乳剂),加5%(体积百分比)的干扰物质于样本中,计算回收率,结果如表1中所示。
表1各Intralipid中HDL的检测结果
干扰物质 Intralipid Intralipid Intralipid Intralipid
浓度 100mg/dL 200mg/dL 400mg/dL 500mg/dL
第一组试剂 100.0% 101.4% 97.5% 95.8%
第二组试剂 92.7% 86.6% 80.2% 75.3%
干扰物质Intralipid可以用来等效评价脂血干扰,回收率>90%说明抗干扰性能良好,性能要求试剂抗干扰能力达到400mg/dL。从表1可以看出,本发明的试剂可抗Intralipid干扰至500mg/dL,符合性能要求。第二组试剂抗Intralipid干扰能力为100mg/dL,不符合性能要求。
3、脂血样本结果比较
选取市场上普通的选择性抑制法试剂为对照试剂,与本发明改良的试剂比较,同时检测10例临床TG结果>8mmol/L的脂血样本。结果如表2中所示。
表2脂血样本的检测结果
临床上脂血样本TG>8mmol/L,高密度脂蛋白胆固醇一般会病理偏低。从表2可以,对照试剂测值偏高,本发明试剂未受脂血干扰,与TG结果有良好的临床相关性。临床使用普通的选择抑制法试剂检测脂血样本,一般会对脂血样本进行沉淀、离心等前处理,去除非HDL,然后再于生化分析仪上检测,操作复杂,不利于临床使用。本发明的试剂抗脂血干扰能力强,免除了脂血样本前处理步骤,可以直接上机使用,临床使用更简便,试剂特异性更好,实用性更强。
4、精密度
用高、中、低三个水平浓度的血清样本测试试剂,每个水平重复测试20次,分别计算测量值的平均值和标准差(SD),计算变异系数(CV),如表3中所示。
表3本发明试剂盒检测结果的变异系数
高值 中值 低值
平均值(mmol/L) 2.03 1.59 0.80
CV% 0.48 0.84 0.64
变异系数用来衡量一项方法的精密度,变异系数越小,说明精密度越好。高密度脂蛋白胆固醇测定的行业标准要求CV<4%,本发明的试剂CV<1%,远小于行业标准要求,说明该试剂具有优良的精密度。
5、样本相关
选取《全国临床检验操作规程》推荐的沉淀法为比对方法,同时测量40例临床样本,通过相关来衡量本试剂的准确性。结果如图3所示,计算相关系数为0.9863,大于0.95,说明两种方法相关性良好,本发明试剂盒具有优良的准确性。

Claims (9)

1.一种检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒,它包括试剂R1和试剂R2;
所述试剂R1的组分及浓度如下:
所述表面活性剂I为PEG-2000、PEG-6000和PEG-8000中的至少一种;
所述表面活性剂II为Tween20、Tween40、Tween60和Tween80中的至少一种;
所述表面活性剂I和所述表面活性剂II的HLB值之和大于13;
所述试剂R2的组分及浓度如下:
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述缓冲液I和所述缓冲液II均为2-吗啉乙磺酸、哌嗪-N,N’-双(2-乙磺酸)、3-(N-吗啉代)丙磺酸和N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸中至少一种;
所述缓冲液I和所述缓冲液II的pH均为6.0~7.0。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于:所述多聚阴离子化合物为环糊精硫酸盐、肝素硫酸盐、磷钨酸钠和硫酸葡聚糖中至少一种。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于:所述二价阳离子为Mg2+、Ca2+和Mn2+中至少一种。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于:所述显色剂为苯酚、3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠、N-乙基-N-(2-羟基-3-丙磺基)间甲苯胺和N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐中至少一种;
所述防腐剂为叠氮钠、庆大霉素和Proclin300中至少一种。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于:所述表面活性剂Ⅲ选自Triton X-100、Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、二苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚、PEG-2000、PEG-6000、PEG-8000和胆酸盐中至少一种。
7.一种高密度脂蛋白胆固醇含量的检测方法,包括如下步骤:将待测样品与权利要求1-6中任一项所述的试剂盒组分混合,反应,检测,即得到所述待测样品中高密度脂蛋白胆固醇的含量。
8.根据权利要求7所述的检测方法,其特征在于:所述待测样品为血清和血浆中的至少一种;
所述检测采用吸收光谱法。
9.权利要求1-6中任一项所述的试剂盒在检测高密度脂蛋白胆固醇含量中的应用。
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